Appl. Chem. Eng., Vol. 26, No. 4, August 2015, 470-476 http://dx.doi.org/10.14478/ace.2015.1058 Article 떡쑥추출물로부터분리된 Dicaffeoylquinic Acid 유도체들의항산화및타이로시네이즈저해활성 임나리 김해수 하지훈 노근영 박수남 서울과학기술대학교정밀화학과나노바이오화장품연구실화장품종합기술연구소 (2015 년 5 월 7 일접수, 2015 년 6 월 10 일심사, 2015 년 6 월 18 일채택 ) Antioxidant and Tyrosinase Inhibitory Activities of Dicaffeoylquinic Acid Derivatives Isolated from Gnaphalium Affine D. DON. Na Ri Im, Hae Soo Kim, Ji Hoon Ha, Geun Young Noh, and Soo Nam Park Department of Fine Chemistry, Cosmetic R&D Center, Seoul National University of Science and Technology, 232 Gongneung-ro, Nowon-gu, Seoul 139-743, Korea (Received May 7, 2015; Revised June 10, 2015; Accepted June 18, 2015) 초록본연구에서는떡쑥추출물로부터 3가지 dicaffeoylquinic acid (DCQA) 를분리정제하여구조를결정하고, 항산화활성, 세포보호효과, 그리고 tyrosinase 저해활성을평가하였다. 떡쑥추출물의에틸아세테이트분획에대하여크로마토그래피, 1 H-NMR 및 MS 분석을한결과, 분리된화합물은총 3가지 DCQA 유도체 : 3,5-dicaffoylquinic acid (3,5-DCQA, 1), 4,5-dicaffeoylquinic acid (4,5-DCQA, 2), 1,5-dicaffoylquinic acid (1,5-DCQA, 3) 로나타났다. 분리된 compound 1-3의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거활성 (FSC 50) 은각각 3.70, 5.80 및 5.50 µm로지용성항산화제로알려진 (+)-α-tocopherol (FSC 50 = 21.90 µm) 과비교하여더큰 free radical 소거활성을나타내었다. compound 1-3의 1 O 2 로유도된사람적혈구의광용혈에대한세포보호효과는 (+)-α-tocopherol과유사한세포보호활성을나타내었다. Compound 1-3의 tyrosinase 저해활성 (IC 50) 은각각 0.15, 0.16, 및 0.13 mm로미백성분으로알려진 arbutin (IC 50 = 0.33 mm) 과비교하여높은 tyrosinase 억제효과를나타내었다. 이상의결과들은세가지 DCQA가식품또는화장품산업에서항산화및미백기능성소재로서응용가능성이있음을시사한다. Abstract In this study, three dicaffeoylquinic acids (DCQAs) isolated from Gnaphalium affine D. DON. extracts were structurally identified and evaluated for their antioxidant activities, cellular protective effects, and tyrosinase inhibitory activities. The ethyl acetate fraction of G. affine was chromatographed, which yielded 3 DCQA derivatives of 1-3 : 3,5-dicaffoylquinic acid (3,5-DCQA, 1), 4,5-dicaffeoylquinic acid (4,5-DCQA, 2), 1,5-dicaffoylquinic acid (1,5-DCQA, 3). The structure of each compounds was determined using 1 H NMR and MS analyses. Compounds of 1-3 showed strong free radical (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH) scavenging activities (FSC 50 = 3.70, 5.80, and 5.50 µm, respectively) compared to those of a commonly used lipophilic antioxidant, (+)-α-tocopherol (21.90 µm). Cellular protective effects of 1-3 compounds on the 1 O 2 sensitized photohemolysis of human erythrocytes were similar to (+)-α-tocopherol. 1-3 compounds also exhibited higher tyrosinase inhibitory effects (IC 50 = 0.15, 0.16, and 0.13 mm) compared to arbutin (0.33 mm), known as a skin-whitening agent. These results indicate that three DCQA derivatives may be applied as an antioxidant and a skin whitening agent in food or cosmetic industries. Keywords: gnaphalium affine, dicaffeoylquinic acid, DPPH radical scavenging activity, cellular protective effect, tyrosinase 1)1. 서론 자외선으로부터유도되어생성되는활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 은피부및세포에광산화적손상을일으키는강한산화 Corresponding Author: Seoul National University of Science and Technology, Department of Fine Chemistry, Cosmetic R&D Center, 232 Gongneung-ro, Nowon-gu, Seoul 139-743, Korea Tel: +82-2-970-6451 e-mail: snpark@seoultech.ac.kr pissn: 1225-0112 eissn: 2288-4505 @ 2014 The Korean Society of Industrial and Engineering Chemistry. All rights reserved. 력을갖는산소종으로서 superoxide anion radical (O 2 - ), hydroxyl radical ( OH) 과같은산소중심의라디칼뿐만아니라 hydrogen peroxide (H 2O 2), singlet oxygen ( 1 O 2) 과같은비라디칼종그리고이들이생체성분과반응하여생성된 peroxyl radical (ROO ), alkoxy radical (RO ) 등이포함된다 [1-3]. 이들 ROS는생체내항산화방어망을붕괴시키고이어서세포를구성하는지질, 단백질및 DNA의산화뿐만아니라피부진피내 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) 등단백질가수분해효소의발현을증가시킴으로써피부탄력및장력을나타내는콜라젠과엘라스틴등의세포외매트릭스구성성분들을절단시키 470
떡쑥추출물로부터분리된 Dicaffeoylquinic Acid 유도체들의항산화및타이로시네이즈저해활성 471 고비정상적인교차결합을통하여피부노화를가속화시킨다. 또한 ROS는피부기저막에있는멜라닌세포의활성화를통하여멜라닌세포증식및멜라닌합성을증가시킨다고보고되고있다 [4-8]. 따라서활성산소를효율적으로제거하고세포및조직을보호하기위해서는피부항산화방어망구축및항산화효능이큰항산화제의개발이절실히요구되고있는실정이다 [9,10]. 멜라닌은 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1), tyrosinase related protein-2 (TRP-2) 등의일련의효소반응에의하여생성되며, 이중에서멜라닌생성에있어가장중요한역할을하는효소는 tyrosinas이다 [11,12]. 이는 melanogenesis의초기단계를촉진하는속도조절인자로서, tyrosine을 3,4-dihydroxyphenylalanine (DOPA) 로전환하는 tyrosinehydroxylase 활성과 DOPA를 DOPAquinone으로산화하는 DOPA oxidase 활성을모두가지고있기때문에 tyrosinase 활성을억제하는것은미백효능에결정적인역할을한다 [13]. Tyrosinase 활성저해제로는 kojic acid, arbutin, hydroquinone, ascorbic acid 등이있으며높은세포독성및낮은제형안정성등의문제로인해사용량에있어서제한을받고있다 [14]. 최근에특히미백기능성화장품소재개발관련안전성등의문제가대두됨에따라보다안전한천연물로부터 tyrosinase 활성저해제개발이주목을받고있다. 떡쑥 (Gnaphalium affine D. DON.) 은초롱꽃목국화과의쌍떡잎식물로한국, 일본및중국등동아시아에널리분포되어자생한다. 떡쑥은천식, 기관지염및감기몸살, 항염등에효과가있고, 전립선증, 관절염, 요통및혈압을떨어뜨리는작용도한다 [15]. 저자들은최근연구에서는떡쑥추출물의에틸아세테이트분획으로부터높은항산화활성을확인하여보고한바있다 [16]. 떡쑥의성분으로는플라보노이드 [18-20], 페놀화합물 [21], 폴리사카라이드 [22], 에센셜오일 [23], 다이터펜류 [24,25] 및다른화합물 [26] 이존재하는것으로보고되어있다 [17]. 본연구에서는떡쑥추출물중에틸아세테이트분획에서 3가지 dicaffeoylquinic acid (DCQA) 유도체들을분리하여구조동정을하였으며, 이들화합물에대하여 DPPH로유도된 free radical 소거활성, 광노화에있어서중요한활성산소인 1 O 2 로유도된세포손상에대한보호작용, 그리고멜라닌형성에직접적으로관여하는 tyrosinase의저해활성을평가하였다. 이를통해 DCQAs가식품및화장품산업에서항산화및미백기능성소재로서가능성이있는지를알아보고자하였다. 2. 재료및실험방법 2.1. 기기및시약 UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia) 사의 Cary 50, 적혈구광용혈실험에사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품을사용하였고, ph 미터는 Hanna (Korea) 사제품을사용하였다. 비교물질로사용된 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), arbutin, caffeic acid와 heparin, 광증감제로사용된 rose-bengal, free radical 소거활성에사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical, 효소로사용된 mushroom tyrosinase (7.99 mg solid, 3,130 units/mg solid) 및 L-tyrosine은 Sigma Chemical Co. (USA) 에서구입하여사용하였다. 완충용액제조에사용된 Na 2HPO 4 12H 2O, NaH 2PO 4 2H 2O, NaCl, 그리고에탄올 (EtOH), 메탄올 (MeOH), 에틸아세테이드 (EtOAc), n-헥산등각종용매는시판특급시약을사용하였다. HPLC 용매는 J. T. Baker 사 (USA) 와 B&J사 (USA) 의 HPLC grade 제품을사용하였다. 실험에사용한떡쑥은 2014년 5월제주시제주대학로 102 제주대학교바이오산업센터근처에서채집된것을 70% 에탄올로추출하여사용하였다. 2.2. 떡쑥추출물로부터성분분리건조된떡쑥 500 g에 70% 에탄올 5 L를넣고 24 h 동안침적시킨후여과하였다. 이러한침적및여과과정은 3회반복하여실험하였다. 이여액을감압농축기 (R-3, Buchi-Shibata, Tokyo, Japan) 를이용하여 40 에서농축시킨후동결건조시켜분말을얻었고이분말을 70% 에탄올추출물로실험에사용하였다. 70% 에탄올추출물일부를물과 n-헥산을처리하여비극성성분을제거하고이어서에틸아세테이트로분획한후감압농축하여에틸아세테이트분획물을얻어실험에이용하였다. 저자들은선행연구를통하여에틸아세테이트분획물에서큰항산화능이있음을확인한바있다 [16], 따라서에틸아세테이트분획으로부터활성성분을찾고자분리정제를수행하였다. 에틸아세테이트분획의 TLC 분석은극성 silica gel 60 F 254 TLC판 (0.25 mm thick, Merck, Darmstadt, Germany) 을이용하여수행되었으며, 전개용매는 ethyl acetate/chloroform/formic acid/distilled water (8 : 1 : 1 : 1, v/v/v/v) 를사용하여분석하였다. TLC를통하여얻은 8개의띠 (B1~8) 중 2개의주요띠 (B3, Rf 0.71) 와 (B4, Rf 0.65) 를분리하기위해서 Diaion HP-20 (4.5 30 cm, 250-850 µm; Supelco, Bellefonte, USA) column chromatography를수행하였다. 용리용매로는 MeOH : H 2O (100/0, 75/25, 50/50, 25/75, 0/100, v/v) 를사용하였다. 분리된화합물들을관찰하기위해 silica gel TLC를이용하였으며 254 nm 및 365 nm ultra violet (UV) 파장에서반점을확인하였다. 활성분획물을 2차정제하기위해 Sephadex LH-20 (3 40 cm, 25-100 µm; Sigma, St. Louis, USA) column chromatography를실시하였으며용리용매로는 MeOH/H 2O (7 : 3, v/v) 를사용하여두개의활성분획물 (F1, F2) 을얻었다. 분획물 F1, F2는각각 B3 (Rf 0.71), B4 (Rf 0.65) 에상응되었으며, 이들분획물에대해 HPLC 분석을수행한결과 F1은두개의피크를, F2는단일피크를나타내었다. 순수한활성물질을얻기위하여분획물 F1은 Auto purification System Prep-LC (4.6 150 mm, 5 µm; Waters, Milford, MA, USA) 를이용하여다시 column chromatography 를실시하였다. 100% MeOH (A 용매 ) 와 2% acetic acid가포함된 H 2O (B 용매 ) 를이동상으로사용하고, 이동상의유속을 17.6 ml/min, UV wavelength 는 330 nm로고정하여수행하였다. 2.3. HPLC 및 LC-ESI/MS 분석조건분리된화합물을분석하기위해 auto-sampler (SIL-20A, Shimadzu), photodiode array detector (SPD-20A, Shimadzu), binary pump (LC-20AT, Shimadzu), column oven (CTO-20A, Shimadzu) 그리고 vacuum degasser (DGU-20A, Shimadzu) 를갖춘 reversed-phase HPLC 시스템 (Shimadzu model, Kyoto, Japan) 을이용하였다. 분석용 column 으로는 Shimpack VP-ODS C 18 column (4.6 250 mm, 5 µm; Shimadzu, Kyoto, Japan) 을사용하였다. HPLC 분석은 2% acetic acid 가포함된 H 2O (A용매) 와 100% MeOH (B용매) 를이용해기울기용리법으로분석하였다. HPLC 분리조건으로유속은 0.8 ml/min, 시료는 20 µl를주입하여 A용매 70-15%, B용매 30-80% 로농도에변화를주어 35 min간수행하였다. column 오븐온도는 40 로설정하고 UV wavelength는 330 nm로고정하여수행하였다. MS/MS 분석은 LCQ ion trap mass spectrometer (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA) 를갖춘 LC/MS system을사용하였으며, negative ion mode로 capillary voltage는 -15 V, capillary temperature는 400, nebulizer pressure는 10 psi 그리고 collision gas (N 2) 에서행하였다. Appl. Chem. Eng., Vol. 26, No. 4, 2015
472 임나리 김해수 하지훈 노근영 박수남 2.4. DPPH법을이용한 Free Radical 소거활성 DPPH법은시료의 free radical 소거능을확인할수있는시험법으로서, 비교적안정한라디칼인 DPPH에대한시료의환원력을측정한다. 따라서 DCQAs에대한 free radical 소거활성측정은 DPPH를이용하였으며실험방법은 Hatano 등 [27] 에의해보고된방법에따라서수행되었다. 메탄올에용해시킨 0.2 mm DPPH 용액 1 ml에에탄올 1 ml를첨가하고여러농도의샘플을 1 ml를첨가하여섞은다음실온에서 10 min 동안방치후, spectrophotometer로 517 nm에서흡광도를측정하였다. 자유라디칼소거활성은 DPPH의농도가 50% 감소되는데필요한시료의농도 (free radical scavenging activity, FSC 50, µg/ml) 로표기하였다. (a) Inhibition (%) = { 1 - [ (A Experiment - A Blank) A Control ] } 100 2.5. Photohemolysis 법을이용한세포보호효과측정 적혈구의광용혈실험법은 Park 등이보고한방법에따라서수행되었다 [28]. 적혈구는건강한성인남녀 3명으로부터얻었다. 채혈즉시 heparin이첨가된시험관에넣은후, 3,000 rpm으로 5 min 동안원심분리하여적혈구와혈장을분리하였다. 분리한적혈구는 0.9% saline phosphate buffer (ph 7.4, Na 2HPO 4 12H 2O 9.6 mm, NaH 2PO 4 2H 2O 1.6 mm) 로 3회반복하여세척하였다. 모든실험은채혈후 12 h 이내에행하였다. 실험에사용된적혈구현탁액은 700 nm에서 O.D. 값이 0.6이었으며이때적혈구수는약 1.5 10 7 cells/ml이었다. 적혈구현탁액 3.5 ml를파이렉스시험관 (No. 9820) 에넣은후, 시료를농도별로각각 50 µl씩첨가하였다. 암소에서 30 min간 pre-incubation시킨후, 광증감제인 rose bengal (12 µm) 0.5 ml를가하고파라필름으로입구를봉한후 15 min 동안광조사하였다. 광용혈에필요한광조사는내부를검게칠한 50 cm 20 cm 25 cm 크기의상자안에 20 W 형광등을장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에적혈구현탁액이담긴파이렉스시험관을형광등과평행이되도록배열한후 15 min 동안광조사하였다. 광조사가끝난후암반응 (post-incubation) 시간에따른적혈구의파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm 에서투광도 (transmittance, %) 로부터구하였다. 이파장에서적혈구현탁액투광도의증가는적혈구의용혈정도에비례한다. 모든실험은 20 항온실에서행하였다. 시료의세포보호효과는 postincubation 시간과용혈정도로구성된그래프로부터적혈구가 50% 가용혈되는시간인 τ 50 으로표기하였다. Relative protective effects = 2.6. Tyrosinase 저해활성 Sample τ 50 Control τ 50 Tyrosinase 저해활성은 Vanni 등이보고한시험방법에따라실험을진행하였다 [29]. 기질로사용된 L-tyrosine (0.3 mg/ml) 34 µl, mushroom tyrosinase (1,500 units/ml) 3 µl, potassium phosphate buffer (0.1 M, ph 6.8) 60 µl, sample 3 µl 를 96 well에서첨가하여잘혼합시켰다. 반응액을 37 에서 10 min 동안항온배양한다음, 얼음수조에넣어반응을종결시키고, ELISA reader (Tecan, Salzburg, Austria) 를이용하여 475 nm에서흡광도를측정하였다. Tyrosinase 저해활성은 tyrosinase의활성을 50% 감소시키는데필요한시료의농도 (IC 50, mm) 로표기하였다. (b) Figure 1. The HPLC chromatogram of isolated compounds (1-3). (a) F1 fraction and (b) F2 fraction of G. affine extracts. 2.7. 통계처리 모든실험은 3회반복하였고통계분석은 5% 유의수준에서 Student s t-test를행하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 분리된 compounds 의정제및구조결정 떡쑥의에틸아세테이트분획은 Diaion HP-20 및 Sephadex LH-20 column chromatography를통해두개의활성분획물 (F1, F2) 을분리하여 3가지 compounds (1-3) 을얻었다. F1에는 compound 1 및 compound 2, F2에는 compound 3가존재하였다. 활성분획물 F1, F2에대해서 HPLC 분석이수행되었으며, 각각에해당하는 HPLC 크로마토그램은 Figure 1에나타내었다. 3가지 compounds (1-3) 에대한머무름시간은각각 8.47 min, 11.60 min (Figure 1a) 그리고 8.82 min (Figure 1b) 로나타났다. 분리된 compounds (1-3) 의 MS와 1 H-NMR 분광학적데이터는다음과같다. Compound 1 [R t 8.47 min] : yellow powder; Negative ESI-MS : m/z 515.1 [M-H] -, MS/MS fragments: m/z 353.0, 191.2, 179.1; 1 H-NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ; 7.48 (1H, d, J = 16, H-7 ); 7.45 (1H, d, J = 16, H-7 ); 7.06 (1H, d, J = 1.5, H-2 ); 7.04 (1H, d, J = 1.5, H-2 ); 7.00 (1H, dd, J = 1.5, J = 8.1, H-6 ); 6.99 (1H, dd, J = 1.5, J = 8.1, H-6 ); 6.78 (1H, d, J = 8.1, H-5 ); 6.77 (1H, d, J = 8.1, H-5 ); 6.25 (1H, d, J = 16, H-8 ); 6.16 (1H, d, J = 16, H-8 ); 5.20 (1H, ddd, J = 3.8, J = 9.5, J = 10.5, H-5); 5.32 (1H, ddd, J = 3.0, J = 3.2, J = 3.8, H-3); 4.14 (1H, dd, J = 3.8, J = 9.5, H-4); 2.16 (1H, dd, J = 3.0, 공업화학, 제 26 권제 4 호, 2015
떡쑥추출물로부터분리된 Dicaffeoylquinic Acid 유도체들의항산화및타이로시네이즈저해활성 473 (a) (b) (c) Figure 2. Mass spectra of compounds (1-3) in negative ion mode (LC-ESI/MS) : (a) MS 1 spectra; (b) MS 2 spectra; (c) MS 3 spectra. Figure 3. Structure of the compounds (1-3). (1) 3,5-DCQA, (2) 4,5-DCQA, and (3) 1,5-DCQA. J = 15, H-2α); 2.14 (1H, dd, J = 3.8, J = 13.2, H-6α); 1.98 (1H, dd, J = 3.2, J = 15, H-2β); 1.94 (1H, dd, J = 10.5, J = 13.2, H-6β). Compound 2 [R t 11.60 min] : yellow powder; Negative ESI-MS : m/z 515.1 [M-H] -, MS/MS fragments: m/z 353.0, 191.2, 179.1, 173.1; 1 H-NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ; 7.48 (1H, d, J = 16, H-7 ); 7.42 (1H, d, J = 16, H-7 ); 7.02 (1H, d, J = 1.5, H-2 ); 7.00 (1H, d, J = 1.5, H-2 ); 6.98 (1H, dd, J = 1.5, J = 8.1, H-6 ); 6.99 (1H, dd, J = 1.5, J = 8.1, H-6 ); 6.75 (1H, d, J = 8.1, H-5 ); 6.73 (1H, d, J = 8.1, H-5 ); 6.24 (1H, d, J = 16, H-8 ); 6.14 (1H, d, J = 16, H-8 ); 5.36 (1H, m, H-5); 5.11 (1H, m, H-4); 4.17 (1H, dd, J = 3.8, J = 9.5, H-3); 2.15-2.17 (2H, m, H-2); 2.13 (2H, m, H-6). Compound 3 [R t 8.82 min] : yellow powder; Negative ESI-MS : m/z 515.1 [M-H] -, MS/MS fragments: m/z 352.9, 191.1, 179.1; 1 H-NMR (DMSO-d 6, 400 MHz) δ; 7.46 (1H, d, J = 16, H-7 ); 7.34 (1H, d, J = 16, H-7 ); 7.06 (1H, d, J = 1.9, H-2 ); 7.00 (1H, d, J = 1.9, H-2 ); 6.94 (1H, dd, J = 1.9, J = 8.2, H-6 ); 6.90 (1H, dd, J = 1.9, J = 8.2, H-6 ); 6.73 (1H, d, J = 8.2, H-5 ); 6.70 (1H, d, J = 8.1, H-5 ); 6.21 (1H, d, J = 16, H-8 ); 6.12 (1H, d, J = 16, H-8 ); 5.24 (1H, m, H-5); 4.00 (1H, m, H-3); 3.50 (1H, dd, H-4); 2.49 (1H, dd, H-2α); 2.33 (1H, dd, H H-6α); 2.16 (1H, dd, H-2β); 1.78 (1H, dd, H-6β). Compounds (1-3) 은 Figure 2에나타난 negative ESI-MS spectrum에서 molecular ion [M-H] - 이 m/z 515.1에서동일하게나타났으며, 동일 한 MS/MS fragment ion peak들을나타내었기때문에동일한분자식 (C 25H 24O 12) 을가진이성질체로서확인되었다. 이들이성질체들은 2개의 caffeoyl 작용기그리고 quinic acid 부분이연속적으로소실되면서 m/z 353.0에서 [M-caffeoyl-H] -, m/z 191.2에서 [M-2caffeoyl-H] - 또는 [quinic acid-h] -, 그리고 m/z 179.1에서 [caffeic acid-h] 의 MS/MS fragment ion peak를나타내었다. 반면, compound 2의경우에는 H 2O 의소실에의한결과로 m/z 173.1에서 [quinic acid-h 2O-H] 의특징적인 MS/MS fragment ion peak를나타내었다. 따라서, 이상의 HPLC 머무름시간, 1 H NMR, 및 MS 분광학적데이터를바탕으로이전에보고된문헌데이터 [30,31] 와비교해봤을때, compounds (1-3) 은각각 3,5-DCQA, 4,5-DCQA, 및 1,5-DCQA로확인되었으며각화합물의구조는 Figure 3에표시하였다. Diaffeoylquinic acid류의화합물은펜넬, 쑥, 고구마잎, 커피등에서발견되는천연폴리페놀화합물로서항산화, 미백, 신경보호, 항바이러스활성등의다양한생리활성을갖는것으로알려져있다 [32]. 3.2. DPPH법을이용한 Free Radical 소거활성 Free radical은반응성이매우높은분자로서자동산화과정을거쳐건강한세포에손상을야기한다. 항산화제는수소원자를 free radical 에줌으로써생체내의자동산화반응을차단시키고 free radical의손상으로부터세포를보호하는역할을한다. 이와같이항산화제의수소원자를제공함으로써라디칼을소거하는능력을통해시료의항산화 Appl. Chem. Eng., Vol. 26, No. 4, 2015
474 임나리 김해수 하지훈 노근영 박수남 Table 1. Cellular Protective Effect of Cellular Membrane of the Compounds (1-3) Isolated from G. Affine Extracts on the Rose-bengal Sensitized Photohemolysis of Human Erythrocytes (Control = 31.8 ± 2.7 min) τ 50 (Half time of hemolysis) 1) Concentration (µm) 10 25 50 Compound 1 38.3 ± 2.8 38.8 ± 1.7 40.8 ± 0.3 Compound 2 42.5 ± 0.3 44.3 ± 0.1 49.5 ± 1.1 Compound 3 42.5 ± 0.8 45.5 ± 0.4 47.7 ± 0.5 CA 39.4 ± 0.6 40.8 ± 0.5 42.4 ± 1.0 (+)-α-tocopherol 40.6 ± 1.0 43.4 ± 0.1 45.0 ± 0.7 1) Control, τ 50 = 31.8 ± 2.7 min Figure 4. DPPH radical scavenging activities of the DCQA compounds (1-3) isolated from G. affine extracts. 능을평가할수있다. DPPH는잉여전자의공명이일어나서안정화된 radical로서 free radical 소거활성실험에많이이용되고있다. 따라서본논문에서는분리된화합물의 free radical 소거활성을 DPPH 시험법을통해측정하였다 (Figure 4). 본실험에서, 각화합물들의 DPPH free radical 소거활성 (FSC 50) 은 DPPH 최대흡수파장인 517 nm에서감소하는흡광도를측정함으로써결정된다. (+)-α-tocopherol 및 caffeic acid 는비교대조군으로사용되었다. 3,5-DCQA (1), 4,5-DCQA (2) 및 1,5-DCQA (3) 의 DPPH free radical 소거활성 (FSC 50) 은각각 3.70 ± 0.09, 5.80 ± 0.08 및 5.50 ± 0.05 µm로나타났다. 반면에비교대조군인 caffeic acid와 (+)-α-tocopherol의 FSC 50 은각각 8.80 ± 0.01, 21.9 ± 0.30 µm로나타났다. 3가지 DCQA 모두 (+)-α-tocopherol 및 caffeic acid보다우수한 free radical 소거활성을나타내었다. Compounds (1-3) 의높은항산화활성은 Parejo 등 [33] 이보고한바에따르면카테콜부분의존재로인해높은활성을보인것으로판단된다. 또한, compounds (1-3) 는 caffeoyl 작용기의결합위치와무관하게 free radical 소거활성이비슷하게나타났다고사료된다. 이는 DCQAs (1-3) 가기능성라디칼소거제로사용될수있음을시사한다. 3.3. 1 O 2 로유도된사람적혈구파괴에대한세포보호효과 피부에는포르피린, 리보플라빈과같은광증감제가존재하며이들은자외선조사시광증감반응에의해 1 O 2 와여러활성산소종 (O - 2, H 2O 2, OH ) 을발생시킨다. 이들활성산소종중에서특히광증감반응으로생성되는 1 O 2 는반응성이매우큰 ROS로세포막에라디칼반응을개시시킴으로써세포손상을야기하고피부노화를가속화한다. 그러므로 1 O 2 로부터유도된피부세포보호는피부노화를억제하는데있어서중요하다. 적혈구광용혈실험은광노화모델로, 활성산소에 의한세포파괴에대해서시료의세포보호효과를측정하는데적합한실험법이다. 본실험에서는광증감물질인로즈벵갈을사용하여발생된 1 O 2 에의한사람적혈구세포의용혈정도를측정함으로써 DCQAs 의세포보호효과를확인하고자하였다. 세포보호효과는적혈구세포가 50% 파괴되는데걸리는시간 (τ 50) 으로나타냈으며세포보호활성이클수록그값은크게나타난다. 비교대조군으로는지용성항산화제로알려진 (+)-α-tocopherol와 caffeic acid를사용하였다. 특히, (+)-α-tocopherol은활성산소에의해발생되는지질과산화반응의연쇄반응을효율적으로차단할뿐만아니라 1 O 2 도효율적으로제거하는것으로알려져있다. 3,5-DCQA (1), 4,5-DCQA (2) 및 1,5-DCQA (3) 에대하여 10, 25 및 50 µm의농도에서적혈구세포가 50% 파괴되는데걸리는시간 (τ 50) 을통해세포보호효과를비교하였다 (Table 1). 시료를넣지않은대조군의경우 31.8 ± 2.7 min으로재현성은양호하게나타났다. 10, 25 및 50 µm의농도에서 3,5-DCQA (1) 는각각 τ 50 이 38.3 ± 2.8, 38.8 ± 1.7 및 40.8 ± 0.3 min, 4,5-DCQA (2) 는 42.5 ± 0.3, 44.3 ± 0.1 및 49.5 ± 1.1 min 그리고 1,5-DCQA (3) 는 42.5 ± 0.8, 45.5 ± 0.4 및 47.7 ± 0.5 min으로전반적으로농도의존적인세포보호효과를나타내었다. 특히, 4,5-DCQA (2) 와 1,5-DCQA (3) 는모든농도에서 caffeic acid 및 (+)-α-tocopherol보다다소큰세포보호활성을보였지만 3,5-DCQA (1) 의경우비교물질들에비해다소낮은활성을보였다. 즉, DCQAs (1-3) 는비교물질들과전반적으로유사한세포보호효과를보여주고있다. 이는 DCQAs가소수성성질이높아인지질로이루어진세포막을잘침투함으로써지용성항산화제인 (+)-α -tocopherol과유사한보호효과를보인것으로사료된다 [34]. 3.4. Tyrosinase 저해활성멜라닌은여러경로를통해합성된다. 멜라닌합성과정에서 tyrosinase는기질인 L-tyrosine 을산화시켜 3,4-dihydroxy-L-phenylananine (DOPA) 로, 그리고 DOPA를산화시켜 DOPAquinone을생성하는단계에서핵심적인효소로서작용한다. 두단계의산화반응이후의반응은자동산화적으로진행되고 tyrosinase 의존재하에의해서가속화된다. 따라서 tyrosinase는멜라닌합성의전체적인반응을조절하는중요한효소로미백활성평가에있어서 tyrosinase 저해활성평가는매우중요하다. 본연구에서는 3,5-DCQA (1), 4,5-DCQA (2), 1,5-DCQA (3) 과비교물질로 caffeic acid 그리고대표적인미백제로알려져있는 arbutin의 tyrosinase 저해활성을측정해보았다 (Figure 5). 3,5-DCQA (1), 4,5-DCQA (2) 그리고 1,5-DCQA (3) 의 IC 50 은각각 0.15 ± 0.03, 0.16 ± 0.01, 0.13 ± 0.01 mm로나타났다. 세가지 DCQAs (1-3) 모두비교물질인 caffeic acid (IC 50 = 0.35 ± 0.02 mm) 및 arbutin (IC 50 = 0.33 ± 0.01 mm) 에비해 2배이상높은 tyrosinase 저해활성을나타내었다. 따라서 DCQAs (1-3) 는미백기능성소재로써화장품에응용가능성이있는것으로보인다. 공업화학, 제 26 권제 4 호, 2015
떡쑥추출물로부터분리된 Dicaffeoylquinic Acid 유도체들의항산화및타이로시네이즈저해활성 475 References Figure 5. Tyrosinase inhibitory activity of the DCQA compounds (1-3) extracts from isolated from G. affine extracts. 4. 결론 본연구에서는자외선및활성산소로부터피부를보호하기위한천연기능성소재를개발하고자, 떡쑥추출물로부터세가지화합물을분리하고항산화활성, 세포보호효과, 그리고 tyrosinase 저해활성을평가하였다. 1. 떡쑥추출물의에틸아세테이트분획에서분리된세가지화합물은 1 H-NMR 및 MS 분석을통해구조동정한결과, 각각 3,5-dicaffoylquinic acid (3,5-DCQA), 4,5-dicaffeoylquinic acid (4,5-DCQA), 1,5-dicaffoylquinic acid (1,5-DCQA) 로동정하였고, 이성분들은본연구를통하여최초로떡쑥에존재함을확인하였다. 2. DPPH 라디칼소거활성 (FSC 50) 은 3,5-DCQA는 3.70 ± 0.09 µm, 4,5-DCQA는 5.80 ± 0.08 µm, 1,5-DCQA 는 5.50 ± 0.05 µm을나타내었다. 이는비교물질인 (+)-α-tocopherol보다우수한항산화효능을보여주었다. 3. 1 O 2 로유도된사람적혈구의파괴에있어서세가지 DCQA의세포보호효과는 10, 25 및 50 µm의농도에서농도의존적으로증가하였으며, 비교물질인 caffeic acid 및 (+)-α-tocopherol과전반적으로유사한세포보호효과를나타내었다. 4. 세가지 DCQA의 tyrosinase 저해활성 (IC 50) 은 1,5-DCQA (0.132 ± 0.009 mm) > 3,5-DCQA (0.149 ± 0.028 mm) > 4,5-DCQA (0.159 ± 0.004 mm) 순서로확인되었다. 특히세가지 DCQA 모두비교물질인 caffeic acid (0.352 ± 0.023 mm) 및 arbutin (0.33 ± 0.009 mm) 에비해 2배이상높은저해활성을나타내었다이상의연구결과, 떡쑥추출물로부터분리된세가지 DCQA는우수한항산화활성및미백활성을보였으며, 기능성항노화소재및미백화장품의원료로서식품및화장품분야에서이용가능성이있음을시사하였다. 감 본과제 ( 결과물 ) 는산업통상자원부의재원으로지원을받아수행된제주권광역경제권선도산업육성사업 ( 과제번호 : R0002229) 의연구결과입니다. 사 1. S. B. Han, H. A. Gu, S. J. Kim, H. J. Kim, S. S. Kwon, and H. S. Kim, Comparative study on antioxidative activity of Glycyrrhiza uralensis and Glycyrrhiza glabra extracts by country of origin, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 39, 1-8 (2013). 2. S. Pillai, C. Oresajo, and J. Hayward, Ultraviolet radication and skin aging: roles of reactive oxygen species, inflammation and protease activation, and strategies for prevention of inflammation-induced matrix degradation-a review, Int. J. Cosmet. Science, 27, 17-34 (2005). 3. G. E. Rhie, M. H. Shin, J. Y. Seo, W. W. Choi, K. H. Cho, and K. H. Kim, Aging- and photoaging-dependent changes of enzymic and nonenzymic antioxidants in the epidermis and dermis of human skin in vivo, J. Invest. Dermatol., 117, 1212-1217 (2011). 4. V. Afonso, R. Champy, D. Mitrovic, P. I. Collin, and A. Lomri, Reactive oxygen species and superoxide dismutases Role in joint diseases, Joint Bone Spine., 74, 324-329 (2007). 5. M. J. Davies, Reactive oxygen species, metalloproteinases, and plaque stability, Amer. Heart J., 23, 2382-2383 (1998). 6. D. Bagchi D, M. Bagchi, E. A. Hassoun, and S. J. Stohs, In vitro and in vivo generation of reactive oxygen species, DNA damage and lactate dehydrogenase leakage by selected pesticides, Toxicology, 104, 129-140 (1995). 7. S. B. Berman and T. Hastings, Inhibition of glutamate transport in synaptosomes by dopamine oxidation and reactive oxygen species, J. Neurochem., 69, 1185-1195 (1997). 8. J. Yamakoshi, F. Otsuka, A. Sano, S. Tokutake, M. Saito, and M. Kikuchi, Lightening effect on ultraviolet-induced pigmentation of guinea pig skin by oral administration of a proanthocyanidin-rich extract from grape seeds, Pig. Cell Res., 16, 629-638 (2003). 9. S. M. Park, S. Y Kim, G. N. Lim, N. R. Jo, and M. H. Lee, In vitro skin permeation and cellular protective effects of flavonoids isolated from Suaeda asparagoides extracts, J. Ind. Eng. Chem., 18, 680-683 (2012). 10. N. R. Jo, H. A. Gu, S. A. Park, S. B. Han, and S. N. Park, Cellular protective effect and liposome formulation for enhanced transdermal delivery of isoquercitrin, J. Soc. Cosmet. Scientists Korea, 38, 103-118 (2012). 11. M. Iwata M, T. Corn, S. Iwata, M. A. Everett, and B. B. Fuller, The relationship between tyrosinase activity and skin color in human foreskins, J. Invest. Dermatol., 95, 9-15 (1990). 12. K. Kameyama, T. Takemura, Y. Hamada, C. Sakai, S. Kondoh, and S. Nishi-yama, Pigment production in murine melanoma cells is regulated by tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 (TRP), dopachrome tautomerase (TRP 2) and a melanogenic inhibitor, J. Invest. Dermatol., 100, 126-132 (1993). 13. J. C. Cho, H. S. Rho, Y. H. Joo, S. M. Ahn, D. H. Won, S. S. Shin, Y. H. Park, K. D. Suh, and S. N. Park, The depigmenting activities of hydroxyl carboxamide derivatives containing hydrophobic moiety, Bull. Korean Chem. Soc., 33, 1333-1336 (2012). 14. Y. J. Kima and H. Uyama, Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future, CMLS, Cell. Mol. Life Sci., 62, 1707-11723 (2005). 15. Z. Xi, W. Chen, Z. Wu, Y. Wang, P. Zeng, G. Zhao, X. Li, and L. Sun, Anti-complementary activity of flavonoids from Gnaphalium affine D. Don, Food Chem., 130, 165-170 (2012). Appl. Chem. Eng., Vol. 26, No. 4, 2015
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