해부. 생물인류학제 3 권제 4 호 Anat Biol Anthropol Vol. 3, No. 4 (9) pp. 4~49 https://doi.org/.637/aba.9.3.4.4 Original Article 전사유전자의이온수송체유전자조절기전 조혜정, 안규윤 전남대학교의과대학해부학교실 Regulatory Pathway of Ion-Transporter Genes through Transcription Factor in Hypokalemic Condition Hye Jung Cho, Kyu Youn Ahn Department of Anatomy, Chonnam National University Medical School Abstract : The Nuclear factor-erythroid--related factor () plays a key role in the cellular defense against oxidative stress. Low K + increased the reactive oxygen species and it stimulate activation. Previous our study demonstrated that low potassium promoted expression of H/K-ATPase and knbc by transcription factor in cultured models. In addition, phosphorylation of ERK, JNK, p38 and PI3K was involved in the activation of expression. This study aims to elucidate the mechanism which low potassium regulates expression through various in vitro and in vivo models. Using various kinase inhibitors, promotion of expression in low potassium condition was inhibited by LY94 and SP65 while PD9859 and SB358 did not affect, suggesting that phosphorylation of Akt and JNK is specifically involved in expression in low potassium condition. Kidney tissues from low potassium diet rats showed increased phospho-erk/ and phospho-akt in diet time dependent manner but no effect to JNK and p38 phosphorylation. Specifically, Phospho- was also increased in nuclear compartment by low potassium diet. In order to demonstrate direct evidence that low potassium regulates ionic transporters by, knockout mice were employed. Mouse embryonic fibroblasts (MEF) were harvested for the study. As expected, low potassium promotes expression of and level of phospho-erk/ and phospho-akt in MEF- ( +/ +). Low potassium promoted expression of knbc and H/K-ATPase in MEF- (+/+), but unchanged or even decreased in MEF- (+/-) and MEF- (-/-). Taken together, these results show that was activated by ERK/ and AKT in low potassium condition and further regulates expression of knbc and colonic H/K-ATPase. Keywords : Hypokaiemic condition, Akt, p-akt, ERK/, p-erk/, MEF- wild-type ( +/+) cell line, MEF- Hetero ( +/-) cell line, MEF- knock-out (-/-) cell line 저자 ( 들 ) 는 의학논문출판윤리가이드라인 을준수합니다. 저자 ( 들 ) 는이연구와관련하여이해관계가없음을밝힙니다. Received: Octobert, 9; Revised: November 5, 9; Accepted: December, 9 Correspondence to: 안규윤 ( 전남대학교의과대학해부학교실 ) E-mail: kyahn@jnu.ac.kr 서론 정상상태에서 K + 배설의 9% 는신장집합관을지나면서 K + 가분비되어이루어지고, 이과정은알도스테론과 Na + 의이동에의해조절되면서체내 K + 균형이유지된다고한다 [,]. 저칼륨혈증신장에서 H/K-ATPase, Na/K-ATPase 및 c 9 Korean Association of Physical Anthropologists This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/ licenses/by-nc/3.) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. ISSN 67-566X (Online) ISSN 67-565 (Print)
4 조혜정, 안규윤 NBC- 등이온수송체발현의증가 [3-6] 와 mrna와단백발현이증가함을보고 [7] 하였고 가 NBC-, colonic H/K-ATPase 및 Na/K-ATPase α3 이온수송체의조절에관여한다는 promotor 연구 [8] 로 K + 평형조절에이온수송체나 전사유전자를포함한많은유전자가관여할것으로생각하였다. 칼륨결핍은대사성알칼리증을야기시키는데이의유지는 NBC-의활성에의해 HCO3 - 재흡수가증가하기때문이라하였고 [] 여기에 K + 농도를유지하는데 H/K-AT- Pase가관여하는데위나대장에서클로링되어각각 gastric H/K-ATPase나 colonic H/K-ATPase로명명되었다. 는 Cap-N-Collar (CNC) 계열의 basic region-leucine zipper (b-zip) 전사조절인자로서, erythroid-derived CNC homology protein (ECH) 라고불리기도하고, 또한다양한자극에대해반응하는 redox 감수성인자로서항산화와생체방어에관여하는유전자발현을조절하기도한다 [7,9-]. 세포가외부로부터자극을인지하여 를촉진하여항산화나 phase II 해독화효소의합성을유도하는지는알려져있지않지만세포내에서신호전달에의미있는역할을하는 mitogen-activated protein kinases (ERK, p38 MAPK, JNK) 를비롯한 Akt 및 PKC 등과같은키나아제에의해 의 Serine과 Threonine 기의인산화를통해서 가 Keap과분리된후핵으로의이동과 Antioxidant Response Element 결합을용이하게한다는가능성도제시되고있다 [7,-5]. 또한 Lim과 Ahn [7] 은 의인산화와는별개로세포내산화-환원시스템을방해하여산화-환원시스템에관여하는전사인자들특히 -Keap 복합체의 Cysteine-SH가산화됨으로써 -Keap 구조가바뀌고이로인해 가떨어져나와항산화를유도할것으로보고하였다. 저칼륨상태에서활성산소종의양이증가되고 [6,7], 증가된활성산소종은 의핵내이동을촉진한다고보고 [4,8] 한바있어저칼륨혈증신장에서 를활성화시키는인산화효소에대해알아보는것도흥미로울것으로생각된다. 본연구는 전사유전자가어떤인산화효소에의해활성화되는지 ex vivo 세포배양실험및 in vivo 동물실험을통해구명하고자하였다. 저칼륨배양조건에서 CV-, 93T 및 MEF 세포주를배양한후 mrna와단백을추출하여 RT- PCR 및 Western 분석을시행하였고, 칼륨제한식이신장에서는단백을추출하여 Western 분석으로 나이온수송체들을정량화하였다. 재료및방법. 실험동물본실험에사용된동물은앞선연구자들 [,5,6,5] 의방 법에따라체중 3 g 내외의성숙 Sprague-Dawley계수컷흰쥐 3마리로다섯군으로구분하였다. 제군은정상식이 (5 meq K + /kg, TD888, Harlan Teklad, U.S.A.) 를, 제군은칼륨제한식이 (potassium-free diet, TD888, Harlan Teklad, U.S.A.) 3일, 제3군은칼륨제한식이 주, 제4군은칼륨제한식이 주, 제5군은칼륨제한식이 3주로식이적응을시켰다. 칼륨제한식이군은먹이섭취가변화될것으로여겨져날마다적은양을먹은군의양으로먹이를조절하였다 [].. 저칼륨상태에서세포배양과 transfection HEK 93T와 CV- 세포주는 ATCC 제조회사 (ATCC, Manassas, VA, USA) 에서구입하였다. 각각의세포주는 Lee 등 [8] 방법을따라실험을행하였다. 즉, 이들세포주는 U/mL penicillin, μg/ml streptomysin과 % fetal bovine 혈청이포함된고포도당 Dulbecco s modified Eagle s 배양액 (DMEM, Gibco, Gaithersburg, MD, USA) 을사용하여 5% CO 와 37 온도를유지하여세포배양기에서배양하였다. 세포는 3분간 trypsin에처치후추출하였다. 다양한인산화억제제 {LY94 (PI3K inhibitor), μm; PD9859 (MAPK inhibitor), μm; SB358 (p38 MAPK inhibitor), μm; SP65 (JNK inhibitor), μm} 를처치한후 시간동안배양하였다. MEF (mouse embryonic fibroblast)- wild-type (+/+), MEF- Hetero (+/-) 및 MEF- knock-out (-/-) 세포주는서영준교수 ( 서울대학교약학대학 ) 가제공해주었다. 최적의저칼륨배양조건을찾기위해 K의농도를 5.4,.7,,.3. mm에서배양하였으며 K 농도가.7 mm일때가장높은효과를나타냈었다 [8]. 3. 총 RNA 분리와 RT-PCR 분석 RNA는배양된 MEF 세포주로부터 Trizol 용액 (Invitrogen, USA) 을이용하여추출하였고 RT-PCR 분석을위해서는 Invitrogen One step III TM Reverse Transcription PCR kit (Invitrogen, USA) 를이용하였다. PCR 조건은 95 에서 5 분 ; 95 에서 3초, 58 에서 3초, 7 에서 3초로 4회 ; 7 에서 분이었다. 사용된 PCR primer 순서 (5ʹ to 3ʹ) 는 m (F): GCG ACG GAA AGA GTA TGA GC, (R) GTT GGC AGA TCC ACT GGT TT; knbc (F): CAC TGA AAA TGT GGA AGG GAA G, (R): GAC CGA AGG TTG GAT TTC TTG; Colonic H/K (F): GTC GAG CTG GCA GAC CAG AAA GAT, (R): TGC ACC TAT CCA CAG AAG GAT GGA, (F): AGA GCA TAG CCC TCG
전사유전자의이온수송체유전자조절기전 43 TAG AT, (R): CCC AGA GCA AGA GAG GTA TC였다. PCR 산물은 % agarose 겔에전기영동시키고 cyber green 염색을이용하여관찰하였다. 각각은 으로비교정량화하였다. 4. 단백분리와 Western 분석칼륨제한식이기간별로신장조직을적출하여급속동결시킨후, 조직의일부를 Nonidet P-4 buffer (5 mm NaCl, mm benzamidine, 5 mm Tris ph 8., Trypsin inhibitor μg/ml, 5 mm EDTA ph 8., mm PMSF, NP-4 %) 에넣고분쇄하여균질액을만들었다. 균질액은상층액을분리한다음 3, rpm으로 분간원심분리하고상층액은세포질추출단백으로, 중간층침전물은핵추출단백으로사용하기위해완충액으로녹인다음 -7 에보관하였다. 세포배양에서얻은세포 pellet은 RIPA 완충액 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 으로분해하고단백을추출하였다. 추출한총단백 3~ μg을 8% polyacrylamide gel에전기영동한다음 nitrocellulose membrane에 4 에서 ma로 시간전이하였다. Membrane은 TBS-T buffer ( mm Tris, 5 mm NaCl, M HCl, ph 7.6,.% Tween ) 에 5% skim milk가첨가된 blocking buffer에실온에서 시간동안처리한후 차항체 (Santa Cruz, USA), ERK/, Akt, JNK, p38, phospho-erk/ (p-erk/), phospho-akt (p-akt), phospho-p38 (p-p38) polyclonal antibody (Cell Signaling Technology, USA), phospho-jnk (p-jnk, BD Transduction Laboratories, USA) phospho- monoclonal antibody (Epitomics, USA), (: ; Millipore, USA) 에 4 에서 4시간반응시켰다. 다시 TBS-T로 분씩 3번수세하고 peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG (Santa Cruz, USA :,) 로부치하였다. TBS-T로 3번수세하고발색제인 ECL 용액 (Amersham, USA) 에 5분간반응시킨후시간별로현상하였고 densitometry로정량화하였다. 결과 저칼륨배양조건에서다양한인산화효소억제제 (LY94, SP65, PD9859, SB358) 를 93T 세포주에처리하고단백을추출하여 Western 분석으로정량화하였다. 저칼륨배양조건에서증가된 의발현량이 LY94 와 SP65로처리했을때 5% 이상감소하는것을관찰할수있었으나 PD9859와 SB358로처리했을때는거의변화가없었다 (Fig. ). 이는 전사유전자활성화에 Akt와 JNK 인산화효소가관여할가능성을시사하는소견이 었다. 칼륨제한식이신장조직에서 단백은세포질이나핵에서칼륨제한식이가길어질수록증가하였다. p- 발현은세포질에서는관찰되지않았으나핵에서는칼륨제한식이 3일째에발현되기시작하여 주째에최고조의발현을보였고 3주째에서도관찰되었다. 이는칼륨제한식이가길어질수록핵으로많이축적됨을알수있었다 (Fig. a, b). ERK/의발현은칼륨제한식이기간에따른변화는차이가거의없었으나 p-erk/의발현은칼륨제한식이가길어질수록증가하는경향이었고특히, 3주에최고의발현을보였다. Akt와 p-akt의발현은칼륨제한식이 주에서발현이증가하기시작하여칼륨제한식이가길어질수록증가하였다. JNK와 p38의발현은칼륨제한식이에따른변화는차이가거의없었으나 p-jnk와 p-p38의발현은거의발현이되지않았고칼륨식이변화에따른차이도없었다 (Fig. 3a). CV- 과 MEF 세포주에저칼륨상태로배양한후단백을추출하여 Western 분석한결과 CV- 세포주에서 p-akt의발현은 분에시작하여 3시간까지지속되며, p-erk/의발현은 5분에서증가하기시작하여 3분까지지속되었다 (Fig. 3b). MEF 세포주에서 p-akt 의발현은 분에증가하기시작하여 3시간까지지속되며, p-erk/의발현은 3분에서증가하기시작하여 3분까지지속되었다 (Fig. 3c). 이는세포주에따라약간의차이는있지만저칼륨상태에서 p-erk/의발현이먼저시작하고 p-akt의발현이후에시작하는것으로보아 발현조절이 ERK/가먼저시작하고그후에 Akt가관여할것으로생각되었다. 93T, CV- 세포주뿐만아니라 MEF 세포주에서도저칼륨배양시 를활성화시키는지확인하기위해다양한저칼륨배양조건으로 RT-PCR 실험을수행하였다. Fig. 4a, 4b에서보여주듯이.7 mm의저칼륨배양조건에서 의활성이최고조로발현되는것을확인하였다. 또한.7 mm의저칼륨배양조건에다양한시간대별로 및이온수송체들의 mrna 발현을확인한결과정상대비저칼륨배양조건에서, knbc 및 colonic H/K mrna 발현이증가함을관찰하였다 (Fig. 4c, 4d, 4e 및 4f). 저칼륨상태 MEF 세포주에서 가 ion transporter 의발현증가와관련이있는지조사하기위해 MEF- wild-type ( +/ +), MEF- Hetero ( +/ -), MEF- knock-out ( -/-) 세포주에서얻은 mrna로 RT-PCR 실험을수행하여 와 knbc, colonic H/K의 mrna 발현을확인하였다. 저칼륨배양조건에서 MEF- wildtype (+/+) 의 발현이증가하였지만 MEF- Hetero ( +/ -) 세포주에서는감소하였고, MEF- knock-
44 조혜정, 안규윤 Low K+.7 mm Normal None LY PD SB SP Inhibitors None LY94 PD9859 SB358 SP65 Low K+.7 mm Normal 5 3 LY (μm) LY94 Normal μm 5 μm μm μm 3 μm (c) Low K+.7 mm Normal 3 SP (μm) SP65 Normal μm μm μm 3 μm Fig.. Akt and JNK specific inhibitors block low-potassium stimulated activation. 93T cells were treated with indicated pharmacological inhibitors in the normal or low potassium media for h (LY94, μm; PD9859, μm; SB358, μm; SP65, μm). Cells were lysed, and Western blotting was performed using anti- antibodies., (c) Cells were treated with indicated concentration of LY94 or SP65 for h. Cells were lysed, and Western blotting was performed using anti- antibodies. P- Normal LK 3D LK W LK W LK 3W Nucleus out (-/-) 세포주에서는발현이되지않음을확인하였다. knbc와 colonic H/K의 mrna발현역시저칼륨상태 MEF- wild-type ( +/ +) 세포주에서는증가하였으나 MEF- Hetero ( +/-) 세포주와 MEF- knock-out ( -/ -) 세포주에서는억제되었음을관찰하였다 (Fig. 5a, 5b) P- Rb Normal LK 3D LK W LK W LK 3W Cytoplasm Fig.. P- accumulates in the nucleus following low K + stimulation. Western blot analysis reveal that the accumulation of p- and protein from nuclear extract increased in the rat kidney according to potassium depleted diet. In cytoplasm extract, the abundance of protein increased but p- protein was undetected. 고찰 본연구는저칼륨상태에서어떤인산화효소가 활성화에관여하는지, 그리고활성화된 가이온수송체의발현에영향을미치는지를알아보고자정상및칼륨제한식이흰쥐신장과 CV-, 93T 및 MEF 세포주를정상및저칼륨상태에서배양하여각각 RT-PCR 과 Western 분석으로정량화하여 전사유전자의기전을규명한것이다. 본연구에서 LY94, SP65, PD9859, SB358 인산화효소억제제를저칼륨배양
전사유전자의이온수송체유전자조절기전 45 (c) P-ERK/ ERK/ P-Akt Akt P-JNK JNK P-p38 p38 P-AKT AKT P-ERK/ ERK/ P-AKT AKT P-ERK/ ERK/ Normal Normal LK 3D LK W LK W LK 3W CV- cell line : Low K+ (.7 mm) 3 5 7 3 min 3 hr MEF cell line : Low K+ (.7 mm) 3 5 3 min 3 hr Fig. 3. Effect of low K + on phosphorylation of ERK/ and Akt in rat kidney, CV- cell and MEF cell. Expression levels of both phosphorylated and total ERK/, Akt, JNK and p38 were measured by western blot analysis in the kidney of potassium depleted rats. A transient increase in the phosphorylation of ERK/ and Akt was observed in potassium depleted rat kidney, whereas the phosphorylation of JNK and p38 did not changed. CV- cells exposed to normal or low potassium media for indicated time periods and harvested in protein lysis buffer. Western blotting was performed using specific antibodies. In low potassium condition, stimulated phosphorylation of ERK/ as early as 5 min, and this increase persisted through 3 min. The activation of Akt was observed at 3 min, and this activation persisted through 4 h. (c) MEF cells stimulated phosphorylation of ERK/ as early as 3 min, and this increase persisted through 3 min. The activation of Akt was observed at min, and this activation persisted through 3 h. 조건에서 93T 세포주에처리하고 Western 분석하였더니 저칼륨배양조건에서증가된 의발현량이 LY94 와 SP65로처리했을때 5% 이상감소함을관찰할수있었으나 PD9859와 SB358로처리했을때는변화가없었고, 칼륨제한식이신장조직에서는 ERK/와 Akt 의활성화된형태인 phospho-erk/, phospho-akt의발현이칼륨제한식이가길어질수록증가하였고 JNK와 p38 의활성은변화가없었다. 이와같은소견은 PI3K/Akt 및 MARK/ERK 신호전달경로는다양한성장인자및조절인자에의해활성화되며, 이로인해세포성장, 역전사, 번역, 세포증식, 이동및세포주기를조절하는중요한역할을하며이러한 kinase는신장조직에서도다양한세포작용과연관성이있다는보고 [,9-] 와, 의인산화활성조절요인으로 MAPK, protein kinase C, PI3K 등이작용하고활성산소종을생성하는약물들에의해유도된산화적스트레스는 MAPK 신호전달계의활성화를초래한다는보고 [] 를감안하면 전사유전자활성화에 Akt와 JNK 인산화효소가관여함을시사하는소견이며저칼륨혈증시신장 Akt와 p-akt 및 ERK와 p-erk의단백발현변화 [] 가이온수송체유전자조절뿐만아니라세포내신호전달에있어중요한역할을할것으로생각되었다. 일반적으로 는세포내에서불안정한상태로존재하지만, 세포에산화적, 전자친화적인스트레스가가해지면안정화되는단백질로서 NAD (P)H-quinone oxidoreductase (NQO), glutathione S-transferase (GSTs), glutamate cysteine ligase (GCL), heme oxygenase (HO-) 과같은세포방어유전자들의발현량을조절한다고한다 []. 본연구에서는저칼륨상태동안 에의한이온수송체들의조절기전을조사하였고, 저칼륨상태동안 의발현량증가는이온수송체들의활성에 가중요한역할을할것이라는가능성을새롭게제시하였다. 저칼륨상태동안이온수송체의조절에대한 의중요성에관한두가지가능성이있다. 첫째, 이전연구들 [3-8] 에의하면저칼륨상태에서는 ROS의생성이증가되고, 증가된 ROS 는 의방출과핵으로의이동을촉진한다고보고한결과를토대로본연구에서도 ROS의생성을측정할수는없었지만정상식이신장세포질에서발현되지않은 p- 가칼륨제한식이핵에서 p-를관찰할수있어 (Fig. a), 핵으로이동된 p-로인해다양한이온수송체들이조절받을가능성을제시하는바이다. 이는저칼륨상태에서 ROS의생성이유도되고 ROS의과도생성은대부분세포비대와세포분열에관여하는다양한유전자들의발현을매개하는중요한신호전달기전이라는사실을뒷받침해주고있다. 둘째, 에의한이온수송체들의조절은이온수송체유전자들간에약간의차이점이있어보인다. Lee 등 [8] 은세포주에저칼륨상태를처리했을때 와
46 조혜정, 안규윤 (c) m m MEF-WT hr 5.4.7.5 mm Control Low K+ (.7 mm) 4 48 hr 3 6 4 48 hr.8.6.4..8.6.4. 5.4 mm.7 mm mm.5 mm mm κnbc (c-terminal) Colonic H/K (d) (e) (f) m knbc Colonic H/K.5.5.5 4 hr 3 hr 6 hr hr 4 hr 48 hr Control Low K+ (.7 mm).8.6.4..8.6.4. 4 hr 3 hr 6 hr hr 4 hr 48 hr 4 hr 3 hr 6 hr hr 4 hr 48 hr Control Low K+ (.7 mm) Fig. 4. Low-potassium Enhances gene in MEF cells. (a, b) MEF cells were treated with low potassium media, total RNA was extracted, and mrna expression was analyzed by RT-PCR. expression was measured with various concentrations of low potassium at h (control 5.4 mm; low potassium.7 mm, mm,.5 mm, mm). The expression levels of are up-regulated during low potassuim at.7 mm. (c) Expression of, knbc and colonic H/K at various time periods in.7 mm low potassium conditions. (d~f) Densitometric analysis of mrna expression levels of, knbc and colonic H/K. 3.5.5.5 Control Low K+ (.7 mm) 이온수송체들의발현이급격하게증가되는것을관찰하였고전사인자억제유전자 (dominant-negative ) 를과다발현시켰을때저칼륨상태에서매개된이온수송체들의발현이완전히억제되는것을확인하였으나 ChIP assay 실험을통해 와이온수송체인 colonic H/K-ATPase와 knbc 간의서로다른결합이이루어짐을밝혔다. 이는 가직접적으로 knbc의프로모터영역에결합하지만, colonic H/K-ATPase의프로모터영역에는직접적으로결합하지않음을보여주었다. colonic H/K-ATPase 유전자의 5ʹ-flanking 영역에 개의 결합사이트가있음에도불구하고, 이두개의사이트는전사시작사이트로부터약 5 kb 내에위치하고있다. 오히려, 전사시작사이트의가까운영역에는몇개의 Sp과 Sp가결합할수있는서열로추정되는 GC-rich 뉴클레오타이드가있고, ChIP assay 결과이온수송체의프로모터영역에 Sp과 Sp가직접적으로결합한다는것을보여주었다. 사실, 산화적혹은전자친화적스트레스에노출되었을때 -c-jun 복합체는 PKC 에의해인산화가되어지고, 핵으로이동된다. Sp 역시스트레스신호가왔을때 c-jun과복합체를형성하고표적유전자의활성화가 c-jun을끌어당기는 anchor 단백질로서의역할을한다고한다. 이러한증거들을토대로 -Sp 복합체가저칼륨상태동안표적유전자를활성화시킬수
전사유전자의이온수송체유전자조절기전 47 Con Low K+ (.7 mm) 4 hr Con Low K+ (.7 mm) 48 hr WT WT Hetero K/O WT WT Hetero K/O m κnbc (c-terminal) Colonic H/K.5 m knbc Colonic H/K.5.5.5 4 hr 4 hr.5 4 hr.5 48 hr.5 48 hr.5 48 hr Con Low K (.7 mm) Con Low K (.7 mm) Con Low K (.7 mm) Fig. 5. Effect of low K + on expression in (-/-) MEF cell. MEF cells of each genotype were incubated in low potassium (.7 mm) media for 4 and 48 hr. Densitometric analysis of mrna expression levels of, knbc and colonic H/K in MEF cells during pretreatment with low potassium. Low potassium promoted expression of, knbc and colonic H/K-ATPasein MEF- (+/+), but unchanged or even decreased in MEF- (+/-) and MEF- (-/-). 있을것으로생각되었다. 가 ion transporter들의발현에직접또는간접적으로영향을미치는가는 Lee 등 [8] 이 93T와 CV- 세포주를저칼륨조건으로배양후각각의이온수송체 mrna 발현변화를 RT-PCR을통해 knbc, colonic H/K-ATPase, 및 Na/K-ATPase α3가증가함을관찰하였고, dominant-negative 처리때는다시감소함을보고하였다. 본연구에서도 93T, CV- 세포주뿐만아니라 MEF 세포주에서도저칼륨배양시 를활성화시키는지확인하기위해다양한저칼륨배양조건으로 RT-PCR 실험을수행하였다. Lee 등 [8] 이확인하였던결과와같이.7 mm의저칼륨배양조건에서 의활성이증가하는것을확인하였고또한.7 mm의저칼륨배양조건에다양한시간대별로 및이온수송체의 mrna 발현을확인한결과정상조건대비저칼륨배양조건에서 및 knbc, colonic H/ K의 mrna 발현이증가함을관찰하였다. 저칼륨조건에서 가이온수송체의발현증가와관련이있는지조사하기위해 MEF- wild-type ( +/+), MEF- Hetero ( +/-), MEF- knock-out (-/-) MEF 세포주를배양하였다. 저칼륨배양조건에서 MEF- wild-type (+/+) 의 발현이증가하였지만 MEF- Hetero ( +/-) 세포주에서는감소하였고, MEF- knock-out (-/-) 세포주에서는발현이되지않음을확인하였다. knbc, colonic H/K의 mrna 발현역시 MEF- wild-type ( +/+) 에서저칼륨배양하였을때 발현이증가하였으나 MEF- Hetero (+/-) 와 MEF- knock-out (-/-) 세포주에서는 발현이억제되었음을관찰하였다. 이상의결과로저칼륨상태에서 는 ERK/와 Akt 에의해활성화되고, 활성화된 는 knbc과 colonic H/K-ATPase 유전자의전사를조절할것으로추측하였다. 추후 knock out 생쥐를제작하여 downstream target 유전자군을확보하고이들유전자의발현변동여부및관련표현형을분석한다면 K + 평형에관련된유전자의발현을조절하는전사나전사후기전을밝힐수있을뿐만아니라선택된유전자들의기능과생체조절에관한정보와신장에서 K + 분비에관한연구에기초를제공해줄것이
48 조혜정, 안규윤 다. 더나아가 K + 평형은신장외소화관에서도조절되기 때문에많은세포형에있어서이들유전자의기능과생체조절의이해에도움이될것으로생각된다. 사 MEF (mouse embryonic fibroblast)- wild-type ( +/+), MEF- Hetero ( +/-) 및 MEF- knock-out (-/-) 세포주는서영준교수 ( 서울대학교약학대학 ) 가제공해주셨습니다. 감사드립니다. 사 REFERENCES. Giebisch G. Renal potassium transport: mechanisms and regulation. Am J Physiol. 998;74:F87-33.. Bae CS, Cho HJ, Ahn KY. Alteration of Akt, p-akt, ERK, and p-erk proteins expression in the kidney of hypokalemic rat. Korean J Phys Anthropol. 7;3:87-98. Korean 3. Ahn KY, Turner PB, Madsen KM, Kone BC. Effect of chronic hypokalemia on renal expression of the gene encoding the gastric H(+)-K(+)-ATPase alpha-subunit. Am J Physiol. 996;7:F557-66. 4. Ahn KY, Park KW, Kim KK, Kone BC. Chronic hypokalemia enhances expression of the H( +)-K( +)-ATPase α alpha -subunit gene in renal medulla. Am J Physiol. 996;7:F34-. 5. Ahn KY, Kim SC, Moon B, Kim KK, Kim BY. Renal adaptive responses of Na-K-ATPase subunit isoforms to chronic hypokalemia. The Korean J Anat. 998;3:45-8. Korean 6. Kim JH, Cho HJ, Bae MO, Park JJ, Ahn KY. Regulation of biocarbonate ions hypokalemic rat kidney. Korean J Anat. 4;37:337-45. Korean 7. Lim JS, Ahn KY. Expression of transcription factor in rat kidney. Korean J Nephrol. ;3:39-45. Korean 8. Lee CB, Lee YS, Lee JY, Lee SE, Ahn KY. and Sp synergistically enhance the expression of ion transporters in potassium-depleted conditions. J Nephrol. ;5:5-3. 9. Moi P, Chan K, Asunis I, Cao A, Kan YW. Isolation of NF-E-related factor (), a NF-E-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF- E/AP repeat of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 994;9:996-3.. Itoh K, Igarashi K, Hayashi N, Nishizawa M, Yamamoto M. Cloning and characterization of a novel erythroid cell-derived CNC family transcription factor heterodimerizing with the small Maf family proteins. Mol Cell Biol. 995;5:484-93.. Liu M, Grigoryev DN, Crow MT, Haas M, Yamamoto M, Reddy SP, et al. Transcription factor is protective during ischemic and nephrotoxic acute kidney injury in mice. Kidney Int. 9;76:77-85.. Yu R, Chen C, Mo YY, Hebbar V, Owuor ED, Tan TH, et al. Activation of mitogen-activated protein kinase pathways induces antioxidant response element-mediated gene expression via a -dependent mechanism. J Biol Chem. ;75:3997-3. 3. Motohashi H, Yamamoto M. -Keap defines a physiologically important stress response mechanism. Trends Mole Med. 4;:549-57. 4. Shen G, Jeong WS, Hu R, Kong AN. Regulation of, NF-kappaB, and AP- signaling pathways by chemopreventive agents. Antioxid Redox Signal. 5;7:648-63. 5. Cho HJ, Ahn KY. Alteration of and p- proteins expression in hypokalemic rat kidney. Korean J Phys Anthropol. 5;8:55-6. Korean 6. Zhou X, Yin W, Doi SQ, Robinson SW, Takeyasu K, Fan X. Stimulation of Na, K-ATPase by low potassium requires reactive oxygen species. Am J Physiol Cell Physiol. 3;85:C39-6. 7. Babilonia E, Wei Y, Sterling H, Kaminski P, Wolin M, Wang WH. Superoxide anions are involved in mediating the effect of low K intake on c-src expression and renal K secretion in the cortical collecting duct. J Biol Chem. 5;8:79-6. 8. Deplancke B, Gaskins HR. Redox control of the transsulfuration and glutathione biosynthesis pathways. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. ;5:85-9. 9. Kwon T, Kwon DY, Chun J, Kim JH, Kang SS. Akt protein kinase inhibits Rac-GTP binding through phosphorylation at serine 7 of Rac. J Biol Chem. ;75:43-8.. Vivanco I, Sawyers CL. The phosphatidylinositol 3-kinase AKT pathway in human cancer. Nat Rev Cancer. ;:489-5.. Osaki M, Oshimura M, Ito H. PI3K-Akt pathway: its functions and alterations in human cancer. Apoptosis. 4;9:667-76.. Jaiswal AK. signaling in coordinated activation of antioxidant gene expression. Free Radic Biol Med. 4;36: 99-7.
전사유전자의이온수송체유전자조절기전 49 간추림 : 저칼륨상태에서활성산소종의양이증가되고, 증가된활성산소종은 의핵내이동을촉진한다고하 고, 활성화는 extracellular-regulated kinase (ERK), Jun N-terminal kinase (JNK), p38 과 phosphatidyl-inositol 3-kinase (PI3K) 라는인산화효소가작용하는것으로알려져있다. 본연구는저칼륨상태에서어떤인산화효소가 활성화에관여하는지, 그리고활성화된 가이온수송체의발현에관련이있는지알아보고자정상및칼륨제한식이흰쥐신장과 CV-, 93T 및 MEF (mouse embryonic fibroblast) 세포주를정상및저칼륨상태에서배양하여 각각 RT-PCR 과 Western 분석으로정량화하였다. 저칼륨배양조건에서증가된 의발현량이 LY94 와 SP65 로처리하였을때감소하는것을관찰할수있 었으나 PD9859 와 SB358 로처리하였을때는변화가없었다. 이는 전사유전자활성화에 Akt 와 JNK 인산 화효소가관여할가능성을시사하였다. 칼륨제한식이신장조직에서는 ERK/ 와 Akt 의활성화된형태인 phospho- ERK/, phospho-akt 의발현이칼륨제한식이가길어질수록증가하였고 JNK 와 p38 의활성은변화가없었다. 저칼륨상태 CV- 세포주에서는 phospho-erk/, phospho-akt 의발현이증가함을확인하였다. 또한 phospho- 가칼륨 제한식이가길어질수록핵으로많이축적됨을알수있었다. 저칼륨배양조건 MEF- wild-type ( +/+) 세포주에 서는 발현이증가하였지만 MEF- Hetero (+/-) 세포주에서는감소하였고, MEF- knock-out (-/-) 세 포주에서는발현이되지않음을확인하였다. knbc 과 colonic H/K 의 mrna 발현역시저칼륨배양조건 MEF- wild-type (+/+) 세포주에서는증가하였으나 MEF- Hetero (+/-) 와 MEF- knock-out (-/-) 세포주에서는억제되었음을관찰하였다. 이상의결과로저칼륨상태에서 는 ERK/ 와 Akt 에의해활성화되고, 활성화된 는 knbc 과 colonic H/ K-ATPase 유전자의전사를조절할것으로추측하였다. 찾아보기낱말 : 저칼륨상태, Akt, p-akt, ERK/, p-erk/, MEF- wild-type (+/+) 세포주, MEF- Hetero ( +/-) 세포주, MEF- knock-out (-/-) 세포주