J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 44(7), 1090~1099(2015) http://dx.doi.org/10.3746/jkfn.2015.44.7.1090 연구노트 상백피로부터 α-glucosidase 저해제의분리및동정 장연정 임현희 전영희 이동희 최상원 대구가톨릭대학교식품영양학과 Isolation and Identification of α-glucosidase Inhibitors from Morus Root Bark Yeong Jung Jang, Hyun Hee Leem, Yeong Hee Jeon, Dong Hee Lee, and Sang Won Choi Department of Food Science and Nutrition, Catholic University of Daegu ABSTRACT Among the four different parts of mulberry (Morus alba L.) tree, ethanol extract of Morus root bark showed the highest α-glucosidase inhibitory activity (IC 50=12.01 μg/ml). Bioassay-guided fractionation of the ethanolic extract of root bark by Diaion HP-20, silica gel, ODS-A, and Sephadex LH-20 column chromatographies led to the isolation of four compounds, including Compound (Comp.) 1 (IC 50=5.22 μg/ml), Comp. 2 (IC 50=1.78 μg/ml), Comp. 3 (IC 50=2.94 μg/ml), and Comp. 4 (IC 50=1.54 μg/ml) with strong α-glucosidase inhibitory activities. Their chemical structures were elucidated as morusin (Comp. 1), kuwanon H (Comp. 2), chalcomoracin A (Comp. 3), and chalcomoracin B (Comp. 4) by UV and NMR spectral analyses. These results suggest that prenylflavonoid and mulberrofuran of Morus root bark may be useful as potential therapeutic agents for diabetes. Key words: Morus root bark, α-glucosidase inhibitors, morusin, kuwanon H, chalcomoracin A & B 서 최근급격한산업사회의발전에따른국민소득증가및식생활의서구화로의변모로육류소비가크게늘어나면서암, 고혈압, 심장병, 당뇨및치매등여러생활습관병이크게증가하고있으며, 특히 2010~2011년기준국내고혈압 당뇨인구는이미 1,073만명에달하고있고 ( 이는 30세이상인구셋중한명꼴 ) 2040년에는성인절반 (1,842만명 ) 이고혈압 당뇨에걸릴것이라는놀라운보고가나오고있다 (1,2). 따라서이러한생활습관병을예방하고치료할수있는보다안전하고효과있는식물유래의생리활성물질 (phytochemicals) 을개발하려는연구가활발히진행되고있으며 (3,4), 특히당뇨및고혈압치료에좋은것으로잘알려진뽕나무산물로부터새로운기능성소재의개발연구가크게주목을받고있다 (5). 상백피는뽕나무 (Morus alba L.) 의뿌리껍질로예로부터한방에서는해열, 항경련, 항알레르기, 항염증작용과더불어이뇨촉진등의효과가있는것으로알려져왔다 (6). 동의보감에 상백피는폐장 ( 肺臟 ) 의기운이막혀숨이차고가슴이그득한천만 ( 喘滿 ) 과수기 ( 水氣 ) 로부종 ( 浮腫 ) 이생긴것을치료한다, 담 ( 痰 ) 을삭이고갈증을멎게하며폐속의수 Received 3 March 2015; Accepted 22 April 2015 Corresponding author: Sang Won Choi, Department of Food Science and Nutrition, Catholic University of Daegu, Gyeongsan, Gyeongbuk 712-702, Korea E-mail: swchoi@cu.ac.kr, Phone: +82-53-850-3525 론 기를제거하고소변을잘나오게한다, 기침과피가섞인침을뱉는타혈 ( 唾血 ) 을치료하고대 소장을잘통하게하며, 뱃속의기생충이나벌레를죽이고, 쇠붙이에다친상처인금창 ( 金瘡 ) 도아물게한다 고적혀있다 (7). 지금까지상백피로부터항암, 항당뇨, 항염증, 항고혈압및항균성분인 1-deoxynojirimycin(DNJ), γ-aminobutyric acid, oxyresveratrol, mulberrofuran 및 prenylflavonoid 유도체가분리및동정된바가있으며 (8-17), 그외에도항고지혈증 (18), 항진통 (19), 항멜라닌 (20) 및항산화 (21) 성분등이다수보고된바가있다. 이와같이상백피로부터여러가지생리활성물질이보고된바가있으나아직까지항당뇨작용과관련된 α-glucosidase 저해제의분리및동정에관한연구는거의없는실정이다. α-glucosidase는장의말단에존재하는당분해효소로서그저해제는탄수화물이포도당으로소화되는것을지연시킴으로써결국식후의혈당치를감소시키는역할을한다 (22). 지금까지식물로부터 α-glucosidase 저해제의분리및동정에관한많은연구가보고되어왔으며 (23-25), 특히누에의 DNJ 성분은 α-glucosidase 저해제로잘알려져있고 (26) 그외에도 acarbose 및 voglibose 등의합성저해제도시판되고있다 (27). 최근본연구진들은잠상산물을이용한당뇨예방용건강기능식품을개발하기위한연구의일환으로먼저뽕나무의부위별 ( 오디, 상엽, 상지, 상백피 ) 에탄올추출물의항당뇨활성을 α-glucosidase를이용한 in vitro assay에서측정하였으며 (28), 그결과효소저해활성이가장강한상백피에탄
상백피로부터 α-glucosidase 저해제의분리및동정 1091 올추출물로부터 α-glucosidase 저해제를분리및동정한바를보고하고자한다. 재료및방법실험재료본실험에서사용한뽕나무뿌리껍질상백피는 2013년경북울진에서재배한 청일뽕 으로부터봄에잎이나기전에채취한것으로수확후일주일간그늘에서자연건조시킨다음 50 C 열풍건조기 (JISICO J-300M, Seoul, Korea) 에서 48시간건조한것을세절하여사용하였다. 시약및크로마토그래피용충진제본실험에사용한 α-glucosidase는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 로부터구입하여사용하였으며, 상백피로부터 α-glucosidase 분리및정제를위한 column chromatography용충전물질로 Diaion HP-20(Mitsubishi Chemical Co., Tokyo, Japan), silica gel 60(70~230 mesh, Merck, Darmstadt, Germany), ODS-A gel(12 nm, 150 μm, YMC Training Inc., Boston, MA, USA) 및 Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 을사용하였으며, 물질분리및분석을위한 thin layer chromatography(tlc) 는 pre-coated silica gel 60 plate (0.25 mm, Merck) 를사용하였다. 그외모든시약은 HPLC 급 (Merck) 또는분석용특급시약을사용하였다. 상백피로부터 α-glucosidase 저해제의분리및정제상백피로부터 α-glucosidase 저해제의추출, 분리및정제는 Fig. 1과같이실시하였다. 상백피 (6 kg) 를 95% 에탄올 (30 L) 로 ultrasonicator(power Sonic 420, 50/60 Hz, 700 W, Hwashintech, Incheon, Korea) 에서 2시간 2회반복추출한후여과 (Whatman No. 2 filter paper, Whatman International Ltd., Maidstone, UK) 및감압농축하여 (rotary evaporator, EYELA, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan) 에탄올추출물을얻었다. 이것을같은추출용매 (10 L) 로용해하여일야실온에서방랭한다음재여과하여침전물을제거한후다시감압농축하여상백피조에탄올추출물 (720 g) 을제조하였다. 상백피조에탄올추출물중 50 g을취하여 20% 에탄올수용액으로현탁시킨다음미리 20% 에탄올수용액으로평형화시켜놓은 Diaion HP-20 column (16 cm 100 cm) 에충진시킨후 20%, 40%, 60% 및 80% 에탄올수용액을순차적으로용출시켰다. 각각의용출액을감압농축하여 4가지에탄올분획물즉, 20% EtOH fr. (24.86 g), 40% EtOH fr.(2.38 g), 60% EtOH fr.(6.06 g) 및 80% EtOH fr.(2.86 g) 을각각얻었다. 여기서앞서용출된 4개분획물의 α-glucosidase 저해활성을측정한결과 80% 에탄올분획물의저해활성이가장높았다 (Table 1). 80% 에탄올분획물로 silica gel 60을이용한 flash column chromatography를실시하였다. 먼저 silica gel(70~230 mesh) 을클로로포름 : 메탄올 (10:1, v/v) 혼합용매로충분히 slurry를만든후칼럼 (2.8 cm 58 cm) 에충진하여용매 Morus alba L. root bark (6 kg) Extracted twice with 95% aq. EtOH under ultrasonicator filtered and evaporated in vacuo 95% EtOH ext. (720 g) Diaion HP-20 C.C (50 g) 20% EtOH fr. (24.86 g) 40% EtOH fr. (2.38 g) 60% EtOH fr. (6.06 g) 80% EtOH fr. (2.86 g) Silica gel (CHCl 3 : MeOH=10:1, v/v) Fr. 1 (0.21 g) Fr. 2 (0.60 g) Fr. 3 (0.47 g) Fr. 4 (0.21 g) Fr. 5 (0.19 g) Fr. 6 (0.11 g) ODS-A C.C (80% EtOH) Sephadex LH-20 C.C (80% EtOH) Comp. 1 (10 mg) Comp. 2 (9.6 mg) Comp. 3 (9.3 mg) Comp. 4 (6.5 mg) Fig. 1. Schematic procedure for isolation and purification of α-glucosidase inhibitors from Morus root bark.
1092 장연정 임현희 전영희 이동희 최상원 Table 1. α-glucosidase inhibitory activity of several fractions from the ethanolic extract of Morus root bark isolated by Diaion HP-20, silica gel, ODS-A, and Sephadex LH-20 column chromatographies Sample Extract & fraction Inhibition (IC 1) 50, μg/ml) Mulberry root bark EtOH ext. 12.01 Four ethanol fractions isolated from the crude ethanol extract of Morus root bark by Diaion HP-20 column chromatography (C.C.) Six fractions isolated from the 80% EtOH fr. of Diaion HP-20 by silica-gel C.C. Four purified compounds isolated by ODS-A or Sephadex LH-20 C.C. Reference compound 20% EtOH fr. 40% EtOH fr. 60% EtOH fr. 80% EtOH fr. Fr. 1 Fr. 2 Fr. 3 Fr. 4 Fr. 5 Fr. 6 Comp. 1 Comp. 2 Comp. 3 Comp. 4 Acarbose Quercetin trans-resveratrol 1) IC 50 represents the concentration of each compound required for 50% inhibition of α-glucosidase activity. 2) Values represent the mean±sd (n=3). 3) Values with different letters in a column are significantly different at P<0.05. 96.21 153.05 45.10 5.06 6.52 9.98 4.38 10.54 8.35 0.34 5.22±0.10 c2)3) 1.78±0.26 e 2.94±0.02 d 1.54±0.07 e 0.03±0.01 f 15.03±0.32 b 32.90±0.58 a 를충분히용출시키면서평형화시켰다. Diaion 80% 에탄올분획물 (10 g) 을클로로포름 : 메탄올 (10: 1, v/v) 혼합용매로현탁시켜칼럼에충진후동일한용매를이동상으로하여 10 ml씩 300개분획으로나누어용출시켰다. 분취한각분획물을 precoated silica gel 60( 클로로포름 : 메탄올 = 10:1, v/v) 을이용하여 TLC를실시하고성분이동일한분획끼리모아 6개의분획즉, fr. 1(0.21 g), fr. 2(0.60 g), fr. 3(0.47 g), fr. 4(0.21 g), fr. 5(0.19g), fr. 6(0.11 g) 을얻었다. 앞서용출된 6개의분획물의 α-glucosidase 저해활성을측정한결과 fr. 1, 3 및 6의저해활성이높았다 (Table 1). fr. 1을 80% 에탄올수용액으로용해한후미리 80% 에탄올수용액으로평형화시켜놓은 ODS-A를칼럼 (3 cm 38 cm) 에충진시킨다음 80% 에탄올수용액을이동상으로하여튜브당 2 ml씩 200개분획으로나누어용출시킨후각분획을 UV-vis spectrophotometer(s-3100, Sinco Co., Seoul, Korea) 를이용하여흡수스펙트럼을측정하고동일한분획을모아감압농축하였다. 마지막으로최종분리된분획을 80% 에탄올수용액으로평형화한 Sephadex LH-20 칼럼 (2.5 cm 48 cm) 에충진시킨후같은용매를이동상으로하여튜브당 1 ml씩 200개의분획으로나누어용출한다음자외선흡수스펙트럼이동일한분획을모아감압농축하여 Comp. 1(10 mg) 을얻었다. 이와유사한방법으로 fr. 3과 fr. 6을각각 ODS-A 및 Sephadex LH-20 column chromatography를순차적으로실시하여 fr. 3으로부터 Comp. 2(9.6 mg) 를, fr. 6으로부터 Comp. 3(9.3 mg) 및 Comp. 4(6.5 mg) 를각각순수하게분리및정제하였다. 상백피로부터분리된 α-glucosidase 저해제의화학구조동정 UV-vis spectroscopy: 상백피로부터분리된 α-glucosidase 저해활성을갖는 4가지화합물의구조분석을위해먼저자외선흡수스펙트럼을조사하였다. 분리한화합물을메탄올에용해한다음 UV-vis spectrophotometer(sinco S-3100) 를사용하여 200~600 nm 영역에서 scanning 하여최대흡수파장 (λmax) 을조사하였다. Nuclear magnetic resonance(nmr) spectroscopy: 상백피로부터분리된 4가지화합물의 1 H-NMR(500 MHz) 과 13 C-NMR(125 MHz) 분석은 AVANCE Ⅲ 500(Bruker, Karlsruhe, Germany) 을사용하여상온에서측정하였으며, 이때시료는 acetone-d 6(Comp. 1 & 2) 와 DMSO-d 6(Comp. 1 & 2) 를이용하여각각용해하였다. 그리고 tetramethylsilane(tms) 을내부표준물질로첨가하여시료의화학적이동값을 δ치 (ppm) 로나타내었다. 통계처리본연구의실험결과들은 3회반복측정하여평균표준편차로나타내었으며, 각실험을 3회측정후얻어진결과를이용하여회귀분석그래프를작성하고 IC 50 값 ( 효소활성을 50% 저해하는농도 ) 을구하였다. 그리고각시험구간의유의성은 Duncan's multiple range test를이용하여 P<0.05 범위에서측정하였다.
상백피로부터 α-glucosidase 저해제의분리및동정 1093 결과및고찰뽕나무부위별에탄올추출물의항당뇨활성사전연구 (28) 에서뽕나무 4가지부위별 ( 오디, 상엽, 상지, 상백피 ) 에탄올추출물의항당뇨활성을 α-glucosidase 를이용하여측정한결과는다음과같다. 4가지부위중상백피에탄올추출물 (IC 50=12.01 μg/ml) 이가장높은효소저해활성을나타내었고, 그다음으로상지 (IC 50=33.82 μg/ml) > 상엽 (IC 50=165.9 μg/ml)> 오디 (IC 50=780.5 μg/ml) 순으로낮게나타났다. 따라서상백피에탄올추출물로부터 α-glucosidase 저해제를분리및정제하였다. Diaion HP-20, silica gel, ODS-A 및 Sephadex LH-20 column chromatography 에의해분리된상백피분획물의 α-glucosidase 저해활성측정상백피에탄올추출물로부터 α-glucosidase 저해제를분리및정제하기위해먼저 Fig. 1과같이조에탄올추출물을 Diaion HP-20, silica gel, ODS-A 및 Sephadex LH-20 column chromatography를차례로실시하여 4가지화합물을분리 정제하면서각분획물의 α-glucosidase 저해활성을비교한결과는 Table 1과같다. 먼저상백피에탄올추출물을 Diaion HP-20 column chromatography를실시하여얻어진 4가지분획물의 α-glucosidase 저해활성을측정한결과 80% 에탄올분획물 (IC 50=5.06 μg/ml) 이가장높은저해활성을나타내었고, 그다음으로 60% 에탄올분획물 (IC 50=45.10 μg/ml)> 20% 에탄올분획물 (IC 50=96.21 μg/ ml)> 40% 에탄올분획물 (IC 50=153.05 μg/ml) 순으로낮게나타났다. 효소저해활성이가장높은 80% 에탄올분획물을 silica gel column chromatography를실시하여 6가지분획을얻었으며, 그들의효소저해활성을측정한결과 fr. 1(IC 50=6.52 μg/ml), fr. 3(IC 50=4.38 μg/ml) 및 fr. 6 (IC 50=0.34 μg/ml) 이가장높은저해활성을나타내었다. 마지막으로 3가지활성분획을 ODS-A 및 Sephadex LH-20 column chromatography를차례로실시하여정제한후최종얻어진 Comp. 1(10 mg), Comp. 2(9.6 mg), Comp. 3 (9.3 mg) 및 Comp. 4(6.5 mg) 의 α-glucosidase 저해활성을측정한결과 Comp. 1(IC 50=5.22 μg/ml), Comp. 2 (IC 50=1.78 μg/ml), Comp. 3(IC 50=2.94 μg/ml) 및 Comp. 4(IC 50=1.54 μg/ml) 로각각저해활성을나타내었다. 이와같이상백피로부터분리된 4가지화합물은비록 α-glucosidase의강력저해제로잘알려진 acarbose(ic 50=003 μg/ ml)(29) 보다저해활성이낮지만천연물유래 α-glucosidase 저해제로보고된 quercetin 및 resveratrol보다저해활성이높음을알수있었다 (30). 상백피로부터분리된 α-glucosidase 저해제의화학구조동정상백피로부터분리된 4가지 α-glucosidase 저해제의화 학구조를 UV 및 NMR 분석을통해다음과같이측정하였다. Comp. 1은 268.9 nm에서최대흡수파장과 350 nm에서 minor 흡수파장을각각나타내었기에본화합물은 flavonoid 화합물중고리가연결된 flavone 화합물임을추정할수있었다 (31). Comp. 1의 1 H-NMR spectrum을측정한결과 δ6.35 (1H, dd, J=2.0 & 8.0 Hz, H-5'), δ6.50(1h, d, J=2.5 Hz, H-3') 및 δ7.13(1h, d, J=8.0 Hz, H-6') 에서 flavonoid 화합물 benzene B ring의 4-substituted resorcinol 골격을나타내는 3가지 aromatic proton과 δ6.21(1h, s, H-6) 에서 benzene A ring의 1개의 proton 그리고 δ3.00 & 3.33 (2H, br d, J=8.0 Hz, H-9), δ5.03(1h, br t, J=8.0 Hz, H- 10), δ1.38 & 1.55(each 3H, br s, H-12 & H-13) 를보아 pyrone ring의 3번위치에 isoprenyl group의존재와더불어 δ6.52(1h, d, J=10 Hz, H-14), δ5.70(1h, d, J=10 Hz, H-15) 및 δ1.38 & 1.55(each 3H, br s, H-12 & H-13) 에서 2,2-dimethylcromene ring을지니고있는전형적인 prenylflavonoid임을확인할수있었다. 이러한 1 H-NMR 결과로부터 Comp. 1 화합물이 prenylflavonoid의대표적인화합물인 morusin임을추정할수있었다 (32). 한편 Comp. 1의 13 C-NMR spectrum을관찰한결과 δ 181.8(C-4) 에서하나의케톤기와 δ161.0(c-4') 및 δ (C-2') 에서 benzene B ring의 2개의 hydroxyl group과 δ 161.9(C-7) 및 δ151.7(c-5) 에서 benzene A ring의 2개의 hydroxyl group 그리고 δ160.6(c-8a) 및 δ158.5(c-2) 에서 benzene C ring의 2개의 hydroxyl group을가진탄소들과 δ131.2(c-11), δ121.4(c-10), δ25.4(c-12), δ23.6(c- 9), δ17.3(c-13) 에서 1개의 isoprenyl group를나타내는탄소 signal들그리고 δ127.6(c-15), δ114.1(c-14), δ 78.0(C-16), δ27.7(c-17 & C-18) 에서 2,2-dimethylcromene ring을확인할수있었다. 마지막으로 δ98.8(c-6) 에서 benzene A ring의비치환탄소와 δ131.3(c-6'), δ 110.7(C-1'), δ106.8(c-5'), δ102.8(c-3') 에서 benzene B ring의비치환탄소를각각확인할수있었으며, 그외 benzene A ring과 benzene C ring의공통결합부분인 δ 160.6(C-8a) 및 δ100.4(c-4a) 를각각확인할수있었다. 이러한결과로부터본화합물은 prenylflavonoid의대표적인화합물인 morusin임을확인할수있었으며, 지금까지상백피로부터 morusin을비롯한여러유도체가분리및동정된바가있다 (32,33). 다음상백피로부터분리된무정형분말 Comp. 2의 UV 흡수스펙트럼을측정한결과 263 nm에서최대흡수파장과 285 nm에서 minor 흡수파장그리고 325 nm에서 shoulder 를나타내었다. 이로써본화합물은 flavonoid 화합물중 prenylflavonoid에속하는 kuwanon 유도체임을추정할수있었다 (32). Comp. 2의 1 H-NMR spectrum을관찰한결과 δ6.58 (1H, dd, J=2.0 & 8.0 Hz, H-5'), δ6.66(1h, d, J=2.5 Hz,
1094 장연정 임현희 전영희 이동희 최상원 H-3') 및 δ7.29(1h, d, J=8.0 Hz, H-6') 에서 flavonoid 화합물 benzene B ring의 4-substituted resorcinol 골격을나타내는 3가지 aromatic proton과 δ5.99(1h, s, H-6) 에서 benzene A ring의 1개의 proton 그리고 δ3.00 & 3.33(2H, br d, J=8.0, H-9), δ5.09(1h, br t, J=2.0 & 8.0 Hz, H-10), δ1.28 & 1.50(each 3H, br s, H-12 & H-13) 을보아 pyrone ring의 3번위치에 isoprenyl의존재와더불어 δ4.20 (1H, d, J=1.0 Hz, H-14), δ5.00(1h, br t, J=2.0 & 8.0 Hz, H-15), δ1.57(3h, br s, H-17), δ1.80(2h, br d, H-18), δ3.30(1h, br d, H-19), δ4.20(1h, br d, H-20), δ5.96 (1H, d, J=8.0 Hz, H-26), δ7.16(1h, d, J=8.0 Hz, H-27), δ6.36(1h, d, J=2.0 Hz, H-30), δ5.92(1h, dd, J=2.0 & 8.0 Hz, H-32), δ6.95(1h, d, J=8.0 Hz, H-33), δ3.02(2h, br d, J=7.0 Hz, H-34), δ4.92(1h, d, J=2.0 Hz, H-35), δ1.32 & 1.62(each 3H, br s, H-37 & H-38) 로보아 H-24 번위치에 isoprenyl group을가진 chalcone의존재를확인할수있었다. 이러한 1 H-NMR 결과로부터 Comp. 2는 kuwanon C핵에 chalcone 핵을지니고있는 prenylflavonoid 의대표적인화합물 kuwanon H임을추정할수있었다 (32). 한편 Comp. 2의 13 C-NMR spectrum을관찰한결과 δ 208.1(C-21) 에서 chalcone 핵의 ketone기와 δ181.6(c- 4) 에서 flavone 핵의케톤기를각각확인할수있었으며, δ155.8(c-5), δ160.2(c-7), δ156.3(c-2'), δ160.2(c-4') 에서 flavone 핵의 4개의 hydroxyl group과 δ161.9(c-23 & C-25), δ155.9(c-29 & C-31) 에서 chalcone 핵의 4개의 hydroxyl group이존재하였다. δ97.5(c-6) & δ106.6 (C-8) 에서 flavone A핵과 δ102.5(c-3'), δ106.6(c-5') & δ131.1(c-6') 에서 flavone B핵, δ159.0(c-2) & δ119.5 (C-3) 의 flavone C핵의탄소와 δ103.5(c-4a) & δ160.2 (C-8a) 에서 flavone A핵과 flavone C핵의연결부위를확인하였으며, 아울러 δ106.8(c-26) & δ130.2(c-27) 에서 chalcone의 A핵과 δ102.5(c-30), δ106.6(c-32) & δ 132.7(C-33) 에서 chalcone의 B핵그리고 δ37.1(c-14), δ 122.3(C-15), δ132.7(c-16), δ22.5(c-17), δ37.1(c-18 & C-19), δ45.4(c-20) 에서 chalcone C핵의존재를각각확인할수있었다. 마지막으로 δ131.1(c-11), δ121.8(c- 10), δ25.4(c-12), δ21.1(c-9), δ17.4(c-13) 에서 flavone 핵에치환된 isoprenyl group과 δ130.2(c-36), δ122.3 (C-35), δ23.4(c-37), δ21.1(c-34), δ17.6(c-38) 에서 chalcone 핵에치환된 isoprenyl group을각각확인할수있었다. 이러한결과로부터본화합물은 kuwanon 계열의유도체인 kuwanon H임을확인할수있었으며, 여러연구자들에의해이미상백피로부터 kuwanon H가분리및동정된바가있다 (32,33). 상백피로부터분리된노란색무정형분말 Comp. 3의 UV 흡수스펙트럼을측정한결과 319 nm에서최대흡수파장과 291 및 334 nm에서 minor 흡수파장을나타내었다. 이로써본화합물은 2-arylbenzofuran 유도체임을추정할수있었 다 (34). Comp. 3의 1 H-NMR spectrum을측정한결과 δ7.35 (1H, d, J=8.0 Hz, H-4), δ6.93(1h, d, J=2.0 Hz, H-7), δ6.77(1h, dd, J=8.5 & 2.0 Hz, H-5), δ6.92(1h, s, H-3), δ6.77(2h, s, H-2' & H-6') 에서 H-4' 에치환기를가진 2-arylbenzofuran 핵을확인할수있었으며, δ4.12(1h, br s, H-3''), δ5.77(1h, br s, H-2''), δ1.92(3h, br s, H-7''), δ2.50 & 2.18(2H, m, H-6''), δ3.76(1h, t, J=6.0, H-5''), δ4.64(1h, t, J=6.0, H-4''), δ6.36(1h, dd, J=6.5 & 2.0 Hz, H-13''), δ8.53(1h, d, J=9.0 Hz, H-14''), δ6.53(1h, d, J=2.0 Hz, H-17''), δ6.29(1h, dd, J=8.5 & 2.5 Hz, H-19''), δ6.98(1h, d, J=8.5 Hz, H-20'') 로보아 Comp. 3은 2-arybenofuran 유도체에 chalcone 핵을지니고있는 mulberrofuran 유도체임을추정할수있었다 (30). 그러나 Kang 등 (33) 이이미보고한 H-11'' 번위치에 isoprenyl group을가진 chalcomoracin과달리 isoprenyl group이없는 chalcomoracin 유도체임을확인할수있었다. 한편 Comp. 3의 13 C-NMR spectrum을관찰한결과 δ 206.3(C-8'') 에서 chalcone 핵의 ketone기를확인할수있었으며, δ157.9(c-6), δ(c-3' & C-5') 에서 2-arylbenzofuran 핵의 3개의 hydroxyl group과 δ164.5(c- 10''), δ163.7(c-12''), δ157.7(c-18''), δ156.8(c-16'') 에서 chalcone 핵의 4개의 hydroxyl group이존재하였다. δ 121.9(C-4), δ113.2(c-5), δ98.5(c-7) 에서 2-arylbenzofuran A핵과 δ131.0(c-1'), 116.8(C-4'), δ103.8(c-2' & C-6') 에서 2-arylbenzofuran B핵, δ155.6(c-2) & δ 101.9(C-3) 의 2-arylbenzofuran C핵의탄소와 δ154.5 (C-8) & δ122.7(c-9) 에서 2-arylbenzofuran A핵과 C핵의연결부위를확인하였다. δ133.9(c-14'') & δ107.5(c- 13'') 에서 chalcone의 A핵과 δ128.8(c-20''), δ105.2(c- 19'') & δ103.6(c-17'') 에서 chalcone의 B핵그리고 δ 135.2(C-1''), δ124.6(c-2''), δ33.3(c-3''), δ47.9(c-4''), δ36.6(c-5''), δ32.5(c-6''), δ23.9(c-7'') 에서 chalcone C 핵의존재를각각확인할수있었다. 이러한결과로부터본화합물은 2-arylbenzofuran 핵에 chalcone 핵이결합되어있으나 H-11'' 번위치에 isoprenyl group이없는 chalcomoracin 유도체임을확인할수있었으며 (34), 보다상세한화학구조동정을위해서는 NOESY 및 2D NMR 분석이필요하다. 마지막으로상백피로부터분리된노란색무정형분말 Comp. 4의 UV 흡수스펙트럼을측정한결과 319 nm에서최대흡수파장과 291 및 334 nm에서 minor 흡수파장을나타내었다. 이로써본화합물은 Comp. 3과유사한 2-arylbezofuran 유도체임을추정할수있었다 (34). Comp. 4의 1 H-NMR spectrum을측정한결과 δ7.35 (1H, d, J=8.0 Hz, H-4), δ6.92(1h, d, J=1.5Hz, H-7), δ 6.77(1H, dd, J=10.0 & 2.0 Hz, H-5), δ6.91(1h, s, H-3), δ6.77(2h, s, H-2' & H-6') 에서 H-4' 에치환기를가진 2-
상백피로부터 α-glucosidase 저해제의분리및동정 1095
1096 장연정 임현희 전영희 이동희 최상원 arylbenzofuran 핵을확인할수있었으며, δ4.10(1h, br s, H-3''), δ5.77(1h, br s, H-2''), δ1.92(3h, br s, H-7''), δ2.52 & 2.21(2H, m, H-6''), δ3.75(1h, t, J=5.0 Hz, H-5''), δ4.64(1h, t, J=5.0 Hz, H-4''), δ6.45(1h, d, J=9.0 Hz, H-13''), δ8.44(1h, d, J=9.0 Hz, H-14''), δ6.53(1h, d, J=2.5 Hz, H-17''), δ6.30(1h, dd, J=10.0 & 2.5 Hz, H-19''), δ6.99(1h, d, J=8.5 Hz, H-20''), δ3.27(2h, d, J=7.0 Hz, H-21''), δ5.18(1h, t, J=5.0 Hz, H- 22''), δ 1.72(3H, br s, H-24'') 및 δ1.57(3h, br s, H-25'') 로보아 H-11'' 번위치에 isoprenyl group을가진 mulberrofuran 유도체임을확인할수있었다. 이러한 1 H-NMR 결과로부터 Comp. 4 화합물은 2-arybenofuran 유도체에 chalcone 핵을지니고있는 chalcomoracin임을추정할수있었다 (34). 한편 Comp. 4의 13 C-NMR spectrum을관찰한결과 δ 206.2(C-8'') 에서 chalcone 핵의 ketone기를확인할수있었으며, δ158.0(c-6), δ(c-3' & C-5') 에서 2-arylbenzofuran 핵의 3개의 hydroxyl group과 δ164.6(c- 10''), δ163.4(c-12''), δ158.0(c-18''), δ156.8(c-16'') 에서 chalcone 핵의 4개의 hydroxyl group이존재하였다. δ 121.9(C-4), δ113.2(c-5), δ98.5(c-7) 에서 2-arylbenzofuran A핵과 δ131.0(c-1'), 115.8(C-4'), δ104.8(c-2' & C-6') 에서 2-arylbenzofuran B핵, δ(c-2) & δ 101.9(C-3) 의 2-arylbenzofuran C핵의탄소와 δ155.6 (C-8) & δ122.7(c-9) 에서 2-arylbenzofuran A핵과 C핵의연결부위를확인하였다. δ132.3(c-14'') & δ108.1(c- 13'') 에서 chalcone의 A핵과 δ128.8(c-20''), δ107.5(c- 19'') & δ103.6(c-17'') 에서 chalcone의 B핵그리고 δ 133.9(C-1''), δ124.6(c-2''), δ33.2(c-3''), δ47.8(c-4''), δ36.7(c-5''), δ32.3(c-6''), δ23.9(c-7'') 에서 chalcone C 핵의존재를각각확인할수있었다. 마지막으로 δ22.3(c- 21''), δ123.5(c-22''), δ131.5(c-23''), δ25.9(c-24''), δ 17.9(C-25'') 에서 chalcone A핵에치환된 isoprenyl group 을확인할수있었다. 이러한결과로부터본화합물은 2-arylbenzofuran 핵에 chalcone 핵이결합된 chalcomoracin (mulberrofuran C) 임을확인할수있었으며, 보다상세한 4가지화합물의 NMR spectra 데이터는 Table 2 및 Table 3과같다. 지금까지뽕나무 (Morus mongolica) 뿌리및잎으로부터 4가지유도체가분리및동정한바가있으나 (34, 35), 국내에서생산되고있는뽕나무뿌리로부터확인된바는본연구가처음이다. 이와같이상백피로부터 4가지 α- glucosidase 저해제를분리및동정하였으며 (Fig. 2), 특히 α-glucosidase 저해활성이강한 kuwanon H 및 chalcomoracin 성분들은 prenylflavone 및 2-arylbenzofuran 골격에 isoprenyl group과 chalcone 핵을지니고있는공통된특징을가지고있었다. 지금까지보고된잠상산물추출물의항당뇨작용과그로부터분리된생리활성물질의항당뇨효과에관한연구를살펴보면먼저 Singab 등 (36) 은 streptozotocin 유발당뇨쥐모델실험에서상백피 70% 에탄올추 Table 3. 13 C-NMR spectral data of four α-glucosidase inhibitors isolated from the ethanolic extract of Morus root bark Position Comp. 1 Comp. 2 Position Comp. 3 Comp. 4 13 C-NMR 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23 25 26 27 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 1' 2' 3' 4' 5' 6' C-4a C-8a 158.5 181.8 151.7 98.8 161.9 23.6 121.4 131.2 25.4 17.3 114.1 127.6 78.0 27.7 27.7 110.7 102.8 161.0 106.8 131.3 100.4 160.6 159.0 119.5 181.6 155.8 97.5 160.2 106.6 21.1 121.8 131.1 25.4 17.4 37.1 122.3 132.7 22.5 37.1 37.1 45.4 208.1 161.9 161.9 106.8 130.2 155.9 102.5 155.9 106.6 132.7 21.1 122.3 130.2 23.4 17.6 156.3 102.5 160.2 106.6 131.1 103.5 160.2 13 C-NMR 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 7'' 8'' 9'' 10'' 11'' 12'' 13'' 14'' 15'' 16'' 17'' 18'' 19'' 20'' 21'' 22'' 23'' 24'' 25'' 155.6 101.9 121.9 113.2 157.9 98.5 154.5 122.7 131.0 103.8 116.8 103.8 135.2 124.6 33.3 47.9 36.6 32.5 23.9 206.3 113.2 164.5 128.1 163.7 107.5 133.9 122.0 156.8 103.6 157.7 105.2 128.8 101.9 121.9 113.2 158.0 98.5 155.6 122.7 131.0 104.8 115.8 104.8 133.9 124.6 33.2 47.8 36.7 32.3 23.9 206.2 113.2 164.6 116.7 163.4 108.1 132.3 122.0 156.8 103.6 158.0 107.5 128.8 22.3 123.5 131.5 25.9 17.9 Chemical shift in δ ppm, coupling constant (J) expressed in Hz in parenthesis and measured in the solvent DMSO-d 6, taking TMS as an internal standard. 출물의투여는혈당감소및인슐린증가로항당뇨효능이있음을확인하였으며, 그주된성분으로서 morusin, cyclomorusin 및 moracin 성분을분리및동정한바가있다. 또한상백피에함유된 DNJ 및 GABA 성분이주된항당뇨성분으로보고 (9) 된바가있다. 한편상엽으로부터분리된 chalcomoracin 등은 STZ-유발당뇨쥐의항당뇨모델실험에서항당뇨의주된물질로작용할수있음을이미보고 (35) 한바가있으며, Abd El-Mawla 등 (37) 은 streptozotocin 유발
상백피로부터 α-glucosidase 저해제의분리및동정 1097 Comp. 1 (morusin) Comp. 2 (kuwanon H) Comp. 3 (chalcomoracin A) Comp. 4 (chalcomoracin B) Fig. 2. Chemical structures of four α-glucosidase inhibitors isolated from Morus root barks. 당뇨쥐모델실험에서뽕잎의 70% 에탄올추출물은혈당감소및인슐린증가를나타내어항당뇨효능이있음을확인하였고그주된성분으로 morusin 및 cyclomorusin 성분을확인한바가있다. 또한 Ye 등 (38) 은상지물추출물은 alloxan 유발당뇨쥐모델실험에서혈당감소와혈액 fructosamine 농도를감소시킴으로써항당뇨효능이있음을확인한바가있으며, Yang 등 (39) 은뽕잎으로부터 15개의생리활성물질을분리및동정한바가있고그중 chalcomoracin 및 moracin C, D, N 등의 moracin 유도체가 α -glucosidase 저해작용이있음을확인한바가있다. 이와같이상백피를비롯하여상엽및상지추출물의항당뇨작용과그주된생리활성물질의분석에관한연구는보고된바가있으나상백피로부터 α-glucosidase 저해제의분리및동정에관한연구는본연구가처음이다. 이상의결과를종합해보면상백피에탄올추출물의강한 α-glucosidase 저해작용은뿌리에존재하는 prenylflavonoid 및 mulberrofuran 유도체에기인된것으로생각되며, 향후세포실험및동물실험을통해상백피에탄올추출물및분리된저해제들의항당뇨효능을측정할예정이다. 요약본연구는잠상산물로부터고부가가치항당뇨기능성소재를개발하기위한연구의일환으로, 먼저뽕나무부위별 4가 지 ( 오디, 뽕잎, 상지, 상백피 ) 에탄올추출물의 α-glucosidase 저해활성을측정한결과상백피가가장높은저해활성을나타내었으며, 그로부터여러 column chromatography 및 NMR 기기분석을통해 4가지 α-glucosidase 저해제를분리, 정제및동정한결과는다음과같다. 상백피에탄올추출물을 Diaion HP-20, silica gel, ODS-A 및 Sephadex LH-20 column chromatography를실시하여 4가지화합물 [Comp. 1(10 mg), Comp. 2(9.6 mg), Comp. 3(9.3 mg), 및 Comp. 4(6.5 mg)] 을분리및정제하였으며, 그들의효소저해활성을측정한결과 Comp. 1(IC 50=5.22 μg/ml), Comp. 2(IC 50=1.78 μg/ml), Comp. 3(IC 50=2.94 μg/ml) 및 Comp. 4(IC 50=1.54 μg/ml) 로나타났다. 그리고그들화합물의동정을위해 UV 및 NMR spectroscopy를이용하여구조를분석한결과 Comp. 1(morusin), Comp. 2(kuwanon H), Comp. 3(chalcomoracin A), Comp. 4(chalcomoracin B) 로각각동정하였다. 이상의연구결과로미루어보아상백피로부터분리된 α-glucosidase 저해제는향후당뇨치료용기능성소재로활용할수있을것으로기대된다. 감사의글본연구는산업통상자원부의지역연고산업육성사업 (RIS) 의지원에의하여수행되었으며, 이에감사드립니다.
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