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Korean Chem. Eng. Res., 52(6), 701-705 (2014) http://dx.doi.org/10.9713/kcer.2014.52.6.701 PISSN 0304-128X, EISSN 2233-9558 꾸지뽕나무뿌리열수추출물로부터미백및주름개선화장품소재의개발 신혜진 정향리 황단비 김동욱 인제대학교제약공학과 621-749 경남김해시어방동 607 번지 (2014 년 4 월 10 일접수, 2014 년 6 월 2 일수정본접수, 2014 년 6 월 7 일채택 ) Cudrania tricuspidata Root Extract as Whitening and Antiwrinkle Cosmetic Agent Hyejin Shin, Hyangli Jeong, Danbi Hwang and Donguk Kim Department of Pharmaceutical Engineering, Inje University, 607 Eobang-dong, Gimhae, Gyeongnam 621-749, Korea (Received 10 April 2014; Received in revised form 2 June 2014; accepted 7 June 2014) 요 약 본연구에서는꾸지뽕나무의뿌리, 줄기, 열매및잎으로부터유효성분을열수추출하고다양한화장품소재시험을실시하여화장품소재로서의개발가능성을검토하였다. 세포독성시험에서꾸지뽕나무의뿌리, 줄기그리고열매추출물은독성을나타내지않았지만잎추출물은 200 µg/ml 이상의농도에서다소의독성을나타내었다. 꾸지뽕나무뿌리추출물은 500 µg/ml 의농도에서 81% 의 tyrosinase 억제효과 ( 미백효과 ) 와 58% 의 elastase 억제효과 ( 주름개선효과 ) 를나타내었고, UVB 자외선흡수능도다소보여주었다. 21 일간의온도안정성시험결과, 꾸지뽕뿌리추출물을포함한액제와로션제형은 25 o C 에서는안정하였으나 47 o C 에서점도와입자크기가불안정하였다. 본연구결과꾸지뽕뿌리추출물은높은폴리페놀및플라보노이드의함량, 우수한미백및주름개선효과를나타내어천연기능성화장품소재로서높은가능성을보여주었다. Abstract Water extracts of root, leaf, branch and fruit of Cudrania tricuspidata were tested to use as natural antiwrinkle and whitening cosmetic ingredient. Root extract indicated 86.5 mg/g polyphenol concentration and 55.5 mg/g flavonoid concentration. From MTT test, root, branch and fruit extract did not show cell toxicity up to 1,000 µg/ml, however, leaf extract displayed significant cell toxicity in concentrations higher than 200 µg/ml. Cudrania tricuspidata root extracts displayed excellent 81% tyrosinase inhibition (whitening effect), 58% elastase inhibition (antiwrinkle effect) at 500 µg/ml and showed minor UVB absorbance. When solution and lotion formulation were made including Cudrania tricuspidata root extract, they are stable at 25 o C for 21 days, but showed significant deviation in viscosity and particle size at 47 o C. From the study, Cudrania tricuspidata root extract demonstrated good potential for natural whitening and antiwrinkle cosmetic agent. Key words: Cudrania tricuspidat Root, Cosmetic Agent, Antiwrinkle, Whitening, UV Absorption 서 피부는내인성노화와외인성노화로나눌수있는데, 내인성노화는주로유전적인원인에근거하며외인성노화는주로자외선에의해발생한다 [1]. 자외선은표피와진피를통과하며, 적절히차단하지않으면진피에서콜라겐 (collagen) 과엘라스틴 (elastin) 의구조를분해하여활성산소를생성한다 [2]. 멜라닌세포에서만들어진멜라닌 (melanin) 은표피의기저층에위치한피 To whom correspondence should be addressed. E-mail: pedkim@inje.ac.kr This is an Open-Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 론 부세포를보호하기위해자외선을흡수하는역할을한다. 생성된멜라닌은케라틴생성세포 (keratinocyte) 로운송되어진다. 기능성화장품은미백, 주름개선및자외선차단효과를가지는화장품으로정의되며식품의약품안전처고시에따르면등록된미백효과소재는알부틴 (arbutin), 나이아신아마이드 (niacinamide), 아스코빌글루코사이드 (ascorbyl glucoside), 닥나무추출물, 감초추출물등 9 종이있으며, 주름개선효과공인물질은아데노신 (adenosine) 과레티놀 (retinol) 등 4 종이있다 [3]. 이러한화학물질 ( 추출물 ) 이세계적으로화장품에자주사용되지만문헌에서는피부자극에대한보고가있어왔다 [4,5]. 따라서대부분의화장품회사들은안전하면서효율적인미백, 주름개선및자외선차단에사용되는새로운화장품소재를모색하고있는실정이다. 또한최근유기농화장품이인기를얻으면서유기농화장품 701

702 신혜진 정향리 황단비 김동욱 인증기관인 ECOCERT 는화장품성분의 95% 이상이천연물질이어야한다는규정을제시하고있다 [6]. 이러한규정과소비자들의요구를충족하기위하여식물자원에서기능성화장품소재를개발하는노력이계속되고있다. 미백소재로는포도잎, 레몬추출물, bearberry, 키위, Sophora Angustifolia 및 Buddleja axillaris 등이대표적이고 [7-9], 주름개선소재로는녹차, 홍차, 콩, 석류, 포도씨, 마로니에, 연근및알로에등이있다 [10-12]. 화장품은상업적으로판매되는제품이기에그성분은간단한제조과정으로대량생산이가능해야하고비용적측면에서경쟁력이있어야한다. 이러한이유에서본연구에서는꾸지뽕나무를천연소재로선정하였다. 꾸지뽕나무 (Cudrania tricuspidata B.) 는뽕나무과에속하는낙엽성소교목또는관목으로서우리나라의전남북, 경남북, 충남지방과중국, 일본등지에자생하는식물이다. 꾸지뽕나무는높이가약 6 m 로자라며열매는식용이고뽕나무와닮은모양을가진다. 동의보감에따르면꾸지뽕나무는신경통, 피부질환, 습진및타박상을치료하는데사용되어졌다 [13]. 본연구에서는꾸지뽕나무를화장품소재로사용하기위하여뿌리, 잎, 줄기, 열매의열수추출물에대해세포독성시험, 미백효과시험, 주름개선효과시험, 자외선흡수효과시험및온도안정성시험을실시하여, 기능성화장품소재로서의가능성을검토하였다. 2-1. 시료의추출 2. 실험 꾸지뽕나무의뿌리와열매는각각건조품을경기이천과제주서귀포에서구입하였으며잎과줄기는강원도고성군농업기술센터의수확건조품을구입하였다. 꾸지뽕나무의각부분을증류수에담근후 100 o C 에서 2 시간동안끓여추출물을획득하였으며사용시까지시료는동결건조되어보관되었다. 2-2. 폴리페놀 (polyphenol) 함량및플라보노이드 (flavonoid) 함량측정꾸지뽕나무추출물의활성성분에대한농도측정을위해폴리페놀과플라보노이드의함량이측정되었다. 폴리페놀함량은 Folin-Denis 법을응용하여다음과같이측정하였다 [14]. 열수추출물을 1 mg/ml로증류수에용해시키고 Folin-Denis 시약 1ml를첨가하여 27 o C 수욕조에서혼합하였다. 5분후 Na 2 CO 3 포화용액 1ml을가하여혼합하고실온에서 1시간동안방치하였으며 ELISA reader(powerwave XS2, BioTek, USA) 로 725 nm에서흡광도를측정하였다. 표준곡선은 tannic acid를이용하여 0~ 100 µg/ml의농도조건에서작성하였다. 플라보노이드함량은열수추출물 1 mg/ml로증류수에용해시키고 diethyleneglycol 2 ml와 1N-NaOH 0.02 ml를가한다음 37 o C 항온수조에서 1시간동안방치한후 420 nm에서흡광도를측정하였다 [14]. 표준곡선은 rutin을사용하여 0~100 µg/ml의농도조건에서작성하였다. 2-3. 안전성시험 (safety test) 화장품소재로서의안전성을평가하기위하여세포생존율을 MTT assay 로측정하였다 [15,16]. B16 F10 mouse melanoma cell ( 한국세포주은행 ) 을 1 10 4 cell/ml 씩분주하여 24 시간배양후 10~1,000 µg/ml 의농도로희석한추출물의시료가첨가된새배 지로교체하고다시 24 시간동안배양하였다. 여기에 MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylte- trazolium bromide, Sigma) 를각 well 당 20 µl 첨가한후 37 o C, 5% CO 2 incubator(sanyo, Japan) 에서배양 2 시간후형성된 formazan 을 200 µl DMSO 에녹이고, 595 nm 에서 ELISA reader (PowerWave XS2, BioTek, USA) 로흡광도를측정하였다. 세포생존율 (cell viability) 은아래의식으로계산되었다. Cell viability(%)=[(exp.-blank)/control] 100 2-4. 효력시험 (efficacy test) 미백효과시험은 tyrosinase 억제효과시험 (tyrosinase inhibition assay) 과 DOPA 산화억제효과시험 (DOPA oxidation inhibition assay) 에의해수행되었다. Tyrosinase 억제효과시험은다음과같이수행되었다 [17]. 0.1 M sodium phosphate buffer(ph 6.8) 180 µl, 각농도별로희석시킨추출물 80 µl 와 mushroom tyrosinase 20 µl 를 1.5 mm L-tyrosine 20 µl 와혼합한후 37 o C 에서 10 분간반응시키고 490 nm 에서흡광도를측정하였다. DOPA 산화억제효과시험은다음과같이실시되었다 [17]. 0.1 M potassium phosphate buffer(ph 7.0) 240 µl, 추출물 20 µl 와 tyrosinase 20 µl 를혼합후 37 o C 에서 6 분간반응시키고 2 mm 의 L-DOPA(3,4-Dihydroxy- L-phenylalanine) 20 µl 를혼합하여 25 o C 에서 1 분간반응후 ELISA reader 로 475 nm 에서흡광도를측정하였다. 주름개선효과시험은 elastase 억제효과시험 (elastase inhibition assay) 를이용하여수행되었다. 0.2 M Tris-HCl buffer(ph 8.0) 180 µl 에추출물을 100~1,000 µg/ml 로희석시킨시료용액 80 µl 와기질 1.0 mm N-succinyl-(Ala) 3 -ρ-nitroanilide 20 µl 를첨가하였다 [18]. 2.5 U elastase(porcine pancreas solution) 20 µl 를첨가하여 25 o C 에서 10 분반응후 ELISA reader 로 410 nm 에서흡광도를측정하였다. 꾸지뽕나무추출물의자외선차단소재로서응용가능성을평가하기위하여 UV 흡광도를측정하였다. 열수추출물 10 mg 을증류수 10 ml 에녹인후용액을 20 분의 1 로희석하여사용하였고, 표준품으로 PABA(para-aminobenzoic acid, UVB 차단제 ) 와파루솔 A(4-tert-butyl-4'-methoxydibenzoylmethane, UVA 차단제 ) 을사용하였다. 흡광도측정은 UV/VIS Spectrophotometer(Shimadzu model UV-mini-1240 series) 를사용하였으며 280~400 nm 범위에서측정하였다. 2-5. 온도안정성시험 (Temperature stability test) 꾸지뽕나무열수추출물이포함된액제 ( 스킨 ) 와로션을제조하여온도안정성시험을실시하였다. 액제는중량비로추출물 4.9%, 글리세린 22% 및정제수 73.1% 로구성되었으며, 로션은추출물 1.8%, 스윗아몬드오일 14.6%, 왁스 2.9%, 방부제 3.0% 및정제수 77.7% 로제조되었다. 각화장품은 25 o C, 47 o C의온도조건에서 21일동안 ph, 점도, 입자크기를측정하였으며상분리, 외관성상의변화를관찰하였다. 점도는 Brookfield 점도계 (DV-1, USA) 를사용하였으며, 액제는 S63 spindle, 로션은 S64 spindle을이용하여 60 rpm 속도에서 30초간측정하였다. 입자크기는 PSA(Particle Size Analyzer, 90 Plus BIC, USA) 를사용하였으며 3번반복측정하여제형의입자평균크기를구하였다.

꾸지뽕나무뿌리열수추출물로부터미백및주름개선화장품소재의개발 703 3. 결과및고찰 3-1. 폴리페놀 (Polyphenol) 및플라보노이드 (Flavonoid) 함량측정 화장품에응용되는식물계소재에는다양한폴리페놀및플라보노이드계물질들이다량포함되어있는것으로알려져있다. 폴리페놀화합물은플라보노이드, coumarin, stilbenes, tannins 등을포함하며 [19], 그중에서도플라보노이드는강력한생물학적활성이잘알려져서천연화장품소재로널리사용되어지고있다. 따라서본연구에서는꾸지뽕나무추출물의활성성분분석을위해폴리페놀과플라보노이드의함량을측정하였다. 꾸지뽕나무추출물의폴리페놀및플라보노이드함량이 Table 1 에나타나있다. 꾸지뽕나무의뿌리와잎추출물은줄기와열매추출물에비해높은폴리페놀및플라보노이드함량을보였고잎추출물에서가장높은플라보노이드함량을보여주었다. 뿌리추출물은폴리페놀함량이 86.5 mg/g, 플라보노이드함량은 55.5 mg/g 으로나타났다. 3-2. 안전성시험 화장품의최근추세는안전성시험으로동물시험을배제하고있다. 따라서본연구에서는화장품소재의안전성시험으로 MTT assay 를이용한세포독성시험을실시하였다. 실험에서는시험군으로는꾸지뽕나무추출물을, 대조군으로는비타민 C 를사용하였다. 추출물을 10~1,000 µg/ml 의농도로희석하여세포독성을시험한결과가 Fig. 1 에나타나있다. 꾸지뽕나무의뿌리, 줄기및열매추출물은 1,000 µg/ml 에서 80% 이상의세포생존율을보여높은농도에서도안전하다는것을보여주었다. 그러나잎추출물은 200 µg/ml 이상의농도에서세포독성을나타내었다. 화장품소재로사용하기위해서는안전성이가장중요시되므로꾸지뽕나무잎추출물은폴리페놀과플라보노이드의함량은높지만, 세포독성이비교적강하여화장품에높은농도로사용하기에부적절하다고판단된다. Table 1. Polyphenol and flavonoid concentration of Cudrania tricuspidata extracts Total polyphenol (mg/g) Total flavonoid (mg/g) Roots 86.53±1.04 55.47±1.25 Leaves 81.35±0.83 79.53±1.60 Branch 28.95±0.35 12.52±0.24 Fruit 20.95±0.39 8.54±0.13 Fig. 1. Cell toxicity of Cudrania tricuspidata root, leaf, branch, and fruit extract by MTT assay. Fig. 2. Whitening effect of Cudrania tricuspidata root, leaf, branch and fruit extract by (a) tyrosinase inhibition assay, (b) DOPA oxidation inhibition assay. 3-3. 효력시험 Tyrosinase 는멜라닌합성경로의첫번째와두번째단계에관련된효소이며 tyrosinase 억제효과시험은 tyrosine 의산화 ( 첫번째단계 ) 와 DOPA(dihydroxyphenylalanine) 산화억제효과시험 ( 두번째단계 ) 로나누어진다. 꾸지뽕나무추출물의미백효과시험의결과가 Fig. 2a 와 Fig. 2b 에나타나있다. 실험에서대조군으로는미백화장품소재로가장널리사용되는알부틴 (arbutin) 을이용하였다. Tyrosinase 억제능은꾸지뽕나무뿌리추출물이 500 µg/ml 농도까지가장높았으며 500 µg/ml 의농도에서 81% 의높은억제율을보여주었다. 꾸지뽕나무추출물의 tyrosinase 억제효과는대체로대조군인알부틴보다는다소낮았다. 꾸지뽕나무추출물중에서는뿌리와열매추출물의 tyrosinase 억제효과가비교적우수하였다. DOPA 산화억제효과시험에서는꾸지뽕나무추출물의미백효과가대조군인알부틴에비해전반적으로보다우수하였다. 꾸지뽕나무추출물중에서는뿌리와열매의 DOPA 산화억제효과가보다뛰어남을알수있다. 꾸지뽕나무뿌리추출물의 DOPA 산화억제효과는 500 µg/ml 의농도에서 82% 의우수한억제율을보여주었다. 문헌에서식물추출물의 tyrosinase 억제능을살펴보면 500 µg/ml 의농도에서조록나무 (Distylium racemosum Siebold) 는 88%, 고삼 (Sophora flavescens Aiton) 이 84%, 검양옻나무 (Toxicodendron succedaneum Kuntze) 가 81% 의 tyrosinase 억제효과를보여주었다 [20]. 또한큰뱀무 (Geum aleppicum Jacq) 와호장 (Polygonum cuspidatum) 그리고유칼립투스나뭇잎 ( folium eucalypti) 도우수한미백효과를보여주었다 [7-9,23,24]. 꾸지뽕나무뿌리추출물은문헌자료와비교시에도상당히우수한미백소재로나타났다. Collagen 과 elastin 은피부진피의주요구성성분중하나이며자외선 (UV) 과같은외부자극이 fibroblast cell( 섬유아세포 ) 에도달하면 elastase 와 collagenase 가생산되어 elastin 과 collagen 의구조가파괴된다. 이러한현상이축적되면, 주름이생성된다. 꾸지뽕나무추출물의 elastase 억제효과시험결과가 Fig. 3 에나타나

704 신혜진 정향리 황단비 김동욱 Fig. 3. Antiwrinkle effect of Cudrania tricuspidata root, leaf, branch and fruit extract by elastase inhibition assay. 있다. 대조군으로는주름개선기능성화장품소재로서널리사용되는 adenosine 을이용하였다. 꾸지뽕나무의뿌리추출물은 500 µg/ml 의농도에서 58% 의억제율을보여주어서대조군인 adenosine 과유사한주름개선효과를나타내었다. 꾸지뽕나무추출물중에서는뿌리와잎이우수한효과를나타내었다. 문헌에서 elastase 억제효과를보이는식물은 500 µg/ml 의농도에서산수유나무 (Cornus controversa Hemsl.) 가 90%, 센달나무 (Machilus japonica Siebold) 가 87%, 삼나무 (Cryptomeria japonica) 가 83% 그리고들장미 (Rosa multiflora) 가 83% 의억제효과를보여주었다 [20]. 우수한 elastase 억제활성을나타내는다른식물로는조록나무 (Distylum racemosum), 호장 (Polygonum cuspidatum) 그리고빈랑나무 (Areca catechu) 가보고되었다 [10-12,21,22]. 위식물들과비교하여꾸지뽕나무의 elastase 억제율은유사하거나비교적우수한효과를보여주었다. 대기환경이다양한화학물질에의해오염됨에따라최근지표면에도달하는자외선량이점차증가하고있다. 햇빛아래장시간노출되면피부세포는손상을입을수있다. 따라서야외활동이증가하는여름철에는피부의보호를위해적절한자외선차단제의사용은필수적이다. 자외선은 UVA(320-400 nm), UVB(290-320 nm) 그리고 UVC(200-290 nm) 로나뉘며 UVA 는피부를검게만들 Fig. 4. UV absorption of Cudrania tricuspidata root, leaf, stem and fruit extract. Concentrations of extract and standards are 50 µg/ml and 10 µg/ml, respectively. 고 (suntan) UVB 는피부홍반 (sunburn) 을일으키며 UVC 는피부암을유발한다. 다행히도 UVC 는오존층에서흡수되어지표면에도달하지않는다. 자외선차단소재는 UV 흡수제와 UV 산란제로나뉘며 UV 흡수제는대부분폴리페놀을포함한벤젠고리구조를가진유기화학물질이고, UV 산란제는 TiO 2 와 ZnO 같은것들이있다 [3]. 우리나라의식품의약품안전처에공인된자외선차단제는모두유기 / 무기합성화합물로서최근의화장품개발동향에비추어볼때천연식물계자외선차단소재의개발은시급한형편이다. 꾸지뽕나무추출물에대하여 UV 흡광도를측정한실험결과가 Fig. 4 에나타나있다. 대조군은 UVB 영역에서흡수능을가지는 PABA(p-amino benzoic acid) 와 UVA 영역에서흡수능을가지는 4-tert-butyl-4'-methoxydibenzoylmethane 를사용하였다. 꾸지뽕나무의뿌리추출물은 290 nm 에서흡광도값이 0.33 이었고잎추출물이 325 nm 에서 0.26 의값을나타냈다. 이것은뿌리 Table 2. (a) Temperature stability test of solution including Cudrania tricuspidata root extract at 25 o C and 47 o C 25 o C 47 o C 0 day 7 day 14 day 21 day ph 4.5 4.3 4.22 4.01 Viscosity (cp) 2 2 2 2 Particle size (µm) 6.6 8.7 1.7 2.9 ph 4.5 4.17 3.54 3.74 Viscosity (cp) 2 2 2 2 Particle size (µm) 6.6 20 14.6 6.1 (b) Temperature stability test of lotion including Cudrania tricuspidata root extract at 25 o C and 47 o C 25 o C 47 o C 0 day 7 day 14 day 21 day ph 5.8 5.5 5.74 5.52 Viscosity (cp) 910 600 820 630 Particle size (nm) 346.7 580 503 490 ph 5.8 5.5 5.44 5.06 Viscosity (cp) 910 2520 3380 2730 Particle size (nm) 346.7 660 686.7 616.7

꾸지뽕나무뿌리열수추출물로부터미백및주름개선화장품소재의개발 705 와잎추출물에서폴리페놀및플라보노이드함량이높은것과관련된것으로보여진다. 비록꾸지뽕나무추출물이자외선영역에서흡광도가아주높지않지만, 다른성분과혼합되어사용될때화학적차단제의함유량을낮추는데는도움이될것으로생각된다. 3-4. 안정성시험 꾸지뽕나무추출물을포함한액제 (solution) 와로션 (lotion) 제형을제조하여온도안정성시험을실시하였으며그결과가 Table 2a 와 2b 에나타나있다. 제조한제형에대해 25 o C 그리고 47 o C 에보관하면서 21 일동안 7 일간격으로 ph, 점도, 입자크기를측정하였다. 액제제형에대하여 (Table 2a) 25 o C 에서모든항목이안정하였지만 47 o C 에서는입자크기가큰차이를보였으며이는고온에서제형이불안정하여새로운제형의개발이필요한것으로생각된다. 로션제형에대해서도 (Table 2b) 47 o C 에서점도와입자크기의불안정함이관찰되었다. 그러나온도안정성시험기간동안상분리현상은나타나지않았다. 본실험에서꾸지뽕나무의뿌리, 줄기, 열매및잎추출물중폴리페놀및플라보노이드의함량, 세포독성, 미백효과, 주름개선효과및자외선차단효과를측정한결과, 뿌리추출물이가장우수한효능을나타내었다. 따라서꾸지뽕나무뿌리추출물은천연기능성화장품소재로서높은가능성을보여주었다. 4. 결론 꾸지뽕나무의뿌리, 잎, 줄기그리고열매를열수추출하고다양한화장품소재시험을실시하여화장품소재로서의가능성을탐색하였다. 뿌리추출물은 86.5 mg/g 의폴리페놀과 55.5 mg/g 의플라보노이드를포함하고있었다. 뿌리추출물은 500 µg/ml 의농도에서 81% 의 tyrosinase 억제효과와 58% 의 elastase 억제효과를보여주었으며, UVB 에대해서도다소의흡수력을보여주었다. 꾸지뽕나무뿌리추출물을포함한액제와로션제형의안정성시험에서는 25 o C 에서안정하였으나 47 o C 에서점도와입자크기가불안정하였다. 본연구결과꾸지뽕나무의뿌리추출물은높은폴리페놀및플라보노이드의함량, 우수한미백및주름개선효과를보여주어서천연기능성화장품소재로서높은가능성을보여주었다. 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