Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 175-181 (2015) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2015.30.4.175 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 Hep3B 간암세포에서개똥쑥추출물에의한 Cell Cycle Arrest 효과 김은지 1, 김근태 1, 김보민 1, 임은경 1, 김상용 2, 하성호 3, 김영민 1, 유제근 1 * Cell Cycle Arrest Effects by Artemisia annua Linné in Hep3B Liver Cancer Cell Eun Ji Kim 1, Guen Tae Kim 1, Bo Min Kim 1, Eun Gyeong Lim 1, Sang Yong Kim 2, Sung Ho Ha 3, Young Min Kim 1, and Je-Geun Yoo 1 * Received: 22 June 2015 / Revised: 6 August 2015 / Accepted: 17 August 2015 2015 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: Cells proliferate via repeating process that growth and division. This process is G1, S, G2 and M four phases consists. Monitoring the progression of the cell cycle is a specific step that to be a continuous process is repeated to adjust the start of the next step. At this time, this process is called a Checkpoint. Currently, there are three known checkpoints that G1-S phase, G2-M phase, and the M phase. In this study, we confirmed that cell cycle arrest effects by ethanol extracts of Artemisia annua Linne (AAE) in Hep3B liver cancer cells. AAE was regulated proteins which involved in cell cycle such as pakt, pmdm2, p53, p21, pcdk2 (T14/Y15). AAE induced cell cycle arrest in G1 checkpoint through phosphorylation of CDK2. Akt and p53 upstream is inhibited by AAE and p53 activated by non-activated pmdm2, p53 inhibitor. Thereby, activated p53 is transcript to p21 and activated p21 protein is combined with Cyclin E-pCDK2 complex. Therefore, we confirmed that AAE-induced cell cycle arrest was occurred by 1 한남대학교생명나노과학대학생명시스템과학과 1 Department of Biological Sciences and Biotechnology, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University, Daejeon 305-811, Korea Tel: +82-42-629-8934, Fax: +82-42-629-8873 e-mail: jgyoo@gmail.com 2 바이오앤진 2 Department of BIONGENE, Seoul 110-521, Korea 3 한남대학교생명나노과학대학화학공학과 3 Department of Chemical Engineering, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University, Daejeon 305-811, Korea p21-cyclin E-pCDK2 complex by inhibition of pakt signal. Because of this cell cycle can t pass to S phase from G1 phase. Keywords: Hep3B, Cell cycle arrest, Cyclin E-Cdk2, AAE, G1 arrest 1. INTRODUCTION 간암은원발성간암과전이성간암으로나눌수있으며, 이와같이간에발생하는악성종양을모두간암이라하지만, 일반적으로는원발성간암을말한다. 간암은전세계적으로자주발병되는암중의하나로암사망원인 3 위를차지하고있으며, 우리나라도인구 10 만명당남녀 26.9 명정도로간암이흔히발생하여세계에서가장높은발생률을보이고있다 [1]. 또한간암은다른부위암에비해진행되는속도나예후가불안정한형태의질환으로치료와예방에관심이높아지고있다 [2]. 최근연구에따르면개똥쑥 (Artemisia annua Linné) 은국화과에속하는일년생초본으로열대아시아에분포되어있으며, 우리나라에서는길가나들판에무리지어야생하고있다. 한방에서는주로해열제, 지혈제, 피부병치료제나살충제로사용되며, 그외항균, 항바이러스및망산화작용등이알려져있다 [3,4]. 개똥쑥의주요성분으로는 arteannuin, arteannuin B, scopoletin, coumarin 및 eupatin 등이있으며이러한성분들이항암및항균작용과관계가깊어이들의화학적구조를밝혀내는연구가수행되었다 [5,6]. 최근보고에의하면개똥쑥은총항산화력이높은약용식
176 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 175-181 (2015) 물중의하나로서개똥쑥의높은항산화활성은시료중에함유된페놀화합물에의한것으로보고되어있다. 선행연구에서는에탄올로추출한개똥쑥 (Ethanol extracts of Artemisia annua Linné, AAE) 를인체자궁경부상피암세포 (HeLa) 와위암세포 (AGS) 에처리하였을때암세포증식억제효과가있음이보고되었다 [3,4]. 인간의암은 cell cycle 조절인자들의돌연변이에의해유발된다. Cell cycle 에있어서다음단계로의진행을조절하는 Checkpoint 가존재하고, Checkpoint 를조절하는 protein 인 Cyclin-CDK 복합체가발현된다. 세포에이상이생기면 Cyclin- CDK 을조절하여 cell cycle arrest 를유도함으로써세포증식이중단되고, 이상이없는세포들은 Cyclin-CDK 에의해 cycle 이원활하게진행된다. 따라서, Cyclin-CDK 의돌연변이나이상이종양형성에관련됨이보고되었다 [7]. Cyclin 과 Cdk 는여러암세포에서과발현되며, 이러한 Cyclin-Cdks 복합체의억제를유도하는 protein 은 CKI (Cdk kinase inhibitor)family 라불리는 p53, p21, p27 이다. 이들은 Cyclin-Cdk 복합체에붙어 Cdk 의탈인사화를억제시킴으로써 Cell cycle arrest 를유도한다 [8]. 따라서본연구에서는 Hep3B 간암세포에개똥쑥추출물 (AAE) 을처리하였을때, 암세포증식억제가 cell cycle arrest 에의한것인지를알아보고자하였다. 또한, AAE 의증가에따른 Cell cycle 관련 protein 의발현변화를확인하였고, Checkpoint 를조절하는상위조절인자인 p-akt, p53 신호분자조절의연관성을알아보기위하여 LY294002 와 Pifithrin-á 를각각단독으로처리하거나 AAE ( 개똥쑥추출물 ) 과병행처리하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 실험재료실험에사용된개똥쑥은대전한약재시장에서구입하였고, 개똥쑥 100 g 에에탄올 800 ml 을가하여 72 시간동안상온에서환류시키며추출하였다. 이러한방법으로추출된개똥쑥추출물을감압농축기를이용하여감압농축시킨뒤, 농축된추출물은 -86 o C 에서보관하였다. 각농도별개똥쑥추출물은상기추출물을동일용량의 DMSO 에녹여만들었으며, -20 o C 에서냉동보관하여사용하였다. LY294002 와 Pifithrinα 는 Calbiochem (Calbiochem, SD, CA, USA) 에서구입하여 20 mm 으로만들어사용하였다. 2.2. 세포배양 Hep3B 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) 에서분양받았으며, 10% FBS (Hyclone, Laboratoris Inc., Logan, UT, USA) 와 1% antibiotics 가포함된 DMEM media (Hyclone, Laboratris Inc., Logan, UT, USA) 를사용하여 5% CO 2, 37 o C 조건하에배양하였다. 매 48 시간마다 Trypsin-EDTA (Hyclcone, Laboratories Inc., Logan, UT, USA) 를이용하여세포를부유상태로만든다음세포를 1 10 6 cells/ml 로분주하고계대배양하였다. 2.3. MTT assay에의한암세포의생존율측정 12 well plate에 Hep3B cell 를 1 10 5 cells/ml로분주하고 24 시간동안안정화시킨후 AAE를 12시간과 24시간동안처리하여 CO 2 incubator에서배양하였다. LY294002, Pifithrinα와병행처리시에는 inhibitor를 30분전처리한뒤, AAE를처리한후 12시간과 24시간동안 CO 2 incubator에서배양하였다. 그런다음 MTT solution 100 µg/ml를첨가하여 1시간동안 CO 2 incubator에서반응시켰다. MTT solution을처리한 media를제거하고pbs washing후 PBS를제거한뒤 DMSO 150 µl씩넣어각 well에생성된 formazan을모두녹인다음 96 well plate에 100ìL씩옮긴후 ELISA microplate reader (Bio-Red model 680, Bio-Red Laboratories Inc. Tokyo, Japan) 로 595 nm에서흡광도를측정하였다. 측정은각농도별로세번시행하였으며, 이에따른평균값과표준오차는 Microsoft Excel program을사용하여분석하였다. 2.4. 유세포분석기 (Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS) 를통한 Cell cycle arrest 관찰 Cell cycle은 Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS) 를사용하여측정하였다. Hep3B cell에 AAE를 24시간동안농도별 (40, 60, 80 µg/ml) 로처리한후 PBS로 washing 하였다. LY294002, Pifithrin-α와병행처리시에는 inhibitor를 30분전처리한뒤, AAE를처리하였다. Trypsin- EDTA로세포를떼어낸뒤원심분리 (3000 rpm, 10분 ) 를통해세포를모으고 95% 이상의에탄올에고정시킨뒤, 40 µg/ml의 propidium iodide (PI) 과 200 µg/ml의 RNase A로염색한다음 Flow- FACS Canto (Becton-Dickinson Biosciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA) 로 DNA content를측정하였다. 2.5. Wound healing assay Hep3B cell을 6 well plate에각 well당 1 10 5 cells/ml로분주하여 24시간동안배양한다음배양액을제거한뒤 10 µl pipet tip으로 scratch하였다. 현미경으로관찰하고배양액교체후 AAE를 40, 60, 80 µg/ml 농도별로처리하였다. LY294 002, Pifithrin-α와병행처리시에는 inhibitor를 30분전처리한뒤, AAE를처리하였다. 물질처리후 12~24시간동안 wound healing이된정도를현미경으로사진을찍어관찰하였다. 2.6. Western blotting 6-well plate에 Hep3B cell를각 well당 1 10 5 cells/ml로분주하여 24시간동안배양한다음 AAE를농도별로처리하였다. LY294002, Pifithrin-α와병행처리시에는 inhibitor를각각 20 µm을처리후 30분뒤, 모든물질을최종처리한후 6시간동안 CO 2 incubator에서배양하였다. 배양이끝난세포에 RIPA lysis buffer [25 mm Tris-Cl (ph 7.4), 1% NP40, 0.5% sodium
Hep3B 간암세포에서개똥쑥추출물에의한 Cell Cycle Arrest 효과 177 deoxycholate, 150 mm NaCl, 1 mm PMSF] 를각 well 에 150 µl 씩첨가하여단백질을분리한뒤 14000 rpm, 4 o C 에서 20 분동안원심분리하여상등액을취하였다. 추출한단백질은 ELISA-reader 를이용하여 595 nm 에서흡광도를측정하여정량하였다. 8%, 12% acrylamide gel 를이용하여만들어놓은 sample 을 loading 한뒤전기영동을실시한후 nitrocellulose membrane 에 transfer 하였고, 다음에 2% Bovine serum albumin (BSA) 을이용해 blocking 한후, 1 차항체를 4 o C 에서밤새반응시키고 TBST 로 5 분씩 4 번 washing 후 2 차항체를결합시킨다음실험결과를측정하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. AAE 의처리가 Hep3B 간암세포주의증식에미치는영향선행연구에서는항산화효과가뛰어나다고알려진개똥쑥을에탄올로추출하여인체자궁경부상피암세포 (HeLa) 와위암세포 (AGS) 에처리하였을때암세포증식억제효과가있음이보고되었다 [3,4]. 본연구에서는 Hep3B 간암세포에 AAE 를처리하였을때암세포의증식억제효과를알아보고자하 였다. AAE 가 Hep3B 세포의증식에미치는영향을확인하기위하여 AAE 를농도별 (10, 20, 40, 60, 80, 100 µg/ml) 로처리한뒤 MTT assay 를통하여암세포의생존율을측정하였다. 그결과, Fig. 1(a) 에따르면 AAE 의농도가높아질수록 Hep 3B 간암세포의증식이억제되는것을확인하였으며, 12 시간보다 24 시간에서증식이더많이억제되고있다는것을확인하였다. 따라서 Hep3B 간암세포의증식억제가 AAE 의농도와시간의존적으로일어남을확인하였다. 또한 wound healing assay 를통하여 AAE 이세포증식억제에미치는영향을확인하고자하였다. Hep3B cell 을배양한 6 well plate 에 scratch 를낸후 AAE 를 12 시간동안농도별 (40, 60, 80 µg/ ml) 로처리하여 wound healing area 를측정하였다. 그결과 Fig. 1(b) 에서와같이 control 군보다물질처리군에서시간이지날수록 wound healing area 이감소함을확인하였다. 따라서본실험에서수행한연구결과를통하여 AAE 가 Hep3B 간암세포의세포증식을억제하고있음을확인하였다. 3.2. AAE 를처리한 Hep3B 간암세포의 cell cycle arrest 유도효과 CDK2 는 Cyclin E 와결합하여 G1 에서 S 단계로의전이와 DNA 복제를위한가장중요한신호단백질이다. Cyclin E- Fig. 1. Cell cycle arrest effect of AAE in Hep3B liver cancer cell. Cell viability was measuresd by MTT assay. He3pB cells were treated with concentrations of AAE 10~100 µg/ml. (A) cells were treated with 10~100 µg/ml of AAE 12 h and 24 h. The statistical analysis of the data was carried out by use of an ANOVA-test. a-c p<0.05 and a-c p<0.05 (each experiment, n=3). (B) The wound healing assay was empolyed to determine the migration of Hep3B liver cancer cell line. Wound was performed after confluence, and cells were treated with concentreation of AAE 40~80 µg/ml. Cells were monitored every 12 hours for one day to evaluate the rate of migration into the scratched area.
178 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 175-181 (2015) CDK2 복합체는 CDK2 에붙어있던인산기가떨어져나가면서 Rb-E2F 복합체의 Rb 단백질을인산화시켜 E2F 와떨어지면서 G1 에서 S 단계로넘어갈수있게된다. [3] 이러한복합체를억제시키는인자로 CKI 라고불리는 CIP/KIP 그룹이있으며, CKI 중하나인 p21 단백질은이복합체와결합하여 CDK2 에붙어있는인산기가떨어지지못하게하는과정을통해 S 기로의진행을방해하여세포주기억제를일으키는것으로보고되었다 [9]. 선행연구에서는인체혈구암세포 U937 cell 에물질을처리하였을때암세포의증식이억제되고 cell cycle arrest 가유도됨이보고되었다 [10]. 따라서본실험에서는 AAE 에의한세포증식억제효과가 cell cycle arrest 에의한것인지알아보기위하여 Flow cytometric 을실시하였다. Hep 3B cell 에 AAE 를농도별 (40, 60, 80 µg/ml) 로 24 시간동안처리하여반응시킨후 40 µg/ml 의 propidium iodide (PI) 과 200 µg/ml 의 RNase A 로염색한다음 DNA content 를측정하였다. 그결과, Fig. 2 에서나타난것과같이 G1 값이 40 µg/ ml 에서 54.42%, 60 µg/ml 에서 57.2%, 80 µg/ml 에서 61.06% 로농도의존적으로증가하고반면에, S 값이 40 µg/ml 에서 22.72%, 60 µg/ml 에서 21.04%, 80 µg/ml 에서 16.67% 와 G2 값이 40 µg/ml 에서 23.96%, 60 µg/ml 에서 21.83%, 80 µg/ ml 에서 13.45% 로농도의존적으로감소하는것을확인하였다. 이러한실험결과를통하여 AAE 가 Hep3B 세포의 G1 checkpoint arrest 를유도함을확인하였다. 3.3. AAE 처리에따른 Cell cycle arrest 관련단백질의조절정상세포에서 Akt 는 Mdm2 의발현을유도하여 p53 을저해시킨다고보고되었다. 정상세포의 Akt 가인산화되어활성상태가되면 Mdm2 를인산화하여 p53 ubiquitination 을통해일정수준으로존재하게한다. 반면에, 손상된세포가계속해서증식하여생긴암세포에서는 Akt 활성이억제됨으로써 p53 발현을유도하여세포증식억제에영향을준다는것이선행연구를통해확인되었다 [11-14]. p53 은정상세포에서 p- Mdm2 에의해일정수준으로존재하지만, 세포가손상되거나스트레스를받게되면 p-mdm2 의활성이억제되어 p53 의발현정도가일정수준보다상승하게된다. 이렇게상승된 Fig. 3. AAE effects on p-mdm2 Ser166, p-akt, p53, CyclinE, p-cdk2 T14, p-cdk2 Y15 and p21 in Hep3B liver cancer cell. Cells were treated 40~80 µg/ml for 6 h. protein levels of p-mdm2 Ser166, p-akt, p53, CyclinE, p-cdk2 T14, p-cdk2 Y15 and p21 were determined by Western blotting. The β-actin probe served asd protein-loading control. p53 은손상된세포를복구시키거나복구가불가능한경우세포주기억제를통한생장조절및 apoptosis 를유도한다. 선행연구에의하면 Mdm2 의활성이저해될수록 p53 과 p21 의발현이증가하는것을확인하였고, 그로인해 cell cycle arrest 가일어난다는것을확인하였다 [12]. 본실험에서는 Hep3B 세포에 AAE 를농도별로처리하여 cell cycle 신호단백질들의양상을알아보기위하여 Western blotting 을실시하였다. 그결과 Fig. 3 에서나타난것과같이 AAE 를농도별로처리하였을때아무것도처리하지않은대조군에비하여 AAE 의농도가증가함에따라 p-akt 의활성은감소하고, p53 의발현은증가하는것을확인하였다. 인산화된 Akt 는 Mdm2 를인산화하여 p53 을낮은수준으로발현되게함으로써 Cell cycle 을진행하는것으로보고되었다 [15]. 또한 Akt pathway Fig. 2. AAE caused cell cycle arrest at G1 phase. Cells were treated with AAE (40~80 µg/ml) for 24h. Cell cycle arrest effect were measured by flow cytometric.
Hep3B 간암세포에서개똥쑥추출물에의한 Cell Cycle Arrest 효과 179 는 cell cycle protein 의활성을조절함으로써 G1 에서 S 기로의 cycle 을진행시킨다 [16,17]. 선행연구에서 cell cycle 에관여하는 Akt 와 Mdm2 의활성이 p53 과 Cdk2, Cyclin E 그리고 p21 의활성을감소하는것을확인하였고 [18,19], 본실험에서수행한연구결과를통하여 AAE 가 Hep3B 간암세포에서 cell cycle 에관여하는 p-akt 와 p-mdm2 신호분자의활성을감소시키고 p53 과 CDK2, Cyclin E 억제제인 p21 의발현양이증가하면서 Cyclin E 의발현양은감소하는것을확인하였다. 또한 Cyclin E 의 subunit 인 phosphoform CDK2 는증가함을확인하였다. CDK2 는 Threonine14 과 Tyrosine15 에인산기가붙게되는데인산기가떨어져나가면서 cell cycle 진행이이루어지기때문에 Phosphoform CDK2 는 Inactive 한형태임을확인하였다. 3.4. Akt 와 p53 의저해에따른신호단백질의조절과세포증식에미치는영향 Hep3B 간암세포에서 Akt 와 p53 을저해하였을때 Hep3B 간암세포의증식과사멸에미치는영향을알아보기위하여 Akt 저해제인 LY294002 와 p53 저해제인 Pifithrin-α 를 AAE 와병행또는각각단독으로처리하였을때 MTT assay 와 Wound healing 및 cell cycle FACS 와 Western blotting 을하였다. 그결과 Fig. 4(a) 에나타난바와같이 LY294002 단독처리군에서는세포증식이억제되었고, AAE 병행처리군은 LY294002 단독처리군보다더욱억제되는것을확인하였다. 반면에 Pifithrin-α 단독처리군은 control 군에비해증가하였고, AAE 병행처리군은 Pifithrin-α 단독처리군보다증식이억제됨을확인하였다. 또한 Fig. 4(b) 에나타난바와같이 wound healing assay 의결과 LY294002 단독처리군에서는 wound healing area 이 control 군에비해억제되었고, AAE 병행처리군은 LY 294002 단독처리군보다더욱억제되는것을확인하였다. 반면에 Pifithrin-α 처리군은 control 군과 wound healing area 이비슷하게증가하였으며 AAE 병행처리군은 Pifithrin-α 단독처리군보다 wound healing area 이억제되었음을확인하였다. 이러한결과를토대로 Akt 가암세포의증식에있어서중요한역할을하며, Akt 의작용이억제되었을시세포증식과관련된인자들이억제됨을알수있었다. 또한, Pifithrin-α 는 p53 의발현을억제하는것이아니기때문에 Pifithrin-α 단독처리시세포증식억제에영향을미치치않음을알수있었다. 이와같은조건으로 FACS 와 Western blotting 을실시한결과 Fig. 4(c) FACS 에서는 LY294002 단독처리군에서는 G1 값이 55.25% AAE 병행처리군은 58.83% 로 AAE 에의해더욱증가하였고, S 값은 LY294002 단독처리군에서는 22.87% AAE 병행처리군은 15.03%, G2 값은 LY29400 단독처리군에서는 22.58% AAE 병행처리군은 21.33% 로감소하였다. 반면에 Pifithrin-α 단독처리군의 G1 값이 51.6% AAE 병행처리군은 52.16% 로 AAE 에의해더욱증가하였고, G2 값은 Pifithrin-α 단독처리군에서는 24.52% AAE 를병행처리군은 16.43% 로감소하였다. 이와같이 Akt 를저해했을때 AAE 에의한 G1 cell cycle arrest 효과가더욱강하게나타나며 Akt 가세포증 식에중요인자임을나타낸다. 이러한결과를토대로 AAE 에의한 cell cycle arrest 가 Akt 의존적으로진행됨을알수있었다. 동일한조건에서 AAE 가 p-cdk2(t14,y15), Cyclin E, p21 신호분자조절에어떠한영향을미치는지알아보기위해 Western blotting 을실시하였다. 그결과, Fig. 4(d) 에서보이는바와같이 LY294002 와 AAE 를병행처리시 Cyclin E 의발현은 LY294002 단독처리군보다현저히감소하였고, Pifithrin-α 와 AAE 병행처리했을때 AAE 에의해감소하였지만 Pifithrin-α 의영향으로 AAE 단독처리군과비교하여발현양이증가한것으로보인다. p-cdk2(t14,y15), p21 은 LY294002 와 AAE 를병행처리했을때 LY294002 단독처리군과비교하여발현양이증가하였고 Pifithrin-α 와 AAE 병행처리했을때 AAE 에의해증가하였지만 Pifithrin-α 의영향으로 AAE 단독처리군과비교하여발현양이감소한것으로보인다. 이러한결과로보아 AAE 에의한 p-cdk2(t14,y15), Cyclin E, p21 신호분자의조절은 Akt 의존적인경로를통해일어남을확인하였다. 한편 Pifithrin-α 를단독으로처리했을때 p-cdk2(t 14,Y15), p21 의발현이감소하였으며, Cyclin E 는증가하였다. 이는 AAE 가 p53 에비의존적으로일어나며 Akt 의존적인경로로일어남을확인했다. 결론적으로, 본연구를통하여 AAE 가 Hep3B 간암세포의 cell cycle arrest 에의한증식억제하는것으로밝혀졌다. 이러한 G1 cell cycle arrest 는 AAE 가 Akt 신호분자를경유하여일어나는것으로보인다. 4. CONCLUSION 개똥쑥은여러신호경로를통하여암세포의증식억제와항암효과가있다고보고되었다 [3,4]. 따라서본연구에서는 Hep3B 간암세포에 AAE ( 개똥쑥추출물 ) 를처리했을때 cell cycle arrest 에어떠한영향을미치는지알아보았다. MTT assay 를통한세포생존율측정에서 AAE 를농도별과시간별로처리했을때 Hep3B 간암세포의증식이억제되었다. Wound healing assay 를통한이동성실험에서 AAE 가농도와시간에의존적으로세포이동성이감소됨을확인하였다. 이러한세포증식억제와이동성억제가 cell cycle 에의한것인지를알아보기위해 Flow cytometric 를실시한결과 AAE 농도의존적으로 G1 cell cycle arrest 가일어남을확인하였다. 또한, cell cycle 신호단백질들의양상을알아보기위하여 Western blotting 을실시한결과 cell cycle 을진행하는단백질인 p-akt 와 p-mdm2, cyclin E 의발현은감소하였고, cell cycle arrest 를유도하는단백질인 p53, p-cdk2(t14,y15), p21 의발현은증가함을확인하였다. 한편 LY294002 를단독으로처리했을때와 AAE 병행처리했을때 p-cdk2(t14,y15), p21 의발현이증가하였으며 Pifithrin-α 를단독으로처리했을때와 AAE 병행처했을때 p-cdk2(t14,y15), p21 의발현이감소함을확인하였다. 따라서본연구를통하여 AAE 가 Hep3B 간암세포의 cell cycle arrest 효과가 Akt 의존적으로일어나는것임을확인
180 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 30(4): 175-181 (2015) Fig. 4. AAE induces cell cycle arrest via Akt-dependent, p53-independent pathway. Cells co-treated LY294002 or Pifithrin-α with AAE in Hep3B liver cancer cells. (A) Cells were pre-treated with 20 µm LY294002 or 20 µm Pifithrin-α for 30 min and then co-treated with 60 µg/ml AAE for 12 h and 24 h. Cells viability was measured by MTT assay. The statistical analysis of the data was carried out by use of an ANOVA-test. *, p<0.05, **,##, p<0.01 and,,, p<0.001 (each experiment, n=3). (B) Wound was performed after confluence, and cells were pre-treated with 20 µm LY294002 or 20 µm Pifithrin-α for 30 min and then co-treated with 60 µg/ml AAE. Cells were monitored every 12 hours for one day to evaluate the rate of migration into the scratched area. (C) Cells were pre-treated with 20 µm LY294002 or 20 µm Pifithrin-α for 30 min and then co-treated with 60 µg/ml AAE for 24 h. Cell cycle arrest effect were measured by flow cytometric. (D) Cells were pre-treated with 20 µm LY294002 or 20 µm Pifithrin-α for 30 min and then co-treated with 60 µg/ml AAE for 6 h. Protein levels were determined by Western blot analysis. 하였다. 의하여연구되었음. Acknowledgements 이논문은 2014 학년도한남대학교학술연구조성비지원에 REFERENCE 1. Montalto, G., M. Cervello, L. Giannitrapani, F. Dantona, A. Terra-
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