대한진단검사의학회지 : 제 22 권제 5 호 2002 Korean J Lab Med 2002; 22: 325-30 임상미생물학 TaqMan PCR System 을이용한 B 형간염바이러스 DNA 분석 Hubert G.M. Niesters 박도심 * 이영진 * 조지현 * Maija Lappalainen** 채준석 *** 로테르담대학병원바이러스부, 원광대학교의과대학진단검사의학교실및의과학연구소,* 헬싱키대학교센트럴병원바이러스부,** 전북대학교수의과대학내과학 - 임상병리학교실 *** Hepatitis B Virus DNA Assay using the TaqMan PCR System Hubert G.M. Niesters, Ph.D., Do Sim Park, M.D.,* Young Jin Lee, M.D.,* Ji Hyun Cho, M.D.,* Maija Lappalainen, M.D.,** and Joon Seok Chae, Ph.D.*** Department of Virology, University Hospital Rotterdam, Rotterdam, The Netherlands; Department of Laboratory Medicine and Institute of Wonkwang Medical Science,* School of Medicine, Wonkwang University, Iksan, Korea; Department of Virology,** Helsinki University Central Hospital, Helsinki, Finland; Veterinary Internal Medicine/Clinical Pathology,*** College of Veterinary Medicine, Chonbuk National University, Chonju, Korea Background : Hepatitis B virus (HBV) DNA quantitation and detection assay is necessary when monitoring the disease progression or therapeutic effect of viral hepatitis. The TaqMan PCR system (TPS) that was recently developed for HBV DNA quantitation was known for not only capable and exact quantitation but also capable sensitive detection. Therefore, we evaluated the clinical utility of the TPS by comparing it with hybrid capture system (HCS) and nested polymerase chain reaction (PCR). Methods : The dilution test was performed to evaluate reproducibility and the dynamic range of TPS and HCS. Further, the sensitivity of the diluted sera were also compared with TPS, HCS, and nested PCR. The sera of HBsAg positive patients (n=119) were tested to compare the sensitivity of the three methods and the quantity of HBV DNA by TPS and HCS. Results : The TPS showed lower coefficients of variations (TPS, 6.5-60.4%; HCS, 11.9-61.4%) and a wider dynamic range than HCS in the dilution test. The sensitivity was high in order of nested PCR, TPS and HCS (cover 10 6, 5 10 5, and 10 2 of diluted concentration) in the dilution test. But the sensitivity was high in order of TPS, nested PCR, and HCS (89, 68%, and 56%) in the 119 sera of HBsAg positive patients. The TPS and HCS revealed a significant correlation (R=0.90, P<0.0001). Conclusions : The TPS and nested PCR showed higher sensitivity than HCS, and TPS showed better sensitivity than nested PCR in clinical specimens. Also, the TPS showed more quantitation potential than HCS. Thus, it appears useful in accurately defining the viral replication state and antiviral therapeutic effects among persons with HBV infection. (Korean J Lab Meb 2002; 22: 325-30) Key words : Hepatitis B virus, DNA, quantitation, TaqMan PCR, Hybrid capture 접수 : 2002년 7월 19일접수번호 : KJCP1595 수정본접수 : 2002년 9월 16일교신저자 : 박도심우 138-040 전북익산시신용동 344-2 원광대학병원진단검사의학과전화 : 063-850-1543, Fax: 063-842-3786 E-mail : email@wmc.wonkwang.ac.kr * 본논문은 2001년도원광대학교교내연구비에의해지원되었음. 서론 B형간염바이러스 DNA의정량은 B형간염의항바이러스치료효과와질환의진행경과를아는데필수적이며, 조기진단및혈청학적진단이모호한경우의확진시에도유용하다 [1, 2]. B형간염바이러스의정량적검사로흔히사용되는액체보합법 (liquid 325
326 Hubert G.M. Niesters 박도심 이영진외 3 인 hybridization) 은비교적정확하게 B형간염바이러스 DNA를정량하는것으로보고되어있으나 [1], 민감도가낮아위음성률이 35-59% 에이른다고한다 [3-5]. 반면최근개발된 TaqMan polymerase chain reaction system( 이하 TPS) 을이용한 B형간염바이러스검사는정확한정량이가능할뿐아니라 PCR (polymerase chain reaction) 검사보다도높은민감도를겸비하고있어 B형간염바이러스 DNA검출에유용한검사로소개되고있다 [6]. 이외에도 TaqMan PCR법은자동화장비를이용하여다량의검체를동시에검사할수있으며, 전기영동과정을생략함으로써검사소요시간을단축하고, 검사과정중오염가능성을줄임으로써특이도가높은것으로알려져있다 [1, 6-9]. 이에저자들은 TPS를이용하여 B형간염바이러스감염자들의 B형간염바이러스 DNA를정량하고이들결과를 hybrid capture system( 이하 HCS) 을이용한정량검사및 nested PCR법과비교하여임상적유용성을평가하였다. 대상및방법 1. 대상 1999년 5월부터 2001년 12월사이에원광대학교병원에 B형간염바이러스 DNA 정량검사가의뢰된검체를대상으로 HCS 를이용한정량검사를시행하고이들중일부를 -20 에보관하여 nested PCR과 TPS로 B형간염바이러스 DNA검사를시행하였다. 고농도 (HCS의상한측정범위인 2,000 pg/ml 이상 ) 의 B형간염바이러스 DNA를가진혼주혈청을 Table 1과같이 10단계농도로계대희석하여개별분주후각농도의검체에대해 4일간 4회에걸쳐 TPS와 HCS에검사 ( 각방법당 40개혈청검체를검사 ) 하여농도별일간변이계수 (coefficient of variation) 를구 하고, 혼주혈청을 100배희석하여측정한평균농도를기준으로각농도별회수율을구하여두방법의재현성과측정범위를알아보았다. 또한 10단계농도에대하여 nested PCR을시행하여민감도를비교하였다. B형간염바이러스표면항원양성인 119명의 B형간염바이러스감염자들의혈청으로 TPS, HCS, nested PCR의 B형간염바이러스 DNA 검출능을비교하였다. 동시에 TPS와 HCS에서나온 B형간염바이러스정량결과를비교하여두방법의상관성을구하였으며 30명의건강한대조군을대상으로 TPS의특이도를확인하였다. 2. 방법 1) B형간염바이러스표면항원검사혈청내 B형간염바이러스표면항원검사는 Elecsys 2010 system (Roche Diagnostics, GmbH, Germany) 를이용하여제조사의지침대로시행하였다. 2) HCS를이용한 B형간염바이러스 DNA 정량 HCS (Digene Corporation, Gaithersburg, USA) 를이용한 B 형간염바이러스정량검사과정과결과판정은제조사의지침대로시행하였다 (5 pg/ml 이상은양성, 5 pg/ml 미만은음성 ). 단제조사에서제시한상한정량범위인 2,000 pg/ml 이상에대한추가희석검사는시행하지않았다. 3) TPS를이용한 B형간염바이러스 DNA 정량 (1) DNA 추출 B형간염바이러스추출은자동화 DNA 추출장비인 MagNA Pure LC (Roche Diagnostics System) 와 MagNA Pure LC total nucleic acid isolation 키트 (Roche Diagnostics System) 를 Table 1. Reproducibility, dynamic range, and sensitivity of TPS, HCS, and nested PCR on dilution test Serial dilution Measured method TPS HCS Mean (copies/ml) CV* (%) Mean recovery rate (%) Mean (copies/ml) CV (%) Mean recovery rate (%) Nested PCR 1 6.53E+09 6.5 107.2 7.88E+09 11.9 83.2 positive 1:2 4.07E+09 23.3 108.5 4.10E+09 23.5 99.9 positive 1:10 5.47E+08 31.5 107.1 5.93E+08 61.4 98.3 positive 1:10 2 1.43E+07 22.5 100.0 8.43E+07 36.4 100.0 positive 1:10 3 4.03E+05 43.9 91.1 negative positive 1:10 4 1.54E+04 45.0 81.2 negative positive 1:10 5 7.80E+02 37.0 69.9 negative positive 1:5 10 5 1.80E+02 60.4 65.2 negative positive 1:10 6 negative negative positive negative negative negative negative *between day variation during four days, mean recovery rate=measured value (log copies/ml)/expected value (log copies/ml), the expected range was caculated from 1:100 dilution concentration, less than 5 pg/ml by HCS (using by manufacturer s protocol). Abbreviations: TPS, TaqMan PCR system; HCS, Hybrid Capture system; E, exponential.
TaqMan PCR System 을이용한 B 형간염바이러스 DNA 분석 327 이용하여제조사의지침에준하여다음과같은방법으로실행하였다. 즉계대희석한검체, 각환자혈청에대해각 200 L를 sample cartridge에넣고여기에 chaotropic염들과 proteinase K 를포함하는용해완충액 300 L와혼합하여항온후바이러스를용해시켰다. 용해산물에자성유리소체 (magnetic glass particle) 들을첨가하여 DNA를자성유리소체표면에흡착시키고, DNA 가흡착된자성유리소체를 sample cartridge벽으로부터회수하였다. 회수된 DNA를세척한후, 50 L의용출액으로 DNA를용출하고자성을이용하여자성유리소체를남기고 DNA만을추출하였다. (2) 정량표준화및정도관리 B형간염바이러스전체 DNA (3.2 kilobase) 가삽입된 pbr 322벡터를함유한대장균에서플라스미드를추출한후이를이용하여 300-10 7 copies/ml 범위의플라스미드표준화곡선 (standard curve) 을생성하였으며, 표준화곡선의확인은 viral quality control (VQC) HBV DNA 판넬 (CLB, Amsterdam, The Netherlands) 를이용하였고 (Fig. 1), 매검사마다음성대조와양성대조를동시에시행하였다. (3)TaqMan PCR을이용한증폭과감지 PCR을위한시발체와 probe는 Pas 등 [7] 의방법을인용하여제작하였다. 증폭과정은계대희석한검체와각환자혈청에서분리한 DNA 10 L, 전시발체 (5 -GGACCCCTGCTCGTGTTAC A-3, 184-203영역 ) 와역시발체 (5 -GAGAGAAGTCCACC MCGAGTCTGAA-3, 273-249영역 ) 각 45 pmol, TaqMan probe (5 -FAM-TGTTGACAARAATCCTCACCATACC RCAGA-TAMRA-3, 218-247영역 ) 15 pmol에 TaqMan universal MasterMix (Applied Biosystems, Nieuwerkerk a/d Ijssel, The Netherlands) 2배농축액을혼합하여총 50 L가되게한후다음과같이진행하였다. 먼저증폭산물을불활성화하기위하여 uracyl N-glycosylase는 50 에서 2분간반응시켜이전의증폭산물에의한오염가능성을배제한다음 95 에 10분간반응시켜 uracyl N-glycosylase는불활성화시키고, AmpliTaq Gold polymerase는활성화시킨후, 95 15초, 60 65초의두 1.200 과정으로 50회를반복하여증폭시켰다. 증폭반응이진행되면서발생하는형광신호를이용하여역치주기를구하였으며농도를아는검체의역치주기를이용하여표준화곡선이결정되었고, 각검체의 B형간염바이러스 DNA 농도는자동화된전산프로그램으로산출되었다 (Fig. 1). 증폭과감지과정은모두 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems) 에서시행되었다. 대조군을포함하여전검체는 DNA의추출부터증폭, 감지과정을별도의반응관으로이중으로시행하였다. 4) Nested PCR을이용한 B형간염바이러스 DNA 검출 DNA 추출은계대희석한검체와각환자대해 200 L의혈청을이용하여 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilder, Germany) 를이용하여제조사의지침대로시행하고최종 200 L 용출액으로 DNA를추출하였다. 시발체제작을포함하여추출된 DNA의증폭반응은 B형간염바이러스 PreMix Kit (Genotech, Daejeon, Korea) 를이용하여제조사의지침에준하여다음과같이시행하였다. 1차시발체혼합액 ( 전시발체, 5 -GC TTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAA-3, 1765-1794 영역 ; 후시발체, 5 -CTGACTACTAATTCCCTGGATGCTG GGTCT-3, 2034-2000영역 ) 2 L, PCR Master Mix 4 L, D NA 4 L, 8-MOP (methoxypsoralene) 을혼합하여총 20 L 의반응액을만들고이를 GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer, CA, USA) 에서 94 5분 1회, 94 30초, 60 1분, 72 1분의 3단계반응 30회, 72 5분 1회의 1차증폭반응을실시하였고, 2차시발체혼합액 ( 전시발체, 5 -GGGCATGGACA TTGACCCGTATAAAGAATT-3, 1771-1800영역 ; 후시발체, 5 -ACTAATTCCTCGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3, 2028-1999영역 ) 2 L, PCR Master Mix 4 L, 1차증폭산물 4 L, 8-MOP 을혼합하여 1차증폭반응조건과동일하게 2차증폭반응을시행하였다. 2차증폭산물 10 L를취하여 1.5% agarose gel에서표지자와함께전기영동한후, ethidiumbromide (10 mg/ ml) 로염색하여자외선투영기에놓고 259염기쌍의위치에서밴드가관찰되면양성으로판정하였다. 50 Rn 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 a b c d e f g h Threshold cycle (Ct) 40 30 20 10 h g y=-3.4077x+48.07 R 2 =0.9784 f e d c b a -0.200 0 2 4 6 8 10 14 20 24 30 34 40 44 50 Cycle A 0 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 Log expected value B Fig. 1. Amplification plots and standard curve by TPS using the viral quality control panel. (A) Rn (fluoresence units) was plotted against each cycle. (B) Ct was plotted against input of HBV DNA quantity (repeated 30 times).
328 Hubert G.M. Niesters 박도심 이영진외 3 인 Table 2. Sensitivity of TPS, HCS, and Nested PCR in 119 sera of HBsAg positive patients HBV DNA (copies/ No. (%) of positive by: ml) by TPS TPS HCS Nested PCR less than 10 6 36/49 (74%)* 0/49 (0%) 13/49 (27%)* 10 6-10 8 32/32 (100%) 29/32 (91%) 30/32 (94%) more than 10 8 38/38 (100%) 38/38 (100%) 38/38 (100%) total 106/119 (89%)* 67/119 (56%) 81/119 (68%) *P<0.05, compared with HCS. Abbreviations: See Table 1. (1) Statistics 각방법간 B형간염바이러스의검출률의비교는 Chi-square test, 상관성검증은피어슨상관분석을시행하고상관계수를구하였다. 각분석은 SPSS 10.0 버전을이용하였다. HBV DNA by TPS (log copies/ml) 10 9 8 7 6 5 4 3 y=0.99x-0.02 R=0.90 (P<0.0001) 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 HBV DNA by HCS (log copies/ml) Fig. 2. Correlation of TPS and HCS by 67 sera that showed detectable DNA by both method. 39 sera along the y axis (those were not contained in quantity correlationship statistics), which were negative by HCS (using by manufacturer s protocol), but showed detectable DNA by TPS. 결 과 1. 계대희석혈청을이용한 TPS 와 HCS 의정밀도와측정범위및 nested PCR 의민감도 (Table 1) 두방법이동시에정량이가능하였던농도 ( 원액, 2배희석농도, 10배희석농도, 100배희석농도 ) 에서는 4일동안 4회의검사에서일간변이계수 (coefficient of variation) 는 TPS 6.5-31.4%, HCS 11.9-61.4% 범주로 TPS가 HCS보다정밀도면에서우수하게나타났다. 측정범위는 HCS가갖는최대일간변이계수인 61% 이내에서 90-110% 의회수율 ( 회수율은실제측정된평균측정값을기대평균농도값으로나눈비율로구하였으며, 기대농도값은계대희석검체중 100배희석된검체의평균농도를기준으로여기에각희석배수를곱하여계산하였다.) 을기준으로할때 TPS는원액에서 1 10 3 배희석한농도까지측정범위인반면, HCS는 2배희석한농도에서 100배희석농도까지가측정범위였다. 또한 TPS는 1 10 3 배이상희석한농도에서정량적으로기대치보다낮은회수율을보이기는 5 10 5 까지희석한농도에서 DNA 검출이가능하였고, nested PCR은 1 10 6 배희석농도까지검출이가능하였다. 결과적으로 HCS보다 TPS나 nested PCR은현저히높은민감도를나타냈으며 nested PCR은 TPS보다 2배더희석한농도까지양성을보여가장우수한민감도를보였다. 2. B 형간염바이러스감염자의검체에서 TPS, HCS, nested PCR 의민감도 (Table 2) 119명의 B형간염바이러스감염자를대상으로 B형간염바이러스 DNA를검사한결과 TPS가 106/119 (89%) 으로가장높은검출률을보였으며 (P<0.05), nested PCR은 81/119 (68%), HCS는 67/119 (56%) 로나타났다. TPS에의한농도를기준으 로분류한결과 10 6 copies/ml 미만범위에서의양성률은 TPS 36/49 (74%), nested PCR 13/49 (27%), HCS 0/49 (0%), 10 6-10 8 copies/ml범위에서 TPS 32/32 (100%), nested PCR 30/32 (94%), HCS 29/32 (91%), TPS 10 8 copies/ml 이상인 38검체는세방법에서모두 B형간염바이러스 DNA가검출되었다. 희석한검체를대상으로한것과는달리실제 B형간염감염자들의결과는특히저농도검체에서 TPS가 nested PCR이나 HCS보다훨씬우수한민감도를보였다 (P<0.05). 3. TPS 의특이도 TPS의특이도를확인하기위해 30명의 B형간염바이러스표면항체가음성이었던건강한대조군에대하여검사를시행하였으며모두음성으로판정되었다. 4. B 형간염바이러스감염자의검체에서 TPS 와 HCS 의상관성 (Fig. 2) 119명의 B형간염바이러스감염자검체중 TPS와 HCS 동시에양성을보인 67검체를대상으로상관성을비교한결과유의한상관성을보였다 (R=0.90, P<0.0001). 고 본연구에서는최근개발된 TPS를이용하여 B형간염바이러스정량검사를시행하고, 그결과를 B형간염바이러스 DNA검사로흔히사용되는 HCS 및 nested PCR과비교하여그유용성을정밀도, 측정범위, 민감도, 특이도, 정량적상관성면에서알아보고자하였다. 찰
TaqMan PCR System 을이용한 B 형간염바이러스 DNA 분석 329 TPS와 HCS 두방법모두에서 DNA 검출이가능하였던농도범위에서 TPS의일간변이계수는 6.5-31.5%, HCS의일간변이계수는 11.9-61.4% 로 TPS의정밀도가 HCS에비해현저히우수한성적을보였다. TPS를이용하여검출이가능하였던전범위의농도에서는일간변이계수는 6.5-60.4% 로 Chen 등 [6] 이 TPS를사용하여검사한일간변이계수 17-55% 범위와유사한성적이었다. B형간염바이러스정량검사는항바이러스제제치료후주요추적검사이므로검사결과의신뢰도를높이기위해서는일간정밀도가우선조건이되어야하는데 TPS는저농도상태에서고농도상태보다약간높은일간변이계수를보이기는하였으나전반적으로는 HCS보다우수한정밀도를가지므로정량법으로보다적절한조건을갖는것으로판단되었다. 정량측정의범위면에서도 B형간염바이러스 DNA가포함된혼주혈청을희석하여검사한결과, TPS는원액농도부터 1 10 3 배희석농도까지 HCS비해우수한일간변이계수를보이면서도평균기댓값과비교해 10% 이내의오차를갖는반면, HCS는 2 배희석한농도에서 100배희석한농도까지만 10% 이내오차를유지하여 TPS가더넓은측정범위를갖는것으로판단되었다. 또한 TPS는기대치보다결과값이낮은경향을보이기는하였으나 TPS는 5 10 5 배희석한농도까지도검출이가능하였으며동시에 HCS가갖는최대일간변이계수보다작은범위를유지하였으므로질환의경과를알아보는데는도움이될수있을것으로판단되었다. B형간염바이러스감염자들의혈청을이용한검사에서도 TPS 는 HCS에비해 33% 나우수한민감도를보였는데, 이는 Zanella 등 [3] 의결과와도비슷한수준이었다. 이외에 Loeb 등 [8] 이나 Paraskevis 등 [10] 도 HCS보다민감하다고알려진다른정량법들과 TPS를비교한결과 TPS가더높은민감도를갖고있다고보고한바있다. 이러한결과들은역으로기존의정량법들의높은위음성률을의미하며, Loeb 등 [8] 은이런위음성결과들이항바이러스제제치료과정에서내성유발요인중의하나로가정하고, 더민감한바이러스추적검사법이사용되야한다고제안한바있다. Nested PCR법과 TPS의민감도성적은혼주혈청의계대희석검체와 B형간염바이러스감염자들의검체사이에약간의불일치를보였다. 즉혼주혈청희석검체를이용한결과는 nested PCR 이 2배더낮은농도까지검출하였으나 (Table 1), B형간염바이러스감염자들의검체에서는 TPS가 nested PCR법보다유의하게우수한높은민감도를보였다. 이러한차이는대부분과정이수기로된 nested PCR검사법에서 DNA 추출이나증폭과정동안검체각각에대한파이펫사용시발생한차이나증폭기기내에서미세한온도차이, 시발체의설정위치에따른효율및검출조건, 검체내포함된미지의 PCR 억제인자등이두방법에다르게영향을미친때문으로추정되었다. Chen 등 [6] 은 DNA 추출법과 DNA양을동일하게한후 TPS와 PCR-hybridization법을이용하여비교한결과 TPS가 PCR-hybridization법보다민감도가우수하다고보고한바있다. 비록본연구에서 DNA 추출과정이 TPS는 MagNA Pure LC 장비를, nested PCR은 QIAamp DNA Mini Kit를이용하고, DNA양이 TPS는 10 L인반면, nested PCR은 4 L로다르기는하나본검사실에서자체확인한결과4 L 이상의 DNA 증량이 nested PCR의민감도를증가시키는요인으로작용하지않았다. 이외에시발체의설정위치는임상검체의 nested PCR의효율에영향을주요인자중하나인데본연구에서사용된시발체는환자들의진단목적으로사용되어왔었고병원내검사실에서사용되기전에국내에서사용되었던일부제품들과비교하여대등하거나우수한민감도를보였으므로본연구에서설정한검사조건으로나온성적으로는실제 B형간염바이러스감염자들의간염바이러스 DNA검출에는 TPS 가가장높은민감도를나타내는것으로판단되었다. TPS는또한 B형간염바이러스음성검체에서 100% 의특이도를나타냈는데, 이는 TPS법이검사전의 uracyl N-glycosylase 을이용하여오염가능성을제거하는과정과시험중에반응관을여는과정을없앰으로써 PCR법의단점인위양성문제를방법적으로보완하였음을증명하였다. TPS와 HCS의정량적상관성은통계적으로유의하여 TPS가기존에사용되었던 HCS 정량법을대체할수있는 B형간염바이러스 DNA 정량법으로판단되었다. 더욱이 TPS는기존의 nested PCR법과비교해서도전기영동과정이없어검사소요시간이짧고, 화학적반응을지속적으로감지함으로서정량이가능할뿐아니라, 대량의검체를자동으로동시에검사할수있다는방법적장점을갖고있다. 결론적으로 TPS를이용한 B형간염바이러스 DNA 정량측정은기존의정량측정법보다우수한정밀도와폭넓은측정범위를가지며, 임상검체에서의민감도와특이도가높을뿐아니라자동화가가능한검사법이므로기존의 B형간염바이러스 DNA검사를대체하여유용하게사용될수있는검사법으로판단되었다. 요약배경 : B형간염바이러스 DNA의정량과검출은 B형간염환자의항바이러스치료결과나질환의경과파악에필수적이다. Hybrid capture system (HCS) 은 B형간염바이러스정량에흔히사용되어왔으나민감도에제한이있으며, nested PCR법은민감도는높으나정확한정량은어렵다. 최근 TaqMan PCR system (TPS) 을이용한 B형간염바이러스 DNA는민감도도높고정확한정량이가능한검사법으로알려져있다. 이에저자들은 B형간염바이러스 DNA를 TPS, HCS, nested PCR로측정비교하여그임상적유용성을평가하고자하였다. 방법 : 혼주혈청을계대희석하여 TPS와 HCS의재현성, 측정범위를비교하였고, 이들방법과 nested PCR법의민감도를비교하였다. 또한 119예의 B형간염바이러스표면항원양성검체를이용하여 TPS와 HCS의정량적상관성을비교하였고, 동시에 TPS,
330 Hubert G.M. Niesters 박도심 이영진외 3 인 HCS, nested PCR의민감도를비교하였다. 결과 : 계대희석한검체에서 TPS는 HCS보다낮은일간변이계수 (TPS: 6.5-60.4%, HCS; 11.9-61.4%) 와넓은측정범위를보였고, 민감도는 nested PCR, TPS, HCS (10 6, 5 10 5, 10 2 희석농도까지검출 ) 순이었다. 그러나 B형간염바이러스표면항원양성검체에서의민감도는 TPS, nested PCR, HCS (89%, 68%, 56%) 순이었으며, TPS와 HCS는정량적으로유의한상관성을보였다 (R=0.90, P<0.0001). 결론 : TPS와 nested PCR은 HCS보다우수한민감도를나타냈으며, TPS는임상검체에서 nested PCR보다우수한민감도를보였다. 또한 TPS는 HCS 보다정량검사에서더우수한검사능을보였다. 그러므로 TPS는 B형간염바이러스감염자의바이러스증식능이나항바이러스제제치료후효과를정확히파악할수있는유용한검사로판단되었다. 참고문헌 1. Weinberger KM, Wiedenmann E, Bohm S, Jilg W. Sensitive and accurate quantitation of hepatitis B virus DNA using a kinetic fluorescence detection system (TaqMan PCR). J Virol Methods 2000; 85: 75-82. 2. Saito T, Shinzawa H, Uchida T, Kawamata O, Honma S, Watanabe H, et al. Quantitative DNA analysis of low-level hepatitis B viremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis B. J Med Virol 1999; 58: 325-31. 3. Zanella I, Rossini A, Domenighini D, Albertini A, Cariani E. Quantitative analysis of hepatitis B virus DNA by real-lime amplification. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2002; 21: 22-6. 4. 김영식, 이광길, 박수연, 이희주, 서진태. Digene Hybrid Capture assay 와자가제조 PCR법을이용한 HBV DNA 측정법의비교. 대한임상미생물학회지 2000; 3: 132-6. 5. 기창석, 이남용, 김대원. B형간염바이러스 DNA 정량을위한 Hybrid Capture System, Hybrid Capure II 및 Quantiplex HBV DNA Assay의비교. 대한임상병리학회지 1999; 19: 202-7. 6. Chen RW, Piiparinen H, Seppanen M, Koskela P, Sarna S, Lappalainen M. Real-time PCR for detection and quantitation of hepatitis B virus DNA. J Med Virol 2001; 65: 250-6. 7. Pas SD, Fries E, De Man RA, Osterhaus AD, Niesters HG. Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays. J Clin Microbiol 2000; 38: 2897-901. 8. Loeb KR, Jerome KR, Goddard J, Huang M, Cent A, Corey L. Highthroughput quantitative analysis of hepatitis B virus DNA in serum using the TaqMan fluorogenic detection system. Hepatology 2000; 32: 626-9. 9. Meng Q, Wong C, Rangachari A, Tamatsukuri S, Sasaki M, Fiss E, et al. Automated multiplex assay system for simultaneous detection of hepatitis B virus DNA, hepatitis C virus RNA, and human immunodeficiency virus type 1 RNA. J Clin Microbiol 2001; 39: 2937-45. 10. Paraskevis D, Haida C, Tassopoulos N, Raptopoulou M, Tsantoulas D, Papachristou H, et al. Development and assessment of a novel realtime PCR assay for quantitation of HBV DNA. J Virol Methods 2002; 103: 201-12.