< 표지 > 완결과제최종보고서 일반과제 ( ), 보안과제 ( ) ( 과제번호 : PJ009065) 고추 Marker Assisted Backcross 를이용한고효율분자육종시스템구축 (Development of a high-throughput molecular breeding system using marker assisted backcross in pepper ) 주관연구기관명 : 농우바이오 연구수행기간 2012.05 2014.12 농촌진흥청
요약문 Ⅰ. 제목 : 고추 Marker Assisted Backcross 를이용한고효율분자육종시스템구축 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 - 주요선진국은일찍부터종자산업의중요성을인식하고유전자원확보와첨단생명공학을이용한신품종개발에역점을두어왔고 따라서종자산업선 후발국간에유전자원의확보및이용을위한경쟁이심화되고신품종보호권등은국가간쟁점으로대두되고있음 신속하게품종을개발하기위해서는분자표지를이용하여육종재료가지니는유용유전자의유전자형 을정확히파악함으로써 우량개체선발효율의극대화하기위한분자표지를이용한육종시스템정착이필수적임 - 다국적종자회사는육종연한을단축하기위하여이미자체적으로 유전형분석플랫폼으로시스템을구축하고있음 그러나국내종자회사는아가로즈젤을이용한 를주로활용하고있어유전형분석의효율이떨어지고 이에따라육종연한이길어짐 국내종자회사의국제경쟁력을강화하기위해서 분석시스템을개발할필요가있음 Ⅲ. 연구개발의내용및범위 을통한품종육성 유전형분석을하기위해서 분석시스템를구축함 또한 를진행하여식물계통에대한적용성을확인함 유전형분석키트개발 많은 유전형분석키트는품종을구별하거나 병원균의진단 인간유전자분석등에활용되어왔음 키트는한번에약 개이상의유전형을분석할수있는시스템으로 개의유전형을분석해야하는 시스템에활용하기에는분석할수있는유전형의수가제한적이기에적합하지않지만 둘이상의형질의 기반의 시스템에는매우유용하게사용가능함 Ⅳ. 연구개발결과 전통육종에분자마커를활용한선발기술등의첨단기술을활용한분자육종의
접목이이루어졌으며 보다많은분자마커를저비용 고효율로분석할수있는시스템 의개발을수행함 고추와토마토에서저항성 유전형분석키트각각개발함 Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 최근식물분자유전학은엄청난발전을이룩하였으나 이러한유전정보와첨단기술을국내품종개발에활용하는것은이제막시작단계임 향후식물의형질을결정하는분자유전학적지식을바탕으로한유전자조작기술이품종개량과분자마커를통한선발에활용되면전통육종으로는어려웠던형질의개량이가능해질것전망이며 를이용한육종은품종개발연한을획기적으로단축할것으로전망됨
S U M M A R Y Next-generation sequencing (NGS) technology and fast improvement in plant genetics have elevated to massive development of molecular genetic markers through fast analysis of huge molecular biological data. Furthermore, in domestic commercial breeding of horticultural crops, the application of marker assisted breeding (MAB) has been introduced recently. For effective improvement of cultivar breeding, in this research, transcriptome analysis and single nucleotide polymorphism (SNP) comparison with high density pepper map in UC-DAVIS were performed using four lines of Capsicum annuum and C. chinense. For rapid analysis of MAB of tolerant pepper lines, 412 Fluidigm probes were newly designed in this study. These designed probes and SSR and COSII markers were applied for background selection through the MAB program. In addition, powdery mildew (PM), tomato spot wilt virus (TSWV) resistance related markers were subjected to foreground selection of BC1, BC2, and BC3 progenies. The MAB system using Fluidigm probes, and trait-related and common markers was introduced into domestic pepper breeding, which will rapidly approach to a new elite line and a commercial tolerant cultivar. Recent breeding technology is using molecular markers for genotyping of useful gene. Many breeders are generally using the MAS (Marker assisted selection) marker for selecting objective characters. On the other hand, the MAB (marker assisted backcross) marker that using SNP (Single nucleotide polymorphism), is not commonly used. SNP marker is reported that related with metabolism, function, characteristics, pathogen resistance, according to its location. Therefore, scientists are research to find the new SNP location with function. Based on the SNP information that has various pathogen resistances for pepper and tomato, we developed the test kit with multiplex PCR. In case of the kit for pepper, the SNP information that has pathogen resistance of tobacco mosaic virus (TMV), Bacterial spot (BS), Chilli venial mottle virus (ChiVMV), Phytophthora blight (Phyto) were used. And for tomato, the SNP information that has pathogen resistance of meloidogyne incognita (Mi), tomato mosaic virus (ToMV), tomato yellow leaf curl virus (TYLCV), leaf mold (Cf9), fusarium wilt (I2) were used. The test kit is appropriate to be applied for small-sized nursery company and private breeders who cannot afford MBA analysis that needs expensive machine and reagents. And furthermore, by reducing breeding time, early promoted superior cultivar would help to grow national competitiveness.
목 차 제 1 장서론 1 제 2 장국내외기술개발현황 4 제 3 장연구개발수행내용및결과제1세부 7 제1협동 33 제 4 장연구개발목표달성도및대외기여도 55 1절목표대비대외달성도 55 2절정량적성과 56 제 5 장연구개발결과의활용계획 57 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 58 제 7 장기타중요변동사항 59
제 8 장국가과학기술종합정보시스템에등록한연구장비현황 60 제 9 장참고문헌 61
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표 신속대량유전형분석의장점 항목 의다량분석분석비용 분석시약분석인력분석시간 신속대량분석법도입효과 배이상의 분석수증가 유전형분석비용감소기존 분석시약과동일 이상실험실인원감소유전형분석에소요되는시간이개선 - 3 -
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표 2. 전사체염기서열을분석한교배조합의양친목록 교배조합 모친 부친 GMSK GMS-DCA(50-1) PI8000(4027-2) TSWV KSWP(4170-1) RPQ(4056-2) PM PCH14003(4285-1) PMR(4057-1) - 7 -
그림 2. 전사체염기서열을이용한 SNP 발굴파이프라인. - 8 -
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그림 3. total RNA 추출사진. 18S, 28S 위치에서뚜렷한 band 가관찰되었다. 그림 4. Agilent 2100 Bioanalyzer 를이용해 QC 를분석한결과예시. 18S, 28S 지역에서높은피크값을확인했다. 표 3. 6개부모친의 NGS sequencing 결과 Lines Bases Reads Read length 50-1 8,247,161,666 81,655,066 101 4027-2 7,317,488,582 72,450,382 101 4056-1 7,464,096,748 73,901,948 101 4057-1 8,470,600,936 83,867,336 101 4170-1 7,959,879,892 78,810,692 101 4285-1 9,421,567,042 93,282,842 101 Average 8,146,799,144.33 80,661,377.67-10 -
표 4. 6개부모친의 Quality trimming 결과 (PE : paired end reads, S : single reads) Lines Reads before Kept reads Discarded reads trimming Paired Singletons Total Paired Singletons Total 50-1 81,655,066 80,027,936 799,861 80,827,797 27,408 799,861 827,269 4027-2 72,450,382 71,248,886 589,893 71,838,779 21,710 589,893 611,603 4056-1 73,901,948 72,809,220 536,691 73,345,911 19,346 536,691 556,037 4057-1 83,867,336 82,471,112 686,908 83,158,020 22,408 686,908 709,316 4170-1 78,810,692 77,354,460 719,703 78,074,163 16,826 719,703 736,529 4285-1 93,282,842 92,063,830 600,109 92,663,939 18,794 600,109 618,903 Average 80,661,378 76,782,323 666,611 79,984,768 21,540 666,611 676,610-11 -
표 5. 6개부모친의 Alignment 결과 Lines Trimmed reads (A) Aligned reads (B) Ratio (B/A X 100) 50-1 80,827,797 49,710,339 61.5% 4027-2 71,838,779 44,921,010 62.53% 4056-1 73,345,911 45,099,611 61.49% 4057-1 83,158,020 52,512,054 63.15% 4170-1 78,074,163 49,079,614 62.86% 4285-1 92,663,939 56,575,692 61.05% Average 79,984,768 49,649,720 62.07% 표 6. Depth에따른양친사이의 SNP 수 Parents combination Depth 25 50 100 50-1 vs. 4027-2 9,485 6,951 4,513 4170-1 vs. 4056-2 8,325 6,130 3,965 4285-1 vs. 4057-1 12,957 9,743 6,501 Average 10,256 7,608 4,993-12 -
표 7. 병저항성유전자혹은연관분자표지의 SNP분석 Pathogen Locus Marker Sequence length SNP Reference CMV Cmr1 Tm-1Intr_3 500 1 T1616BAC 174 1 Kang et al., 2010 TEV pvr1 gene 773 8 Kang et al., 2005 TSWV Tsw TSWV N-8 843 10 Hoang et al., TSWV S-1 148 3 unpublished ChiVMV pvr6 gene 436 3 Hwang et al., 2009 TMV L gene 4008 86 Tomita et al., 2011 Xanthomonas Bs2 gene 193 9 Thomas et al., 1999 Bs3 gene 3268 2 Romer et al., 2007 Phytophthora QTL5 PhytoSNP5 308 3 Choi et al., unpublished - 13 -
그림 5. SNP filtering 과정. 4 단계의 filtering 과정을거쳐 58,151 개의 SNP 에서 1,910 개 의 SNP 선발. - 14 -
표 8. 교배친의다형성검정 (polymorphism test) 을위한분자표지 염색체 SNP probe 크기 (cm) 분자표지사이의간격 (cm/ 분자표지 )* 1 69 177.1 2.57 2 43 113.8 2.65 3 57 141.6 2.48 4 32 144.1 4.50 5 25 101.6 4.06 6 36 136.6 3.79 7 21 104.2 4.96 8 8 50.3 6.29 9 22 110.2 5.01 10 35 98.0 2.80 11 33 90.0 2.73 12 31 106.3 3.43 Total 412 1460.6 3.55 1,910개의 SNP 중염색체별로분자표지간거리가평균 3.55 cm이되도록 412개의 SNP 를선발하여 BioMark TM probe를제작하였다. * 인접한두분자표지사이의거리를의미. 염색체크기 (cm) / SNP probe 개수. - 15 -
그림 6. 교배친의 다형성 검정(polymorphism test)을 위한 분자표지 유전자 지도. 1,910개의 SNP 중 BioMarkTM probe로 디자인 된 412개 SNP 분자표지의 유전자 지도. 염색체 의 왼 쪽은 유전적 거리(cM)을 의미하고 오른쪽은 probe의 이름을 의미한다. 나. 다형성 검정(polymorphism test) 및 단일 염기 다형성 분자표지 선발 2개 교배 조합의 양친 4계통을 두 반복으로 412개 분자표지들을 이용하여 교배친의 유 전형 분석을 실시하였다(표 9). 유전자형이 이형 접합체이거나, 각각의 교배친 사이에 다형성이 없는 분자표지를 제외한 결과 PM 저항성 교배조합의 양친에서는 다형성이 있는 분자표지가 122개였고, TSWV 저항성 교배조합의 양친에서는 107개 발견 되었다. Fluidigm사의 BioMarkTM HD System이 한 번에 분석할 수 있는 단일 염기 다형성 분 - 16 -
. 표 9. 다형성검정을실시한교배조합의양친목록 교배조합 모친 부친 PM 저항성 PCH14003 (4285-1) PMR (4057-1) TSWV 저항성 KSWP (4170-1) RPQ (4056-2) 표 10. 교배친의다형성검정과분자표지선발결과 교배조합 다형성이발견된분자표지 ( 개 ) 염색체 PM 저항성 TSWV 저항성 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Total 23 8 13 3 6 17 4 2 10 14 9 13 122 23 5 16 9 7 9 9 0 5 11 6 7 107 선발된분자표지 ( 개 ) PM 저항성 6 4 4 5 3 3 4 2 4 4 4 5 48 TSWV 저항성 8 4 4 5 3 3 4 0 4 4 4 5 48 선발된분자표지사이의간격 (cm/ 분자표지 )* PM 저항성 TSWV 저항성 29. 52 22. 14 28. 45 28. 45 35. 4 35. 4 28. 82 28. 82 33. 87 33. 87 45. 53 45. 53 26. 05 26. 05 25. 15-27. 55 27. 55 24. 5 24. 5 22. 5 22. 5 21. 26 21. 26 30.43 30.43 412 개 BioMark TM probe 를사용하여다형성검정결과육성집단별로양친간다형성이존재하 는 probe 를확인할수있었다. PM 저항성교배조합의양친에서는 122 개, TSWV 저항성교배조 합의양친에서는 107 개의 probe 가확인되었으며, 각육성집단별로 BioMark TM 사용될 48 개분자표지를선발하였다. 선발된분자표지간간격은평균 30.43 cm 이다. * 인접한두분자표지사이의거리를의미. 염색체크기 (cm) / SNP probe 개수. HD system 에 - 17 -
그림 7. 육성집단별단일염기다형성분자표지유전자지도. PM 저항성과 TSWV 저항성교배조합의양친에대해 412개 BioMarkTM probe로다형성검정결과선발된 48개 SNP 분자표지. 초록색이 PM 저항성육성집단에사용될분자표지를나타내고빨간색이 TSWV 저항성육성집단에사용될분자표지를나타낸다. - 18 -
그림 7. PM 저항성육성집단 ( 여교잡 1세대 ) 의 BioMarkTM HD system 분석결과. PM 저항성육성집단의 75개체에대하여 48개 SNP 분자표지를사용하여 BioMarkTM HD system 분석결과를색깔로표시하였다. 진한녹색이반복친의유전형을의미하고녹색이이형접합유전형, 노란색이공여친의유전형을의미한다. 흰색으로표시된부분은유전형분석의정확도가낮은부분을의미한다. 가장위에있는행이반복친과의유전형유사도가가장높은개체를의미하며아래로내려갈수록반복친과의유전형유사도가낮은개체를의미한다. 반복친과유전형유사도가가장높은개체의유사도는 84% 이며가장낮은개체의유사도는 63% 이며평균값은 73.5% 이다. 그림 8. BioMarkTM HD system 으로부터선발하여육성중인여교잡 1 세대 PM 저항성고추식물체사진 - 19 -
그림 10. PM 저항성육성집단 ( 여교잡 2 세대 ) 의 BioMarkTM HD system 분석결과. 그림에대한설명은그림 7. 와같다. 반복친과유전형유사도가가장높은개체의유사도는 91% 이며가장낮은개체의유사도는 84% 이며평균값은 87.5% 이다. - 20 -
그림 11. BioMarkTM HD system 으로부터선발하여육성중인여교잡 2 세대 PM 저항성고추식물체사진 - 21 -
그림 12. PM 저항성육성집단 ( 여교잡 3세대 ) 의 EP1TM system 분석결과. PM 저항성육성집단의 94개체에대하여 96개의분자표지를이용하여반복친과의유사도를측정하였다. 가로축이분자표지를의미하며세로축이개체를의미한다파란색으로표시된부분이반복친의유전형을나타내며초록색으로표시된부분이이형접합상태의유전형이다. 개체는반복친과의유사도를기준으로내림차순으로정렬하였으며유사도가가장높은개체는 99.4%, 가장낮은개체는 95.9% 이다. 그림 13. BioMarkTM HD system 으로부터선발하여육성중인여교잡 3 세대 PM 저항성고추식물체 사진 - 22 -
그림 14. TSWV 저항성육성집단 ( 여교잡 1 세대 ) 의아가로즈젤기반 COSII, SSR 의활용분석결과 그림에대한설명은그림 7 과같다. 반복친과유전형유사도가가장높은개체의유사도는 80% 이며가장낮은개체의유사도는 49% 이며평균값은 64.5% 이다. - 23 -
그림 15. TSWV 저항성육성집단 ( 여교잡 2 세대 ) 의 BioMarkTM HD system 분석결과 그림에대한설명은그림 7 과같다. 반복친과유전형유사도가가장높은개체의유사도는 96% 이며가장낮은개체의유사도는 71.1% 이며평균값은 83.2% 이다. - 24 -
그림 16. BioMarkTM HD system 으로부터선발하여육성중인여교잡 2 세대 TSWV 저항성고추식물체 사진 - 25 -
그림 17. BioMarkTM HD system 으로부터선발후육성중인 BC2F2 의 TSWV 저항성고추식물체사진 그림 18. BioMarkTM HD system 으로부터선발후육성중인 BC2F3 의 TSWV 저항성고추식물체사진 - 26 -
그림 19. 샘플수에따른반복친과의유사도최댓값. 141개의샘플중 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140개의샘플을임의추출하였으며각각의경우에반복친과의유사도최댓값을 10,000 반복으로수행하였다. 샘플수가 100개이상일경우반복친과의유사도가가장높은개체를선발할확률이높다. - 27 -
그림 20. 마커수와샘플수에따른반복친유사도최댓값분산. 141개의샘플과 161개의분자표지를대상으로여러조합의임의추출을하여각각의경우에대해반복친유사도최댓값의분산을 10,000 반복으로측정하였다. 샘플수와분자표지수증가에따라분산의크기가감소하였다. 샘플수가 100개이상, 분자표지수가 120개이상일경우분산크기가작아 MAB의정확도가높아진다. - 28 -
그림 21. 연구결과종합. 1차년도연구를통해얻은 58,151개의 SNP에서 filtering, BioMarkTM probe design, polymorphism test를통해육성프로그램별로 48개의 SNP marker를선발하였다. 선발된 SNP marker는육성집단별로적용되어반복친과의유전형유사도가높은개체를선발하는데사용되었으며유사도가가장높은개체를선발후개체를고정시키고품종등록을진행하였다. - 29 -
표 11. Segregation analysis of resistance to chilli veinal mottle virus in NW3, NW4, F1, F2, and BC1 offsprings Population No. of phenotypes Expected ratio Resistant Susceptible Resistant Susceptible ϰ p P 1 (C. annuum NW3 ) 0 73 0 1 - - P 2 (C. annuum NW4 ) 10 0 1 0 - - F 1 73 0 1 0 - - F 2 220 80 3 1 0.5 0.505 BC 1 (F 1 P 1 ) 50 50 1 1 - - BC 1 (F 1 P 2 ) 300 0 1 0 - - 그림 21. urves from high-resolution melting (HRM) analysis of the CVMV1 (the left box) and CVMV2 (the right box) markers in parents and F1 plants. These markers were derived from the amplified fragment length polymorphism fragment sequences of - 30 -
EcoRI AAA/MseI CGG and EcoRI ACG/MseI CTA, respectively. The HRM results contain three genotypes, homozygous resistance (RR), heterozygous resistance (RS), and homozygous susceptibility (SS), which showed different melting curves. 그림 22. Amplified bands from the CVMV3 cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS) marker linked to ChiVMV resistance in parents (P1: NW3; P2: NW4), F1, and F2 populations. M: 1 kb plus ladder. - 31 -
그림 23. ChiVMV 저항성 CAPS 분자표지를 SNP 로전환하여분석한결과사진. 저항성 ( 빨간색 ) 및 이병성 ( 파란색 ) 동형접합체와이형접합체들 ( 초록색 ) 간에그룹을형성하여분자표지전환이잘되었음을 확인함. - 32 -
Cmr1 (R)/cmr1 (S) TGCCATAGGAGCCAGCAGAGTGAAATATGACAAGAGAGCGACTTATGATTGATCTTATCTCAGGAATTATTT[T/C]CT TACCGATAGGTTGCTGGTTATGGGATAGCTTGAAATG [T/C] - 33 -
5 a tgagaactttcgacc 3 5 GTCTTGATA[T/A]AATCTTCAAAGCTGGCAA 1 2 3 R S NTC R S NTC R S NTC Resistance(O); YCM334 / Susceptible(X); Tean Phyto Resistance Phyto Common 1 Taactttgccagctttgaagatta tcaaatagaaataggcaggacact 2 tataactttgccagctttgaagatta tcaaatagaaataggcaggacact 3 taactttgccagctttgaagagta tcaaatagaaataggcaggacact - 34 -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 500 435 370 300 250 200 150 100 Pep.M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 NTC Disease Genes Marker/Gene Genetic distance - 35 -
CMV Cmr1 Tm-1Intr_3 1cM T1616BAC 1cM TEV pvr1 Gene - TMV L Gene - TSWV Tsw TSWV N-8 0.35cM TSWV S-1 0.23cM ChiVMV pvr6 Gene - 세균성점무늬병 (Xanthomonas) Bs2 Gene (partial) - 세균성점무늬병 (Xanthomonas) Bs3 Gene - 역병 (Phytophthora) Phyto major QTL Phyto SNP 5 10-12cM IBP1558 12-13cM - 36 -
[primer01] Tm-1Intr_3 [ Cmr1 (R) / cmr1 (S) ] [T/C] Primer 1 (Tm-1lntr_3) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4-37 -
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선충뿌리혹병 ; Mi [G/A] - 39 -
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과색 총생화서 매운맛 종 빨강 노랑 주황 갈색 총생 비총생 신미 감미 C. annuum 3 18 16 7 2 2 2 2 C. chinenese 1 3 1 2 C. baccatum 4 3 C. frutescens 3 Total 4 28 20 9 2 2 2 2 β β - 41 -
원예적형질 유전자 mrna 크기 (bp) Mutation Reference 노랑과색 CCS 2,159 Deletion Popovsky, S. et al. 2000 주황과색 PSY 1,295 SNP Kim, O.R. et al, 2006 LCYB 1,785 SNP Guzman, I. et al. 2010 CrtZ-2 1,112 SNP Borovsky, Y. et al. 2013 갈색과색 CL 1,280 SNP Borovsky, Y. et al. 2008 총생화서 FA 600 #2 exon duplication Elitzur, T. et al, 2009 매운맛 Pun1 1,323 15 bp deletion Ben-Chaim, A. et al. 2006-42 -
빨강 갈색 주황 노랑 종 + - * + - + - + - C. annuum 3 6 1 12 4 9 9 C. chinenese 1 2 1 3 C. baccatum 2 1 4 C. frutescens 2 1 Total 4 8 1 15 5 18 10 * CCS 유전자에 deletion이존재할경우 +, 존재하지않을경우 로표기함. - 43 -
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[primer01] Tm-1Intr_3 [ Cmr1 (R) / cmr1 (S) ] [T/C] [primer02] T1616BAC [ Cmr1 (R) / cmr1 (S) ] [C/T] [primer04] TEV [ Pvr1 (S) / pvr1 (R) / pvr1 1 (R) / pvr1 2 (R) ] [G/A/G/G] [G/G/G/A] [primer07] TSWV S-1 [ Tsw (R) /tsw (S) ] [C/T] [A/G] [T/C] - 46 -
Primer 1 (Tm-1lntr_3) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Primer 2 (T1616BAC) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 478bp 362bp Primer 4 (TEV) 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Primer 7 (TSWV) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 413bp 436bp Primer 8 (ChiVMV) 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 324bp - 47 -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 500 435 370 300 250 200 150 100 Pep.M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 NTC Pep.M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 NTC - 48 -
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(A) (B) M 1 2 3 4 5 6 NTC M M 1 2 3 4 5 6 NTC M 600 500 400 300 200 600 500 400 300 200 100 100 M 1 2 3 4 5 6 NTC M M 1 2 3 4 5 6 NTC M - 52 -
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