KSBB Journal 200. 25: 27~276 황기의산지별및연근별 isoflavonoids 의함량분석 임경란 김미진 정택규 윤경섭 * ( 주 ) 사임당화장품기술연구소 Analysis of Isoflavonoid Contents in Astragalus membranaceus Bunge Cultivated in Different Areas and at Various Ages Kyung-ran Im, Mi-Jin Kim, Teak-Kyu Jung, and Kyung-Sup Yoon* R&D Center, Saimdang Cosmetics Co., Ltd., Daejeon 0-80, Korea Abstract This study was carried out to obtain the basic information for isoflavonoid contents that can be used to index Astragalus membranaceus B. cultivated in the Republic of Korea and China. Isoflavonoid contents in Astragalus membranaceus B. which were cultivated in various areas (Jecheon, Jeongseon, Yeongju, and Taebaek in Korea, and China) and ages (-year-old, -years-old) were determined. Calycosin and formononetin as major constituents were determinated by HPLC method in Astragalus membranaceus B. The results show that there were no statistically significant differences for the average contents of isoflavonoids among -year-old and -years-old. However, isoflavonoid contents were significant differences according to the cultivation areas. HPLC analysis showed that the calycosin content of -year-old at Jeongseon was the highest level of 0.0 ± 0.002% and that of -year-old at Yeongju was the lowest level of 0.00 ± 0.00%. The highest level of formononetin content was 0.050 ± 0.00% of -year-old at China, while the lowest level was 0.020 ± 0.00% of -year-old at Yeongju. These results strongly suggest that contents of isoflavonoid in Astragalus membranaceus B. might be quite different with respect to the cultivation areas. Keywords: Astragalus membranaceus B., isoflavonoid, calycosin, formononetin, cultivation 서론 ) 황기 (Astragali Radix; Astragalus membranaceus Bunge) 는콩과 (Leguminosae) 에속하는다년생초본식물인단너삼의뿌리로한국, 중국, 몽고등의아시아지역과유럽및아프리카의일부지역에널리분포하며, 우리나라에서는주로강원도정선과태백, 경상북도영주, 충청북도제천등에서재배되고있다 [-]. 한방에서는이뇨, 강장, 혈압강하등의목적으로사용되며약리실험에서도세포성및체액성면역증강효과, 항산화효과, 항노화효과, 항염작용, 강장작용, 이뇨작용, 항종양작용, 항바이러스작용등이있는것으로밝혀졌다 [4-0]. 황기는오래전부터인체를보하는약재로서 *Corresponding author Tel: +82-42-255-5856, Fax: +82-42-255-4670 e-mail: ksyoonjh@hanmail.net 한방에서는황기건중탕 ( 黃沂建中湯 ), 십전대보탕 ( 十全大補湯 ), 황기계지오물탕 ( 黃耆桂枝五物湯 ), 방기황기탕 ( 防己黃耆湯 ) 등의많은한방처방에서황기를인삼다음의보기약으로서사용하던재료로인체에대한안전성이이미확인된바있다 []. 이러한황기의주요성분으로는 triterpenoids, isoflavonoids, polysaccharides 등이알려져있으며그밖에다양한성분들이포함되어있는것으로보고된바있다 [2]. 황기에포함된 triterpenoids 성분은 astragalosides 와같은 saponin 류의배당체가주로포함되어있는것으로알려져있다 []. 또한, isoflavonoids 성분은 formononetin 과 calycosin 이대표적이며두성분의배당체, 그리고 (6 R, R) -hydroxy-9, 0- dimethoxypterocarpan--o-d-glucoside 와 7,2 -dihydroxy-, 4 -dimethoxyiso flavan-7-o-d-glucoside 의 6 가지성분이주요성분으로보고된바있다 [4-9]. Isoflavonoids 성분은식물성유사호르몬 (phytoestrogen) 의일종으로에스트로겐
272 과구조적유사성을가지며, 작용도유사하여여성호르몬의천연대체물질로서알려져있고, 특히이들은항산화효과, 미백및주름개선등의노화방지효과를가지고있으며, 천연물에서추출되어화장품원료로서응용되어지고있다 [20-24]. 본연구소의선행연구에서는황기의대표적인 isoflavonoids 성분인 formononetin 과 calycosin 을추출정제한후항노화효과및보습효과를측정하여기능성화장품의천연소재로서의이용가능성을확인한바있다. 일반적으로황기는재배연수에따라유통되고있으며, 황기의연근별활성에대한연구가많이이루어진반면, 국내에서재배하는황기의산지별및연근별성분의변화에대한자세한연구가부족한실정이다. 따라서본연구에서는황기를산지별및연근별로나누어지표성분의함량변화에대해서조사하였다. 황기의지표성분으로는주요활성성분이면서함량이비교적높은 isoflavonoids 인 calycosin 과 formononetin 으로선정하였다. 재료및방법 실험재료 황기는산지별로제천산, 정선산, 영주산, 태백산의국내산황기 4 종과중국산황기 종에대하여 년근, 년근을거피및절단된상태로 ( 주 ) 농림생약에서구입하여사용하였다. 황기의추출과정및효소처리에사용된 ethyl alcohol (EtOH) 및 ethyl acetate (EtOAc) 는시약급을구입하여그대로사용하였고, HPLC 분석용용매로는 acetonitrile (ACN) 과 water 를 HPLC grade 로 Fisher 사에서구입하여사용하였다. 황기추출물에포함된생리활성성분중 formononetin 표준품은 Fluka (47752, USA) 에서구입하여사용하였으며, calycosin 표준품은자체적으로분리 동정하여사용하였다. 기기로는 HPLC (Agilent Technologies 200 series, UV detector, USA), 회전식증발건조기 (Eyela, Japan) 가사용되었다. H-NMR (400 MHz) 와 C-NMR (00 MHz) 분석은 Unity Plus 00 spectrometer (Varian Unity PLUS, USA) 가사용되었고, FAB-MS (Fast atom bombardment Mass. JEOL, JMS-700, Japan) 를이용하여측정하였다. 황기의최적당분해효소결정 황기의최적당분해효소를결정하기위하여제천산 년근황기 80% EtOH 수용액추출물을가지고상업적으로판매되어사용하고있는 Viscozyme L (00 FBG/g, Novo Nordisk Co., Denmark), Celluclast.5 LFG (700 EGU/g, Novo Nordisk Co., Denmark), Pectinex 00 L (5,000 FDU/ ml, Novo Nordisk Co., Denmark) 을이용하여효소처리를실시하였다. Viscozyme L 은 arabanase, cellulase, ß-glucanase, hemicellulase, xylanase 등을포함한탄수화물분해효소이며, Celluclast.5 LFG 는셀룰로오스분해효소이다. 또한, Pectinex 00 L 은 pectintranseliminase, polygalacturonase, pectinesterase 를주성분으로하는펙틴분해효소이다. 이효소를추출물의 % 농도로처리한후 50 에서 2 시간동안교반하였다. 여기에증류수 00 ml 을가하고추출용액과동량의 EtOAc 를가하여분획 농축하여 calycosin, formononetin 의함량을측정하고, 이들의함량이높은것을당분해효소로선정하여산지별및연근별황기의효소처리시사용하였다. 황기의추출및효소처리 황기는산지별및연근별로구분하여추출하였으며, 추출용매는황기의배당체성분까지추출되어지고농축이용이한 80% EtOH 수용액을사용하였다 [8-9]. 산지별 5 종황기의 년근및 년근을각각 60 g 씩정량하여추출기에넣은후, 80% EtOH 수용액으로 4 시간씩 2 회반복환류냉각추출하였다. 추출여액을와트만 2 번여과지로여과하고회전식증발건조기로감압농축하여황기추출물을얻었다. 이들추출물을 0% EtOH 수용액 400 ml 에다시용해시키고상업적으로판매되어사용하고있는 Viscozyme L 을가하여 50 에서 2 시간동안진탕배양하였다. 배양액을와트만 2 번여과지로여과하고회전식증발건조기로감압농축하여황기효소처리분말을얻었다. 황기의추출및효소처리실험은 회반복실험하여재현성을확인하였다. 지표성분의분리 황기의대표적인 isoflavonoids 인 calycosin 은현재시판되고있지않으므로본연구에서자체분리동정하였다. 황기 80% EtOH 추출물 500 mg 사용하여 차 ODS-A column chromatography (2.5 cm 20 cm) 를실행하였다. 이때, 이동상용매는 60%, 80% EtOH 수용액을각각 500 ml 씩이용하여용출시킨후 UV detector 를사용하여 2 개의분획으로분취하였다. Fr. (200 mg) 을두번째 ODS-A column chromatography (2.5 cm 20 cm) 를 60%, 80% EtOH 수용액을각각 500 ml 씩이용하여 5 개의분획으로나누었다. 80% EtOH 수용액초반부의 Fr. 을농축하여 % 이상의단일화합물을얻었다. 이것을소량의 HPLC 용 MeOH 로용해후, 뚜껑이없는 test tube 에담아 ~4 일간 4 에서결정화하여화합물 0 mg 을얻었다. 분리된화합물은 H-NMR, C-NMR 및 FAB-MS spectra 를각각측정하였으며, spectral data 를문헌치 [26] 와비교하여이화합물을 calycosin 으로동정하였다. 지표성분정량분석 황기의 calycosin, formononetin 의정량분석은고속액체크
KSBB Journal 27 로마토그래피 (HPLC) 법을행하였다. HPLC 분석조건으로칼럼은 YMC-Pack Pro C 8 (5 μm, 4.6 mm 250 mm), 검출기는 UV detector 260 nm 로하였다. 유속은 0.8 ml/min 이며, 이동상은용매 A (0.% CH COOH 을함유한 ACN) 와용매 B (0.% CH COOH 을함유한 Water) 기울기용리로하여 Table 의조건에따라실시하였다. 지표성분의정량은표준물질을 0., 0.05, 0.025, 0.0, 0.005 mg/ml 로제조하고 HPLC 에서나타난 peak area 의 2 회반복평균값을취한후표준품의양과 peak area 사이의상관관계를도출하여검량선을작성하여계산하였다. Table. Condition for HPLC analysis Time (min) Solvent A a) Solvent B b) 0 5 20 0 40 45 0 25 40 0 0 a) Solvent A : 0.% CH COOH in ACN. b) Solvent B : 0.% CH COOH in H 2O. 결과및고찰 지표성분에대한검량선 standard curve 75 60 0 Calycosin 및 formononetin 검량선의상관관계는 0.999 이상으로매우양호하였다. Calycosin 의정량곡선은 y = 40805.997 x +.86, r = 0.99980 이었으며, formononetin 의정량곡선은 y = 2678.867 x - 7.840, r = 0.99965 이었다. 여기서 y 는 peak area 값이며 x 는함량 (mg/ml) 이다. Calycosin 및 formononetin 그리고이들배당체의화학구조를 Fig. 에나타내었다. isoflavonoids 로전환시키는방법들이보고되어있지만 [26], 이는수율이낮고산업적으로이용하기어려운단점이있다. 따라서경제성이있는다양한종류의당분해효소등을이용하여최적의분해효소를선정하고자하였다. 제천산 년근황기의효소별지표성분의함량을 Table 2 에나타내었으며, 그결과황기의주요활성 isoflavonoids 무배당체성분인 calycosin 과 formononetin 함량이효소처리시 5 배이상증가함을알수있었다. Viscozyme L > Celluclast.5 LFG > Pectinex 00 L 순으로황기의배당체성분을무배당체로전환시키는것을확인하였고, 산지별및연근별황기의효소처리시 Viscozyme L 을사용하였다. Table 2. The contents of major isoflavonoids of Astragalus membranaceus B. extracts hydrolized with various combined enzymes. Combined Enzymes Non Viscozyme L Pectinex 00 L Celluclast.5 LFG Amount of dry contents (g/60 g) 0.5 ± 0.0 0.22 ± 0.00 0.45 ± 0.02 0.2 ± 0.0 Contents (%) Calycosin Formononetin 0.65 ± 0.00 5.752 ± 0.08.2 ± 0.07 4.492 ± 0.200 0.68 ± 0.0 2.95 ± 0.55.96 ± 0.67 2.275 ± 0.207 산지별및연근별황기추출물지표성분의함량비교 황기의연근별및산지별추출물의고형분양과황기의대표적인 isoflavonoids 인 calycosin 및 formononetin 의함량을 Table 에나타내었다. Table. The contents of major isoflavonoids of Astragalus membranaceus B. by HPLC. Areas Jecheon Jeongseon Yeongju Taeback China Years Amount of dry contents (g/60 g).82 ± 0.2.04 ± 0.58 8.95 ± 0.97 4.2 ± 0.66 22.9 ± 0.80 2.68 ±.0 2.46 ± 0.94.6 ± 0.7 7.98 ± 0.6 20.5 ± 0.55 Contents (%) Calycosin Formononetin 0.056 ± 0.002 0.044 ± 0.0 0.0 ± 0.002 0.04 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.022 ± 0.000 0.025 ± 0.000 0.040 ± 0.00 0.087 ± 0.00 0.009 ± 0.00 0.049 ± 0.00 0.06 ± 0.009 0.048 ± 0.002 0.0 ± 0.000 0.020 ± 0.00 0.024 ± 0.004 0.02 ± 0.00 0.026 ± 0.00 0.050 ± 0.00 0.0 ± 0.002 Calycosin [R :OH, R 2:H]. Calycosin 7-Ο-β-D-glucoside [R :OH, R 2:glucosyl]. Formononetin [R :H, R 2:H]. Formononetin 7-Ο-β-D-glucoside [R :H, R 2:glucosyl]. Fig.. The isoflavonoids of Astragalus membranaceus B. 황기의최적당분해효소선정 배당체형태의 isoflavonoids 를무배당체의형태의 전체고형분의양은산지별로는중국산 > 영주산 정선산 제천산 태백산으로상대적으로중국산의고형분의양이월등히많았으며, 5 종의산지별황기는 년근보다는 년근의고형분의양이많음을알수있었다. 황기의주성분인 calycosin 및 formononetin 은각각 Rt 9.4 min, 26.5 min 에서 peak 가나타남을확인하였다. Calycosin 함량평균은 년근이 0.054 ± 0.06%, 년근이 0.00 ± 0.04% 로 년근의 calycosin 함량이높았으며, 정선산및중국산의 calycosin 함량이상대적으로높았다.
274 Formononetin 의함량평균은 년근이 0.08 ± 0.06%, 년근이 0.026 ± 0.009% 로 년근 formononetin 의함량이높았으며, 제천산및중국산의 formononetin 함량이상대적으로높았다. 또한산지별, 연근별황기모두 formononetin 보다 calycosin 함량이많음을알수있었다. 효소처리후의지표성분의함량비교 황기의 isoflavonoids 은대부분배당체형태로존재하고있다. 그러므로당분해효소를이용하여배당체형태의 calycosin 7-Ο-β-D-glucoside, formononetin 7-Ο-β-D-glucoside 를무배당체형태의 calycosin 과 formononetin 으로전환하여지표성분의함량을비교하고, 당성분의함량을미루어짐작할수있었다. 황기효소처리분말의 calycosin 및 formononetin 함량을 Table 4 에나타내었으며, HPLC 크로마토그램은 Fig. 2 에나타내었다. Table 4. The contents of major isoflavonoids of Astragalus membranaceus B. extracts hydrolized with Viscozyme L. Areas Jecheon Jeongseon Yeongju Taeback China (a) Years Amount of dry contents (g/60 g).5 ± 0.67 0.02 ± 0.8 7.46 ± 0. 0.80 ± 0.4 9.26 ± 0.68 2.2 ± 0.27 0.5 ± 0.7 0.08 ±.00 6.88 ± 0.68 8.56 ± 0.66 Contents (%) Calycosin Formononetin 0.8 ± 0.00 0.94 ± 0.02 0.096 ± 0.000 0.076 ± 0.006 0.04 ± 0.008 0.074 ± 0.006 0.06 ± 0.004 0.6 ± 0.009 0.095 ± 0.007 0.06 ± 0.06 0.079 ± 0.00 0.066 ± 0.006 0.05 ± 0.00 0.040 ± 0.000 0.024 ± 0.00 0.0 ± 0.00 0.047 ± 0.00 0.052 ± 0.00 0.06 ± 0.00 0.00 ± 0.006 황기추출물의효소처리후전체고형분의양이조금씩감소함을알수있었는데이는효소처리하는과정에서전분과단백질등의침전으로인한것으로사료된다. 효소처리후의 calycosin 의함량평균은 년근이 0.08 ± 0.00%, 년근이 0. ± 0.060% 로 년근의함량이높았고, 제천산및중국산의함량이상대적으로높았다. 효소처리를하지않았을경우에는 년근의 calycosin 함량이 년근보다높았지만효소처리후 년근이 년근보다높아짐을확인할수있었다. 이결과로보아 년근보다 년근에 calycosin 배당체가많이함유되어있음을짐작할수있었다. 제천산, 영주산, 태백산황기는 년근및 년근모두효소처리후 calycosin 함량이 2~ 배정도증가한반면, 정선산 년근및중국산 년근의경우는효소처리후에도함량변화가미미한것으로보아 calycosin 배당체함량이낮음을알수있었다. 효소처리후의 formononetin 함량변화를살펴보면제천산, 태백산및중국산은약 2 배정도증가하였으며, 정선산, 영주산은 년근과 년근모두함량변화가미미하였다. 산지별황기중에서는제천산황기가 calycosin, formononetin 및이들의배당체모두상대적으로함량이높았으며, 정선산및중국산황기는 calycosin, formononetin 의배당체가상대적으로적게함유되어있음을알수있었고, 특히, 제천산황기의경우 Fig. 2 에서보는바와같이 calycosin 및 formononetin 의 isoflavonoids 함량도높지만 Rt 5.0 min 이내에서상당수의 peak 가다른산지의황기보다높게나타남을알수있었다. 전반적으로황기에는 formononetin 보다 calycosin 이, formononetin 배당체보다 calycosin 배당체가많이함유되어있음을알수있었으며, 년근보다는 년근에배당체성분이많이함유되어있음을미루어짐작할수있었다. 이상의결과로보아산지별및연근별황기의 isoflavonoids 함량만본다면제천산이상대적으로우수하였으며, 고형분함량을고려한다면중국산황기가상대적으로우수하다고할수있겠다. 요약 (b) Fig. 2. HPLC chromatogram of Astragalus membranaceus B. root extract cultivated in Jechon and China (-year-old, hydrolized with Viscozyme L). 황기는국내에서생산되는 대약재의하나이며인삼다음으로사용량이많은약재로서황기의성분연구는비교적많이이루어져있는실정이다. 그러나황기의주성분에대한표준화가현재정확히마련되지않은현실정을감안하여황기의연근별및산지별 isoflavonoids 의함량분석에대한연구를진행하였다. 산지별 5 종황기 ( 제천, 정선, 영주, 태백, 중국 ) 의 년근및 년근 80% EtOH 수용액추출물을가지고 calycosin 과 formononetin 함량을측정하였으며, 또한 cellulase, β- glucanase 및 xylanase 가주성분인 Viscozyme L 을가하여효소처리한후, calycosin 과 formononetin 의함량을측정
KSBB Journal 275 하고아울러이들의배당체함량도예측하였다. 추출물의전체고형분의양은산지별로는중국산 > 영주산 정선산 제천산 태백산으로상대적으로중국산의고형분의양이월등히많았다. 또한 5 종의산지별황기는 년근보다는 년근의고형분의양이많음을알수있었다. Calycosin 함량은효소처리전에는 년근보다 년근에서높았으며, 정선산 중국산 제천산 태백산 영주산순이었다. 효소처리후에는 년근보다는 년근에서높은함량을나타내었고, 제천산 정선산 중국산 태백산 영주산으로, 이는제천산의경우 calycosin 배당체성분이많이함유되어있음을짐작할수있었다. 정선산및중국산 년근의경우는효소처리후에도 calycosin 함량변화가미미한것으로보아 calycosin 배당체함량이낮음을알수있었다. Formononetin 함량은효소처리전 후모두전반적으로 calycosin 에비해낮았으며, 정선산과영주산은효소처리후에도 formononetin 함량변화가미미한것으로보아 formononetin 배당체함량이낮음을알수있었다. 산지별로 isoflavonoids 의함량을보면제천산이가장높았으며, 고형분함량을고려한다면중국산이상대적으로높음을알수있었고, 연근별로 isoflavonoids 의함량을보면재배연수가오래됐다고해서이들의함량이월등히높아지지는않았다. 지표성분의결정에따라달라질수있으나, 본연구의지표성분인 isoflavonoids 함량은산지별로상당한차이를보임으로황기를건강기능식품이나화장품원료로이용할경우산지및연근의선택이중요할수있음을시사하였다. 접수 :200 년 월 4 일, 게재승인 :200 년 6 월 4 일 REFERENCES. Yin, Y., S. I. Heo, M. J. Jung, and M. H. Wang (2009) Antioxidant and antidiabetic effects of various sections of Astragalus membranaceus. Kor. J. Pharmacogn. 40: -5. 2. Kim, J. S. and C. S. Kim (997) A study on the constituents from the roots of Astragalus membranaceus (Ⅱ). Kor. J. Pharmacogn. 28: 75-79.. Min, S. H. and B. R. Lee (2008) Effect of Astragalus membranaceus powder on yeast bread baking quality. Korean J. Food Culture. 2: 228-24. 4. Xie, Z. F., Z. C. Lou, and X. K. Huang (994) Classified dictionary of traditional Chinese medicine. p. 74, New World Press, Beijing. 5. Rios, J. L. and P. G. Waterman (997) A review of the pharmacology and toxicology of Astragalus. Phytother. Res. : 4-48. 6. Hikino, H., S. Funayama, and K. Endo (976) Hypotensive principles of Astragalus and Hedysarum roots. Planta Med. 0: 297-02. 7. Tomoda, M., N. Shimizu, N. Ohara, R. Gonda, S. Ishii, and H. Otsuki (992) A reticuloendothelial system activation Glycan from roots of Astragalus membranaceus. Phytochemistry. : 6-66. 8. Zang, Y. D., Y. L. Wang, J. P. Shen, and D. X. Li (984) Hypotensive and antiinflammatory effects of Astragalus saponin. Acta. Pharm. Sin. 9: -7. 9. Li, C. Y. and H. I. Rhee (2004) Antioxidant activity of Astragalus membranaceus extract. J. Agric. Sci. 5: 0-0. 0. Baek, N. I., Y. S. Kim, J. S. Kyung, and K. H. Park (996) Isolation of anti-hepatotoxic agent from the root of Astragalus membranaceus. Kor. J. Pharmacogn. 27: -6.. Lee, H. Y., H. K. Ha, D. Y. Jung, J. Y. Choi, N. H. Lee, J. Y. Ma, Y. B. Yu, and H. K. Shin (2008) Study on pharmacological activity of sipjeondaebotang by difference in component ratio between Astragali Radix and Cinnamomi cortex. J. Korean oriental medical society. 29: 56-66. 2. Lin, L. Z., X. G. He, M. Lindermajer, G. Nolan, J. Yang, M. Cleary, S. X. Qiu, and G. A. Cordell (2000) Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry study of the flavonoids of the roots of Astragalus mongholicus and A. membranaceus. J. Chromatogr. A. 876: 87-95.. Hirotani, M., Y. Zhou, H. Lui, and T. Furuya (994) Astragalosides from hairy root cultures of Astragalus membranaceus. Phytochemistry. 6: 665-670. 4. T. Wu, T., S. W. Annie Bligh, L. H. Gu, Z. T. Wang, H. P. Liu, X. M. Cheng, C. J. Branford-White, and Z. B. Hu (2005) Simultaneous determination of six isoflavonoids in commercial Radix astragali by HPLC- UV. Fitoterapia. 76: 57-65. 5. Xiao, H. B., M. Krucker, K. Albert, and X. M. Liang (2004) Determination and identification of isoflavonoids in Radix astragali by matrix solid-phase dispersion extraction and high-performance liquid chromatography with photodiode array and mass spectrometric detection. J. Chromatogr. A. 02: 7-24. 6. Ma, X., T. Zhang, Y. Wei, P. Tu, Y. Chen, and Y. Ito (2002) Preparative isolation and purification of calycosin from Astragalus membranaceus Bge. var. mongholicus (Bge.) hsiao by high-speed counter-current chromatography. J. Chromatogr. A. 962: 24-247. 7. Zheng, H. Z., Z. H. Dong, and Q. She (998) Modern study of traditional Chinese medicine. p. 886, Xue Yuan Press, Beijing. 8. Yu, D., Y. Duan, Y. Bao, C. Wei, and L. An (2005) Isoflavonoids from Astragalus mongholicus protect
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