3. 미생물오염의측정방법 미생물의측정방법은국가적인규모로규격이정해져있지않다. 비미생물의측정방법은반도체기술의발전과함께일본공업규격 (JIS) 에의하여규격화되어있다. 그러나, 미생물의측정은병원, 제약공장, 식품공장, 농림축산업, 생물공학등그밖의관련분야가다양하기때문에그측정방법도다수있을수있고, 획일화, 규격화되어있지않는것이현황이다. 미생물은매우종류가많고계통적인분류는곤란하다. 일반적으로는다음과같이분류된다. 이외에는리켓치아, 비루스가있다. 미생물 원핵미생물 건핵미생물 세균류 (bacteria) 남조류 (blue-green algae) 균류 (fungi) 조류 (algae) 원생동물 (protozoa) 미생물오염의측정에서특히주의하지않으면안되는것은측정대상이육안으로보이지않는매우작은생물체이며, 우리들주위에어디에나생식하고있는미생물을대상으로하고있다는것이다. 그렇기때문에시험중의미생물은증식하거나, 사멸하거나해서시시각각변화하고있기때문에다시한번같은샘플에대해서시험을한다고해도언제나같은시험결과를얻을수있다는확신이없으며, 또, 처음에샘플에포함되어있지않았던미생물을시료조작중에실수로혼입시켜도시험결과에큰오차가발생하게된다. 따라서무균조작을완벽하게습득한후에시료채취로부터결과판정까지다른시험방법에는없는세세한주의를하여신중하고, 신속하게수행할필요가있다. 또, 병원성의미생물을취급할때에는실수로감염되는경우가없도록유 의하고, 시험에사용한배지나기구등, 오염될가능성이있는것들은모 두멸균처리를하지않으면안된다. 미생물오염의측정방법은측정대상이나그목적에따라서다르나이하의 3가지로대별할수있다. 1 일정용적의공기를강제흡입하여, 샘플링공기중에포함되어있는미생물을측정하는공기중부유균측정법
2 일정시간내에일정면적에자연낙하한미생물량을측정하는공중낙하균측정법 3 시설내바닥이나벽등의표면에부착된미생물량을측정하는표면오염균측정법 이러한측정법은모두특징을갖고있으며, 측정의결과얻어지는정보도다르다. 또미생물의측정에공통적인과제는배양기간을요한다는것이며, 가장짧아도 2일후가아니면결과는나오지않는다. 이와같은각측벙법의특징이나원리를충분히이해한뒤에목적에맞는방법을선정하고계측계획이나평가를수행할필요가있다. 3-1 공중부유균측정 1) 공중부유균측정법개요 (1) 충돌법고정배양지표면에샘플공기를고속의분류로서충돌시켜미생물입자가관성력에의하여포집되는방법이다. 공중부유균의측정은가장많이이용되고있다. 균의포집효율이높다는것과포집효율을이론적으로예측할수있다는것이특징이다. 대표적인측정법 ( 측정기 ) 에는슬리트법 (MG 에어샘플러, 카레라 - 슬리트샘 플러 ), 핀홀법 ( 핀홀샘플러 ), 다단다공판법 ( 앤더슨샘플러 ), 다공판법 (SAS 샘 플러 MAS-100), 회전원심법 (RC 샘플러 ) 등이있다. 슬리트샘플러는슬리트를통하여샘플공기를흡입배양지위에충돌시 키는방법이다. 게다가배양지를회전시켜서경시적인미생물수의변화 도측정이가능하다. 핀홀샘플러는슬리트샘플러를개량한것으로슬리트대신에 5개의구멍이있다. 앤더슨샘플러는다공판과평판배지를 6단으로조합한것이다. 각단에수백개의구멍이있고구멍은하단으로향하고단계적으로작아져샘플공기의충돌속도가하단으로갈수록고속이되는구조로되어있다. 상단에큰입자가포집되고하단으로갈수록작은입자가포집된다. (2) 충돌세정법 ( 인핀져법 )
유체를채운유리제용기 ( 인핀져 ) 에샘플공기를흡입시켜미생물입자를 액중에포집하는방법이다. 샘플링종료후후집액을멸균멤브레인필터 로여과시켜필터위에포집된미생물입자를배양측정한다. (3) 여과법샘플링공기를각종필터로여과시켜미생물입자를필터위에포집하는것이다. 필터를배양지에놓든가액체배양지에용해시킨후배양하여계수한다. 필터로서는멤브레인필터나제라틴필터를이용한다. (4) 입자계수법샘플공기중에서입자계수로측정하고, 분진농도로부터미생물입자농도를추정하는방법이다. 이방법은균수와입자수와의사이에상관관계가있는경우를전제로하고있다. 2) 공중부유균측정법 (1) 샘플링방법 ( 일반세균, 진균포집용 ) 미생물입자에대한포집성능이명시되어있는공중부유균측정기를사용하여시설의완성시, 정기청소, 소독후혹은정기적인청정도측정에는 1000l 이상의공기를샘플링한다. 그밖의측정에는상기공중부유균측정기를사용하여최소 50l 이상의공기를샘플링한다. (2) 배양조건 -Trypticase Soy 한천배지, 32, 48시간 -진균 : 포테토텍스트로스한천배지 ( 클로램페니콜, 100mg /l 첨가 ) 25, 96시간주 ) 배양온도, 시간 : 일본약학회위생시험법에의하면, 36±1, 48시간으로되어있으며, 실제이조건으로배양하는경우가많다. 그러나, BCR이라는조건에서는미생물오염관리를엄하게해야하기때문에 NASA 규격에따라 32 가최적의온도라고생각한다. (3) 계측 한측정점에서 3 장이상의평균치를얻도록한다. 공기 1 m3당출현콜로 니수 (c.f.u/ m3 ) 로표시한다. (c.f.u = colony forming unit) 3) 기타학회, 규격에서측정방법의예
(1) 일본약학계위생시험법에의한공중부유균측정법 a. 샘플링방법일반세균 : 핀홀샘플러 26.5l/min 진균 : 슬리트샘플러 30l/min b. 배양일반세균 : 표준한천배지 36±1 24-48 시간진균 : 포테토텍스트로스한천배지 ( 클로램페니콜첨가 ), 25±1 5-7일 c. 계측직경 90 페트리접시에서 1측정에서 3매의평균공기 1m3당콜로니수 (c.f.u/ m3 ) (2) NASA규격 (NASA NHB-5340-1) 에의한실내부유균 ( 일반세균 ) 측정법 a. 샘플링방법 (a) 연속법 : 장시간슬리트샘플러회 /hr 1cfm( 최대흡인량 60.0ft 3 미만 ) (b) 계속법 : 단시간슬리트샘플러 b. 배양 (a) 장시간샘플러 (1시간샘플링 ) 직경 150 페트리접시 Trypticase Soy 배지 32 호기성배양, 72시간후계측 (b) 단시간샘플러 (15분미만의샘플 ) 직경 100 페트리접시 Trypticase Soy 배지 32 호기성배양, 샘플 75%, 72시간후에측정. 염기성배양, 샘플의 25% 24, 48, 72시간후에측정 c. 계측공기 1cf 3 당콜로니수 (c.f.u/ft 3 ) 로평가한다. 3-2 공중낙하세균측정법 1) 공중낙하균측정개요공중낙하균측정법 ( 낙하법 ) 은일정면적의한천배지 (Koch법) 혹은, 금속편 ( 스텐레스강판법 ) 을일정시간정치하고이런것들의위에떨어지는미생물입자를포집하여, 일정기간배양한후계수하는방법이다. 낙하균에의한표면오염량의절대측정이가능하다.
Koch 법은취급이간편하고적은경비로가능하다는것으로공중미생물측정법으로서무엇보다더널리사용되고있다. 그러나이기법은측정오차가크다는것과, 측정시환경조건에의한측정결과가크게좌우되기때문에다른장소에서측정결과와비교가어렵다는것이결점으로되어있는방법이다. 또, 청정도레벨이높은 BCR에서는배양중에일정수의낙하균을포집하기때문에자시간배양지를노출시킬필요가있는등, 유효한방법이라고는말하기어렵다. NASA 법 ( 스텔레스강판법 ) 은멸균한스텐레스강판을소정시간노출시켜 이것을배양액에세정한후배양, 계수하는방법이다. 각종균의측정시 간에이용되는배지및배양조건의예를다음에나타낸다. 2) 공중낙하균측정법 (1) 샘플링방법한천배양지가들어있는샤레직경 90 혹은, 직경 150을측정장소에놓고 3장동시에뚜껑을열고정치시킨다. 1시간노출시킨후다시조용히뚜껑을닫는다 (2) 배양일반세균 : Trypticase Soy 한천배지, 32, 48시간진균 : 포테토텍스트로스한천배지 ( 클로램페니콜 100mg /l 첨가 ), 25 96시간 (3) 계측직경 150 페트리접시한점측정할때마다 3장의평균치를구한다. 얻은접시하나당콜로니 ( 집락 ) 수를낙하균수 (c.f.u/ft 3 ) 로평가한다. 주 : 1 측정장소가병원설비특히, BCR 내인경우를고려하여낙하균의포집효율을향상시켜보다엄밀한측정이가능하도록샤레직경은큰쪽이좋다. 또, 같은이유로배지의노출시간은 1시간으로했다. 2 배양조건에대해서는부유균과낙하균의측정결과를비교하는경우도고려하여, 공기중부유균측정과동일조건으로하였다. 3) 기타학회및규격에있어측정방법의예
(1) 일본약학계위생시험법에의한공중낙하균측정법낙하법 (Koch법) : 공기중에서일정시간내에일정면적의한천배지위에낙하하여발육하는세균의총수를계산한다. 낙하법의특징은기기전원을필요로하지않고간단하며, 정치하기만하면되므로대상으로하는공기를흐트러트리지않고측정이가능하다. a. 샘플링방법 : 한천배지가들어있는샤례 ( 직경 90) 를한점의측정장소에 3장동시에뚜껑을열고정치시킨다음, 5분간노출시킨후다시뚜껑을조용히덮는다. b. 배양일반세균 : 표준한천배지 36±1 24-48 시간진균 : 포테토텍스트로스한천배지 ( 클로램페니콜첨가 ), 25±1 5-7일 c. 계측직경 90 페트리접시로 1측정에서 3매의평균치. 얻어진샤레 1개당의콜로니 ( 질락 ) 수를낙하세균수 (c.f.u/m 3 ) 로한다. 4) NASA 규격 (NASA NHB-5340-1) 에의한공중낙하균 ( 일반세균 ) 의측정예스텐레스강판법 : 멸균된스텐레스강판을측정장소에놓고, 실내공기에노출된표면에축적된위생물오염의정도를조사한다. (1) 샘플링방법멸균된스텐레스강판을 (16게이지, 1 X 2 in) 를소정시간공기중에노출시킨다. 각측정장소에대해서 6개의강판을모아서각각의건조멸균한입구가큰병에넣는다. 그중에무균의 1.0% 펨톤수 50ml를넣고 12분간초음파세정을한다. 세정후가열시료와비가열시료로반씩나눈다. - 비가열시료 : 4장의페트리접시 ( 직경 100) 에시료 5ml와 Trypticase Soy Agar( 이후 TSA라한다.) 20ml를각각무균상태로첨가한다. 병으로부터스텐레스강판을꺼내 TSA가들어있는페트리접시에묻는다. - 가열시료 : 시료를 80, 20분간, 열중탕으로가열하고, 전자와같이 4 장의페트리접시에나눈다. 아포형성균의검사용이다. (2) 배양 - 호기성배양 : 가열, 비가열시료각각 2 개씩 4 개접시에, 스텐레스강
판이들어있는접시를배양, 32 에서 24, 48, 72 시간후콜로니수를센다. - 염기성배양 : 가열, 비가열시료를각각 2개씩 4개의접시를 32 에서 72시간배양하고콜로니수를센다. (3) 계수각조의 2개의페트리접시 ( 비가열, 호기성, 염기성배양한것. 가열, 호기성, 염기성배양한것 ) 의모두의평균콜로니수에 10을곱한것이스텐레스강판 1 장당의미생물수가된다. 6장에대해서평균치가그장소의측정치가된다. 주 ) 멸균물의취급이나샘플링처리등을포함한전체의무균적인조작은미국연방규격 209E의청정도클라스 M3.5를만족시킬수있는층류클린벤치안에서수행되어야한다. 5) 각분야에있어서의측정법의예 낙하균의측정방법은댗로낙하세균법이사용된다. 그러나각각에있어서 샤레의노출시간, 배지의종류가다른경우가많다. (1) 식품위생규범 일반세균 : 표준한천배지 ( 직경 90) 5 분간, 35±1, 48 시간 ) 진균 : PDA+ 클로램페니콜 ( 직경 90), 20 분, 23±2, 7 일간. (2) 의약품제조시설 일반세균 : 표준한천배지 ( 직경 90) 1 시간, 36±1, 24-48 시간 ) 진균 : PDA+ 클로램페니콜 ( 직경 90), 1 시간, 25±1, 5-7 일간 (3) 보통실내공기시험 일반세균 : 표준한천배지 ( 직경 90) 5 분간, 36±1, 24-48 시간 ) 진균 : PDA+ 클로램페니콜 ( 직경 90), 5 분, 25±1, 5-7 일간.