intron Biotechnology, Inc. ISO 900/400 Certified Company SwineOrigin Influenza Virus typing Realtime RTPCR Kit (Eurasian SIV/M/H/NA) 돼지독감 및 신종인플루엔자 (SOIV) 확진 검사를 위한 Onestep Realtime RTPCR 사용설명서 Real time RTPCR Test for the detection of Influenza A virus especially in Swine Influenza A virus (SIV) and SwineOrigin Influenza A virus (SOIV) by onestep Realtime RTPCR. 50 Tests Instruction Manual Ver.0 RUO REF Research Use Only IP4003 www.intronbio.com www.intronbio.co m www.intronbio.com www.introninnoplex.com
Trademarks: intron, DNAspin, DNAmidi, DNAmaxi, PCRquickspin, MEGAspin, MEGAquickspin, MEGAbead, PROBER, GDEX, Gspin, Viral Genespin, easyspin, RNAspin, easyblue, easyred, WESTone, WESTZOL, PROPREP, SMART, PRO MEASURE, Genelator, FDetector, BroadWay, PROSTAIN, plug, Maxime, itaq, istartaq, imax, istarmax, RedSafe, Muta Direct, emyco, MSolution, CENDORI, VeTeK, innoplex, GxN, telefaxgene, CLP and IQeasy is a trademark of intron Biotehcnology, Inc. intron kits are intended for research use only. Prior to using them for other purposes, the user must validate the system in compliance with the applicable law, directives, and regulations. The PCR process is covered by patents issued and applicable in certain countries. intron Biotechnology, Inc. does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this product is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license. 200 intron, all rights reserved.. 국외 판매 대리점 Australia Scientifix Pty Ltd. unit C3, Hallmarc Business Park 2A Westall Rd, Clayton 36. Phone : 6 3 5405900 Fax : 6 3 954 777 URL : www.scientifix.com.au Belgium Gentaur Logistic VOORTSTRAAT 49, 90 KAMPENHOUT, BELGIUM Phone : 32659045 Fax : 26509045 URL : www.gentaur.com Canada Cedarlane Laboratories Ltd. 440 Paletta Court Burlington, ON L7L 5R2 Canada Phone : 292000 Fax : 2920020 China Chinagen Inc. Suite 2, st Building., 2nd Industrail District Kefa Road, Science & Technology Park Central, Shenzhen, 5057 Phone : 6 (0)755 2604525 Fax : 6 (0)755 2604527 URL : www.chinagen.com.cn Croatia & Slovenia Transing d.o.o 0000 Zagreb, Kulmerska a Phone : 35 4666 639 Fax : 35 4662 622 URL : www.transing.hr France EUROMEDEX 24, rue des Tuileries BP 64 67460 SOUFFELWEYERSHEIM CEDEX France Phone : 33 3 07 22 Fax : 33 3 7 07 25 URL : www.euromedex.com Germany HISS Diagnostics GmbH. Colombistrasse 27 D7909 Freiburg Phone : 49 76 39 490 Fax : 49 76 202 0066 URL : www.hissdx.de Hong Kong Tech Dragon Limited Rm 0, Topsail Plaza, On Sum Street Shatin, NT, Hong Kong Phone : 52 2646 536 Fax : 52 2646 5037 URL : www.techdragon.com.hk Hungary BioKasztel Ltd. Budapest, Kelenhegyi ut 22. Phone : 36 3 0694 Fax : 36 3 0695 URL : www.kasztel.com India Biogene india B4, Second Floor, Moti Nagarm New Delhi005 Phone: 9 42500/2592004 fax: 9 425260 URL: www.biogeneindia.com Iran NANOMEHR CO. North Karegar Ave, Between Nostrat St and Keshavarz Bulvd, Saman Buld, No202 unit No30, Tehran Iran Phone : 9 2 4432 362 Fax : 9 2 4432 364 URL : www.nanomehr.ir Iran Sina Bio Medical Chemistry Co. Arafati street, Sohani street Sohank street, Minicity Sq., Tehran 95546963 Phone : 9 2 2244 24 Fax : 9 2 2244 0 Israel Talron Biotech Ltd. 7 Hazait street Rehovot 76349 Phone : 972 (0) 9472563 Fax : 972 (0) 94756 URL : www.talron.co.il Indonesia PT.Blue Sky Biotech Blok J 3 No.46 Taman Tekno BSD SerpongTangerang 534 Phone : 62 2 756 564 Fax : 62 2 756 565 Italy Li StarFISH S.r.l. Via Silvio Pellico, 3, 2006 Carugate Milano Phone : 39 02 9250794 Fax : 39 02 925725 URL : www.listarfish.it Italy Valter Occhiena s.r.l. Via Rosta, 7 bis 043 Torino Phone : 39 0 77 697 Fax : 39 0 776 00 URL : www.valterocchiena.com Japan Cosmo Bio Co. Ltd. ToyoEkimae Bldg, 220, Toyo 2Chome, Kotoku Tokyo, 35006 Phone : 3 5632 960 Fax : 3 5632 969 URL : www.cosmobio.co.jp Japan Funakoshi Co. Ltd. 97, Hongo 2Chome, Bunkyoku, Tokyo, 30033 Phone : 3 564 620 Fax : 3 564 775 URL : www.funakoshi.co.jp Kazakhstan BioHim Pribor Makataeva Street 34, Almaty, 050002,Republic Kazakhstan Phone :7 727 27 23 6 Fax : 7 727 269 27 9 Lebanon Hawa Chicken P.O Box:74, AnteliasLebanon SafraKeserwanLebenon, Lebanon Phone : 9695257 Fax : 9695265 URL: www.hawachickenlb.com Malaysia NHK Bioscience Soutions Sdn. Bhd. 4 Lorong Chekor, 3rd mile off Jalan Kelang Lama, 5000 Kuala Lumpur Phone : 603797 2 Fax : 603797 23 URL: www.nhkbioscience.com Mongolia SX BIOTECH Co.,Ltd. NISORA TOWER 604, TOKYO STREET 4A, ULAANBAATAR 2049, Mongolia Phone : 97650060677 Fax : 976327675 URL: www.sxbiotech.com New Zealand Ngaio Diagnostics Ltd Halifax Street East Nelson 700 Phone : 64 3 54 4727 Fax : 64 3 54 4729 URL : www.ngaio.co.nz Netherland Goffin Molecular Technologies B.V. Postbus 25 470 AG Etten Leur NETHERLANDS Phone : 376506000 Fax : 37650606 URL : www.goffinmeyvis.com Philippines Hebborn Analytics INC. A7 Lester Building Quirino Highway Lagro Quezon City Philippines, Phone : 632 46 773 Fax : 632 4 577 Singapore Precision Technologies PTE Ltd. 2 Henderson Road. #302 Henderson Industrial Park SINGAPORE 59552 Phone : 656273 4573 Fax : 656273 9 Spain LABOTAQ, S.C C Aviacion, 5 Poligono Industrial Calonge 4007 Sevilla Phone : 34 954 3 726 Fax : 34 954 3 7360 URL : www.labotaq.com Taiwan Hongjing Co., Ltd. 5F, No. 74, CHUNGSHAN Rd., Sec, YOUNGHO CITY, Taipei Phone : 6 2 3233 55 Fax : 6 2 3233 66 URL: www.hongjing.com.tw Thailand Pacific Science Co. Ltd. 62,64 Soi Charansanitwong 49/ Charansanitwong rd,bangbumru Bangplad Bangkok 0700 Thailand Phone : 66 2 433 006 Fax : 66 2 434 2609 URL : www.pacificscience.co.th Tunisia RIBO Pharmaceutique & Diagnostique 53, rue du Parc Sidi Bousaid Tunis 2026 Tunisia Phone : 2679095 Fax : 2679473 Turkey BIOCEM Ltd. Co Millet Cad. Findikzade Sok. Emre Apt. No:9/6 34093 Findikzade/IstanbulTURKEY Phone : 9022534003 Fax : 902263206 URL : www.biocem.com.tr U. S. A. Boca Scientific Inc. 950 Peninsula Corporate Circle Suite 025, Boca Raton, FL 3347 USA Phone : 56 995 507 Fax : 56 995 50 URL : www.bocascientific.com
3. Trouble Shooting Negative Control에서 양성판정이 나타나면 검사 중에 시약에 오염이 발생한 것일 수 있으므로 재검사를 실 시하십시오. 검사결과 Internal control 값이 Cutoff 이하로 나타날 경우에는 검체로부터 RNA가 추출 되지 않은 것이므로 RNA 추출 과정부터 다시 실시 하십시오. 4. 사용상의 주의사항 Contents Quick Protocol 샘플준비 RNA 추출 RTPCR 본 제품은 연구용으로만 사용하십시오. 검체는 미지의 바이러스나 세균 감염원으로서의 위험성을 내포하고 있으므로, 취급 시 주의해야 하며, 실험 후 검체는 멸균하여 폐기해야 합니다.. 질병개요 2. 제품개요 및 검사원리 6 7 감염가능 물질의 취급 시에는 일회용 고무장갑을 사용하고 취급 후 손을 깨끗이 씻어야 합니다. 검체를 단시간 보관할 경우에는 2~OC에서 냉장보관하고, 만일 장기간 보관할 경우에는 냉동보관 하 십시오. 사용한 제품의 폐기는 감염가능 물질의 취급과 동일하게 취급하며, 감염성 폐기물로 분류하여 멸균처 리 후 폐기하여 주십시오. 5. 교환 본 제품은 엄격한 품질관리를 필 한 제품입니다. 만일 구입 시 제품에 이상이 있을 경우 제품 구입처에 서 교환하여 드립니다. 3. 제품구성 4. 저장 및 보관 5. 추가적으로 필요한 시약 및 기기 6. 실험전 유의사항 7. 생물안전 및 개인보호장비. 소독 및 폐기 7 6. Symbol 설명 9. 오염방지 0. 시료의 준비 및 저장, 운반 9. RNA 추출 9 ) 실험전 유의사항 2) Viral RNA 추출방법 2. RTPCR ) 실험전 유의사항 2) RTPCR 3) 프로그램 실행 4) 결과분석 7. 관련제품 Cat. No D40253 IP022 제품명 innoplex TM SIV Realtime RTPCR Kit (NP) innoplex TM SOIV H Realtime RTPCR Kit 포장단위 50 Tests 00 Tests Specification Realtime RTPCR, SIV Specific Realtime RTPCR, H gene (CDC base) 5) 결과분석 예 3. Trouble Shooting 4. 사용상의 주의사항 5. 교환 7 7 7 IP020 innoplex TM FluA5 RTPCR Kit 96 Tubes Pentaplex RTPCR (conventional) 6. Symbol 설명 7 IP02 75 753 innoplex TM FluA2 RTPCR Kit Viral Genespin TM Viral DNA/RNA Extraction Kit IQeasy TM plus Viral DNA/RNA Extraction Kit 96 Tubes 50 col. 50 col. Duplex RTPCR (conventional) Viral DNA/RNA 추출용 Viral DNA/RNA 추출용 7. 관련제품. 국외 판매 대리점 7 23 RNase WiPER TM 400 ml Rnase 및 DNA 오염 제거제 7 2
Quick Protocol 샘플준비. 샘플 채취 용기 바이러스 수송배지 키트 사용 : Viral transport media (VTM) 2. 올바르게 잡는 방법 3. 샘플 채취 방법 ) 비인후 흡입액 (Nasopharyneal swab) 4) 결과 분석 아래표를 기준으로 분석된 결과값을 해석한다. No. 2 3 4 5 6 7 9 0 항목 Positive control No template control Test Test 2 Test 3 Test 4 Test 5 Test 6 Test 7 Test FAM HEX Cy 5 * FAM : SOIV specific NA gene HEX : SOIV specific H gene Cy5 : SOIV and Eurasian SIV specific M gene 5) 결과 분석 예 SIV (HN / H3N2 mix) => 사진 교체 예정 결과해석 반응유효 반응유효 재시험 (재 추출) 재시험 (동일한 경우 SOIV 감염 판정) 재시험 (동일한 경우 SOIV 감염 판정) Eurasian SIV 감염 판정 재시험 (동일한 경우 SOIV 감염 판정) 재시험 (동일한 경우 SOIV 감염 판정) 재시험 (동일한 경우 SOIV 감염 판정) SOIV 감염 Technical Tip SOIV (NA gene) Swab 을 비강 속 깊숙히 삽입 Swab 을 23회 회전시킨 후 5초간 정지하여 최대한 흡수하도록 함. 수송배지가 담겨있는 병 에 도말한 봉을 담구고 병 마개 부위에서 봉을 부러 뜨린 후, 뚜껑을 꼭 잠그 도록 한다. (부러뜨릴 때 안쪽에 손이 닿아 오염되지 않게 주의 한다) 2. 검체가 담긴 병은 즉시 4 냉장고에 보관한다. 2 No template control Eurasian SIV & SOIV(M gene) SIV (H gene) Cutoff 2) 샘플 채취 예 3 6
Quick Protocol 상단의 Analyze 메뉴를 클릭하면, 우측창에서 분석결과값을 확인할 수 있다. RNA 추출 Viral Genespin Viral DNA/RNA Extraction Kit (Cat. No. 75) 이용법 동급의 다른 제품이용 시에는 해당제품의 매뉴얼 참조바람. 샘플 50 μl를 넣음. 250 μl Lysis Buffer 첨가 Vortex / 5 sec. 실온(5~20 )에 0분간 정치 350 μl 의 Binding Buffer 첨가 9 상단의 메뉴항목을 이용하면 분석결과값을 출력 또는 저장할 수 있다. Vortex / 5 sec. 샘플을 column에 넣음 원심분리(3,000 rpm/ min.) 여액 제거 500 μl 의 Washing Bbuffer A 넣음 원심분리(3,000 rpm/ min.) 여액 제거 Collection tube 버림 500 μl 의 Washing Buffer B 넣음 원심분리(3,000 rpm/ min.) 후 여액 제거한 뒤 다시한번 원심분리하여 column 을 건조시 킴 Column을 새로운.5 ml tube에 조립 30~50 μl의 Elution Buffer를 넣은 후, 분간 반응 원심분리(3,000 rpm/ min.) Column 버림 RNA 추출완료 5 4
Quick Protocol RTPCR 샘플 수 만큼의 PCR tube 준비 6 Run 메뉴로 이동하여 을 클릭한다. 이때 설정한 프로토콜의 저장메시지가 뜨면 원하는 위치에 저장한다. 약 ~2 분간 프로그램과 장비간의 연결이 이뤄지며, Instrument status가 Disconnect에서 connect 로 바뀌게 되고 RTPCR 반응이 시작된다. μl 7 μl 5 μl OneStep RTPCR Premix SOIV Detection Solution Template Total μl 7 μl 5 μl 20 μl RTPCR Cycle Step Cycle Temp Time RT Step PCR Step 45 45 30 min. 94 5 min. 94 5 sec. 53 30 sec. 7 반응이 완료되면 analysis 메뉴에 다음과 같이 표시된다. 이때 증폭곡선의 메뉴를 linear로 선택하면 샘플별 S자형 증폭곡선을 확인 할 수 있다. Program 을 이용한 결과 분석 5 4
. 질병개요 4 Assign Target and Samples 메뉴의 View plate layout 항목에서 시료를 넣은 well을 드래그하여 선 택한 후, Assign target(s) to the selected wells.항의 Assign을 선택한다. (해당 well에 검사항목 정보가 표기됨) Reaction의 신뢰성을 확보하기 위하여 NC(No template control)은 반드시 넣어준다. Passive reference 선택항목에서 반드시 으로 설정하고 후속단계로 넘어단다. (ABI 7500은 초기설정과 관계없이 모든 실험정보를 저장 및 분석이 가능하므로 실험 후 수정가능) 5 Run method 메뉴로 이동하여 Graphic View 항목에서 RTPCR cycle을 입력한다. [표 ] 참조 마지막 step은 형광값을 읽을 수 있도록 설정한다. ( 체크 ) [표 ] RTPCR cycle Step Cycle Temp Time RT Step PCR Step 45 45 30 min. 94 5 min. 94 5 sec. 55 30 sec. 적색표기 부분은 signal detection 구간 [병원체] 인플루엔자 바이러스는 보통 우리나라에서는 겨울철에 독감을 일으키는 병원체입니다. 그런데 인플루엔자 바이러스가 수 십 년을 주기로 해서 대 규모로 새로운 형태로 등장하는 경우가 생기는데 이를 신종이라고 부릅니 다. 2009년 새롭게 나타난 인플루엔자는 돼지인플루엔자(Swine influenza)에 서 유래된 형태로 HN형 인플루엔자 바이러스로서 2009년 4월 미국에 서 첫 확인되었으며, 현재 급속하게 전파되어 2009년 9월 20일 현재 전세 계 감염자수는 3,925명에 달하고 이중 3,97명 이상이 사망한 것으로 세계보건기구(WHO)는 집계하고 있습니다. 2009년 유행하는 신종인플루엔자 A (SwineOrigin Influenza HN Virus; SOIV)는 조류 독감(H5N)과 다른 구조를 가진병원체이며 일반적으로 200년 겨울에 유행한 계절 인플루엔자 A(HN)형과도 다른 완전히 새로 운 인플루엔자 바이러스입니다. 일반적으로 조류, 사람 등에 독감을 유발하는 인플루엔자 바이러스는 숙주에 따라 각각 다른 타입으로 존재하 므로 이종간의 감염은 일어나지 않습니다. 하지만 돼지의 경우 호흡기 내 사람, 조류, 돼지 독감바이러스에 대 하여 결합할 수 있는 수용체를 모두 갖고 있으므로 이들 바이러스에 감염될 수 있으며, 실제 심각한 병증으로 의 전개가 일어나지 않더라도 돼지의 몸 속에서 여러 바이러스의 재 배열 (reassortment) 이 일어날 수 있습니 다. 2009 년 전 세계로 퍼진 신종인플루엔자도 이러한 과정을 통해 형성된 것입니다. 2009년 말 국내의 돼지에서도 신종인플루엔자바이러스가 발견됨에 따라 사람에서 돼지로의 이종감염이 일어 남을 확인하였고, 결과적으로 이러한 바이러스의 지속적인 모니터링의 중요성이 크게 대두되고 있습니다. [병인론] 호흡기도 상피세포에 감염을 일으켜 호흡기질병을 유발하고 임신돈에서는 혈관을 통하여 바이러스 혈증 상태 를 보이다가 태반을 통하여 유산, 사산 등의 번식장애를 보입니다. [임상증상] 신종인플루엔자의 경우 고위험군 사람에 있어서 중증 질환으로 전개되는 경우가 많이 관찰되었으나 돼지의 경 우 여느 돼지인플루엔자의 감염증세와 큰 차이가 없습니다. 돼지 인플루엔자는 아주 전형적으로 집단적으로 발생되는 질병이며, 주로 늦가을부터 초봄에 주로 발생합니다. 발병증상을 보면 갑작스럽게 돈군 내의 거의 모 든 돼지가 동시에 발생하여 빠른 속도로 전체 돈군이 호흡기 증상을 보입니다. 전염력도 매우 빠르지만, 이차 적인 감염이 이루어지지 않는다면 회복 속도도 빨라 5~7일 후에는 자연치유되는 경우가 많습니다. 육안적인 증상을 살펴보면 감염된 돼지는 극도로 활력이 저하되어 전지를 앞으로 벌린 채 흉골을 바닥에 붙이고 휴식을 취하며 경련적인 기침을 하는데 그 이유는 점액이 기도를 폐쇄하여 호흡이 어려워서 나타나는 현상입니다. 다른 호흡기 질병과 같이 체온이 상승(4.5 )하면서 사료 섭취량이 전체적으로 떨어지며, 심한 개체는 식욕을 절폐합니다. 주요 임상증상은 ~3일의 잠복기를 거친 후 동시폭발적으로 식욕저하, 활동성 저하, 쇠약, 기복자세, 환각증상, 사람이 지나가도 움직이지 않는 증상이 나타납니다. 강제로 이동시키면 입을 열고 있고, 복식호흡, 힘든 기색, 경련 및 개가 짖는 듯한 발작성 기침을 하며, 안결막염, 비염, 콧물, 콧소리 등이 나타나며 00% 감염이 되나 4% 정도의 치사율을 가지며 이러한 증상은 면역성이 떨어졌거나 다른 원인체와 복합 감염될 경우 임상증상이 심해집니다. 임신돈에 감염되면 유 산, 사산과 분만 후 2~5일에 포유자돈이 폐사하거나 만성경과를 취하여 발육이 부진하며 포유기간이나 이유 후에 폐사합니다. 임신 기간 중에 감염된 자돈은 생후 2~5일 이내에 증상이 발현되며 만성으로 경과하여 증체지연, 쇠약 및 포유 기나 이유기 중의 폐사를 보입니다. 회충의 유충이 폐를 통과하거나 흉막폐렴이나 파스튜렐라가 복합적으로 감염될 경우 증상이 악화됩니다. 기관강과 기관지강 내에 유백색의 점액이 차 있고, 인ㆍ후두 점막의 충 혈, 폐의 첨엽 및 심협에 명확히 분획된 적자색 병변이 나타나며, 소엽간 결합조직의 비후, 폐문 림프절과 중격막 림프절의 심한 충혈과 종창이 관찰됩 니다. 경부 및 장간막 임파절이 극도로 확대되고 부종성을 띠나 충혈은 거의 없습니다. 3 6
2. 제품개요 및 검사원리 innoplex 는 intron Biotechnology의 Realtime PCR 기술을 집 적시킨 제품으로 비인두 swab 등의 검체 내 존재하는 Swine influenza A virus (SIV) 및 SwineOrigin influenza A virus (SOIV)를 실시간으로 검출할 수 있는 제품입니다. 역전사(Reverse transcription, RT) 및 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 이용하여 각 바이러스의 목적유전자를 직접적으로 증폭하고 이를 실시간으로 검출함으로써 검체내에 Swine influenza A virus (SIV) 및 계절독감의 존재 유무 를 신속하고 정확하게 검사하는 제품입니다. intron의 는 3가지 SIV 의 유전자를 주요 Target 으로 합니다. 이는 H gene, M gene 및 NA gene 으로서 influenza 중 SIV 및 SOIV 의 정확한 구분이 가능하며 Eurasian SIV 와의 구분도 가능합니다. 또한 Multiplex real time PCR 기반이면서도 높은 민감도의 검출실험이 가능합니다. 목적유전자 M gene 의 경우 SOIV 및 Eurasian SIV 에 특이적으로 작용하므로 기존의 SIV 와 차적인 구분 이 가능하도록 설계되어 있습니다. H gene 의 경우 2009년 전세계적으로 유행한 SOIV HN 에 특이적인 염기서열을 기반으로 디자인되어 SOIV 감염여부를 확인할 수 있도록 되어 있고, 이를 확진하기 위하여 최 종적으로 NA gene 의 경우 SOIV 에 매우 높은 특이성으로 반응하도록 설계되어 있어 환축의 신종인플루엔 자 감염여부를 2중 확인이 가능합니다. innoplex SIV Realtime RTPCR Kit (Typing)는 RT 및 PCR 과정을 일체화하여 한번의 실험과정 만으 로 원하는 유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 Onestep형 제품으로 SIV / SOIV 를 검출 할 수 있는 유전 자 단편 (primer)이 시약 내에 포함되어 있어 시료의 유전자만 준비되면 바로 실험을 실시할 수 있도록 하여, 각각의 실험준비 및 실험과정에서 발생될 수 있는 오류를 최소화하여, 재현성 및 특이성이 우수한 제품입니 다. 3) 프로그램 실행 ABI 7500 프로그램을 실행시킨 후, Advanced Setup 을 클릭한다. 2 Experiment Menu에서 Experiment Properties항목을 선택한 후, 실험제목(ExperimentName)을 입력하고, 아래 4개 항목을 클릭하여 선택한다. 3 Plate setup에서 Define target and Sample 항목의 Target 정보 및 Sample 정보를 입력한다. 3. 제품구성 [Realtime PCR 에서 Primer 및 Probe 의 작동원리] No 항목 Reporter Quencher 본 키트는 50테스트 단위로 포장되어 제공됩니다. 만일 제품 구성물 중 하나라도 부족할 경우 시약이 없는 것이므로 실험하지 마십시 오. No. Label 표기 용량 수량 SOIV Detection Solution 의 구성 2 3 SOIV (NA) SOIV (H) Eurasian SIV/SOIV (M) FAM HEX Cy5 OneStep RTPCR Premix 400 μl ea 항목 Reporter Quencher 2 3 4 SOIV Detection Solution Positive Control User Manual 350 μl 00 μl ea ea ea SOIV (NA) FAM SOIV (H) HEX Eurasian SIV/SOIV (M) Cy5 Detection Solution 을 장기간 사용하게 될 경우 냉해동의 반복으로 인하여 민감도가 낮아질 수 있으므로 50μl 단위로 분주하여 보관한 뒤 소량씩 덜어서 사용하는 것이 바람직합니다. 7 2
2. RTPCR ) 실험전 유의사항 RNA 실험 시에는 반드시 실험용 장갑을 착용하시고 실험하시 기바랍니다. 맨손으로 실험하실 경우 RNA 분해가 일어날 수 있 습니다. 실험에 필요한 시약들은 수량에 맞추어 미리 실온에 꺼내어 놓 습니다. 특히, 액체 시약들은 완전히 녹인 후, 사용하십시오. 2) RTPCR 2 3 4 PCR tube에 OneStep RTPCR Premix μl, SOIV Detection Solution 7μl 및 검체로부터 추출한 RNA 5μl를 첨가하여 20μl 가 되도록 한다. 음성확인용으로 개의 PCR tube에 OneStep RTPCR Premix μl, SOIV Detection Solution 7μl 및 멸균 증류수 5 μl 를 첨가하여 20 μl가 되도록 한다. 양성확인용으로 개의 PCR tube에 OneStep RTPCR Premix μl, SIV Detection Solution 7μl 및 Positive Control 5μl를 첨가하여 20μl가 되도록 한다. 준비된 각각의 PCR tube를 원심분리기로 간단하게 spindown 시킨다. Technical Tip PCR 혼합표 Contents PCR tube OneStep RTPCR Premix SOIV Detection solution RNA template Total 적용 가능한 장비 Volume ea μl 7 μl 5 μl 20 μl ABI 7500, Light Cycler, SLAN, CFX96 등FAM / HEX / Cy5의 분석 이 가능한 장비. HEX의 경우 JOE, VIC 등으로 대체 하여 분석가능. 4. 저장 및 보관 는 직사광선 및 자외선을 피해서 20 이하의 온도에서 냉동 보관 해야 합니다. 본 키트는 냉동과 해동을 반복할 경우 제품의 품질에 영향을 미치므로 유의하시기 바랍니다. 본 키트는 보관조건을 준수하여 보관할 경우 유효기간 까지 안정합니다. 5. 추가적으로 필요한 시약 및 기기 Disposable gloves RNA extraction kit (Viral Genespin Viral DNA/RNA Extraction Kit ; Cat. No. 75) Pipettes Sterile pipette tip Vortex mixer Centrifuge for microcentrifuge tubes Realtime PCR system 6. 실험 전 유의사항 본 키트는 20 이하에서 보관해야 하며, 반복적인 냉 해동을 피해야 합니다. 본 키트의 사용 시 멸균된 pipette과 tip을 사용해야 합니다. 양성대조는 측정하고자 하는 시료와 함께 보관해서는 안되며, 다른 시약과 혼동하여 사용해서는 안됩니다. 검체는 미지의 미생물에 오염되어 있을 수도 있으므로 사용상 주의를 요합니다. 감염 가능 물질의 취급 시에는 일회용 고무장갑을 사용하고 취급 후, 손을 깨끗이 씻어야 합니다. 사용한 키트의 폐기는 감염가능 물질의 취급과 동일하게 취급하며, 감염성 폐기물로 분류하여 멸균 처리 한 후 폐기하십시오. 유효기간이 경과된 키트는 부정확한 판정이 초래될 수 있으므로 사용을 금합니다. 본 키트는 연구용 시약이므로 진단용으로 사용하지 마시기 바랍니다. 7. 생물안전 및 개인보호장비 개인보호장비 구비 N95 마스크 수준 이상의 호흡장치 덧신/모자 앞트임이 없는 밀폐용 실험복 실험장갑 이중 착용 보안경 (Goggles)이나 안면보호대 (Face shield) 기타 연구실별 위해성 평가에 따른 개인보호장비 5 준비된 각각의 검체와 음성 및 양성확인용 PCR tube를 Realtime PCR 기기에 꽂는다.. 소독 및 폐기 의심검체, 오염된 실험재료 및 기구 등을 폐기하고자 하는 경우 고압증기멸균 처리 등으로 불활성화하여 폐기하며, 소독을 하고자 하는 경우 70% 에탄올, 0% 표백제 용액을 이용하여 0~30분간 처리 해야함. 9. 오염방지 원심분리기와 실험대 및 피펫은 주기적으로 Bleach용액 (0% 락스)으로 세정 PCR 반응 시 음성대조군 샘플 양성대조군 순서로 반응 양성대조군과 샘플은 분리된 공간에서 PCR mixture tube에 첨가 6 Realtime PCR 기기의 프로그램을 실행시킨다.
0. 시료의 준비 및 저장, 운반 검체종류 Deep nasal swab Transtracheal wash Lung tissue Whole blood in EDTA tube 2 바이러스 수송배지 사용법 : 바이러스 수송배지(VTM) 키트 사용 시 키트 안에 동봉된 RayonTipped Swab봉을 이용하여 환축 인후부를 도말한다. 수송배지가 담겨있는 병에 도말한 봉을 담그고 병마개 부위에서 봉을 부러뜨린 후, 뚜껑을 꼭 잠그도록 한다. 검체가 담긴 병은 곧장 4 냉장고에 보관한다. 3 비강도찰 방법 오른손에 멸균면봉을 잡고 환축의 비강을 면봉으로 360º로 3~4 회 돌려 도찰함. 4 검체 채취 및 수송 시 주의사항 검체채취 시 반드시 개인보호장비를 착용하고 수행함 검체는 파손 및 유출되지 않도록 수송 용기에 단계별로 포장하여 이송함 (기본적으로 3단계 포장이 권고됨) 4 를 유지하여 빠른 시간 내 (가급적 24 시간이내 도착) 검체와 의뢰서를 실험기관으로 송부함 개인보호장비 (D급) : 개인보호복, N95마스크, 장갑, 보안경, 보호덧신 호흡기 검체 채취 후 24~4시간 이내에 수송이 어려운 경우 4 보관 후, 보냉제를 넣어 운송함. 만약 그렇지 못한 경우 70 에서 보관함 얼음이나 냉매가 검체에 바로 닿아 얼지 않도록 주의함 5 검사 부적합 검체 아래사항에 해당될 경우 검사 수행 불가능 역학 및 임상진단 기준에 적합하지 않은 검체 검체 채취 시기가 적절하지 않은 검체 수송 온도 및 수송 용기가 적절하지 않은 검체 용기 파손 및 내용물이 유출된 검체 적절한 수송배지를 사용하지 않은 검체 (예, 세균 배양용 고체 배지) Technical Tip 부러뜨릴 때 안쪽에 손이 닿아 오염되지 않게 주의한다. 고위험 병원체 보존 및 안전 관리메뉴얼 참조. RNA 추출 ) 실험전 유의사항 RNA 추출은 Viral RNA 추출전용 키트를 사용해야 하며, 각 제조사 의 지시사항에 따라 Viral RNA를 추출해야 합니다. 본 키트는 Viral Genespin Viral DNA/RNA Extraction Kit (intron, 75) 를 이용한 Viral RNA 추출 방법을 설명하였습니다. RNA 추출 시에는 반드시 실험용 장갑을 착용하시고 실험하시기 바랍니다. 맨손으로 실험하실 경우 RNA 분해가 일어날 수 있습니 다. 검체를 넣어주기 전에 충분히 Vortex하여 주시기 바라며, 점액성 분이 잘 풀어지지 않을 경우에는 PBS를 넣어 현탁한 뒤 후속 실험 을 진행하시기 바랍니다. Manual방법에 의해 RNA 추출 시 실험오차를 고려하여 2인이 각각 하나씩 추출 하십시오. 모든 원심분리는 실온에서 실시 하십시오. 검체 (바이러스 수송배지)로 부터 RNA 추출을 위한 검체 분주부 터lysis buffer 반응까지는 반드시 생물안전작업대 (Biological Safety Cabinet)에서 수행 하십시오. 잔여 원검체는 70 에서 보관 하십시오. 2) Viral RNA 추출방법 샘플 50μl를.5ml tube에 넣는다. 2 250μl의 Lysis Buffer를 첨가한 후, 5초간 Vortex 한다. 3 실온(5~20 )에서 0분간 정치한다. 4 350μl의 Binding Buffer를 첨가한 후, vortex하여 완전히 혼합시켜 준 다. 5 00μl의 시료를 column에 넣은 후, 3,000rpm에서 분간 원심분리 한다. Column의 최대 수용량이 50 μl 이므로 샘플량이 많을 경우 2회 에 나누어서 원심분리한다. 6 Collection tube에 빠져나온 용액을 버리고 Column에 조립한다. 7 500μl의 Washing Buffer A를 첨가한 후, 3,000rpm에서 분간 원심분 리한다. Collection tube에 빠져나온 용액을 버리고 Column에 조립한다. 9 500μl의 Washing Buffer B를 첨가한 후, 3,000rpm에서 분간 원심분 리한다. 0 Collection tube에 빠져나온 용액을 버리고 Column에 조립한 후, membrane에 잔류하는 에탄올을 완전히 제거하기 위해 3,000rpm 에서 분간 원심분리한다. Collection tube를 버리고 Column을 새로운.5ml tube에 조립한다. 2 30~50μl의 Elution Buffer를 membrane에 직접닿도록 첨가한다. 3 분간 원심분리(3,000rpm) 하여 RNA를 elution한다. Technical Tip 샘플이 300μl 이하일 경우에는 DEPC 처리된 증류수로 300μl를 맞춰준다. Lysis Buffer 겨울철이나 낮은 온도에서 Lysis Buffer를 보관한 경우 침전물이 발 생하게 되는데, 이때에는 그대로 사용하지 마시고, 0 정도의 중탕 또는 Incubater 를 이용하여 가열하 면서 가끔씩 흔들어 주면서 침전물 을 완전히 녹인 후, 사용하십시오. Washing Buffer B 사용하기 전 96~00% 에탄올 40ml 을 첨가하여 잘 혼합 한 후, 사용하 십시오. 제품정보 9 0