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1 종 설 대한생식의학회지 : 제 35 권제 1 호 2008 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis) 의임상적적용 관동대학교의과대학제일병원산부인과 김진영 강인수 * Clinical Application of Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) Jin Yeong Kim, Inn Soo Kang * Department of Obstetrics and Gynecology, Cheil General Hospital, Kwandong University College of Medicine [Korean. J. Reprod. Med. 2008; 35(1): ] 착상전유전진단 (preimplantation genetic diagnosis, PGD) 은산전진단 (prenatal diagnosis) 의대안으로소개된방법으로, 착상전배아단계에서유전질환이나염색체이상의유무를진단하여이환되지않은배아를이식함으로써정상적인태아의임신을성립시킬수있는방법이다. 따라서유전질환이나염색체이상이있는태아의임신중절을피할수있는장점이있다. 산전진단은임신이된후양수검사나융모막융모검사, cordocentesis 등을통해얻어진태아세포에서유전질환이나염색체이상을진단하는것으로, 이상이있는경우에는임신중절을하여이환된태아의출생을예방하게되는데, 이러한경우임신중절에따르는신체적, 정신적고통을겪게되며윤리적문제가있다. 또한부부의염색체이상으로인한반복자연유산에서는산전진단이가능한시기이전에유산이일어나기때문에산전진단보다더조기에진단할수있는방법이필요하며, 이러한측면에서착상전유전진단은매우효과적인방법이다. 그과정은체외수정시술 (in vitro fertilization and 주관책임자 : 강인수, 우 ) 서울특별시중구묵정동 1-19, 관동대학교의과대학제일병원산부인과 Tel: (02) , Fax: (02) Ikang67@yahoo.co.kr embryo transfer, IVF-ET) 을시행하여얻어진난자의극체 (polar body) 를생검 (biopsy) 하거나배아 (embryo) 로부터 1~2개의할구세포를생검 (biopsy) 하여단일세포수준에서 polymerase chain reaction (PCR) 이나 fluorescence in situ hybridization (FISH) 기법을이용한유전진단을시행하고, 유전병이없거나정상적인염색체를갖는배아를선별적으로자궁내에이식하여임신을시도한다. 착상전유전진단의착안은배아의초기발달단계에있어 indeterminate cleavage라는현상에기초한다. 즉, 8세포기정도의초기배아로부터는한개내지두개의할구를떼어내도배아는계속발달할수있다는것이다. 1 그러나문제는이렇게얻어진단일세포에서유전진단을할수있을정도로예민한진단기법이뒷받침되어야했으며, 착상전유전진단의발달은 FISH나 PCR로적은검체에서도유전진단을할수있는진단기법이발달함으로써가능하게되었다. 2 최초의착상전유전진단은 1990년 Handyside 등이 X-linked recessive 유전질환을가진가계의부부에서정상인이나보인자가되는여아를선택적으로이식하여임신을보고한것이었다. 3 배아의할구세포에서 PCR 기법을이용하여 Y 염색체특이서열을증폭시킴으로써증폭이없는경

2 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis) 의임상적적용 대한생식의학회지 우는여아로진단하여배아이식을하였다. 한편배아에서뿐아니라, Verlinsky 등은난자의극체를생검하여착상전유전진단을시행하였다. 4 성공적인착상전유전진단을위해서는, 고도의보조생식술기법과단일할구세포를얻기위한미세조작기술, DNA양이매우적은단일세포수준에서의정확한분자생물학적진단기법등이요구된다. 최근까지착상전유전진단을시행하는유전질환이계속증가되고있으며, 배아의염색체이수성을선별하여보조생식술의효율을증대시키는방안으로도이용되고있고, late onset disorder나 HLA typing 등으로그적용범위가확대되고있다. 유럽생식의학회 (European Society for Human Reproduction and Embryology, ESHRE) 산하의 PGD consortium의최근보고에의하면 1997년부터 2004년까지세계적으로약 9180주기의착상전유전진단이시행되어, 약 1170명의건강한아기가태어났다. 5 이에착상전유전진단의임상적적용및결과, 새로운진단기법등의최신동향에대하여알아보고자한다. 착상전유전진단의적응증착상전유전진단의적응증이되는질환들은주로단일유전질환 (single gene disorder, 상염색체우성, 상염색체열성, X-연관질환, triplet repeat disease) 과염색체의구조적이상 ( 전좌, 역위, 결실, 삽입등 ) 이며또한염색체의숫적이상 (aneuploidy) 을예방하기위한경우등에서도시행된다. 그외에도최근적용범위가확대되고있다. 1. 단일유전질환의착상전유전진단착상전유전진단은단일세포에서의진단이므로단일유전자질환에서많이연구되고시행되어왔다. 대표적인질환은 cystic fibrosis로, 가장흔한 ΔF508 돌연변이를진단하기위한착상전유전진단이최초로시행되었다. 6 단일유전질환은유전자의돌연변이 (mutation), 결실 (deletion) 등에의해발생할수있으며, 유전되는방식에따라상염색체 우성, 상염색체열성, X-연관열성, X-연관우성유전, 및 3개의염기서열의수가과다하게증가되는 triple repeat disease로분류된다. 착상전유전진단을시행하는경우에는임상적, 유전적으로정확한진단이확립되고, 단일유전자이상에의한유전질환인지명확해야하며, 정확한가계도와가능한많은가족구성원에대한유전정보가있어야한다. 다인자성유전에서는적용이불가능하다. 또한치료방법이없는치명적인병인지윤리적측면도고려하여야한다. 다양한단일유전자질환에서착상전유전진단이시행되어보고되고있다 (Table 1, 5 Table 2). 최근우리나라에서는생명윤리법에의거, 배아나태아를대상으로시행할수있는유전자검사를 63종의유전질환으로제한하고있다 ( 생명윤리법제 25조 2항, 시행령제 14조 ) 1) 상염색체우성유전질환 (Autosomal dominant) 변이유전자하나만있어도질환이발현되는경우이다. 보통증상이심하지않은경우가많고성장한후에서서히발현되는경우도있기때문에자식을가질수도있으며자식의 50% 가질환에이환된다. 한편, 우성유전질환은변이유전자가있더라도질환이발현되지않는경우가있을수있고 (low penetrance), retinoblastoma 같은유전적인종양에서는 "second hit" 개념으로반대편의정상유전자까지변이가일어나종양이발생되고그렇지않으면변이유전자하나만을갖고있어도질환이발생하지않을수도있다. 우성유전에서는착상전유전진단시에변이유전자와정상유전자를모두정확히진단해내야하므로오진이되지않도록주의를요한다. 착상전유전진단이시행된질환으로는가장흔한경우가 myotonic dystrophy, Huntington disease, Marfan syndrome, Familial adenomatous polyposis coli이고, 그외 Charcot-Marie-Tooth disease, Crouzon syndrome, achondroplasia, neurofibromatosis type 2, Osteogenesis imperfecta I and IV, Stickler syndrome, tuberous sclerosis 등이있다

3 제 35 권제 1 호, 2008 김진영 강인수 Table 1. Indications of preimplantation genetic diagnosis for monogenic diseases (ESHRE consortium data collection V, 2005) 21-hydroxylase deficiency Adrenoleukodystrophy Agammaglobulinemia Alport syndrome Adult polycystic kidney disease BRCA1 Canavan disease Carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome type 1A Central core disease Crouzon syndrome Familial adenomatous polyposis coli Fanconi anemia Gaucher disease Glucose-6-phosphatase deficiency Gorlin syndrome Hunter syndrome (MPS II) Hyperinsulinemic hypoglycemia PHH1 Infantile neuronal ceroid lipofuscinosis Junctional epidermolysis bullosa Lesch-Nyhan syndrome LCHAD (long chain 3-hydroxyacyl-coA dehydrogenase deficiency) Medium chain acyl-coa dehydrogenase deficiency Table 1. Continued MELAS (mitochondrial myopathy, encephalopathy, lactacidosis, stroke) Metachromatic leukodystrophy Multiple exostosis Neurofibromatosis Norrie's disease Oral facial digital syndrome type 1 Ornithine transcarbamylase deficiency Osteogenesis imperfecta type I, IV PDH deficiency Pelizaeus-Merzbacher disease Retinoblastoma RhD sensitization Rhizomelic chondrodysplasia punctata Severe combined immunodeficiency Skewed X inactivation Skin fragility syndrome Spinal and bulbar muscular atrophy Spinocerebellar ataxia type 3, 7 Stickler syndrome Tay-Sachs disease Tuberous sclerosis Tyrosinemia Von-Hippel-Lindau disease Waardenburg syndrome 2) 상염색체열성유전질환 (Autosomal recessive) 대부분의치명적인질환은열성유전이다. 부모로부터물려받은유전자가모두변이유전자일때질환을나타내는경우이다. 한개의변이유전자와한개의정상유전자를가진이형접합 (heterozygous) 일때는질환을나타내지않는다. 가계도에서보면남자, 여자가동일하게이환되고, 한세대 에국한되어나타나며, 이환된아이가있을때다음아기에서다시나타날확률은 1/4이고, 환아가있는가계에서정상아가보인자일확률은 2/3이다. β-thalassemia나 Cystic fibrosis의경우에는돌연변이가환자마다매우다양하고, 양측으로부터물려받은돌연변이가각각다른경우도있는데이를 compound heterozygous라고하며, 이경우착상전유전진단이매우까다롭다. 착상전유전진단이시

4 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis) 의임상적적용 대한생식의학회지 Table 2. Indications and diagnostic strategies in PGD for monogenic disease Indication Method Reference Familial adenomatous polyposis coli Primer extension pre-amplification, PCR Ao et al., for mutation and for marker Cystic fibrosis β-thalassemia Fluorescent PCR-allele size difference Fluorescent marker multiplex Restriction enzyme digestion and linked marker Denaturing gradient gel electrophoresis Findlay, et al., Dreesen et al., Kuliev et al., Kanavakis et al., Congenital adrenal hyperplasia Fluorescent PCR and restriction enzyme Van de Valde et al., Marfan syndrome Fluorescent PCR and marker Sermon et al., Ornithine transcarbamylase deficiency DMD Nested PCR (mutation+marker) Duplex nested PCR Nested multiplex Fluorescent multiplex and marker Ray et al., 이형송등, Ray et al., 이형송등, Spinal muscular atrophy Fluorescent PCR Georgiou et al., Myotonic dystrophy, cystic fibrosis, fragile X syndrome, neurofibromatosis, Crouzon Fluorescent multiplex Harper et al., Charcot-Marie-Tooth disease type 1A Fluorescent multiplex De Vos et al., Cystic fibrosis, β-thalassemia, sickle-cell Fluorescent multiplex and mini-sequencing Fiorentino et al., anemia, hemophilia A, retinoblastoma, spinal muscular atrophy Achondroplasia Fluorescent PCR Moutou et al., Familial adenomatous polyposis coli, von Hippel-Lindau disease, retinoblastoma, Li-Fraumeni syndrome, neurofibromatosis, familial posterior fossa brain tumor Polar body, nested multiplex PCR Rechitsky et al., 행된대표적인질환들은 cystic fibrosis, β-thalassemia spinal muscular atrophy, sickle cell anemia 등이며, Tay- Sachs disease, Lesch-Nyhan syndrome, epidermolysis bullosa, adrenoleukodystrophy, Gaucher's disease, congenital adrenal hyperplasia 등에서시행되었다. 3) X-연관열성유전질환 (X-linked recessive disease) 변이유전자가 X 염색체에존재하는경우이며, 심한경우는모두열성이다. 모친은증상이없는보인자이고그아들의반이질환에이환된다. 변이유전자가발견되는경우도있지만정확한유전정보를모르는경우도있어, 착상전유전진단시 sexing 으로정상또는보인자인여아를선별하여이식하기도한다. 대표적으로 Duchenne muscular dystrophy (DMD), fragile X syndrome, haemophilia A에서많이시행되고있으며, Alport syndrome, Hunter's syndrome, retinitis pigmentosum 등에서착상전유전진단이시행된바있다. 4) X-연관우성유전질환 (X-linked dominant disease) 변이유전자가 X 염색체에존재하며보인자인여아에서도증상이나타날수있다. Ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency, Alport syndrome, orofacial-digital syndrome type I 등이있다

5 제 35 권제 1 호, 2008 김진영 강인수 5) Triplet repeat disease 특정유전자와관련된 3염기의수가불안정하게반복되어증가되면서나타나는질환이다. 각세대를내려오면서반복되는염기의수가증폭되어대를이어서점점심해진다. Neurological disease와관련되어있다. Myotonic dystrophy, Huntington's disease, 취약 X 증후군 (Fragile X syndrome) 등이해당된다. 취약 X 증후군은정신박약을나타내는가장흔한유전질환으로, X염색체 FMR1 gene 내에있는 CGG 염기가증폭된다. 정상적으로는약 6~54개의 copy 를갖지만, 54~200사이의 copy를가지면 premutation으로서보인자상태이고, 200개이상을가지면질환을나타내는데특히남성에서는심하게나타나고, 여성에서는정도나증상이다양하게나타난다. Premutation은조기폐경과도관련이있다. 2. 염색체이상 (Chromosomal abnormality) 에서의착상전유전진단 1) 구조적이상 (structural aberration) 에기인한반복자연유산 (1) 상호전좌및로벗슨전좌 (reciprocal and Robertsonian translocation ) 2개이상의관련된염색체일부가각각잘려서위치가서로교환되는경우로전체적염색체의양은정상이므로대개표현형은정상이지만, 감수분열과정에서많은수의불균형적염색체를가진난자, 정자를형성하므로반복자연유산의원인이된다 (Figure 2a, b). 로벗슨전좌는선단부부착염색체 (acrocentric chromosome, 13, 14, 15, 21, 22) 에서일어나는데, 단완의위성부위가손실되고중심에서두염색체가융합된다. 상호전좌는관련된두염색체의일부가절단된후서로위치만바뀌는경우이다. (2) 역위 (inversion) 한염색체의일부의양끝이잘려서거꾸로재조합되면, 그부위유전물질의순서가거꾸로된다. 중심체를포함하는중심체주변역위 (pericentric inversion) 과중심체로부터떨어진부위의부중심절 역위 (paracentric inversion) 가있다. 보인자는임상적으로대개정상이나, 생식세포는감수분열과정에서불균형한염색체를가진난자, 정자를생성할수있다. 2) 염색체이수성 (aneuploidy) 에대한 screening PGD-AS (preimplantation genetic diagnosis-aneuploidy screening), 또는PGS (preimplantation genetic screening) 라고도한다. (1) Advanced maternal age 체외수정을통하여수정란에서염색체이상이높다는것을알게되었다. 수정란의약 23~80% 정도가염색체이수성을보이며 FISH 기법의발달로염색체이상의기전이나종류에대해알려지게되었다. 24,25 정상적또는비정상적으로발달하는수정란에서 13, 18, 21, X, Y에대한 FISH 결과비정상적발달을보이는배아에서염색체이상이높게나타나며, 26 모체의나이가증가함에따라염색체이수성의난자및배아의염색체이수성이증가되어 20~34세에서이수성의비율이 30.6% 에비해 40~47세에서는 52.4% 로나타나이는임신실패나자연유산, 기형아의위험으로나타난다. 27 따라서모체의연령이고령인경우자연유산과흔히관련되는염색체- 13, 14, 15, 16, 18, 21, 22, X 및 Y 염색체- 등에대해 FISH를통한착상전유전진단을하여유산율을감소시키고착상율을높일수있다. 28,29 (2) 반복자연유산 (recurrent pregnancy loss), 반복적인착상실패 (repeated implantation failure) 원인불명의반복적인자연유산이나착상실패에서도염색체이수성을갖는배아에기인하는경우가있으며, 착상전유전진단을적용하여착상율을증가시킬수있다. 30,31 (3) 성염색체이상 (sex chromosome abnormality) 터너증후군 (45,XO) 이나클라인펠터증후군 (47, XXY) 등성염색체이상에서는난소나고환의형

6 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis) 의임상적적용 대한생식의학회지 성부전으로임신가능성이낮으나간혹난자, 정자가채취되는경우가있으며특히모자이시즘에서는생성되는경우가많다. 그러나생성된난자, 정자및배아의염색체이상확률이높으므로착상전유전진단을적용하여정상적인임신을유도할수있다. 32 (4) 심한남성요인의불임 (severe male factor infertility) 무정자증이나심한희소정자증환자에서 multiple testicular sperm extraction 과 ICSI로임신이가능할수있으나, 비정상적인염색체를갖는수정란발생의위험이높다. 그러나아직은선별적으로시행되며, 이런환자군에서일괄적으로적용하지는않는다. 3. Expanding indications for PGD 1) Late onset disorders with genetic predisposition 유전자변이가있는가계에서성인이된후심각한질환이발생할가능성이높은경우, 산전진단으로진단을할수는있어도이미자란태아를유산시키기는어렵다. 그러나임신이성립되기전에착상전유전진단으로심각한위험성을가진배아를이식에서배제시키는방법은유산을시키는것보다윤리적으로더수용할만하며, 이런점은착상전유전진단의적용범위가산전진단보다확대되어시행될수있다는것을보여준다. 가족력을보이는치매질환으로서 early onset Alzheimer disease (APP gene) 나, 33 Retinoblastoma (RB1), p53 tumor suppressor gene mutation, familial adenomatous polyposis coli, BRCA1, BRCA2, neurofibromatosis 1, 2 같은 cancer predisposition gene에대한착상전유전진단이시행된바있으며유전적인암의발생을방지할수있다. 23 이러한적용은윤리적논란이있으나이러한질환의소인을가지고있는것이환자에게는매우치명적인부담이므로대체로착상전유전진단을수용하는의견이우세하다. 2) Preimplantation HLA typing Verlinsky 등 34 은 Fanconi anemia 환아를출산한부부에서, 두번째임신을위해착상전유전진단을시행하면서 Fanconi anemia 유전자진단과 HLA typing을함께시행하여, Fanconi anemia에이환되지않고환아와동일한 HLA를가진수정란을선택하여이식하였다. 이렇게태어난건강한둘째아기의제대혈줄기세포를환아에게이식하여, 면역학적거부현상없이환아를치료할수있었다. 이러한적용역시윤리적논란이있는데, 이러한시술에반대하는의견은 ' 사람은어떤목적을위해서사용되어서는안된다 ' 는원칙에위배된다는주장이며, 찬성하는의견은이렇게태어난아기도다른자녀와마찬가지로가정에서사랑과보살핌을받기때문에이원칙에위배되지않으며, 또한만약환아와 HLA가일치하는형제가있다면부모는골수이식치료를시행할것이므로이러한시술이인정된다고주장하고있다. 이외에도다양한 hematopoietic disease, thalassemia, Wiskott-Aldrich syndrome, leukemia 등에서 HLA matching을위한착상전유전진단이보고된바있다 35. 착상전유전진단의방법 1. 체외수정시술및착상전유전진단의일정및개요 PGD에서는수정란을검사해야하기때문에불임환자가아니더라도체외수정시술을시행해야한다. 시술전에는질환에대한사항및이환된환아를가질위험성, 예방을위한다른 option 등에대한전문적인유전상담을비롯하여, 체외수정전반 ( 과배란의위험성, 이식을못할가능성, 보인자의구분이불가능한경우보인자의이식등 ) 에대한상담과정이필요하다. 또한 PGD로임신이된경우반드시산전검사로확인이필요하며, 기술적한계에따른오진율이있을수있음을충분히상담하여야한다. 체외수정시술을위해 GnRH (gonadotropin releasing hormone) analogue와 gonadotropin을

7 제 35 권제 1 호, 2008 김진영 강인수 Figure 1. Blastomere biopsy of cleavage-stage embryo with acid Tyrode's solution 사용하여과배란유도 (controlled ovarian hyperstimulation: COH) 후난포가충분히성장하면 hcg 를투여하고 36시간후난자채취를한다. 난자와정자를수정시킬때다른세포의유전물질이혼입되는것을막기위해서세포내정자주입술 (intracytoplasmic sperm injection: ICSI) 을시행하여수정을시행한다. 정상적으로배아가발생하는경우에는수정 1일후전핵단계 (pronucleus, PN stage), 제 2 일에 4-cell stage, 제 3일에 8-cell stage, 제 4일에상실기 (morula stage), 제 5일에포배기 (blastocyst) 로발달한다. 대개할구생검 (blastomere biopsy) 은제 3일째 6~10 cell stage embryo에서시행하며미세조작술로할구를 1~2개분리해낸다. 이외에도난자의극체 (polar body) 또는포배기생검을할수있다. 채취된 1~2개의세포에서유전검사를시행한다. 단일유전자질환에서유전자돌연변이진단의경우 PCR 기법을이용하며, 염색체이수성의진단은 FISH를시행하여염색체검사를시행한다. 검사결과, 비정상적인수정란즉, 돌연변이유전자가있어유전병이발현될수정란또는유산이나기형아를초래할불균형염색체를가진수정란은이식에서제외된다. 유전병이발현되지않을정상수정란또는균형염색체를가진수정란만을선택하여수정제 4~5일에자궁에이식한다. 임신이성공하면산전진단 (chorionic villi sampling 또는 amniocentesis) 을시행하여염색체나유전자상태를확인한다. 2. Cell Preparation Methods 과배란유도및난자채취를하여얻은난자나 체외수정후얻은수정란의일부를생검하여세포를얻어내는과정은다음과같다 (Figure 1). 1) Making a hole in zona pellucida ( 투명대 ) 우선난자나수정란을둘러싸고있는투명대를열어준다. (1) Acidified Tyrode's solution ph 2.2~2.4의산성을이용하여배아의투명대를녹이는방법으로현재가장널리사용되고있으며, 난자의극체를생검하는데는적합하지않다. (2) Mechanical dissection (partial zona dissection: PZD) 물리적인방법으로 "V" 또는 "X" 자형태의투명대절개를하는방법으로극체를생검하는데많이사용된다. (3) Laser hatching 사용이간단하며구멍의크기를정확히조절할수있고, 수정란에해를줄가능성이적다. 최근그사용이증가되고있다. 2) Cell Biopsy (1) 극체생검 (Polar body biopsy) 감수분열의결과로형성된극체는배아발달에필수적요소가아니므로생검하여진단에활용될수있다. 극체의염색체나유전자상태는난자의것과상호관련되므로극체를생검하여유전검사를시행하면난자의상태를진단할수있다. 난자로부터제 1극체만생검하거나제 1극체와함께수정후제2 감수분열이완성된후제 2극체를생검하여진단의정확도를증가시킬수있다. Verlinsky 등 36 은다양한단일유전자질환에서채취된난자 98% 에서성공적으로제 1, 제 2극체생

8 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis) 의임상적적용 대한생식의학회지 검을통한착상전유전진단을보고하였다. 그러나난자, 즉모계에서유래되는질환에만적용이가능하고, 2개의극체를모두얻는데작업량이많다는단점이있다. (2) 난할과정배아의할구생검 (cleavagestage blastomere biopsy) 현재가장많이이용되는방법으로서수정란의할구를진단에이용하므로모계나부계어느쪽에서유전되든지사용할수있다. 37 수정란의 compaction 이완전히일어나면세포를분리하기가어려우므로수정 3일째 (6~10 세포기 ) 오전에시행한다. 이시기에는생검후에세포의회복이빠르며, 할구사이에 junction이잘발달하여자궁에이식할때수정란의구조를그대로잘유지하기때문에가장널리사용된다. 8세포기수정란에서할구 1~2개를생검해내어도 inner cell mass와 trophectoderm 세포의비율이정상으로유지되며, 남은할구세포로부터정상적으로온전한개체가발생한다는사실은이미생쥐와사람에서증명되었으며, 1 생검된배아의착상능력에도차이가없다. 38 방법은 acid Tyrode's solution 또는 laser hatching으로투명대 (zona pellucida) 에구멍을뚫은후에 biopsy pipet으로할구를흡인 (aspiration) 하거나액체를이용하여밀어내는방법 (extrusion) 으로할구를분리해낸다. 이방법의단점으로는 1~2개의세포만진단에이용된다는제한이있고, 배아의모자이시즘을진단하기힘들며, 체외수정시술기간내에 metaphase의염색체배열을얻기가어렵다는점이다. 현재, acid Tyrode's solution에의한 zona drilling 및 blastomere aspiration 방법이가장널리사용되고있으며, 약 97% 의배아에서성공적으로할구생검이된다. 39 (3) Trophectoderm biopsy 수정란이발생하여 blastocyst stage에도달하면 inner cell mass와 trophectoderm으로나뉜다. Trophectoderm은주로태반을형성하며태아형성에는직접관여하지않으므로 trophectoderm 세포를여러개떼어내어도태아에게해를주지않는다는장점이있다. 방법은발생 5~6일째에 blastocyst 를고정하고 inner cell mass의반대편에피펫으로 incision을형성한후 6~24시간후일부 trophectoderm이 herniation되면그일부를생검한다. 10개이상의많은세포의생검이가능하다. 10개정도까지의세포생검은포배기배아의생존을나타내는 hcg 생성에큰영향이없다. 40 5~20개의세포를얻으면 metaphase chromosome spread를얻기가훨씬수월하여더욱정확한유전진단이가능하다. 최근 trophectoderm biopsy로 2~6개의세포를생검하여착상전유전진단후포배기배아이식으로임신에성공한예들이보고된바있다. 41,42 그러나단점으로는수정란의약 36~66% 만이 blastocyst에도달하므로사용가능한수정란이수적으로제한된다는점이며, 43 태아와태반세포사이에염색체상태가다른 confined placental mosaicism인경우에는태반세포로진단해도태아의유전자상태를정확히알수없다는점, 그리고곧이식해야하므로유전진단을할수있는시간이짧다는점이다. 3. 단일세포에서의유전학적분석 1) Fluorescent in situ hybridization (FISH) 염색체의구조적이상이나고령임신, 성염색체이상등에서염색체의이수성 ( 異數性, aneuploidy) 을진단하기위해서는 FISH를이용한다. 44,45 PGD에서는생검된할구세포에서 metaphase 의염색체를얻기가힘들기때문에 FISH를이용하면 interphase nucleus의염색체에서발광체의 signal을관찰하여염색체의수를진단할수있으므로, 염색체의수적이상 (aneuploidy), X-linked 유전질환에서 sexing 등을판정할수있다. 일반적으로 FISH는각염색체에특이적인반복서열 (repetitive satellite) 의 DNA probe를사용한다. 각각다른색깔의형광 signal을내는 repetitive satellite probe을사용하면여러개의 DNA target을동시에관찰할수있다 (Figure 2). Red (tetrarhodamine isothiocyanate: TRITC), green (fluorescein isothiocyanate: FITC), blue (AMCA) 형광물질만 FISH에적합하기때문에두개의형광물질혼합비율에따라다른색상이나타날수있다. 이렇

9 제 35 권제 1 호, 2008 김진영 강인수 Chromosome 7 Chromosome 16 CEP 16 Spectrum Green TelVysion 16q Spectrum Orange CEP 7 Spectrum Aqua 2 / 1 / 2 2 / 3 / 2 1 / 2 / 3 3 / 2 / 1 2 / 2 / 2 2 / 2 / 2 Adjacent 1 Adjacent 2 Alternate 3 / 3 / 3 1 / 1 / 1 4:0 Segregation A B C Figure 2a. FISH probes and signal in 2:2 or 4:0 segregations in patients with 46,XX,t(7;16)(q22.1;q23.2) A) adjacent-1 segregation showing 3 orange, 2 green and 2 aqua signals, B) alternate segregation (balanced) showing 2 orange, 2 green and 2 aqua signals, C) 4:0 segregation showing 1 orange, 1 green and 1 aqua signal. Chromosome 7 Chromosome 16 CEP 16 Spectrum Green TelVysion 16q Spectrum Orange CEP 7 Spectrum Aqua 1 / 1 / 2 3 / 3 / 2 2 / 1 / 1 2 / 3 / 3 2 / 2 / 1 2 / 2 / 3 1 / 2 / 2 3 / 2 / 2 A B C D Figure 2b. FISH probes and signals in 3:1 segregation in the same patient as in Figure 2a. A) showing 1 green, 1 orange and 2 aqua signals, B) showing 2 green, 1 orange and 1 aqua signals, C) 2 green, 2 orange and 1 aqua signals D) 3 green, 2 orange and 2 aqua signals

10 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis) 의임상적적용 대한생식의학회지 게하면휴지기세포에서 X, Y, 13, 16, 18, 21, 22 등의염색체를동시에진단할수있다. 더많은염색체에대해진단하기위해서는 FISH를 2~3회반복하여이용할수있다. 균형전좌를가진생식세포가감수분열을할때흔히 2:2 segregation이많이일어나서 adjacent type 1이나 adjacent type 2로분리되면불균형염색체를가진배아가형성되고, alternate segregation을할때만정상염색체또는균형전좌염색체를갖는배아가형성된다 (Figure 2a). 3:1 segregation은일반적으로빈도가적고생존하기힘드나, 특정염색체의균형전좌에서는비교적흔히발생하며태아가생존하여기형을갖고태어날수있어진단과정에서포함되어야한다 (Figure 2b). PGD 시행전에 probe를계획하고환자의 lymphocyte를이용하여 FISH probe의 efficiency 를측정한후할구세포에서 PGD를시행한다. FISH 의제한점으로는 signal이 superimpose되는경우판독상의문제, 사용할수있는 color의제한, 그리고배아의 mosaicism 의가능성이있다는점이다. 배아의 mosaicism 은약 25% 에서나타나며, 10~25% 는 chaotic 형태로나타난다. 이시기의비정상할구는정상 apoptosis 과정일수도있다. FISH의오진율은약 5~10% 정도로보고되고있다. 46 2) Polymerase chain reaction (PCR) 및관련기법일반적으로단일유전자질환에서는 PCR로진단한다. 돌연변이가일어난특정유전자부위전후에충분한길이의염기서열을알고있으면 2개의 oligonucleotide sequence를선택하여 PCR로유전자를증폭할수있다. PCR primer 가없는경우에는 X-연관열성질환에서성 (gender) 을선택하기위하여 FISH를시행하기도한다. PCR을이용한착상전유전진단에서의유의점으로는, 적은수의세포를증폭하여진단을하게되므로 contamination의문제, PCR 반응의특이성문제, allele drop out (ADO) 의문제등을들수있다. Contamination을방지하기위해서는 PCR 반응장소를청결히유지하고시약을구분하여분주하여사용하여야하며, 비특이적 증폭을방지하고정확성을높이기위하여 heminested 또는 nested primer를사용하여 2단계의 PCR 을시행한다. 즉, 첫단계의 PCR에서일단증폭한 fragment의내부에 2단계 PCR의 primer들이결합할수있도록하여원하는부위만을증폭하는방법으로, 단일유전자질환에서 PCR을이용한착상전유전진단에서대부분적용하고있다. 15 또한단일유전자질환에서는 ADO으로인해심각한오진이될수있으므로 ADO를줄이는것이중요하다. 일반적인 heterozygotic cell의 allele 중한 allele에서는약하게증폭이일어나고다른 allele에서많이증폭되는경우를 preferential amplification (PA) 라고하며, PA가극단적으로되는경우즉, 한쪽 allele만증폭이되고, 다른쪽은증폭이거의안되면 ADO라고한다. ADO rate를줄이기위한방안으로할구 2 개를생검하거나최근에는대부분민감도가높은 fluorescence PCR 기법, linked polymorphic marker를이용하여 multiplex PCR을이용하여진단한다. 47,48 PCR 실패율은약 5~10% 에서있고, 90~95% 의 efficiency는적정한것으로볼수있다. (1) Multiplex PCR PGD에서는단일세포를이용하므로 PCR 증폭시여러유전자를조사하기에는그양이제한적이다. 그러나 multiplex PCR을사용하여 2개이상의여러유전자를동시에조사할수있다 (Figure 3). 17,49 여러개의서로관계없는 primer set를혼합하여한번에 PCR을시행하는방법으로이때에는 primer들과또는 PCR product들사이에상호작용이없어야한다. 첫번째 PCR을할때다른종류의 primer 쌍을여러개넣어증폭하고, 2번째 PCR에서는 sample을나눈후에각기다른 nested primer 쌍을이용하여증폭한다. 이복합반응이잘일어나도록 primer들의상대적인농도, annealing temperature, reaction buffer 를최적화시켜야한다. 검사시간이 6~8시간으로짧으므로 PGD를시행하는데적합하다. 또한 multiplex PCR은 ADO 문제를해결하는데도움이되는데, 병을유발하는돌연변이유전자, 그리고이와인접한 linked marker의 polymorphism을같이조사

11 제 35 권제 1 호, 2008 김진영 강인수 A B C D E F G Figure 3. Electropherogram of the multiplex fluorescent PCR of dinucleotide repeat marker (DYSI), Sry, and dystrophin exon 45 for PGD of Duchenne muscular dystrophy. A (top): the unaffected male partner; B: the carrier female partner; C the affected son (no dystrophin gene peak); D and E: the carrier female embryos (with mutant liked marker and dystrophin gene peak); F and G: the normal female embryos ( 이형송등 17, 2005). 하면이두곳에서 ADO가동시에일어날확률은매우적으므로, 돌연변이가없는것인지 ADO가발생한것인지정확히진단이될수있다. 이것은특히 autosomal dominant 질환이나 compound heterozygote의진단에중요하다. (2) Fluorescent PCR 일반적인 PCR 기법은정성적인방법이므로비슷한크기의 product를구별할수없다. Fluorescent PCR에서는한 primer 대신에형광물질이부착된 fluorescent oligonucleotide를사용하여증폭시켜 laser analysis system으로그 product를감지해내므로 fluorescent PCR의민감도는기존 PCR의약 1000배이상이된다. 이방법으로 cystic fibrosis의착상전유전진단에서정상 allele과 3 bp가결손된 508 allele을정확히구별해낼수있었다. 8 Fluorescent PCR을사용하면민감도가높아서 ADO이나 preferential amplification (PA) 문제를해결할수있다. 즉, PA 경우에도 peak를발견할수있어 PCR에서 ADO가발생하여오진되던문제가많이해결되었다. (3) Whole genome amplification PGD에서때로는 2개이상의돌연변이를진단해야하는데단일세포를사용하므로적은 DNA양이문제가된다. 이것을해결하기위하여 primer extension preamplification (PEP), Degenerate oligonucleotide primed PCR (DOP-PCR) 등이개발되었다. 기존 PCR에서사용하는 specific primer 대신에 15- base random oligonucleotide primer 또는 DOP primer 를이용하면 low stringency 조건에서 DNA 전체에걸쳐결합하므로다량의증폭을얻을수있다. 이것은 PGD에서 comparative genomic hybridization (CGH) 나 microarray를하기전에반드시필요한방법이다. 최근에는바이러스에서유래한 phi 29 polymerase

12 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis) 의임상적적용 대한생식의학회지 와 random hexamer primer를이용한 DNA 증폭방법인 multiple displacement amplification (MDA) 를이용한착상전유전진단도확립되어시행되고있다. 일반 PCR로증폭이어려운경우에서 MDA 기법을이용하여충분한양의 DNA를확보한후 fluorescent PCR 등을시행하면증폭성공율을향상시킬수있다. 50,51 3) Comparative genomic hybridization (CGH) PGD-FISH 에서는대상염색체몇개만을검사하므로검사하지않은다른염색체의이상여부를알수없다는제한점이있다. CGH는 reference DNA (digoxigenin-labeled) 와 test DNA를 (biotinlabeled) 정상중기염색체에동시에경쟁적으로 hybridization시키는방법으로, 상대적인 DNA copy 수의비율을측정할수있다 (Figure 4), test DNA 의염색체결실또는중복, 이수성등이있으면 Green-to-red fluorescence의차이로나타나므로이를진단할수있다. 50 haploidy나 polyploidy, 균형전좌는진단할수없지만, 전체염색체에대해서 aneuploidy screening을할수있는장점이있어, 포괄적진단을목적으로 CGH 기법을이용한착상전유전진단이시행되고있다. 51 실제로 5 panel의 FISH probe를이용한경우보다 CGH를이용한경우임신율과착상율이높은경향을보였고, 5 probe 또는 9 probe로놓칠수있는 38%, 25% 의 aneuploidy를발견할수있었다. 52 단점은시간및인력이많이소요된다는점이다. 일반적으로체외수정에서는난자채취후 5일후에는수정란을자궁안에이식해야하는시간적제한이있는데, CGH는 DNA amplification, labeling 및중기염색체를 template로하여 hybridization시켜 CGH를완료하기까지 5~6 일이소요되는문제점이있다. 만약제 3일의 8-세포기수정란에서할구세포를생검하여 CGH를시행하면배아를동결보존해야하는단점이생긴다. 그러나난자채취일에극체를생검하면 CGH를수행해도 4~5일만에이식하는것이가능하다. Wells 등 53 은극체를생검하여얻은소량의 DNA를 whole genome amplification으로증폭한후 CGH를시행하 고, 여분의 DNA로 single gene mutation까지진단하였다. Voullaire 등 54 은 CGH를이용한할구세포의분석결과, 일반적인 FISH panel에포함되지않는다른염색체들의이상이발견되고, diploid embryo의비율이 FISH를이용한경우보다낮았으며 (25%), 또한 FISH로발견될수없는 partial aneuploidy가발견됨을보고하였다. 즉, 수정란에서 post-zygotic breakage로인하여염색체의 partial gain이나 loss가발생될수있는것이다. 따라서 CGH 방법이안정적으로확립되면지금까지염색체의일부만을검사하던 FISH의한계점을극복하여전체염색체에대한포괄적인진단이가능할것이다. 시간적문제와정확성을극복하기위해 microarray 기법을도입한 microarray-cgh 기법도연구되고있으며, 이는전체염색체각각에특이적인 DNA sequence로이루어진 microarray를 glass slide에부착시키고, 이를 template로하여 CGH를시행하는방법으로, 과정에걸리는시간을단축할수있다. 55 최근 microarray- CGH 방법을이용하여전체염색체에대한이수성진단이보고된바있다. 56 4) 할구세포생검후배아의동결보존착상전유전진단후이식을하고남은정상잉여배아를동결보존할수있으나, 일반적으로배아의융해후생존율은매우낮으며, 57 동결 융해방법을적정화하여그생존율을 75% 정도로증가시킬수있음이보고된바있다. 58 5) DNA-Microarray 동시에수천개의유전자에대해진단할수있는방법으로특정 DNA fragment들을 array시킨 chip 으로 test DNA를진단할수있다. 59 2가지로이용될수있는데하나이상의돌연변이가원인이되는유전질환 (cystic fibrosis, thalassemia 등 ) 에서돌연변이를직접진단하거나, comparative genomic hybridization에서이용될수있다 (microarray-cgh). 알려진돌연변이에대한 Short oligonucleotide probe를 test DNA를 hybrid시키는방법, mini-sequencing 방법등이있다

13 제 35 권제 1 호, 2008 김진영 강인수 A Test DNA Normal DNA 46XY Normal Trisomy 21 Monosomy 21 1:1 3:2 1:2 Green:Red Figure 4. A schematic diagram of CGH procedure 6) Mini-sequencing 정상염기서열을고정한후 test DNA를 hybridize 하고이를 template로하여 labeled ddntp로 hybridization시켜가며 sequencing을하는방법이다. 방법은 SNP (single nucleotide polymorphism) 의신속한진단에유용하다. SNP는 linked marker로이용될수도있으며, microsatellite보다흔히발견되며짧은 PCR fragment로발견되는장점이있는데, 단일세포의증폭시에는짧은 DNA fragment가진단에더효율적이다. 착상전유전진단에서는적은수의돌연변이부위를동시에분석하게되므로 minisequencing이유용하다. Fiorentino 등 60 은 23종의단일유전질환에서 250주기의 PGD 시행결과, 대부분 linked polymorphic marker를이용한 multiplex fluorescent PCR과 mini-sequencing 기법을함께이용하여정확하고효율적인진단을보고하였다. 착상전유전진단의임상결과 1. 단일유전자질환에서착상전유전진단의결과가장흔히시행되는질환으로는상염색체우성유전질환으로 Myotonic dystrophy, Huntington's disease 가있고, 상염색체열성유전질환으로 cystic fibrosis, β-thalassemia, SMA, X-연관유전질환중에는 DMD, 취약 X 증후군 (fragile X) 등이있다. 유전질환의 PGD 결과전반적으로할구생검은약 98% 에서가 B Figure 5. PGD for β-thalassemia performed by using the minisequencing technique. A) Pedigree of a couple carrying β-thalassemia mutations. Informative STR markers are ordered from telomere to centromere. B) The mutations of interest are IVSI-110G-A and IVSI-6T/C. Color is assigned to ddntps (green/a, black/c, blue/g, red/t). The blue peak represents the normal allele (wildtype base G), the green peak (mutant base A) the mutated allele. Embryo 1 (upper left) is a carrier for ISI-6 T/C mutation (showing black peak). Embryo 3 (upper right) is a normal; embryo 2 (lower left) is compound heterozygote for the 2 mutations.; Embryo 4 (lower right) is also affected, although the minisequencing result shows heterozygosity for mutation IVSI-110 G-A (linked STR markers highlights an ADO of affected allele) (Fiorentino F, et al )

14 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis) 의임상적적용 대한생식의학회지 능하여, 생검된할구의약 86% 에서진단이가능하였으며, laser drilling이증가되고있고, trophectoderm 생검도약 4% 정도에서시행된다. 임상적임신율은이식주기당 27% 로보고되었다. 5 1) β-thalassemia Fiorentino 등 60 은부부가각각다른 HBB gene mutation을가진보인자에서 linked STR (short tandem repeat) marker를함께이용하여 multiplex PCR과 minisequencing으로 PGD를시행하였으며 ADO로인한오진을줄일수있었다 (Figure 5). 2) DMD (Duchenne Muscular Dystrophy) 부인이 Dystrophin gene mutation 을갖고있는부부에서 PGD를시행하였으며, duplex-nested PCR과 dystrophin gene exon 45, Y specific Sry 및 poly- Figure 6. Agarose gel electrophoresis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP analysis with bcli restriction enzyme in the PGD for OTC deficiency. In normal embryos (No. 1, 2, 3, 8), the 218 bp PCR products were not digested with bcli ( 이형송등 61, 2004) (M: mother, NC: normal control). morphic marker로 DYSI 부위를동시에증폭시키는 multiplex fluorescent PCR을이용하여 PGD를시행하였다. 이러한방법으로 dystrophin gene mutation과 mutant allele을함께분석함으로써 ADO를줄이고보인자와정상수정란도구분할수있다. 17 3) Ornithine transcarbamylase deficiency 요소회로에관여하는효소로, 결핍시에는고암모니아혈증을초래한다. X-linked co-dominant 질환으로유전자는 Xp21.1에위치한다. 이환된남아의경우생후몇주안에사망하며, heterozygous 여성의경우증상이없는경우부터심한증상을나타내는경우도있다. 부인이 OTC 결핍증보인자인부부에서 duplex-nested PCR및 RFLP 방법으로 PGD를시행하여건강한남아를출산하였다 (Figure 6). 61 4) Fanconi anemia with HLA typing Fanconi anemia에서극체생검및할구생검을하여 PGD를시행하면서, linked marker를함께이용하여 mutation을진단하고, 환아와의 HLA matching 및 aneuploidy 진단까지함으로써정상적인둘째아기의출산이가능하였으며, stem cell의이식이가능하였다 (Figure 7) 염색체전좌에서착상전유전진단의결과염색체전좌를가진환자에서높은자연유산의 A Figure 7. Preimplantation HLA typing combined with aneuploidy testing and PGD for Fanconi anemia complementation group A. HLA haplotype analysis based on parental and affected child's genomic DNA testing (Rechitsky, )

15 제 35 권제 1 호, 2008 김진영 강인수 위험을착상전유전진단으로감소시킬수있다. 63 임상적임신율은주기당 28.6% ( 이식주기당 31.3%) 정도로보고된바있으며, 특히전좌에서는자연유산율이 87~95.8% 로높았던데비해, 착상전유전진단후 16.7% 로현저히감소되었다. 64 ESHRE PGD Consortium Data에의하면평균 14개의난자를채취하여, 91~92% 의성공적인할구생검이이루어졌고, 이식가능한배아의비율은약 25% 였으며, 전반적인임상적임신율은난자채취당 14~15% ( 이식주기당 21~24%), 유산율은 14% 였다. 각각의임신율을보면, 로벗슨전좌에서 18~20% ( 이식주기당 25~26%), 상호전좌에서 12~13% ( 이식주기당 18~19%) 로보고되고있다. 5 착상전유전진단시얻어진수정란중염색체적으로균형적인배아의비율은전좌에서약 23~25% 정도밖에되지않으며, 5,65 로벗슨전좌에서는균형적인배아가좀더많아약 32% 정도이지만, 상호전좌에서는 19~21% 로, 5 자연임신이시도될경우불균형적인염색체로인한높은유산율을예상할수있다. 3. 염색체이수성의선별검사 (aneuploidy screening) 고령임신, 반복적착상실패, 반복자연유산, 성염색체모자이시즘등에서는배아의염색체이수성위험이높다. 따라서착상전유전진단으로염색체이수성의선별검사를하여, 염색체이상과관련된자연유산율을감소시키고, 임신유지율을높일수있다. 66 PGD consortium data에서 aneuploidy screening시정상염색체를갖는배아의비율은 34%, 임상적임신율은이식주기당 24% 였다. 5 염색체이수성을갖는배아도 20% 는 blastocyst까지발달되므로외형적인배아선별에는한계가있으며, 35세이상고령에서는염색체이수성배아가약 50~60% 로높아, PGD로유산율을감소시키고임신유지율과착상율을증가시킬수있다. Munne 등 67 은염색체이수성선별을위한 PGD 결과외형적으로좋은배아라도 35세미만에서는 44% 만이염색체적으로정상이었고, 35~37세에서 42%, 38~ 40세에서는 30%, 41세이상에서는 21% 만이정상염색체를나타내어, 나이에따라급격히정상배아의비율이감소되므로고령에서염색체이수성에대한 PGD가유용함을보고하였다. 고령에서염색체이수성선별을통해착상율증가의효과가있으며 (18% vs 11%), 특히 9개이상의 FISH probe를이용하여 (13, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y 및 1, 7, 14 or 17), PN이적어도 8개이상인경우에서착상율향상의효과를극대화할수있었다. 68 반복적착상실패에서도배아의염색체이수성이 35.7% 정도로나타나며, 염색체이수성에대한착상전유전진단으로임신율을향상시킬수있다. 31 그러나염색체이수성의선별을위한착상전유전진단의효과에있어서는아직논란의여지가많은상태이다. 최근 Mastenbroek 등 69 은 35~41세의환자에서 PGS를시행한군과체외수정만시행한군간에착상율에유의한차이가없었고, 임신유지율및출산율 (24% vs. 35%) 은 PGS군에서더낮은결과를보고하였고, Staessen 등 70 도포배기배아이식에서염색체이수성선별을한군과하지않은군간에착상율 (17% vs. 11%), 임신유지율 (24% vs. 26%) 에차이가없다고하였다. 이에대해 Verlinsky 등 71 은이수성선별후에착상율이 7.2% 에서 34.8% 로증가되고, 유산율은 72% 에서 26.9% 로, 출산율은 27.9% 에비해 65.7% 로증가됨을보고하면서, 적절한할구생검방법, 적절한 FISH probe 사용과진단의정확성이중요하다고하였다. 따라서선별적인환자군에서효율적인 FISH 기법을이용하면특히고령임신등에서는효과가있을것으로생각되며, 추후더많은전향적인연구가필요할것이다. 한편, 성염색체이상에서는난자나정자가생성되기어려우나간혹얻어지는경우가있고특히모자이시즘에서가능하다. 클라인펠터증후군 (47, XXY) 의경우수술적고환내정자채취술을통해정자가채취될수있어보조생식술의시도가증가되고있는데, 이경우채취되는정자의성염색체및상염색체이수성위험이증가되어배아의염색

16 착상전유전진단 (Preimplantation Genetic Diagnosis) 의임상적적용 대한생식의학회지 Table 3. Congenital malformations after preimplantation genetic diagnosis Babies with malformation 17/426 (4%) Major Absence of corpus callosum 1 singleton Hemangioma 2 twins Bilateral cryptorchidia 1 triplet Inguinal hernia 1 twin Unilateral cryptorchidia 1 singleton Cleft lip unilateral 1 singleton Esophageal atresia 1 twin Omphalocele 1 twin Pulmonary stenosis 1 singleton Left ventricular hypoplasty syndrome, 1 singleton aorta stenosis Minor Congenital hip luxation 2 singletons Cranial asymmetry 1 twin Kidney and bladder problems, 1 singleton mental retardation Nephromegalia 1 twin Pre-auricular tags 1 singleton (from ESHRE consortium data collection VI, 2007) 체이상이나모자이시즘이증가되는것으로보고되고있으며, 따라서착상전유전진단으로배아의염색체이수성을예방하여효율적인시술을할수있다 진단의오류 단일세포의 PCR 과정에서오류가있을수있고, 배아의모자이시즘가능성등이오류의원인이될수있다. 전반적인진단오류는약 2% 정도로보고되고있다. 5 FISH에서는전좌에서 3:1 segregation 을구분하지못하거나배아의모자이시즘으로진단오류가발생할수있으며 1~10% 정도로보고된다 PGD의산과적합병증및선천성기형 PGD 후임신된경우에서태아기형의발생율은 4% 정도로 (Table 3), 일반적인 ICSI에서의경우와유사하여, 5 할구생검등의과정이태아발달에해를주지는않는것으로생각된다. 결론착상전유전진단 (PGD) 은유전병이있는가계나염색체이상을가진부부에서유전병에이환된환아의출생이나염색체이상과관련된기형아또는습관성유산을예방할수있는매우효과적인방법이다. PGD의적용이가능한단일유전질환의종류가확대되고있고, 그밖에유전적악성소인을갖는 late onset disease 또는 HLA typing을하여골수세포이식을가능케하는등다양한경우에서시도되고있다. 염색체전좌등의염색체구조적이상이있는습관성유산의경우 PGD로유산율을현격히감소시킬수있다. 또한보조생식술시염색체이수성에대한 PGD로그효율을증대시키는일환으로이용되고있으며, 아직그효용성에대해서는논란이있으나, 선별적인환자에서적절한방법으로시행하여효과를얻을수있을것으로생각된다. 단일세포를이용한진단기법의발전으로, 소량의 DNA로도여러염색체나유전자의포괄적진단이가능해짐으로써, PGD의진단오류를줄이고더욱정확하고안전한기법으로발전되고있다. 참고문헌 1. Hardy K, Martin KL, Leese HJ, Winston RML, Handyside AH. Human preimplantation development in vitro is not adversely affected by biopsy at the 8-cell stage. Hum Reprod 1990; 5(6): Griffin DK, Handyside AH, Penketh RJA, Winston RML, Delhanty JDA. Fluorescent in situ hybridization to interphase nuclei of human pre-implantation embryos with X and Y chromosome specific probes. Hum Reprod 1991; 6:

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