대한진단검사의학회지제 9 권제 호 9 Korean J Lab Med 9;9:33-7 DOI.333/kjlm.9.9..33 Original Article Diagnostic Immunology 두가지자동화 Rapid Plasma Reagin (RPR) 검사와수기법 RPR 검사의정량적검사결과비교 김영식 이제훈 이혜경 김현정 권희정 민기옥 서은주 김수영 가톨릭대학교의과대학진단검사의학교실 병리학교실 Comparison of Quantitative Results among Two Automated Rapid Plasma Reagin (RPR) Assays and a Manual RPR Test Yeong Sic Kim, M.D., Jehoon Lee, M.D., Hae Kyung Lee, M.D., Hyunjung Kim, M.D., Hi Jeong Kwon, M.D., Ki Ouk Min, M.D., Eun Joo Seo, M.D., and Soo-Young Kim, M.D. Departments of Laboratory Medicine and Pathology, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea Background : We compared two automated Rapid Plasma Reagin (RPR) assay kits with a manual RPR assay kit to evaluate the possibility of using the two automated RPR assays as an alternative to the manual RPR assay for a quantitative monitoring. Methods : One hundred eighty-five samples were analyzed, including sera from patients with primary, secondary, and latent syphilis. Measured values of two automated RPR assay kits, (Sekisui Chemical Co., Ltd, Japan) and HBi Auto RPR (HBI Co., Ltd, Korea), were compared with the RPR titers of Macro-Vue RPR card test (Becton Dickinson BD Microbiology systems, USA). As a confirmatory test, Anti-Treponema pallidum EUROLINE WB (IgG) and Anti- Treponema pallidum EUROLINE WB (IgM) (Euroimmun, Germany) were used. Results : There was a prozone effect with at RPR titer (card test) of :, but not with HBi Auto RPR. The R.U. values of the two automated RPR assays did not show proportional increase to the RPR titer. Agreement between manual RPR and two automated RPR assay kits, Mediace RPR assay and HBi Auto RPR assay, were 3.% and 3.%, respectively. Conclusions : The two automated RPR assay kits could not be used as an alternative to manual RPR test for quantitative analysis of RPR titer. As shows a prozone effect at relatively low RPR titer, caution is needed in the interpretation of the measured values. (Korean J Lab Med 9; 9:33-7) Key Words : Rapid Plasma Reagin, RPR titer, Prozone effect 서 론 Received : February 5, 9 Manuscript No : KJLM Revision received : June, 9 Accepted : July, 9 Corresponding author : Soo-Young Kim, M.D. Department of Laboratory Medicine, The Catholic University of Korea, St. Vincent s Hospital, 93-6 Ji-dong, Paldal-gu, Suwon -73, Korea Tel : +-3-9-759, Fax : +-3--676 E-mail : vsykim@catholic.ac.kr 매독검사의경우과거에는 Venereal Disease Research Laboratory (VDRL) 이나 Rapid Plasma Reagin (RPR) card, Treponema Pallidum hemagglutination assay (TPHA) 같은수기법이주로이용되었으나최근에는자동화장비를이용한 RPR 검사법과 Treponema Pallidum antibody 검사법이개발되어조금씩이용되고있다 [-3]. 자동화 Treponema Pallidum 33
3 김영식 이제훈 이혜경외 5 인 antibody 검사의경우정성검사인데비해자동화 RPR 검사의경우는제조회사에의해정량검사로소개되고있어만약이검사방법이정량검사로사용될수있다면보다신속한결과를낼수있고탄력적인인원배치가가능하다는점에서유용하다고하겠다. 일반적으로매독치료후경과는수기법 RPR 역가관찰을통해이루어지는데아직까지수기법 RPR 역가에따라자동화 RPR 검사의정량값이어떻게나타나는지에대한연구는없었다. 본연구자들은자동화 RPR 검사정량값을 RPR 역가와비교해봄으로써자동화 RPR 검사정량값이 RPR 역가와상관성이있는지를알아보고자하였고, 병기별매독환자뿐만아니라다양한질환의환자혈청을대상으로자동화 RPR 검사와수기법 RPR 검사, TPHA 검사사이의결과일치율을알아보고자하였다. 대상및방법. 대상 년 5월부터 월까지가톨릭대학교성빈센트병원진단검사의학과에검사가의뢰된검체중수기법 RPR 검사나 TPHA 검사에서양성이었던검체와진단검사의학과에의뢰된검체중진단명을확인하여류마티스질환또는감염, 임신으로본병원에입원치료중인환자의검체로확인된총 5검체를대상으로하였다. 검체는분주해서 -7 에냉동보관하였고자동화 RPR 및수기법 RPR, VDRL, TPHA, western blot 등각검사를실시할때마다한개씩해동해서검사하였다.. 매독병기별분류기준성기부위또는구인두에경성하감 (chancre) 이관찰되는경우일차매독환자로간주했다. 매독에특징적인피부점막병변을보이는경우이차매독환자로간주했다. 잠복기매독은현재임상증상이나타나지않지만혈청내매독항체가검출되고그리고과거매독치료를받은적이없는경우로정의했다. 모든대상환자는의무기록을조회하여매독병력유무를확인하였고, 매독병력이없고확진검사에서음성인경우매독음성으로간주하였다. 3. 수기법 VDRL, RPR, TPHA 검사 VDRL은 BD VDRL Antigen (Becton Dickinson BD Microbiology systems, Sparks, MD, USA) 을사용하여실시하였고현미경 배배율에서관찰하여응집여부를결정하였다. VDRL 약양성인경우도양성으로간주하였다. 수기법 RPR 검사는 Macro-Vue RPR Card Tests (Becton Dickinson BD Microbiology systems, Sparks, MD, USA) 을사용하여실시하였고육안으로검은색응집덩어리발생여부를결정하였다. TPHA는 TPHA reagents (Asan Pharm. Co., Ltd, Seoul, Korea) 를사용하여실시하였고육안으로혈구응집여부를결정하였다.. 자동화 RPR 검사 HiSens Auto RPR (HBI Co., Ltd, Anyang, Korea) 와 Mediace RPR (Sekisui Chemical Co., Ltd, Tokyo, Japan) 을사용하였다. 두검사모두라텍스입자에 cardiolipin과레시틴을부착시킨것으로매독환자혈청내리아진항체와반응한라텍스입자를비탁법으로검출한다. 두방법모두경계치가. RPR unit (R.U.) 이고, Hisens Auto RPR (HBI Co., Ltd) 의측정범위는 - R.U., (Sekisui Chemical Co., Ltd) 의측정범위는 - R.U. 이다. Hitachi 76 (Hitachi, Tokyo, Japan) 을이용하여제조사의지침에따라검사를시행하였다. 5. 희석배수에따른자동화 RPR 검사정량값과 RPR 역가와의관계수기법 RPR 검사에서 : 이상으로나타난 6검체에대해생리식염수를사용하여단계적으로희석하고각단계별로희석된검체를두가지자동화 RPR 검사로측정해서각희석배수와 R.U. 측청치를그래프로나타냈다. 6. Western blot (Treponema pallidum antibody) 매독확진검사로써매독항체인 IgG와 IgM 존재여부를파악하기위해 Anti-Treponema pallidum EUROLINE WB (Euroimmun, Seekamp, Germany) 을사용하여 western blot을실시하였다. Anti-Treponema pallidum EUROLINE WB (Euroimmun) 은네가지매독항원 (TpN5, TpN7, tmpa, TpN7) 에대한항체를특이적으로검출할수있는데, 네가지항체가모두존재하는표준검체의결과와비교해서동일한위치에밴드가하나라도나타나면양성, 밴드가하나도나타나지않으면음성으로판독한다.
Automated RPR Assays Compared 333. 연구대상특성 결 총 5검체중 검체는매독환자의것이었고 ( 일차매독 3명, 이차매독 명, 잠복기매독 9명 ), 37검체는과거매독을치료받았던환자, 7검체는임신여성, 35 검체는류마티스질환환자의것이었다 (Table ). 전체환자중 7 세이상노인은 3명이었다.. 희석배수에따른자동화 RPR 검사정량값과 RPR 역가와의관계 6검체중 A 검체는이차매독진단당시의환자의것이었고, B 검체는일차매독을진단받고 3개월째치료중인환자, C 검체는발생기간을알수없는매독으로치료받은후 개월이경과한환자, D 검체는이차매독을진단받고 개월째치료중인환자, E 검체는과거매독치료를받았던환자, F 검체는잠복기매독으로 개월째치료중인환자의것이었다 (Fig. ). 6개의그림을종합해보면, (Sekisui Chemical Co., Ltd) 의경 Table. Subject characteristics No. 과 Sex, M/F Age, mean (SD) Syphilis Primary 3 / 33 () Secondary 3/ () Latent 9 7/ (5) Past treated syphilis 37 /6 6 () Pregnant women 7 /7 (5) Rheumatic diseases 35 5/3 5 (7) Infection /9 6 (7) Other diseases 5 /9 57 (3) Total 5 7/ 5 (9) 우, 수기법 RPR 검사역가가 :인양성검체에서전역반응 (prozone effect) 이나타나 R.U. 값이반대로떨어지는데비해 HBi Auto RPR 시약 (HBI Co., Ltd) 은 :6 양성검체에서도전역반응이나타나지않았다. 희석배수증가에따른 R.U. 값감소정도로판단했을때, 역가증가에따른 R.U. 값증가가두시약모두에서역가 : 이상부터는비례적으로증가하지않는것으로판단되었다. 3. 자동화 RPR과수기법 RPR, TPHA, western blot 검사의결과비교매독을앓고있던환자와매독을치료받았던사람 53명모두는 western blot 매독항체 IgG 양성이었다 (Table ). 그러나 western blot 매독항체 IgM의경우는일차매독과이차매독환자에서만모두양성이었고잠복기매독환자의경우는 % (/9) 에서만 IgM 양성이었다. Western blot 매독항체 IgG 양성인검체는모두 53개였는데두가지자동화 RPR 검사에서각각 검체 (3.%) 와 9 검체 (35.9%) 에서만양성으로나타났다. 이검체들은 VDRL에서는 6검체 (6.%), 수기법 RPR 검사에서는 검체 (3.%), TPHA 에서는 5검체 (9.%) 에서양성으로나타났다. TPHA에서위음성을보인 검체는 세남자환자로특이질환없이본병원에서건강검진을시행받았던환자였다. VDRL과수기법 RPR 검사는일차매독과이차매독, 잠복기매독환자모두에서양성을나타냈지만과거매독을치료받았던사람에서는각각.%, 75.7% 에서만양성을나타냈다. 두가지자동화 RPR 검사, 즉 (Sekisui Chemical Co., Ltd) 과 HBi Auto RPR (HBI Co., Ltd) 은일차매독과이차매독환자에서모두양성을나타냈지만잠복기매독환자에서는두시약모두양성률이 55.6% 로낮게나타났고, 과거매독을치료받 Table. The number of samples with positive results (%) according to the assay kits No. WB (IgM)* WB (IgG) TPHA VDRL RPR card HBi Auto RPR Syphilis Primary 3 3 () 3 () 3 () 3 () 3 () 3 () 3 () Secondary () () () () () () () Latent 9 (.) 9 () 9 () 9 () 9 () 5 (55.6) 5 (55.6) Past treated syphilis 37 () 37 () 36 (97.3) 3 (.) (75.7) 6 (.) 7 (.9) No history of syphilis () () (.) (.6) 9 (6.) 5 (3.) 6 (.5) Total 5 (.3) 53 (.7) 53 (.7) 6 (.) 53 (.7) 3 (.) 5 (3.5) *Western blot (IgM), Anti-Treponema pallidum EUROLINE WB (IgM) (Euroimmun); Western blot (IgG), Anti-Treponema pallidum EUROLINE WB (IgG) (Euroimmun). Abbreviations: WB, Western Blot; TPHA, Treponema Pallidum hemagglutination assay; VDRL, Venereal Disease Research Laboratory; RPR, Rapid Plasma Reagin.
33 김영식 이제훈 이혜경외 5 인.6 3.3. 5..7.5.5 3.9.5.3 6.5. 9. 5..7.6.. 3. 6. 5.9.9.5 6.3 7..9...7. : :6 : : : : : : A : :6 : : : : : : B..9.3 5..3 7.9 6...7. 3.3.7 5..7 7. 7.. 7....9...9 : :6 : : : : : : C : :6 : : : : : : D.7 3. 3.6 5. 5.5.5.3 3.7....7..6.7.6 : :6 : : : : : : E : :6 : : : : : : F Fig.. Measurement of reagin antibody using two automated RPR assay kits, and HBi Auto RPR. Serial two-fold diluted samples were tested and the RPR titers (RPR card test) of the undiluted samples were :6 (A), : (B), : (C and D), : (E), and : (F). 았던사람에서는 시약 (Sekisui Chemical Co., Ltd) 의경우.%, HBi Auto RPR 시약 (HBI Co., Ltd) 의경우.9% 에서만양성으로나타났다. Western blot 매독항체 IgG 음성인검체는모두 개였는데이중 VDRL 양성을보인검체는 개 (.6%) 였고, 수기법 RPR 검사양성을보인검체는 9개 (6.%) 였으며, (Sekisui Chemical Co., Ltd) 양성을보인검체는 5개 (3.%) 였고, HBi Auto RPR (HBI Co., Ltd) 양성을보인검체는 6개 (.5 %) 였다. (Sekisui Chemical Co., Ltd) 과 HBi Auto
Automated RPR Assays Compared 335 RPR (HBI Co., Ltd) 검사결과, 총 5검체중정성결과가일치하지않은경우는 3개 (.6%) 였다. (Sekisui Chemical Co., Ltd) 과수기법 RPR 검사, 그리고 HBi Auto RPR (HBI Co., Ltd) 과수기법 RPR 검사사이의결과일치율은각각 3.% (55/5) 와 3.% (5/5) 였다.. 생물학적위양성례분석류마티스질환또는감염, 임신으로본병원에입원치료중인환자의검체 3개중 western blot 매독항체 IgG 음성검체는 3개였는데이음성검체중 5개 (.%) 는 VDRL에서양성이었고, 개 (.6%) 는수기법 RPR 검사에서양성이었으며, 개 (.%) 는두가지자동화 RPR 검사모두에서양성이었다. 임신여성 7명의검체중 VDRL이나수기법 RPR 검사, 두가지자동화 RPR 검사, TPHA에서위양성을보인검체는없었다. 류마티스질환환자 명의검체중수기법 RPR 검사나두가지자동화 RPR 검사, TPHA에서위양성을보인검체는없었지만 VDRL에서는 검체 (5%) 에서위양성을보였다. 감염환자 명의검체중수기법 RPR 검사나두가지자동화 RPR 검사, TPHA에서위양성을보인검체는없었지만 VDRL 검사에서는 검체 (5%) 에서위양성을보였다. 7세이상의노인 3 명의검체중에서 VDRL이나수기법 RPR 검사, TPHA에서위양성을보인검체는없었지만 검체 (3.%) 에서두가지자동화 RPR 검사로측정했을때모두위양성을보였다. 고찰이번연구에서 (Sekisui Chemical Co., Ltd) 은 :으로 RPR 역가가낮은검체에서전역반응을나타내어정량검사로사용되기에는부적합한것으로판단되었다. 왜냐하면일차매독환자는 VDRL 역가가 :에서 :6 사이, 이차매독환자의경우는 :에서 :5 사이, 조기잠복기매독환자의경우는음성에서 :56 사이에분포하기때문에 RPR 역가가 : 이상인환자들을대상으로 (Sekisui Chemical Co., Ltd) 로검사하게되면정량값이실제농도보다낮게나오기때문이다 [-7]. HBi Auto RPR (HBI Co., Ltd) 도비록 RPR 역가가 :6인검체까지전역반응이나타나지않았지만이검사방법또한고역가 RPR 검체에대한희석검사에서희석배수증가에따른 R.U. 값이비례적으로감소되지않아정량검사로사용되기에는한계가있는것으로판단되었다. 따라서이두가지자동화 RPR 검사방법은희석된검체를이용하더라도아직까지 는정확한 R.U. 값을얻기는어려울것으로판단된다. 두가지자동화 RPR 검사, 즉 (Sekisui Chemical Co., Ltd) 과 HBi Auto RPR (HBI Co., Ltd) 는수기법 RPR 검사와결과일치율이각각 3.%, 3.% 로 % 일치하지는않았다. 이런차이는시약성분의구조차이등에기인한것으로판단되는데, VDRL과수기법 RPR 검사는수기법 RPR 검사시약에 charcoal particle이더들어있다는점만다를뿐두검사시약모두 cardiolipin과레시틴, 콜레스테롤이리포솜형태로이루어져있다. 이리소폼에리아진항체가결합하면미세한응집이일어나게되는데약한응집도많이관찰된다. 수기법 RPR 검사시약성분중콜레스테롤은 cardiolipin과레시틴을리포솜바깥쪽에위치시켜리아진항체와결합이잘일어나도록하는데비해자동화 RPR 검사시약의경우는라텍스에 cardiolipin 과레시틴이부착되어있다 []. 이런차이는결합력이약한리아진항체의경우라텍스에부착된 cardiolipin과의결합상태를유지할수없게만드는것으로추측된다. 또한천연 cardiolipin 을사용했느냐아니면재조합 cardiolipin을사용했느냐에따라서도리아진항체결합정도가영향을받는다는보고도있으므로시약재료의차이도이번연구의결과에영향을미쳤으리라판단된다 [9]. Western blot 매독항체 IgG 양성인검체 53개중에서 IgM 도양성인경우는 검체 (5.%) 에불과했다. 일차매독과이차매독환자에서 IgM이모두양성이었지만잠복기매독환자 9명중 IgM 양성은 명 (.%) 뿐이었는데, McMillan 등 [] 이보고한조기잠복기매독환자대상 IgM 양성률 75% 나 Castro 등 [] 이보고한잠복기매독환자대상 IgM 양성률 7% 와비교해판단해볼때본연구의 9명환자대부분이후기잠복기매독이었을것으로판단되었다. 본연구에서 VDRL과 TPHA, 두가지자동화매독항체검사는 9명의잠복기매독환자에서모두 % 양성을나타냈지만두가지자동화 RPR 검사는 5명 (55.6%) 에서만양성을나타냈다. 이결과로판단해볼때자동화 RPR 검사는후기잠복기매독환자를검출하는데한계가있는것으로판단된다. 과거매독을치료받은환자의 37검체는 western blot상매독항체 IgM 음성이면서 IgG 양성이었는데, 이검체를대상으로했을때, 자동화 RPR 검사양성률은약 % 로수기법 RPR 검사양성률 76.7% 에비해매우낮았다. 이로볼때자동화 RPR 검사는매독치료후항체음성전환기간이수기법 RPR 검사에비해짧음으로매독환자치료추적에매우유용한것으로판단된다. 병원에입원한환자중임신여성과류마티스질환환자, 감염환자, 노인환자등 3명을대상으로했을때두가지자동화 RPR 검사의생물학적위양성률은모두.% 로.% 의 VDRL
336 김영식 이제훈 이혜경외 5 인 검사나.6% 의 RPR card에비해더낮게나타났다. VDRL의생물학적위양성률.% 는일반인을대상으로조사한 Smikle 등 [] 의생물학적위양성률.59% 나모든입원환자를대상으로조사한 Geusau 등 [] 의생물학적위양성률.%, 헌혈자를대상으로조사한 Lee 등 [3] 의생물학적위양성률.% 보다더높은데이는본연구의대상이되었던환자가생물학적위양성률이높게나타날수있는임신여성과류마티스질환환자, 노인환자등으로이루어져있었기때문으로판단된다. 이상의결과를종합해볼때두가지자동화 RPR 검사는수기법 RPR 역가검사를대체하여정량검사로사용하기에는부적합한것으로판단된다. 특히 (Sekisui Chemical Co., Ltd) 은저역가의 RPR 검체에서도전역반응을나타냄으로해석시주의가필요할것으로사료된다. 요약배경 : 본연구진들은두가지자동화 Rapid Plasma Reagin (RPR) 검사와수기법 RPR 역가를비교하여두가지자동화 RPR 검사방법이정량적검사로서의수기법 RPR 검사를대체할수있는지알아보고자하였다. 방법 : 5검체를분석하였으며 검체는일차매독과이차매독, 잠복기매독환자로부터얻은것이었다. 두가지자동화 RPR 검사방법, 즉 (Sekisui Chemical Co., Ltd, Japan) 와 HBi Auto RPR (HBI Co., Ltd, Korea) 의측정치를수기법 Macro-Vue RPR card tests (Becton Dickinson BD Microbiology systems, USA) 의 RPR 역가와비교했다. 확진검사로 Anti-Treponema pallidum EUROLINE WB (IgG) 와 Anti-Treponema pallidum EUROLINE WB (IgM) (Euroimmun, Germany) 을이용하였다. 결과 : 는 RPR 역가 :에서전역반응 (prozone effect) 을나타냈지만 HBi Auto RPR은나타내지않았다. 두가지자동화 RPR 검사로측정된측정치는 RPR 역가에비례적으로증가하지는않았다. 두가지자동화 RPR 검사, 즉 과 HBi Auto RPR의 RPR card 일치율은각각 3.% 와 3.% 였다. 결론 : 두가지자동화 RPR 검사방법은수기법 RPR 검사를대체하는정량적인검사로는사용할수없을것으로판단된다. 특히 은낮은역가에서도전역반응을나타내기때문에결과해석시주의가필요할것으로판단된다. 참고문헌. Noh J, Ko HH, Yun Y, Choi YS, Lee SG, Shin S, et al. Evaluation of performance and false positivity of test that uses a chemistry autoanalyzer. Korean J Lab Med ;:3-. ( 노재광, 고학현, 윤여민, 최영숙, 이상곤, 신수등. 생화학자동분석기용 Mediace RPR 검사의성능및위양성평가. 대한진단검사의학회지 ;: 3-.). Huh HJ, Lee KK, Kim ES, Chae SL. Analysis of positive results in Mediace Rapid Plasma Reagin and Treponema pallidum Latex Agglutination as the automated syphilis test. Korean J Lab Med 7;7: -9. ( 허희진, 이교관, 김의석, 채석래. 자동화매독검사인 Mediace Rapid Plasma Reagin과 Treponema pallidum Latex Agglutination 양성결과분석. 대한진단검사의학회지 7;7:-9.) 3. Kim J, Kim WH, Cho C, Kim J, Kim GY, Nam MH, et al. Evaluation of automated architect syphilis TP as a diagnostic laboratory screening test for syphilis. Korean J Lab Med ;:75-. ( 김지용, 김우현, 조치현, 김주연, 김가영, 남명현등. 매독선별검사로서의 Architect Syphilis TP 평가. 대한진단검사의학회지 ;:75-.). McMillan A and Young H. Qualitative and quantitative aspects of the serological diagnosis of early syphilis. Int J STD AIDS ;9: 6-. 5. Dicker LW, Mosure DJ, Steece R, Stone KM. Laboratory tests used in US public health laboratories for sexually transmitted diseases,. Sex Transm Dis ;3:59-6. 6. Lewis DA and Young H. Syphilis. Sex Transm Infect 6;(S): iv3-5. 7. Young H. Syphilis. Sex Transm Dis 99;:69-.. Orum O, Nielsen JR, Birch-Andersen A. The effect of cholesterol on the morphology and reactivity of the mixture of lipids used in syphilis serology. APMIS 99;9:9-. 9. Castro AR, Morrill WE, Shaw WA, Gale DC, Park MM, Peregrino- Ferreira LA, et al. Use of synthetic cardiolipin and lecithin in the antigen used by the venereal disease research laboratory test for serodiagnosis of syphilis. Clin Diagn Lab Immunol ;7:65-6.. Castro R, Prieto ES, Santo I, Azevedo J, Exposto Fda L. Evaluation of an enzyme immunoassay technique for detection of antibodies against Treponema pallidum. J Clin Microbiol 3;:5-3.. Smikle MF, James OB, Prabhaker P. Biological false positive serological tests for syphilis in the Jamaican population. Genitourin Med 99;66:76-.. Geusau A, Kittler H, Hein U, Dangl-Erlach E, Stingl G, Tschachler
Automated RPR Assays Compared 337 E. Biological false-positive tests comprise a high proportion of Venereal Disease Research Laboratory reactions in an analysis of 3, sera. Int J STD AIDS 5;:7-6. 3. Lee CY, Han SM, Kang KC. Evaluation of Treponema pallidum antibody test in blood donors. Korean J Blood Transfus 997;:63-9. ( 이충영, 한상무, 강권철. 공혈자에서매독균항체검사의비교평가. 대한수혈학회지 997;:63-9.)