工學碩士學位請求論文 티벳식물 ( 푸얼차, 서장채국화 ) 의멜라닌생성억제기작에관한연구 Effect of Tibet herbs on the melanin synthesis by B16 melanoma cell 2005 年 8 月 仁荷大學校大學院 生物工學科 ( 生物工學科專攻 ) 安昭泳
工學碩士學位請求論文 티벳식물 ( 푸얼차, 서장채국화 ) 의멜라닌 생성억제기작에관한연구 Effect of Tibet herbs on the melanin synthesis by B16 melanoma cell 2005 年 8 月 指導敎授金殷基 이論文을工學碩士學位論文으로提出함 仁荷大學校 大學院 生物工學科 ( 生物工學科專攻 ) 安昭泳
Effect of Tibet herbs on the melanin synthesis by B16 melanoma cell by So-Young Ahn A THESIS Submitted to the faculty of INHA UNIVERSITY In partial fulfillment of the requirements For the degree of MASTER OF SCIENCE Department of Biological Engineering August 2005
이論文을安昭泳의碩士學位論文으로認定함. 2005 年 8 月 主審 : 副審 : 委員 :
요약 멜라닌은 멜라노사이트에서 생성되는 생합성물질이고 피부색을 결정하는 주 요 물질이다. 천연물질의 기능성화장품으로써 미백물질을 개발하고자, 두 가지 중국천연물질 ( 푸얼차, 서장채국화 ) 에 대한 멜라닌 생합성 억제기작이 연구되 어지고 있다. mushroom tyrosinase enzyme 을 이용한 타이로시네이즈 활성 테스트는 이들 천연 추출물에 의해서는 크게 줄어들지가 않았다. 또한 DPPH 를 이용한 free radical scavenging 활성도 미비하였다. B16 melanoma cell 을 이용한 멜라닌 생성 함량은 푸얼차 150ppm 농도에서 7 0%, 서장채국화 200ppm 에서는 50% 의 저해율을 보였다. 그리고 cell 내의 타이로시네이즈 활 성 측정 결과 150, 200 ppm농도에서 각각 4 5, 50% 의 저해율을 보여 타이로시 네이즈의 합성을 저해하는 것으로 나타났다. 대부분의 미백활성물질이 타이로 시네이즈 활성 저해를 바탕으로 할 때, 이들 두 천연물질은 타이로시네이즈의 합성을 억제시키는 새로운 물질로서 기능성 미백화장품 원료로의 사용이 기대 된다. I
Abstract Malanin is a biopolymer produced in the melanocyte and is a main material determining the skin color. In search for the depigmenting agent as a cosmeceutical, two chinese herbs (Camellia sinensis var. macrophylla and Dendranthema Spp.) w ere ex amined and their mechanisms of melanin synthesis inhibition were investigated. In-vitro tyrosinase activity w as not significantly reduced by these plant ex tracts. Also in-vitro free radical scavenging activity was insignificant. The amount of melanin produced by B16 malanoma cell was reduced by 7 0% at 150 ppm and 50% at 200ppm of Camellia sinensis var. macrophylla and Dendranthema Spp. ex tracts, respectiv ely. The amount of tyrosinase was reduced 4 5 % at 150 ppm and 50 % at 200 ppm plant extracts, respectiv ely indicating that these extracts inhibited the synthesis of tyrosinase. Considering that most depigmenting agents were based on the inhibition of tyrosinase activity, these plant extracts would contain novel compounds inhibiting the synthesis of tyrosinase. II
차 례 요약 Ⅰ Abst ract Ⅱ 차 례 Ⅲ 그 림 목 차 Ⅵ 표 목 차 Ⅷ Ⅰ. 서 론 1 1.1. 미백화장품의 시장규모 및 특허출원 동향 1 1.2. 기술개발 동향 및 전망 2 2. 피부의 색소 4 2.1. 멜라닌 (Me lanin) 4 2.2. 각질형성세포 (K eratinocyte) 5 2.3. 멜라닌세포 ( Melanocyte) 5 2.4. 멜라닌 합성과정 7 2.5. 멜라난의 구분 11 2.5.1. Eume lanin 11 2.5.2. P heome lanin 12 3. 타이로시네이즈의 작용 메카니즘 13 3.1. 타이로신의 접근차단 13 3.2. 타이로시네이즈의 환원에 의한 비활성화 14 4. 미백제 15 4.1. 피부색을 결정하는 요소 15 III
4.2. 미백제의 기작 16 4.3. 천연물에서의 미백제 19 Ⅱ. 연구목적 22 Ⅲ. 재료 및 방법 23 1. 실험 및 활성 측정용 시료 제조 23 2. 실험재료 추출 및 분리 23 3. 시약 및 실험기기 25 4. Tyrosinase 활성 (in v iv o) 저해 실험 25 5. DP P H 소거활성 측정 26 6. 멜라닌 세포 배양 27 7. 멜라닌 함량 측정 27 8. Cell 내의 Tyrosinse 활성 측정. 28 9. 세포독성 측정 28 10. W estern blott ing 을 이용한 Tyrosinase 발현양 조사 29 Ⅳ. 결과 및 고찰 3 1 1. In v itro Tyrosinase 활성, 항산화, 멜라닌 저해 검색 3 1 2. Tibet herbs 추출 및 분리 3 3 3. 용매별 추출한 분획에 대한 멜라닌 함량 저해 측정 3 3 4. 용매별 추출한 분획에 대한 세포 독성 측정 3 6 5. Tibet herbs( 푸얼차, 서장채국화 ) 에 대한 미백 효능 검증 3 9 5.1. 멜라닌 함량 저해 측정 3 9 5.2 배양 중 Tibet herbs 첨가 시 Tyrosinase 활성의 변화 4 0 5.3. 배양 후 물질 첨가 시 Tyrosinase 활성의 변화 4 3 5.4. 세포독성 평가 및 세포 수 측정 4 6 IV
5.5. Tyrosinase 발현량의변화조사 4 9 Ⅴ. 결론 52 참고문헌 53 감사의글 59 V
그림목차 Fig. 1. 미백활성성분별 출원 현황 2 Fig. 2. Epide rmal me lanin unit and Melanin synt hesis 7 Fig. 3. Difference of melanogenesis according to the human race 8 Fig. 4. Me lanocyt es 9 Fig. 5. P athw ay for production of eumelanin and pheomelanin in melanocyte 10 Fig. 6. Biological target mechanism 17 Fig. 7. 천연물에서 추출된 천연물질들 21 Fig. 8. Inhibitory activity of melanin synthesis on B16 melanoma cell -Camellia sinensis var. macrophylla 3 4 Fig. 9. Inhibitory activity of melanin synthesis on B16 melanoma cell. -Dendranthema Spp. 3 5 Fig. 10. The cell proliferation -Camellia sinensis var. macrophylla. 3 7 Fig. 11. The cell proliferation -Dendranthema Spp. 3 8 Fig. 12. Effect of Camellia sinensis var. macrophylla water extract on melanogenesis in B16 cells. Melanin contents and tyrosinase activ it ies w ere reduced. 4 1 Fig. 13. Effect of Dendranthema Spp. w ater MeOH ex tract on melanogenesis in B16 cells. Melanin contents and tyrosinase act iv itie s w ere re duce d. 4 2 Fig. 14. Effect of mineral salts on appearance of dark variant in continuous VI
culture. -Camellia sinensis var. macrophylla 4 4 Fig. 15. Effect of mineral salts on appearance of dark variant in continuous culture. -Dendranthema Spp. 4 5 Fig. 16. Cell proliferation after treating w ith Camellia sinensis var. macrophylla w ater ex t ract. 4 7 Fig. 17. Cell proliferation after treating w ith Dendranthema Spp.water MeOH ex tract 4 8 Fig. 18. Total protein of Dendranthema Spp. was extracted and applied to w este rn blot ting. 50 Fig. 19. Total protein of sinensis var. macrophylla was extracted and applied to w este rn blot ting. 51 VII
표목차 Table 1. Mechanisms of curre nt w hite ning agent 18 Table 2. Screening of tyrosinase inhibitory activ ity, antiox idant activity and melanin content within B16 melanoma cell of Chinese Tibet plan 3 2 Scheme 1. F low diagram of solv ent fractionation of the 9 9.6% m ethanol extract prepared from materials. 24 VIII
Ⅰ 서론 1.1. 미백화장품의시장규모및특허출원동향 삶의질향상으로인해인간의미 ( 美 ) 에대한욕구와관심은날로높아져가고있으며특히백색미인은고대부터인간의가장큰소망이기도하다. 이러한욕구에부응하기위해최근들어미백화장품관련기능성화장품의개발및관심이모아지고있다 [1]. 국내화장품시장은 4,044( 백만달러 ), 세계화장품시장은 17 3,061( 백만달러 ) 의규모로알려져있으며 ( 자료원 : 2001, Euromonitor) 세계시장규모는 2000년도 81조원으로추정되며앞으로연평균 6.4 % 의성장률을지속하여 2005년에는 107 조원에이를전망이다. 미백화장품관련출원은 2001년 11월공개분기준약 17 0여건으로 19 85년특허출원이시작된이후 1995년이후부터연평균 16% 의출원증가율을보이고있다. 또한전체출원중한국이 69%, 일본이 14% 인데비해미국이나유럽은 17% 에불과하여서양여성보다아시아여성들이미백에더관심이많다고볼수있다. 미백활성성분별로는천연식물추출물이 44%, 신규화합물이 25%, 기존미백성분으로알려진비타민 C 유도체등그밖의물질이 31% 로나타났고천연식물을통한새로운미백물질의탐색은국내업체가특히주력하는분야이나, 외국업체도관심을보이고있어이는세계적인흐름으로보인다 (Fig. 1)[2]. 1
Fig. 1 미백활성성분별출원현황 미백화장품의원료개발에있어서천연식물에대한연구는우리전통의학에기반을둔원료개발이라는점과우리나라소비자들의식물성화장품에대한선호도가높다는점이맞물려국내화장품개발의주력분야가되고있으며, 우리나라가경쟁력을확보할수있는부분이어서이분야에대한지속적인특허출원이예상된다. 1.2. 기술개발동향및전망 미백제의개발은멜라노사이트내에서의멜라닌생성을억제하는것과멜라노사이트자극물질을조절하는것과멜라닌배설을촉진시키는것으로크게 3 가지방향으로이루어지고있다. 현재화장품회사에서널리사용하는미백화장품에사용되는원료는천연추출물을이용하거나또는일부합성한원료를 2
사용하고있으며가장널리사용하는미백제로코지산 (Kojic acid), 알부틴 (Arbutin), 비타민 C 유도체, 루시놀 (Rucinol) 등이있으며, 식약청에고시된미백화장품의원료는닥나무추출물, 알부틴, 에틸아스코르빌에테르, 유용성감초추출물등이다. 미백화장품에는이들미백성분외에도보조성분으로자외선차단제가함유되어있는경우가많으며, 화장품에함유되는기능성성분들의효과를극대화하기위한안정성, 경피흡수에관한기술개발관련연구가진행되고있다. 멜라노사이트세포를활성화하는인자들은엔도세린 (Endothelin-1), 멜라노사이트자극호르몬 (α-msh), 일산화질소, 히스타민 (Histamine), 피리딘다이머 (ptpt) 등을포함한십여종에달하며현재멜라노사이트활성화를유도하는정보전달물질들의활성을저해하는성분들이식물추출물에서다수발견되고있다. 향후에는피부미백메카니즘에서가장중요한역할을담당하고있는타이로시나제유전자의프로모터영역을제어하여타이로시나제단백질의합성을제어할수있는저해제나타이로시나제의 mrna 을불활성화하는저해제등유전자레벨에서의연구결과를활용한미백제의개발이진행될전망이다. 3
2. 피부의색소 2.1 멜라닌 (Melanin) 사람의 피부색을 결정하는 가장 큰 인자인 멜라닌은 피부에 고루 분포하 는 페놀류의 생물고분자 물질로 검은 색소와 단백질의 복합체이다. 멜라닌 멜 라노사이트 내의 소기관인 멜라노좀에서 합성되며, 멜라노사이트의 수지상 돌 기를 통하여 주위의 케라티노사이트로 이동한다. 인종에 의한 피부색의 차이 는 개개인의 멜라노사이트에 있는 멜라노좀의 생성능력과 표피로 이동하는 멜 라노좀의 수, 성숙도, 존재양식에 의해 나타난다. 즉 백인의 표피세포 내에는 멜라노좀이 일반적으로 막에 둘러싸어 집괴상의 멜라노좀 복합체를 형성하지 만, 유색인종에서는 그들이 여기저기 분포하고 있기 때문에 짙은 색으로 보여 진다. 흑인의 경우는 백인에 비하여 유전적으로 더 많은 멜라닌을 생성하고, 생성하는 멜라닌의 종류도 eumelanin 의 비율이 더 높으며, 또 케라티노사이트 내에서 멜라닌이 더 퍼지게 되어 있어서 결국은 피부색이 더 검게 된다 [3,4,5,6]. 4
2.2 각질형성세포 (K eratinocyte) 표피의주요구성성분이며외배엽에서기원한다. 각질형성세포란단백질성분인각질 (Keratin) 로구성되어있다는뜻에서붙여진이름이다. 전체표피를이루는세포의 80% 를차지하는각질은외부환경으로부터피부를방어해주는보호막역할을한다. 이세포는표피의각질층뿐만아니라모발과조갑의구조단백질을형성하는각질이라는복잡한세섬유단백질을생산하는특수한기능을갖고있다. 각질형성세포는분화하여각화함에따라형태가변하며 4 개세포층으로구분된다. 즉, 표피의맨아래층으로부터기저층 (basal layer), 유극층 (squamous layer), 과립층 (granular layer) 및각질층 (horny layer) 의 4 층으로나누어진다. 2.3 멜라닌세포 (Melanocyte) 피부색과관계가깊은멜라닌세포는신경릉에서유래되며멜라닌을포함하는멜라닌소체 (melanosome) 라불리우는소기관을합성분비하는수지상세포이다. 멜라닌세포는표피의기저층에산재하며그밀도는부위에따라차이가있으나멜라닌세포 : 기저세포의평균비율은 1 : 10 정도이다. 멜라닌세포는표피외에도점막상피, 모낭, 진피, 망막, 포도막, 연수막, 내이및기타조직 5
에서도볼수있다. 멜라닌세포의수상돌기는상당한거리의표피내로뻗어많은 (36 개정도 ) 각질형서세포와접촉하고있는것을볼수있다. 이연합을표피멜라닌단위 (epidermal melanin unit) 라한다. 이러한구조가멜라닌세포에서생성된멜라닌을주위의각질형성세포로전달하는것을용이하게해주며, 전달된멜라닌은표피의윗부분으로확산되어자외선을포함한넓은영역의빛을흡수하여태양광선에의한피부손상을방어한다 [7]. 멜라닌소체는 Golgi 영역에서합성되며타이로신 (tyrosine) 에타이로시나제 (tyrosinase) 가작용하여합성이시작되며여러단계를거쳐서조밀한멜라닌색소과립을형성한다. 멜라닌소체는수상돌기끝으로옮겨지고각질형성세포가멜라닌세포의돌기를탐식하므로멜라닌소체가표피-멜라닌단위의각질형성세포로옮겨진다. 멜라닌세포의수는민족과피부색에관계없이일정하며계속적으로생장하는멜라닌소체의수, 크기, 멜라닌화의정도, 분포및각질형성세포내에서의멜라닌소체의분해에의해피부색이결정된다. 검은피부는흰피부보다큰멜라닌소체를만들며그크기는각질형성세포에어떻게분포되느냐를결정하는중요한요소가된다. (Fig. 2) 6
Fig. 2 Epidermal melanin unit and Melanin synthesis 큰멜라닌소체는세포질내에개별적으로분산되나작은멜라닌소체는막으로둘러싸여있는식소체 (phagolysosome) 속에들어있다. 피부가자외선에노출되면멜라닌세포는크기, 수및수상돌기가증가하며멜라닌형성이촉진된다. 자외선외에멜라닌세포자극호르몬, 에스트로겐및안드로겐등과같은호르몬도멜라닌세포를자극하는능력이있다. 멜라닌은여러염증상태의부산물로생기는유해한자유기산소유도체에대한생화학적중화제로작용할수있다. 2.4 멜라닌합성과정 피부색은멜라닌형성에있어서의세포내소기관 (organelle) 즉, 멜라닌세포 7
내에서생성되어세포외로방출되는멜라노좀 (melanosome) 이라고불리는특수한형태의갈색세포내소기관의수와분포에관련되어있다. 멜라닌색소는멜라닌세포와그주위를둘러싸고있는다수의말피기세포 (Malpighian cells ; 주로 keratinocyte) 로구성된표피멜라닌단위에서생성된다. Fig. 3에표피멜라닌단위를구성하는멜라닌세포 (Melanocyte) 와주변각질형성세포 (Keratinocyte) 들이기능적으로접촉하고있는형태를제시하였다. Fig. 3 Difference of melanosome according to the human race 멜라닌은멜라닌세포안의독특한소기관인멜라노좀 (melanosome) 에서만들어지면, 생성된멜라닌과립은멜라노좀에들어있는채로멜라닌세포의수지상돌기끝부분으로이동하며, 멜라노좀을함유한수지상돌기의끝이각질형성세포의식세포작용에의하여각질형성세포내로전달되는데 (apocopation, cytocrinia), 이렇게얻은멜라닌을각질형성세포는핵주위에축적하게된다. 8
표피에있어서의멜라닌생성과말피기세포 ( 각질형성세포 ) 로의전송에관련된 형태적, 대사적경로와멜라노좀에서의멜라닌의합성기작은 Fig. 4 와같다. Fig. 4 Melanocytes 멜라닌색소를함유한멜라노좀의수와주위말피기세포로의멜라나좀전송은부분적으로호르몬과자외선등에크게영향을받으나, 일차적으로는유전적인영향을크게받는다. 멜라노좀 (melanosome) 내에서의멜라닌의생성에는 tyrosinase라는효소가가장중요한역할을하며, 그밖에 tyrosinase의합성및전송에관여하는세포내조절인자, dopachrome tautomerase, peroxidase, catalase, glutathione reductase 등의효소나구리 (Cu), 아연 (Zn), 9
철 (Fe) 등의금속이온및 interferon(ifn), prostaglandin(pg), histamine 등이 멜라닌의합성과전달에관여하는것으로알려져있다 [8,9,10]. 멜라닌은피부표면의기저층에존재하는멜라노사이트 (Melanocyte) 세포에서타이로신 (Tyrosine) 이효소및비효소적산화반응을거쳐생성되며, 표피를구성하고있는각질세포로전이된다. 멜라닌생합성과정은 Fig. 5에서멜라닌생합성이화학적으로나타내어져있다 [11]. Fig. 5 P athw ay for production of eumelanin and pheomelanin in melanocyte 10
멜라닌의생합성에관여하는중요한효소는타이로시네이즈 (Tyrosinase), Tyrosinase-Related protein 1(TRP -1) 및 Dopachrome tautomerase(trp-2) 이있다. 타이로시네이즈의두효소는비교적최근에개발되어최근에주목을끌고있으나멜라닌합성에결정적인역할을하는효소는타이로시네이즈이다. 멜라닌의생합성첫단계는타이로시네이즈에의하여유발된다. 타이로시네이즈는 3가지이상의촉매기능이있다. 그중타이로신을도파 (DOPA : Dihydroxy phenylalanine) 로만들어주는 tyrosine hydroxylase 기능과도파 (DOPA) 를도파퀴논 (Dopa-quinone) 으로만드는 Dopaoxidase 의기능이멜라닌형성에중요한역할을한다. 이두반응 (Oxidativ e- hydroxylation) 의다음단계과정들은비효소적인반응에의해서도가능한것으로알려져있으며타이로시네이즈단독으로도멜라닌생성이가능하다고알려져있다. 2.5 멜라닌의구분 2.5.1 Eumelanin 멜라닌합성과정에서효소에의해진행되어나오는부산물인 eumelanin 은 DHI 와 DHICA 를중간산물로하여진행하여 melanin 을생성하여생기는것 11
이다. 이멜라닌은색깔은짙은갈색에서검은색이며유기용매도는염기에도잘녹지않으며황은 0~1 % 미만으로거의없고질소를 6~9 % 정도함유하고있다 [6]. Eumelanin 은 DHICA 를유도체로하는 DHICA-melanin 과 DHI 를유도체로하는 DHI-melanin 이같이혼합되어있는형태로되어있다. DHICA-melanin 은약간의갈색을뛰며, 용매에아주조금녹는성질을가지고있으며, 중간형태의분자량을가지고있다. 반면 DHI-melanin 은검은색을가지며용매에전혀녹지않는성질을가지고있고, 높은분자량을가진다 [12]. Melanin 은 biopolymer 로서 protein, nucleic acid 그리고 carbohydrate 와같은서로다른 monomer unit 들이서로공유결합을통하여결합되어있는형태로그특징을결정하기가매우어렵고, melanin 이생성되면그것이세포내다른물질들과공유결합을하고있어한번생성이되면그분해가쉽지않다. 또이것은 acid hydrolysis 된 amino acid 가나오므로 protein 을함유하고있지만이것의제거는매우어렵다. 이것은 melanosome 에서 melanin 이독립적으로형성되고 apoprotein moiety 사이의 interaction 으로부터 melanoprotein 의개념이그것을대변해줄것이다 [ 9, 13 ]. 12
2.5.2 P heomelanin Eumelanin 과는다르게합성과정에서 tyrosianse의함량이적고 cystein 이나 glutathione 의함량이높을때효소의반응이다른아미노산의작용으로멜라닌이생성될때생기는것이다. 이것의색은붉은빛을띄는갈색이나노란색을띄는성향이강하고상대적으로작은분자량을지니고염기성용액에잘녹는성질을갖는다. 이것은기본구조에수용성물질인 alanine side chain을함유하고있어이러한특징을보인다. 구조적으로는 sulfur 를상대적으로많이함유하고있고, 서로다른 oxidation level의 structural unit을함유하고있으므로그에대한 redox state 는알려지지않았다 [9]. 3 타이로시네이즈의작용메카니즘 3.1 타이로신의접근차단 멜라닌합성의주효소인타이로시네이즈의세부적인메카니즘을알아보면, 기질이타이로시네이즈의활성부위와쉽게결합해타이로신이타이로시네이즈에접근을방해함으로써멜라닌의합성을저해하는경우로생물활성원료개발에가장많이연구하는방법이다. 이경우는다시두가지로재분류될수 13
있다. 1) 기질의크기가타이로시네이즈의활성부위크기와정확히같은경우 2) 활성화된타이로시네이즈의구리 2 가이온과킬레이트 (Chelate) 되는경우 기질크기에의한활성저해의경우어느정도의크기, 모양이적당한가를쉽게정의하는것은위험하나대략적으로보아타이로신과비슷한정도의크기에서좋은효과를나타낸다고보면무방하다. 킬레이트 (Chelate) 에의한활성저해는미백제연구의주분야로서주로폴리페놀유도체, 트로폴론유도체및방향족들이주로보이는예들이다. 킬레이트에의한저해제로서알려진성공적인예는코직산 (Kojic acid) 을들수있으며아스코빅산 (Ascorbic acid) 도약한활성이있다고알려져있다 [14]. 3.2 타이로시네이즈의환원에의한비활성화 타이로시네이즈활성부위안쪽에있는구리 2가이온을구리 1가이온으로환원시켜타이로시네이즈자체를비활성화된형태로전환시키는방법이다. 이과정은타이로시네이즈의환원과정이기때문에환원제다시말해항산화제종류가유용할것으로기대된다. 이관점에서성공적으로개발된미백제의예는코직산 (Kojic acid) 과아스코빅산 (Ascorbic acid) 을들수있다. 14
3.3 타이로시네이즈의재활성화차단 비활성화된디옥시타이로시네이즈는주위의산소를받아옥시타이로시네이즈로재활성화된다. 이관점에서실험하고증명한예로는코직산 (Kojic acid) 를들수있다 [15]. 대표적인예로는구체적인메카니즘이밝혀지지않았으나리놀산 (Linoleic acid) 을들수있다. 리놀산 (Linoleic acid) 에의한미백메카니즘은타이로시네이즈에킬레이트 (Chelate) 효과가없으며, 타이로시네이즈효소자체를비활성화시킨다고알려져있다 [16]. 리놀산 (Linoleic acid) 은시스-이중결합 (Cis-double bond) 두개와탄소 18 개를포함하고있는불포화지방산이며, 라디칼 (Radical) 에의하여산소와과산화반응 (Peroxidation) 을한다. 이기능은리놀산 (Linoleic acid) 에의한멜라닌합성저해효과가타이로시네이즈재활성을위한산소의공급차단에의한효능이라는가능성을보여주고있다. 4 미백제 4.1 피부색을결정하는요소 건강한인간의피부색은붉은색, 노란색, 갈색및파란색색소의적절한조 합에의해서표현된다. 이색소의생성은각각의기원에따라서외부의카로 15
텐 (carotenoids) 을섭취하여발현되는노란색, 신체내에서형성되는멜라닌 (melanin) 에의한갈색, 진피 (dermis) 의산화된헤모글로빈 (oxygenated hemoglobin) 에의한붉은색그리고환원된헤모글로빈 (reduced hemoglobin) 에의한파란색으로나눌수있다. 이중멜라닌색소가피부색의결정에있어서가장주된역할을하는물질로서인종, 개인에따라차이가있다 [17]. 4.2 미백제의기작 피부에멜라닌이과도하게침착하는것을방지하며피부내색소함량을줄이기위한목적을달성하기위한방법을살펴보면 Fig. 6 에서와같이자외선차단, 멜라닌색소를신속하게 bleaching 시키는방법, 생합성된 melanin 이 melanosome 에실려 keratinocyte 로전달되는단계를차단하는방법, Melanin 생합성의속도결정단계인 tyrosinase 활성을억제하는방법, melanocyte 의세포막으로부터 tyrosinase 효소활성및생합성촉진을유도하는신호전달을차단하는방법, 멜라닌세포에특이적으로독성을나타내는물질을투여하는방법등이있다 [12]. 미백을위한원료와그기작을 Table 1에나타내었다. 16
Fig. 6 Biological target mechanism 17
Mechanisms P rincipal ingredients UV interrupter Para Amino Benz oic Acid, Cinnamate, TiO 2 Melanin product inhibitor Arbutin, K oj ic Acid, L icorice Ex t., G lucosamine stratum corneum Retinoic Acid, AHA, Azelaic Acid Improv ement Melanin cell death Hydroquinone antioxidant Vitamin C, Vitamin E Table 1 Mechanisms of current w hitening agent 18
4.3 천연물에서의미백제 화장품에서요구되는효능 효과중에서미백은주름방지나육모 양모와더불어가장중요한효능 효과중의하나이다. 피부의색소침착은표피의기저층에있는색소세포에의해서생성되는멜라닌이그원인으로, 멜라닌생성을억제하는약제는미백화장품의유효성원료로서예부터활발한연구가있었다. 한편, 최근에는화장품분야에있어서도자연파화장품들이시장에서인기를독차지하고있다. 그결과화장품혹은의약부외품의원료공급원으로서천연물이주목되고있다. 이와더불어식물유래성분의미백효과에대한연구도활발히이루어지고있다 [18,19,20,21]. 최근수년간멜라닌생성과제어메카니즘연구의진보는매우현저하였다. 이러한연구성과에의해, 색소세포내의티로시나제 (Tyrosinase) 저해뿐만아니라멜라닌생성의억제, 티로시나제생합성저해작용, 멜라닌배출촉진등미백메카니즘의문제는다각적으로연구되고있다. 또한멜라닌색소세포내에있어서멜라닌모노머를적당한화합물로트립시키는멜라닌생성억제법도제창되고있다 [22]. 종래의미백제로서는, 비타민 C 및그유도체, 알부틴및코직산이유효성분으로허가되어있다. 비타민 C는이상색소침착을억제하는작용이있으며그자신이생체내에존재하기때문에안전성이높다는인식이있고, 미백효과에 19
대해서도소비자들인신앙과유사한신뢰감을가지고있어서화장품의배합성분으로적합한것으로간주되고있다. 그러나다른비타민류와는달리열이나산화에매우약하기때문에분해되기쉽다는결점이있다. 따라서최근그유도체개발연구에활기를띄고있다. 현재화장품에많이사용되고있는미백화장품원료인알부틴의효능은티로시나제의기질로서작용하는능력과관련이있다. 또다른미백제인코직산은티로시나제의활성자리에있는구리를킬레이트화함으로써티로시나제활성을저해한다고보고되고있다. 천연물유래의성분과관련된최근에미백제로는 DL-alpha-tocopheryl ferulate, 안정형비타민 C 유도체들, ellagic acid, 3,5-dicaffeoylquinate, alph-hydroxy acids 등이있다. 연구된이들성분들은 tyrosinase, DOPAchrome tautomerase 및 DHICA-oxidase 의저해활성, 티로시나제생합성저해활성, 멜라닌생성억제작용, 자동산화반응억제작용, 자외선차단작용등에초점을맞춰연구되고있다 [23]. 신규미백제를개발하기위하여천연물에서추출된물질들은분자구조와효능의상관관계를규명하고, 유도체를합성하여효능이극대화되고독성이적은미백제를개발하는것이다. 천연물질중상백피추출물, 감초추출물및닥나무추출물등플라보노이드 (Flavonoide) 계물질들이관심의대상이되고있다 [24,25,26]. 20
Fig. 7 천연물에서추출된천연물질들 상백치추출물에서는옥시레스버라트롤 (Oxyresveratrol) 이효능물질로알려져있으나, 모루신 (Morusin) 등 2,4-레소시놀 (2,4-resorcinol) 을포함하고여러플라보노이드유도체가함께발견되고있다. 닥나무추출물인카지놀 F도역시플라보노이드유도체로볼수있으며최근상품화된바있다. 마지막으로감초추출물인글라브리딘 (Glabridin) 은일찍부터그효능을인정받은바있는물질이다. 이들추출물의공통점은모두 2,4- 레소시놀 (2,4-resorcinol) 을포함하고있으며항산화효과가있다는점이다. 2,4-레소시놀 (2,4-resorcinol) 은타이로시네이즈활성부위의구리이온과킬레이트 (Chelate) 작용을할것으로기대되어진다. 항산화제는킬레이터 (Chelator) 와분리되어있으나탄소고리로연결되어있어서 2,4- 레소시놀 (2,4-resorcinol) 이구리이온과킬레이터 (Chelator) 되어있는동안타이로시네이즈활성부위근청고정될것으로기대된다. 타이로시네이즈활성부위에근접한항산화제는큰크기에도불구하고충분히구리이온을환원시켜타이로시네이즈를비활성화시키는것으로여겨진다. 21
Ⅱ 연구목적 본연구는기능성화장품분야중미백분야에그중심을두고있다. 미백에관련된기능성화장품원료의연구에있어서거의모든연구가멜라닌과연관되어져있다. 미백활성성분으로천연물질에관한연구가높아지고있고이러한흐름에맞추어이연구에서는중국티벳지역에있는천연물질의유효성을찾고자하였다. 이지역은고산지대로자외선이강하기때문에식물자체의항산화성질이강하고실제로피부에대한민간요법으로도많이이용되고있다. 따라서이러한물질들은안전성이나, 효능면에서그가능성이있다고보고있다. B16F10 melanoma cell 을이용하여멜라닌저해능을알아보고자하였고, 멜라닌생성에 key enzyme인 tyrosinase의활성저해능뿐만아니라 tyrosinase 양자체를저해하는지도확인하고자하였다. 22
Ⅲ 재료및방법 1. 실험재료및활성측정용시료제조본실험에사용한천연물질은중국의티벳지역에서서식하는식물로서실제로피부에관한민간요법으로쓰이고있는물질들을수입하였다. 천연물은주입하기전에막여과지 (PTFE 0.2 μm, Advantenc MFS Inc.) 를이용해전처리를하였다. 추출로이용한용매들은덕산화학 (Duksan Pure Chemical Co., Ltd Korea) 에서구입하였고, 물은감압펌프 (Division of Milipore, Waters, Milford, MA 01757, USA) 와필터 (HA-0.5μm, Division of Milipore, Waters Co., USA) 를이용하여여과한증류수를사용하였다. 2. 실험재료추출및분리 천연물을각각 5g 씩 9 9.5% 메탄올 150 ml로상온에서 12 시간씩 3 회반복추 출하여, 추출액을한데모아감압농축하였다. 메탄올추출물을동량의증류수에현탁시켜추출하여메탄올분획을얻었다. 나머지물층을헥산으로추출하여헥산분획을얻었다. 나머지클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올도같은방법으로추출하였고, 나머지를물층으로하였다. 각각의분획에대하여미백활성을검토하였다. 23
Sample 99.6% aq. MeOH Filtration & vaccum evaporation Residue MeOH extraction P artition w ith n-hex ane & H 2 O N-Hexane layer Residue Partition with CHCl 3 & H 2 O Chloroform layer Residue Partition with EtOAc & H 2 O Ethyl acetate layer Residue Partition with BuOH & H 2 O N-Butanol layer Residue Scheme 1 Flow diagram of solv ent fractionation of the 9 9.6% methanol ex tract prepared from materials 24
3. 시약및실험기기 Tyrosinase 저해활성측정으로, dopa oxidase의활성은 L-DOP A를기질로하여생성된 dopachrome의흡광도 microplate reader(versa max, Molecular Devices, USA) 를이용하여 490nm 에서흡광도를측정하였다. 실험에사용한 melanoma 세포주 B16F10은 (ATCC; catalogue no. CRL-64 7 5) 에서분양받았다. 이세포주는 RP MI 164 0 배지에 10% (vol/ vol) FBS (Fetal Bovine Serum), 1% 의 Penicillin-Streptomycin (G ibco BRL, USA) 을첨가한것을기본배지로하여 humidified 5% CO 2, 3 7 incubator 에서계대배양하며실험에사용하였다. Optical density 측정에사용된 spectrophotometer (UV-160A, SHIMADZU) 는 475nm 에서사용하였다. 각종 assay 에사용된 L-3,4-dihydroxyphenylalanin(L-DOPA), mushroom tyrosinase, DP P H(1,1-Diphenyl-2-picrylhydraz yl), DMSO(Dimethylsulfox ide ), 3 -[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetraz olium bromide(mtt), 등은 Sigma(USA) 제품을사용하였다. 4. Tyrosianse 활성 (in v itro) 저해실험 Tyrosinase 활성은 DOPA oxidase 활성을측정한것으로나타내었다. DOP A oxidase 활성은 L-DOP A를기질로하여 tyrosinase에의하여생성되는반응산물인 dopachrome을흡광도 4 9 2nm 에서측정하였다. 반응구는 120μl 25
의 L-DOPA(8.3mM, 67mM phosphate buffer [ph6.8] 에녹였다.) 와 40μl의시료를 9 6-well plate에넣었다. 그런다음, 4 0μl의타이로시나제 (125U) 을넣어혼합하였다. 37 에서 30분간반응시킨후 microplate reader 를이용하여 492nm 에서흡광도를측정하여다음과같이저해율 (IC 50 ) 을구하였다 [27]. 저해율 (%)= 반응구의 O.D 1-100 대조구의 O.D 5. DP P H 소거활성측정 각물질의항산화효과는 Bolis 의방법에따라일정농도의각시료에 0.3mM DPPH( 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 용액을첨가하여강하게 vortex 한후 3 7 에서 30분간반응시킨다. Proton-radical scavenging 에의하여 DPPH가탈색되므로 517nm 에서특징적인광흡수를나타내는 DPPH의광흡수정도로항산화효과를알수있었다. 따라서대조구와실험구의흡광도차를대조구흡광도로나눈값을백분율로하여소거율을계산하고이를다시농도와의상관관계로 50% 의소거율을나타내는 RC 50 값을산출하였다 [28]. 26
6. 멜라닌세포배양 분양받은멜라닌세포는 5% CO 2, 3 7 의조건하에서계대한후세포배양용 6-w ell plate 에각 w ell 당 1.2 10 5 이되도록분주하고같은조건하에서 24 시간배양하였다. 멜라닌세포의수는배양세포의일정량을취하여 trypsin blue 로염색하고 hematocytometer 를이용하여계수하였다. 24 시간배양후각세포가담긴 well 로부터새로운배지로교환해주고, 시험에사용될천연물질들을 final 농도 50ppm, 100ppm, 200ppm 으로 48시간동안처리하여같은조건으로배양하였다. 대조구로서는시료를첨가하지않은배지를이용하였으며, 표준물질로는 arbutin(sigma, St Louis, Mo, USA) 을사용하였다 [29]. 7. 멜라닌함량측정배양이끝난후세포를 PBS 로세척하여오래된배지및세포의부산물등을제거하고, Trypsin-EDTA 를이용하여부착된세포를모아 RPMI 1640 배지로세척한후 1,500rpm 3 분동안원심분리하여세포를수거하였다. 이세포들은다시 PBS 로세척하여 10% DMSO 가담긴 1N NaOH 를첨가하여 8 5 항온수조에서 30분간멜라닌을용해시킨후반응을정지시키고, spectrophotometer 를이용하여 405nm 에서 optical density 를측정하였다 [30]. 멜라닌생성저해율 (%)= 27
대조구의흡광도- 시료첨가구의흡광도대조구의흡광도 100 반응구의각 well 당전체멜라닌의양을 absolute melanin 으로표기하고, 다 시세포수당멜라닌함량은 relative melanin 으로표기하였다. 8. Cell 내의 Tyrosinase 활성측정 Tyrosinase 활성은 DOPA oxidase 활성을측정한것으로나타내었다. 멜라닌함량측정실험과같은방법으로세포를배양한후 Trypsin-EDTA 으로세포를떼어내고원심분리를실시하였다. 회수한세포를 PBS 로 1회수세, 원심분리하였다. 상층액을제거한후 Triton X-100을첨가하여 4 에서 3 0 분간 sonication 시켜서세포를 lysis 시켰다. 4 에서 10,000g로원심분리하여얻은 cell lysate 10 μl와 10mM DOPA 90μl를혼합하여 37 에서 1시간동안매 10 분마다파장 475nm 에서흡광도를측정하여상대적 tyrosinase 활성으로나타내었다 [31]. 9. 세포독성측정 각물질들의세포독성을조사하기위하여 MTT 분석방법을이용하였다. 9 6-well plate 에 B16melanoma 세포주를 1.5 10 4 의 cell 이되도록 plating 하였 28
고, 24시간배양을한다음 positive control로 arbtin, 그리고천연물질을각농도별로첨가하여 4 8시간동안배양하였다. 세포배양이끝난후 100ul 의 MTT(5mg/ ml) 을첨가하여 3 ~ 4 시간반응시켰다. 배지를제거한후 100ul의 DMSO (Dimethylsulfoxide) 을첨가하여 formazan crystals 을용해시켰다. 15~ 20분강하게흔들어준다음, ELISA reader로파장 560(57 0)nm에서흡광도를측정하였다. 천연물을첨가한처리구는대조구를기준으로하여 % Control 로데이터화하였다 [32]. 10. W estern blotting 을이용한 Tyrosinase 발현양조사 세포를 6 well plate에 1.2 10 5 cells 이되도록 plating 하여 24 시간이지나면각물질들을첨가하여 2일동안배양하였다. 배양이끝난후 lysis buffer 를첨가하고 4 에서 3 0분간 sonication 을시켰다. epen tube로옮긴다음, 10,000g 에서 5분동안원심분리를실시하여 cell debris 등을제거하였다. 시료내단백질의정량은 bicinchoninic acid(bca) 방법으로실시하였으며, 총단백질 500μg을이용하여 12% SDS-P AGE를실시하였다. 전기영동이끝난후 PVDF membrane (0.45 μm, invetrogen) 을사용하여 eletrotransfer (3 50mA for 1h) 하였다. eletrotransfer 가끝나면 P VDF membrane 을 block ing solution[tbst with 5% skim milk] 으로실온에서 1시간반응시켰다. P rimary antibody는 tyrosinase(from goat) 인 C-19(SantaCruz, CA) 를이용하 29
였다. Membrane을 blocking solution 에 1:2500이되게희석하여 primary antibody 와실온에서 1시간 30분반응을실시하였다. TBST 로 10 분씩 3회수세하였고, anti-goat HRP-conjugated secondary antibody 를 blocking solution 에 1:5000으로희석하여 1시간 3 0분반응시켰다. 반응이끝난후 TBST로 10 분씩 3회수세하였다. Protein band는 TMB membrane peroxidase substrate(kpl) 를이용하여나타내었다 [33,34]. 30
Ⅳ 결과및고찰 1. In vitro Tyrosinase 활성, 항산화, 멜라닌저해검색 중국티벳고산지대의천연물질에대하여 mushroom tyrosinase 을이용하여 tyrosinase 활성의저해와 DPPH를이용한항산화활성그리고 B16 melanoma cell 을이용하여멜라닌저해능을검색한결과, 세가지효능을모두만족시키는물질은서장채국화, 장청과, 감송, 푸얼차, 강황으로나타났다 (Table 2). 그러나이들물질중에장청과는제일높은활성을보였으나독성이있었고, 감송과강황은이미알려진물질이라제외시켰다. 31
Table 2. Screening of tyrosinase inhibitory activity, antioxidant activ ity and melanin content w ithin B16 melanoma cell of Chinese Tibet plants. Tibet plants a) Tyrosinase IC 50 (%) b) DPPH RC 50 Melanin(%) c) 장인진 -11 0.0107 111.3 서장채국화 59 0.0180 4 1.5 간엽차 29 0.0110 108.5 야생메귀체 20 0.0320 98.3 홍경천 -0.8 0.0054 110.2 장청과 61 0.0022 16.4 홍연 4 3 0.0210 80.2 제유 4 7 0.0086 7 8.3 푸얼차 4 6 0.0054 58.7 감송 4 0 0.114 6 4 6.6 천일홍 -9 0.1997 104.3 강황 4 8 0.017 3 60.7 b) Tyrosinase inhibitory effect w as represented as % against control: Inhibitory activ ity(%) = {(Ac-As)/Ac}x100. c) Melanin contents measured by B16 melanoma cell. 32
2. Tibet herbs 추출및분리 푸얼차 (Camellia sinensis var. macrophylla) 는 n-hex an, Chloroform, Ethyl acetate, n-butanol, water 순으로용매분획하였고서장채국화 (Dendranthema Spp) 에대해서는 Chloroform, Ethyl acetate, water 로분획하였다. 각분획별을감압농축하여미백활성을평가하였다. 3. 용매별추출한분획에대한멜라닌함량저해측정 B16F10 melanoma cell을 6 well plate 에 1.2 10 5 cells/w ell 이되게 seeding 한후 24 시간이경과하면 sample 을첨가하여 48시간배양하였다. 배양이끝난후 trypsin-edta 를처리하여 epen tube 에세포를모아멜라닌생성량의저해능을나타내었다. 푸얼차와서장채국화를 50, 100, 200( μg / ml ) 의농도로첨가하였고멜라닌의합성이현저히감소하였다 (Fig. 8, 9). 서장채국화는농도에의존적으로멜라닌함량이감소하였고푸얼차는 200μg / ml에서급격히감소하는것을볼수있었다. 두물질모두 Positive control 로이용한 Arbutin 보다도멜라닌합성저해능이우수한것으로관찰되어졌다. 33
350 300 Melanin(%) Melanin contents(%) Control 250 200 150 100 50 0 Control Pu-Me 50 Pu-Me 100 Pu-Me 200 Pu-Hex 50 Pu-Hex 100 Pu-Hex 200 Pu-Chl 50 Pu-Chl 100 Pu-Chl 200 Pu-Et 50 Conc.(ug/ml) Pu-Et 100 Pu-Et 200 Pu-Bu 50 Pu-Bu 100 Pu-Bu 200 Pu-W 50 Pu-W 100 Pu-W 200 Fig. 8 Inhibitory activity of melanin synthesis on B16 melanoma cell (Control : non-treat, Me : Methanol, Hex : Hexane, Ch : Chloroform, Et : Ethylacetate, Bu : Butanol, W : W ater) 34
120 Melanin contents (% of Control) 100 80 60 40 20 0 control SJ-Ch 50 SJ-Ch 100 Melanin(%) SJ-Ch 200 SJ-Et 50 SJ-Et 100 SJ-Et 200 Conc.(ug/ml) SJ-W 50 SJ-W 100 SJ-W 200 Fig. 9 Inhibitory activity of melanin synthesis on B16 melanoma cell (Control : non-treat, Ch : Chloroform, Et : Ethyl acetate, W : Water) 35
4. 용매별추출한분획에대한세포독성측정 B16F10 melanoma cell을 이용하여 푸얼차와 서장채국화에 대한 세포독성을 조사하였다. 푸얼차를 처리했을 때 멜라닌 저해능이 고농도 (200 μg / ml ) 에 급격히 줄어드 는 것으로 보아 독성이 있을 것으로 예상했다. 독성 평가 결과, hexan layer 와 ethyl acetate layer 에서는 독성이 강한 것으로 나타났으나 butanol layer 와 water 에서는 control과 비슷한 것으로 보아 독성이 거의 없는 것을 알 수 있 었다 (Fig. 10). 푸얼차는 후발표차로 녹차처럼 주로 차로 즐겨 먹는다. 그래서 독성이 없는 부분 중에서 물층을 중심으로 열수추출하여 미백 효능을 알아보 고자 하였다. 서장채국화는 농도별로 늘어나는 것으로 보아 세포증식 촉진 효과를 보였다. 즉, 독성이 없음을 알 수 있었다 (Fig. 11). 36
120 100 % of Control [560nm] 80 60 40 20 0 control Pu-Me 50 Pu-Me 100 Pu-Me 200 Pu-Hex 50 Pu-Hex 100 Pu-Hex 200 Pu-Chl 50 Pu-Chl 100 Pu-Chl 200 Pu-Et 50 Conc.(ug/ml) Pu-Et 100 Pu-Et 200 Pu-Bu 50 Pu-Bu 100 Pu-Bu 200 Pu-W 50 Pu-W 100 Pu-W 200 Figure 10. B16 cells w ere seeded at 1.5 10 4 cells/ well. After 24 h, the cells were treated w ith Camellia sinensis var. macrophylla for 4 8h. The cell proliferation was measured by MTT assay. 37
180 160 140 120 (%) Control 100 80 60 40 20 0 control SJ-chl 50 SJ-chl 100 SJ-chl 200 SJ-Et 50 SJ-Et 100 SJ-Et 200 Conc.(ug/ml) SJ-W 50 SJ-W 100 SJ-W 200 Fig. 11. B16 cells were seeded at 1.5 10 4 cells/well. After 24h, the cells were treated w ith Dendranthema Spp. for 48h. The cell proliferation was measured by MTT assay. 38
5. Tibet herbs( 푸얼차, 서장채국화 ) 에대한미백효능검증 5.1 멜라닌함량저해측정 용매별분획한멜라닌함량저해결과물층부분에서멜라닌저해능이좋았고, 세포독성또한없었다. 그리고푸얼차는주로차로즐겨먹기때문에열수추출을하여미백효능을알아보고자하였다. 그리고서장채국화는 MeOH 로추출한것에대하여같은방법으로미백효능을검증하였다. B16F10 melanoma cell을 6 well plate 에 1.2 10 5 cells/w ell 이되게 seeding 한후 24 시간이경과하면 sample 을첨가하여 48시간배양하였다. 배양이끝난후 trypsin-edta 를처리하여 epen tube 에세포를모아멜라닌생성량의저해능을측정하였다. 50, 100, 150, 200( μg / ml ) 의농도로첨가하였고농도의존적으로멜라닌의함량이감소하였다 (Fig. 12). 서장채국화또한같은농도로처리하였고, 농도의존적으로줄어드는것을확인하였다 (Fig. 13). 39
5.2 배양중 Tibet herbs 첨가시 Tyrosinase 활성의변화 멜라닌측정할때와같은농도로 seeding 하고 24 시간경과하면푸얼차를 50, 100, 150, 200( μg / ml ) 농도로첨가하여 4 8시간배양하였다. Trypsin-EDTA 으로떼어낸세포를 Triton X-100 으로 lysis 시킨다음원심분리를하여얻은 lysate 와 10mM DOPA 를혼합하여 Tyrosinase 활성변화를측정하였다. 100( μg / ml ) 에서부터 Tyrosinase 활성이줄어드는것을확인하였다 (Fig. 12). 서장채국화도같은조건으로처리하였고, 멜라닌함량저해와비례하게 Tyrosinase 활성이저해하는것을알수있었다 (Fig. 13). 40
Fig. 12 Effect of Camellia sinensis var. macrophylla w ater extract on melanogenesis in B16 cells. Melanin contents and tyrosinase activ ities w ere reduced. 41
Fig. 13 Inhibitory activ ity of Dendranthema Spp. methanol ex tract on melanin synthesis and tyrosinase activities on B16 melanoma cell. 42
5.3 배양후물질첨가시 Tyrosinase 활성의변화 Tibet Herbs( 푸얼차, 서장채국화 ) 가 tyrosinase 활성저해물질인지확인하고자 B16F10 세포배양후물질을처리한후 Cell lysate 를준비하였다. 이러한물질들을 50, 100, 150, 200( μg / ml ) 농도로처리한결과, tyrosinase 활성에별다른영향이없는것으로나타났다 (Fig. 14, 15). 43
140 Tyrosinase activity (% of Control) 120 100 80 60 40 20 0 control Pu 50 Pu 100 Pu 150 Pu 200 Conc.(ug/ml) Fig. 14. Effect of mineral salts on appearance of dark variant in continuous culture. -Camellia sinensis var. macrophylla- 44
120 Tyrosinase activity (% of control) 100 80 60 40 20 0 control SJ 50 SJ 100 SJ 150 SJ 200 Conc.(ug/ml) Fig. 15. Effect of mineral salts on appearance of dark variant in continuous culture. -Dendranthema Spp- 45
5.4 세포독성평가및세포수측정 B16F10 melanoma cell을 9 6 well plate 에 1.5 10 4 cells/w ell 이되게 seeding 하고 24 시간경과하면같은농도로 sample 을처리하여 48시간배양하였다. 오랜된배지는제거하고새배지로갈아준다음, MTT solution (0.5 mg / ml ) 100 μl씩넣는다. 3 ~ 4 시간후 MTT solution 을제거한뒤 DMSO 100μl씩넣어서녹인다. 강하게섞어준다음 560nm 파장에서흡광도를측정하였다. Cell 수는 hemocytometer (OMG) 로 counting 하였다. 독성평가결과, 푸얼차는농도가증가할수록오히려 Cell 이자라는 proliferation 이일어났으나, 직접 cell 을 counting 한결과농도의존적으로줄어드는것으로확인하였다. Cell 수와 MTT 결과가차이가나는이유는 MTT 는죽어가는 Cell도측정하기때문이라사료되고, 200( μl / ml ) 농도에서는독성이있는것으로생각되어진다 (Fig. 16). 서장채국화는 MTT 결과와 Cell 수모두농도의존적으로줄어들었고그차이가약간큰것으로확인하였다. MTT 결과만고려했을때, 독성은거의없는것으로나타났다 (Fig. 17). 46
Fig. 16. Cell proliferation after treating w ith sinensis var. macrophylla water extract. The viability of the cells was determinated by MTT assay. Cell number counted by hemocytometer. 47
Fig. 17. Cell proliferation after treating w ith Dendranthema Spp. methanol ex tract. The viability of the cells was determinated by MTT assay. Cell number counted by hemocytometer. 48
5.5 Tyrosinase 발현양의변화조사 푸얼차와서장채국화를배양중에첨가하였을경우 Tyrosinase 활성이감소하였고배양후첨가한경우는 Tyrosinase 에대한직접적인저해를나타나지않는것으로나타났다. 따라서본실험에서는 Tyrosinase 활성의감소가효소발현양의변화에의한것인지를확인하고자하였다. 사용한세포주는 B16F10 melanoma cell 을이용하였으며농도는모두 50, 100, 150, 200( μg / ml ) 로하여물질을첨가하였다. Tyrosinase 는 Cell 내의 Tyrosinase 활성변화와비슷하게농도의존적으로발현량이감소하는모습을관찰할수있었다 (Fig. 18). 그러나서장채국화는농도에따른효소발현양의변화차이가없는것으로보아, Tyrosinase 양자체를저해하지는않는것으로사료된다 (Fig. 19). 49
Fig. 18. Total protein of sinensis var. macrophylla was extracted and applied to w estern blotting. Specific detection of tyrosinase w as performed using C-19 (anti-tyrosinase). 50
Fig. 19. Total protein of Dendranthema Spp. w as extracted and applied to w estern blotting. Specific detection of tyrosinase w as performed using C-19 (anti-tyrosinase). 51
Ⅴ 결론 본논문에서는신물질로예상되고있는푸얼차와서장채국화에대한새로운미백원료로서의기능성및작용기작을연구하고자 melanogenesis의최종산물인 melanin 생성에가장 key enzyme 인 Tyrosinase 의활성을측정하였다. 또한 Tyrosinase protein 발현량에대한효과를알아보기위하여 Western blotting 도실시하였다. 멜라닌함량측정결과 arbutin과비교하였을때멜라닌형성억제능이더우수한것으로나타났다. 150μl / ml의농도에서푸얼차는 7 0% 의멜라닌저해능을보였고, 서장채국화는 200μl / ml농도에서 50% 의멜라닌감소를일으켰다. 배양중과배양후에두물질을첨가하였을경우 cell lysate 에있는 tyrosinase 활성을비교하였을때배양중에 tyrosinase 활성이농도의존적으로저해됨을관찰하였다. 그러나배양후에는직접적인저해능을볼수없었다. 이두물질에의한 Tyrosinase 발현량또한감소함을 Western blotting으로확인하였다. 상기의결과들을종합해볼때푸얼차와서장채국화는멜라닌생성을억제할수있는미백후보물질임을알수있었고, post-trnascription level 에서조절에관여하는것으로사료된다. 그러나이두물질의자세한작용기작이밝혀지기위해서는많은연구가진행되어야할것이다. 52
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감사의글 어느덧 2년의대학원생활을마치고그소중한결실을마무리하게되었습니다. 대학원생활은저에게가장소중한시간들로기억될것입니다. 밤을새서실험도하고, 실험결과에고민도하면서많이울고웃곤하였습니다. 내실험에대해계획을세우고실험을하면서, 때로는시행착오도겪으며결과까지마무리하는책임감을가지고한단계씩일을진행해나가는경험은앞으로인생을살아가는데있어서큰도움이될것입니다. 바이오신소재실험실에들어와서스스로일을해낼수있다는가능성과기회를주시고이끌어주신우리교수님. 실험실은사회의축소판이라며인간관계또한중요시여기고주위사람들을질책과명령이아닌칭찬과너그러운마음을가지라는교수님의말씀을마음속깊이간직하겠습니다. 정말로사회생활은실험실과는또다른세상인것같습니다. 저는항상교수님의말씀을기억하며일을하는데있어서도추진력과능력을힘껏발휘하려고노력하고있습니다. 실험실생활동안에는잘느끼지못했던점들이지금생각해보면그모든것이제가한단계성장할수있도록해준밑거름이었던것같습니다. 항상부족한저를꾸준히옆에서지켜봐주시고, 논문이완성될수있도록지도해주신김은기교수님께깊이감사드립니다. 그리고후학양성과생물공학의발전에여념이없으신생물공학교수님들께도감사드립니다. 힘들고어려울때조용한격려한마디로용기를주시고저에게많은배움을주신동 준오빠, 경모오빠, 영범오빠, 향복언니께감사드리고, 저와늘함께하지는못했지만 59
언제어디서나환경방을추억하며응원을아끼지않으셨던많은선배님들께도감사의 말씀을드립니다. 알콩달콩함께생활해온실험실식구들... 늘저를챙겨주고많은도움을주었던지호오빠, 중진오빠, 사수정선언니, 정옥이... 너무너무고맙고한편으론받기만한것같아미안하기도해요.. 더멋진사회생활하길바라고더불어늘행복하라는말을전합니다. 때론동기처럼때론후배처럼소녀같은웃음을지닌은영, 은숙, 지혜.. 졸업막바 지까지날배려해주고편하게해주어서고마워... 졸업준비잘하고좋은결실맺을 수있도록나도응원할게. 나를잘따라주었던귀여운상희와윤영이.. 앞으로우리실험실을잘이끌어서어느곳보다도더잘나가는실험실로가꿀꺼라믿는다. 그리고베트남친구들륵과영.. 가끔날긴장시키긴했지만늘웃음을주곤했는데... 지금은능숙하게잘하는지.. 0차후배님들도더불어모두모두실험열심히해서멋진실험자가되길바랍니다. 그리고막판실험에결정적으로많은도움을주었던공정방찬희에게도감사하다는말을전합니다. 그동안바쁘다는핑계로잘챙겨주지못한나의소중한친구들현, 성경, 민영, 다 영, 보연, 선희, 자영에게도미안하고고맙다는말을전합니다. 그리고힘들때나기 60
쁠때나곁에서버팀목이되어준사랑하는규선오빠에게감사하며이들앞날에행복 하고좋은일들만가득하길바랍니다. 마지막으로부족한딸을지금까지믿어주시고묵묵히지켜봐주신사랑하는부모님께감사드리며, 오래도록건강하고행복하게사시길바랍니다. 군복무중에도자주안부전화해준사랑하는동생세혁이에게도고맙다는말을전합니다. 지금제가이자리에서있는원동력이바로가족의사랑이라는것을다시한번느껴봅니다. 짧고도길었던 2 년간의석사생활을마감하며아쉬움과섭섭함이많이남지만제작 은노력의결실인이논문을제가사랑하는모든이에게바칩니다. 항상긍정적으로 최선을다하고밝은웃음을전하는사람이되겠습니다. 감사합니다. 61
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