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1 희귀및유전질환실무자를위한 교육콘텐츠개발 연구기간 : 2006 년 9 월 4 일 ~ 12 월 3 일 연구기관 : 삼성서울병원 책임연구자 : 김선희 1

2 목차 제 1 장서론 제 2 장연구방법 제 3 장연구결과 제 4 장고찰및결론 2

3 제 1 장서론 1. 연구목적 본연구는국내희귀및난치성질환환자들에게질환의이해및확진을위한적절한검사및그결과해석을포함한정확한의학지식을바탕으로질높은의료서비스를제공하기위하여전문인력양성을위한교육콘텐츠를개발하는것이목적이다. 2. 연구의필요성 희귀난치성유전질환은그빈도가낮고치료 modality 가제한되어 있음으로인해비교적의료서비스의사각지대에있는반면환자들및 가족들에게는그질환으로인한 burden 이심각하다. 국내에서이들에게정확한의학지식을바탕으로필요한검사의적절한수행과진료를할수있는의료인이매우제한적이며, 그나마소수의전문클리닉은주로수도권위주로분포하여지역환자들의경우질환의진단및치료가어려워결국많은환자들이자신의질환에대한잘못된이해를가지고있으며적절한의료서비스를받지못하고있는것이현실이다. 3

4 이에범국가적으로이들에대한질높은의료서비스를제공하기위하여희귀및난치성유전질환진료를위한지역거점병원을선정하여시범적으로운영하려함에그전문간호사들을대상으로효율적으로환자들을관리하고상담해줄수있는실무자수련에사용되어질교육콘텐츠의개발이시급하다. 제 2 장연구방법 1. 연구방법 희귀및난치성유전질환의교육콘텐츠의기본항목 / 분야선정 각전문항목 / 분야를맡을자문의선정 각항목 / 분야에대한강의록및교육자료 (references) 수집 실무자교육의실제 Feedback 및 discussion 을통한교육콘텐츠의 refinement Offline 및 online 교육자료 resources 의 compilation 2. 연구수행체계 4

5 3. 연구내용 희귀및유전질환환자및가족에서유전성의가능성판단및필요한 검사의이해와결과해석, 그리고이에기초한유전질환자상담이가능한 실무자양성을위한교육콘텐츠개발 이를위하여다음의각항목에대하여교육콘텐츠를수집 a. 유전학의기초 b. 유전학에서자주사용되는기본적인용어들의이해 c. Human Genome Project 의이해 d. 유전질환의다양한유전양상의이해 - Mendelian inheritance 5

6 - Non-Mendelian inheritance e. 가계도에서사용되는기호들의이해및실제가계도증례의경험 f. 유전질환의진단을위한검사및결과의이해 - 분자유전 - 세포유전 - 생화학유전 - 산전검사 g. 유전상담의실제 i. Ethical, legal, and social implications of genetic tests 제 3 장연구결과 교육콘텐츠의기본항목 / 분야선정및자문의선정희귀및유전질환환자실무자가기본적으로갖추어야할의학유전및실제환자진료를위한기본항목으로다음의 8 항목들을선정하고각항목에대한 1 명의자문의 ( 전문의 ) 를선정하였다. I. 유전학의기초 II. 유전질환의유전양상및병력청취를통한가계도그리기 III. 유전검사 - 세포유전검사및결과의해석 6

7 IV. 유전검사 - 분자유전검사및다양한기법들 V. 유전검사 - 생화학유전 VI. 유전상담의실제 VII. 유전검사 - 산전진단 VIII. Ethical, legal, and social implications of genetic tests 위의각 8 항목에대한교육콘텐츠의개발 각항목에대하여실무자들이익혀야할내용을명시하고, 도움이되는 website 혹은참고자료를활용할수있는콘텐츠를아래와같이마련하였다. ======================================================== I. 유전학의기초 (Human Genetics and Basic Concepts) 익혀야할내용 : 유전학의개요를이해한다. 1 유전학교과서및 Website를활용하여유전학에서흔히사용되는전문용어들을이해한다. I-1. 개요 유전학은생물의형질이대를거듭하여보존되는배경을밝히고자하는 학문의한분야로 19 세기중반멘델의유전현상발견이그효시라고할수 7

8 있다. 인체유전학은다른생명체와같거나혹은차이가있는인간의유전현상을규명하기위한학문인데, 지금은누구나알고있는사실이지만염색체와 DNA가유전현상의핵심이라는사실을알기이전인 1900년대초에이미유전질환이밝혀지고여러유전현상에대한연구가이루어졌다. 그러나, 본격적인인체유전학의발전은 1953년 Watson과 Crick이 DNA의분자구조를밝혀내고, DNA가유전의핵심물질이라는것을입증한이후부터시작되었다고할수있다. 특히, DNA가 RNA로전사 (transcription) 되고, RNA로부터단백질이부호화 (coding) 된다는중심가설 (central dogma) 이확립되면서생명과유전현상을분자수준에서이해할수있게되었다. 이러한인체유전학의발전은인간의질병을연구하여예방과진단및치료법을개발하고자하는의학의발전에지대한영향을미쳤다. 본강의에서는인체유전학의기본적인개념을이해함으로써유전질환과유전검사및유전상담을위한기초지식을습득할수있도록하였다. I-2. 중요한용어및개념 1. 유전 (inheritance) 2. 유전학 (genetics) i. 분자유전학 (molecular genetics) ii. 세포유전학 (cytogenetics) iii. 유전생화학 (biochemical genetics) 3. 유전검사 (genetic test) 8

9 i. 분자유전검사 (molecular genetic test) ii. 세포유전검사 (cytogenetic test) iii. 유전생화학검사 (biochemical genetic test) 4. 염색체 (chromosome) i. 핵형 (karyotype) ii. 삼염색체 (trisomy) iii. 단염색체 (monosomy) 5. 유전자 (gene) 6. 유전체 (genome) 7. 핵산 (nucleic acid) i. DNA ii. RNA iii. Complementary DNA 8. 유전자발현 (gene expression) 9. 중심가설 (central dogma) 10. 서열 (sequence) 11. 변이 (variation) i. 다형성 (polymorphism) 1 단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism; SNP) 2 Minisatellite (variable number tandem repeat; VNTR) 3 Microsatellite 4 Short tandem repeat 9

10 ii. 돌연변이 (mutation) 1 과오돌연변이 (missense mutation) 2 넌센스돌연변이 (nonsense mutation) 3 Splice site 돌연변이 4 Frameshift 돌연변이 5 결실돌연변이 (deletion mutation) 6 삽입돌연변이 (insertion mutation) 12. 대립유전자 (allele) 13. 모자이크 (mosaicism) i. 생식세포모자이크 (germline mosaicism) ii. 체세포모자이크 (somatic mosaicism) 14. 키메라 (chimerism) 15. 동형접합체 (homozygote) 16. 이형접합체 (heterozygote) i. 복합이형접합체 (compound heterozygote) ii. 이중이형복합체 (double heterozygote) 17. 반접합체 (hemizygote) 18. 유전검사 (gene testing) 19. 유전질환 (genetic disorder) i. 염색체질환 (chromosomal disorder) ii. 단일유전자질환 (single gene disorder) iii. 다인자질환 (multifactorial disorder) 10

11 20. 표현형 (phenotype) 21. 유전형 (genotype) 22. 투과도 (penetrance) 23. 예기 (anticipation) 24. 각인 (imprinting) 25. 일배체 (haplotype) 26. 연관 (linkage) 27. 연쇄불균형 (linkage disequilibrium) 28. Uniparental disomy (UPD) 29. Genetic heterogeneity 30. Allelic heterogeneity I-3. 참고자료 1. 진단검사의학 2. Thomson & Thomson 의학유전학 3. Dolan DNA learning center 4. DNA from the beginning 5. DNA interactive 6. GeneTests 11

12 ======================================================== II. 유전질환의유전양상및병력청취를통한가계도그리기익혀야할내용 : Mendelian 유전의법칙을이해한다. Mendelian 유전의유형을이해한다. 2 대표적인 non-mendelian 유전유형을열거할수있다. 3 가계도에사용되는기본적인기호를이해한다. 4 가계도로부터가능한유전방식을유추할수있다. II-1. Mendel 의유전법칙및 Mendelian 유전유형 1. Mendelian 유전의법칙 i. Law of uniformity and reciprocity ( 성염색체는제외 ) ii. Law of segregation and law of purity of gamete iii. Law of free combination of genes (no linkage) 2. Mendelian 유전의유형들 i. 상염색체우성 (Autosomal dominant) 1 매세대에서환자가발생한다. 2 남, 녀비슷하게환자로이환된다. 3 환자가아닌가족원의자녀중에서는환자가발생하지않는다. 12

13 4 환자인가족원의자녀중에서는약 50% 의확률로환자가발생한다 ( 성별차이없이 ). 5 대개어느정도성장이된후, 증상이나타난다. 6 불완전 Penetrance 7 병의발현정도의매우다양하다. (Variable Expressivity; Degree of Manifestation). 8 질환예 : Achondroplasia Figure II-1. A pedigree showing the autosomal dominant inheritance pattern ii. 상염색체열성 (Autosomal recessive) 1 환자가발생한세대의전, 후로는환자를찾아보기어렵다. 2 남, 녀비슷하게환자로이환된다. 3 환자의부모는무증상보인자이다. 4 두보인자부모에게서이환된아이가태어날확률은 1/4 13

14 (25%) 이다. 5 환자의자녀는자동적으로보인자가되며, 따라서 보인자이거나환자와혼인하지않는한증상은발현하지 아니한다. 6 질환예 : 대부분의 inborn errors of metabolism Figure II-2. A pedigree with an autosomal recessive disease. iii. 성염색체우성 (X-linked dominant) 1 이환된남성의딸은항상질환을유전한다. 2 이환된남성의아들은항상환자가아니다. 3 이환된여성은아들이건딸이건공히 1/2 (50%) 의확률로질환을유전한다. 4 가계도에서이환된여성의수가이환된남성의수보다약 2배많다. 5 예 : Vit D resistant rickets with hypophosphatemia 14

15 Figure II-3. A pedigree with an X-linked dominant disease. Figure II-4. A pedigree with an X-linked dominant disease with male carriers are lethal. iv. 성염색체열성 (X-linked recessive) 1 거의모두남성만이환된다. 2 보인자인여성을통해아들에게유전된다. 3 남성에서남성으로유전되는양상은관찰되지않는다. 4 무증상보인자여성이자녀를낳는경우, 남아는 1/2 15

16 (50%) 의확률로환자이며여아는 1/2 (50%) 의확률로역시 보인자가된다. 5 질환예 : Hunter syndrome, X-linked recessive form of chondrodysplasia punctata Figure II-5. A pedigree with an X-linked recessive disease. II-2. Non-Mendelian 유전의대표적유형들및예질환들 1. Genomic imprinting i. 일종의 epigenetic phenomenon으로 genome 내에일부유전자부위가부혹은모 origin에따라달리발현되는현상. ii. 기전 : 1 Chromosome deletion 16

17 2 Uniparental disomy 3 Imprinting center의이상 iii. Genomic imprinting의이상으로인한질환의예 : - Prader-Willi syndrome/angelman syndrome 2. Anticipation/ 삼염기반복질환 (Triple Nucleotide Repeat Disease) i. Anticipation: 세대가내려감에따라질환의발병연령이빨라지거나증상이더욱심해지는현상. ii. 삼염기반복질환 : 3개의 nucleotide의반복회수의변화에의해서특정아미노산의 stretch가길어지거나혹은유전자발현의조절에이상이생겨발생하는질환. iii. 예 : myotonic dystrophy, fragile X syndrome. 3. 미토콘드리아유전 (Mitochondrial inheritance) i. 예 : Leber hereditary optic neuropathy (LHON), myoclonic epilepsy with ragged-red fiber disease (MERRF) II-3. 참고문헌 1. Tom Strachan, Andrew P. Read. Human Molecular Genetics 2 nd ed. JW and Sons Medical Genetics second edition Jorde.Carey, Bamshad, White, 17

18 Mosby pp77-84, pp102-pp Genetic imprinting in human disease. The metabolic and molecular bases of inherited disease volume 1 seventh Ed. Charles R. Scriver, Arthur L. Beaudet, William S. Sly, David Valle pp Genetics in Medicine Chapter 5. Patterns of Single-Gene Inheritance page Thompson & Thompson 6 th Ed. Saunders 진단검사의학 Chapter 60. 단일유전자질환 (Single Gene Disorders) pp 고려의학 ======================================================== III. 유전검사 - 세포유전검사및결과의해석익혀야할내용 : 세포유전학의개요를이해한다. 세포분열단계를이해한다. 인간의염색체에대해이해한다. 염색체검사의적응증을이해한다. 통상적인염색체검사의기법및 molecular cytogenetics 기법에대해서이해한다. 흔히접하게되는염색체질환들을열거할수있다. 18

19 III-1. 개요 유전검사란일반적으로유전적인질병과관련된이상을진단하기위하여사람의 DNA, RNA, 염색체, 단백질또는그의부산물등을분석하는과정을말하는데, 이러한유전자검사를시행하는방법으로는다음과같이크게세가지로나눌수있다. - 세포유전검사 (Cytogenetic tests): 말초혈액또는양수세포를배양하여염색체의수적, 구조적이상을확인하는검사. 염색체검사, 형광동소교잡법 (fluorescence in-situ hybridization; FISH) 등. - 분자유전검사 (Molecular genetic tests): 특정한유전질환의원인으로생각되는유전자 (gene) 를이루는 DNA나 RNA를직접검사하거나특정유전자와같이유전되는표지자 (marker) 를이용하여질환의유전여부를알아보는검사 - 생화학유전검사 (Biochemical genetic tests): 유전적이상에의한효소활성의저하, 대사산물을축적등을검사. 효소측정법 (enzyme assay), 탠덤질량분석법 (tandem mass spectrometry; MS/MS), 아미노산분석, 유기산분석등 세포유전학 (cytogenetics) 은유전물질을세포수준즉, 염색체 (chromosome) 를통해서연구하는학문으로서, 분열세포에서관찰할수있는염색체의숫자와구조를현미경을통해서관찰하는방법을사용한다. 염색체에관한검사는 1956년 Tjio 등이사람의염색체수가 19

20 46개임을보고한이후, 림프구배양, 분염법 (banding technique), 고해상도분염법 (high resolution banding technique) 으로이어지는기술적인발전을이루어왔다. 이러한염색체검사기법의발전과각종질병에서의연구결과로여러유전성질환과염색체이상의관련성이밝혀지고많은유전자위치를확인할수있게되었다. 염색체연구는선천성이상이나기형을보이는여러질환의원인규명의중요한방법일뿐아니라, 여러종양의진단, 예후결정과발암기전을이해하는데중요한정보를제공하여종양학연구의중요한수단이되므로그필요성은커지고있다. III-2. 세포분열 1. 유사분열분열하는세포의선상구조물 (threadlike structures) 이 I879년 Flemming에의해처음으로발견되었고, 이러한형태의세포분열을유사분열 (mitosis) 로명명하였다. 유사분열의각단계는 l884년 Strasburger에의해전기 (prophase), 중기 (metaphase), 후기 (anaphase) 의개념이알려졌다. 유사분열은성세포를제외한모든체세포에서일어나며, 그결과두개의유전적동일성 (genetically identical) 을갖는딸세포 (daughter cell) 를생성한다. 진핵세포에서세포주기는 DNA 합성부터시작하며, 이단계를 S phase라부르고이는약 8시간정도소요된다. 다음단계는 4시간정도의 G2 phase를거친다. G2 phase(gm-2) 에는전체 20

21 유전체의양이배로증가한다. 진핵세포에서의유사분열은약 l시간정도에걸쳐일어난다. 분열이끝난세포는 Gl phase로이어지고세포마다매우다른 Gl phase 기간을갖는다. G1 phase는정상적인기능적세포주기에속하며, 만약더이상세포가분열하지않으면 G0 phase라부른다. 모든세포주기의조절은각종 cell-division cycles(cdc) 유전자에코딩된단백질에의해일어난다. 2. 감수분열생식세포의생성은감수분열 (meiosis; reduction division or maturation division) 이라는독특한형태의세포분열에의해형성되며, 이는 l884년 Strasburger에의해소개되었다. 감수분열과유사분열이구별되는점은 1 상동염색체의짝짓기 (pairing of homolog-ous chromosomes), 2 상동염색체끼리의주기적인유전물질교환 (crossing-over), 3 감수분열 l 단계 (meiosis I) 동안에염색체수가반 (23개) 으로줄어드는현상등을들수있다. 감수분열 I 단계 (meiosis I) 는유전자복제로부터시작한다. 간기의염색체는유사분열시와마찬가지로선상구조물로만관찰할수있다. Prophase I 이시작하면염색체는자매염색분체 (sister chromatids) 를형성하며뒤이어상동염색체의짝짓기 (pairing of homologous chomosomes) 현상을관찰할수있다. 상동염색체가짝을이룬시기에근접부위상동염색분체 (juxtapositioning homologous chromatids) 사이의교차 (chiasma) 와유전물질교환 (exchange) 이일어난다. 이러한두상동염색분체사이의유전물질교환을유전자재조합 (genetic recombination) 이라 21

22 하며, metaphase I 시기에유전자재조합이일어난후각상동염색체들이양극으로이동하는 anaphase I 단계가이어진다. 감수분열 2단계는자매염색분체의종적분리 (longitudinal division) 와뒤이은세포분열이일어난다. 결과적으로각기다른유전정보를가진단배체 (haploid) 의딸세포 4개를형성한다. III-3. 염색체 1. 염색체의구조염색체는 DNA와핵단백질 (nucleoprotein) 로이루어져있다. 세포주기에서세포분열 (mitosis) 의전기 (prophase) 가되면, 이제까지가느다란실같은형태를하고있던 DNA 이중나선 (double helix) 은구조단백질인히스톤 (histone) 을중심으로코일모양으로압축되고포개지게되어굵은끈과같은형태의염색질 (chromatin) 을이루고, 좀더응축하여염색분체 (chro-matid) 를형성한다. 두개의자매염색분체가중심절의이염색질 (heterochromatin) 부분에모여한개의염색체를이룬다. 염색체에서염색질은이염색질 (heterochromatin) 과진염색질 (euchromatin) 로분류한다. 이염색질중 constitutive heterochromatin은활성화된유전자를포함하지않고반복염기서열만으로구성된부위로고도로응축이되어있으며대부분염색체의중심절주위에존재한다. Facultative heterochromatin은유전자는포함하고있지만대부분불활성화된상태이며여성의불활성화 X 염색체 (inactivated X chromosome) 가대표적인예이다. 진염색질은이염색질보다덜응축되어있고 22

23 활성화된유전자를포함하고있는부분이다. 그외핵소체형성부위 (nucleolar organizer region, NORs) 는 rrna 합성을조절하는유전자가존재하는부위이며끝곁매듭염색체의단완에위치한다. 각각의염색체는중심절을기준으로단완 (shortarm, p) 과장완 (long arm, q) 으로구성되어있고, 각각의종말체 (telomere: pter, qter) 로끝난다 ( 그림 65-4a). 중심절은세포분열시에방추사 (spindle fiber) 가붙게되는동원체 (kinetochore) 를갖고있으며, 종말체는염색체양쪽말단부위에매우일정한반복염기서열 (TTAGGG) 이반복되어있고, 이는세포분열과노화에관련되어있는것으로알려져있다. 한편, 염색체는크기, 모양에따라몇가지군으로나눌수있는데, 단완과장완의길이가같은염색체는중앙매듭염색체 (metacentric chromosome), 단완의길이가짧을때는중앙곁매듭염색체 (submetacentric chromosome), 단완부의길이가매우짧아거의보이지않을때는끝곁매듭염색체 (acrocentric chromosome) 라하고, l3번, 14번, 15번, 21번, 그리고 22번염색체가여기에속한다. 2. 정상인의분열중기세포 46개 (23쌍) 의염색체를가지며그중 44개 (22쌍) 는상염색체 (autosomes) 이고, 2개 (XX 또는 XY) 는성염색체 (sex chromosomes) 로구성되어있다. 각각대립되어있는염색체중하나는아버지로부터유전되며또다른하나는어머니로부터유래한다. 정상인의염색체는남성에서 46,XY, 여성에서 46,XX로표시한다. 23

24 III-4. 염색체검사 1. 염색체검사의적응증염색체검사는선천성염색체이상질환이의심될때와, 후천적으로종양세포의염색체이상을검사하기위해서실시한다. 선천성염색체이상질환은대부분발육장애나지능장애를포함하는다발성기형을보이는데이를확진하기위해서는우리몸의어떠한세포를이용해서도염색체검사가가능하지만보통은말초혈액의림프구를이용해검사한다. 또한성분화에이상이있을때나염색체이상의보인자로의심될때도염색체검사를시행한다. 반복유산및사산아의병력이있는산모및그배우자는균형전좌 (balanced translocation) 를갖는보인자일수있으므로염색체검사를해야한다. 가족성유전질환이있거나, 산모의나이가많을때는다운증후군동의염색체이상을갖는태아의확률이급격히증가하기때문에산전진단 (prenatal diag1osis) 을목적으로태아세포를대상으로염색체검사를실시한다. 염색체절단증후군 (chromosome breakage syndrome) 이의심될때도염색체검사를실시한다. 한편, 악성종양의염색체검사는종양세포를대상으로검사를하며, 특히혈액종양에서는염색체검사의결과가환자의진단및예후결정에아주중요하므로골수검체를대상으로반드시염색체검사를시행하고, 최근에는세포배양방법이나분자세포유전학 (molecular cytogenetics) 의발전으로다양한고형종양에서도염색체검사를많이이용하고있다. 24

25 Table III-1. 염색체검사의적응증 1. 발육장애또는지능장애를포함하는다발성기형 2. 염색체이상의보인자로의심될때 - 불임, 반복적자연유산, 이전에기형아를출산한경력이있는경우 3. 반복유산및사산아 4. 성분화이상 5. 산전진단 6. 취약 X 증후군 7. 염색체절단증후군 (chromosome breakage syndrome) - Fanconi 빈혈, Bloom 증후군, 혈관확장성운동실조증 (ataxia telangiectasia) 8. 악성종양, 특히혈액종양 2. 염색체검사에필요한검체선천성유전질환이나기형을의심하는경우, 산전검체로는양수세포나융모막 (chorionic villi) 등을사용하고출생후에는말초혈액의림프구 (Tlymphocyte) 를주로사용한다. 모자익형 (mosaicism) 을진단하기위해서는림프구외에도피부조직으로부터섬유아세포 (fibroblast) 를배양하여염색체검사에사용한다. 악성종양의염색체검사를위해서는반드시종양조직내의종양세포를사용하여염색체검사를실시해야한다. 3. 염색체분석방법염색체분석을위해서는우선적절한대상검체내에서분열세포를얻어야하는데잘분열하지않는세포인경우에는적절한조건으로배양하여세포분열을유도한다. 따라서세포를배양하고양질의염색체를 25

26 수확하기위해서는검체내에포함되어있는세포가살아있는세포 (viable cell) 이어야하므로검체의채취부터검사실에서배양이시행되기까지의시간이염색체분석에매우중요하다. (1) 직접법 (Direct method) 세포배양과정을거치지않고직접분열중기세포를얻는방법으로주로종양세포의염색체검사에이용하며, 검사시간을단축할수있으나분열세포를충분히얻지못하는단점이있다. (2) 배앙법 (Culture method) 말초혈액, 양수, fibroblast 둥대부분의검체에이용하는방법으로대상이되는세포에적합한방법과일정시간세포배양후분열세포를관찰한다. (3) 고해상도분염법 (High resolution banding technique) 세포배양단계에서 DNA 합성억제제인 methotrexate(mtx) 와그해제를위한 thymidine이첨가되는방법으로, 시간이단축되고더많은분열세포와질적으로우수한염색체를얻을수있어서염색체의미세구조를확인할때사용한다. (4) Fanconi 빈혈의진단을위한염색체절단분석법말초혈액에분열촉진물질 (mitogen) 인 phytohemagglutinin(pha) 을첨가하고염색체절단을유발하는 mitomcycin C나 diepoxybutane을넣은후정상인과비교하여염색체절단정도를비교한다. Fanconi 빈혈을비롯한염색체절단중후군의진단에이용한다. 26

27 4. 염색체의수확 (Harvest) 각각의세포가가지고있는염색체의형태및수를현미경으로관찰하기위해서는다음몇단계의과정이필요하다. 우선세포주기를중기에서멈추게하기위하여세포분열에필수적인방추 (spindle) 의형성을방해하는 colchicine 제제 (Colcemid ) 등을사용한다. 분열중기에서멈춘세포에저장용액 (hypotonic KCl) 을처리하여세포를팽창시키고염색체들이세포막안에서잘퍼지도록만든다. 다음단계로고정용액 (acetic acidmethanol) 을처리하여염색체를고정하고단백질과핵산의변성과침전을일으킨다. 이과정은염색질을강화하고염색체형태의질을향상시키며, 세포막이깨지는것을방지하여염색체가흩어지는것을막아준다. 고정된염색체를슬라이드에떨어뜨리고건조시킨후적절한염색을실시하고현미경으로염색체의형태를관찰한다. 5. 분염법 (Banding technique) 각각의염색체구조를좀더자세히보기위하여여러가지분염법 (banding techniques) 들을사용하고있다. 분염기법에는 DNA의상호작용, 관련된단백질, 그리고염색시약들이관련되어있다고알려져있지만명확한기전은아직밝혀져있지않다. (1) G-분염법 (Giemsa banding): 가장많이사용되는분염법으로단백분해효소 ( 주로 trypsin) 로전처리한다음에 Giemsa 염색하는방법이다. (2) Q-분염법 (Quinacrine mustard banding) : 형광염료인 quinacrine mustard나 DAPI등을사용하여 adenine-thymine(at) 이많은부위를 27

28 염색하는방법으로분염양상은 G-분염법과유사하다. (3) R-분염법 (Reverse banding) : GC-rich DNA 부위를염색하는방법으로 G 또는 Q-분염법과반대의염색양상을보인다. (4) C-분염법 (Constitutional heterochromatin banding) : 중심절주위의 heterochromatin 부위를염색한다. (5) Silver-NOR 분염법 (Nucleolus organizer region) : 부수체 (satellite) 의핵소체형성부위 (NOR) 를염색한다. 6. 핵형분석핵형분석 (karyotyping) 이란현미경상에서염색체사진을찍은후, 염색체크기와중심절위치동을기준으로번호순서대로배열하여염색체이상을판독하는과정을의미한다. 핵형 (karyotype) 을구성하는데, 상염색체는 1번부터 22번까지길이가감소하는순서로우선배열하고다시중심절의위치에따라구분하여배열한다. 최근에는이러한과정을자동화한자동화핵형분석시스템 (automated karyo-typing system) 을개발하여사용하고있다. 7. 염색체의명명법 (Nomenclature) i. 염색체핵형을문자로표현하기위하여 I960년 Denver conference 이후많은노력이있었고현재는인체세포유전학명명법에관한국제규약 (International System for Human Cytogenetic Nomenclature, ISCN 2005) 에따라모든 28

29 염색체의표기를통일하고있다. ii. 정상염색체는 46개 (23쌍) 이고, 22쌍의상염색체와 l쌍의 성염색체로구성된다. 이를명명할때는먼저염색체의수를기술하고, 다음에성염색체를기록한다. 따라서정상인의핵형은 46,XX 혹은 46,XY로기술한다. 각각의단완과장완은여러개의염색대 (band) 로이루어져있는데염색대는 ISCN 2005의규칙에따라번호를부여한다. iii. 염색체이상이있는경우에는먼저염색체수와성염색체를표기한후에과, 부족이있을경우 + 또는 - 부호를쓰고해당하는이상염색체의번호를기재한다. 구조적이상이있는경우도염색체수와성염색체수를기술한후에연이어약자로표기한다. 구조적이상은전좌 (tanslocation; t), 결손 (deletion; del), 역위 (inversion; inv), 환상염색체 (ring chromosome; r) 등완염색체 (isochromosome; i) 등의형태로표현한다. ( 예 ) 46,XY,t(9;22)(q34;q1l.2) 45,XX,-7 46,XX,del(5)(p15) iv. 모자익형의경우에다른세포군을표기해야하는할때는 slant line(/) 으로각군을표기하며핵형뒤에 [ ] 로각각의세포군의절대숫자를표기한다. 이러한경우정상적인세포군이있는경우는항상마지막에표기하며, 비정상세포군이 2개이상있는 29

30 경우는가장큰것을먼저표기하고그다음으로큰세포군을표기한다. ( 예 ) 45,X[12]/47,XXX[3]/46,XX[5] III-5. 분자세포유전학 (Molecular Cytogenetics) 1. 개요 : 최근들어세포유전학은전통적인염색체검사방법에분자유전학적검사기법을접목한분자세포유전학 (molecular cytogenetics) 으로크게발전하고있다. 이중에서형광동소교잡법 (Fluorescent in situ hybridization, FISH) 은현재가장많이사용하고있는방법이다. FISH는개발초기에는각염색체의중심절과결합하는 α -satellite probe와, 각염색체의단완과장완모두와반응하는 painting probe가개발되어염색체의수적인이상이나상호전좌 (reciprocal translo-cation) 를진단하는데많은도움을주었다. 최근에는염색체내의특정 DNA 염기서열에만특이하게결합하는 DNA 소식자 (specific DNA probe) 가개발되어, 현미경으로관찰하기어려운염색체의미세한변화까지도관찰할수있게되면서분자세포유전학적검사는고식적인염색체검사와유전자수준에서진행되는분자유전학적검사사이의중간적기능을수행하고있다. 특히분열세포가아닌상태에서도염색체이상에대한정보를얻을수있고, 파라핀조직절편, 동결절편, 천자도말표본둥우리가쉽게얻을수있는검체로염색체검사가가능하게되었으며, 아주미세한이상도검출할수있어서임상적이용이점점증가하고있다. 특히유전자변화를관찰할때 30

31 분자세포유전학적검사가분자유전검사 (DNA, RNA test) 보다유리한점은세포의형태를그대로유지하면서원하는유전자의변화관찰이가능하고, 한번에많은유전자변화를동시에조사할수있으며, 유전자변화를보이는세포와정상세포를구분하여정량적분석이가능하다는점을들수있다. 2. 세포분열중기동소교잡법 (Metaphase in situ hybridization : ISH) i. 분열기의염색체에여러종류의소식자를반응시켜, 염색체의미세한구조적변화또는정체가불분명한염색체 (marker chromosome) 를확인하는방법이다 ( 그림 65-7). 특히 Prader-- Willi 중후군등의염색체미세결실증후군을진단하는데큰도움이되며, 특정유전자의염색체내위치확인에이용한다. ( 예 ) Prader-Willi 증후군 46,XY.ish del(l5)(q11.2q11.2)(snrpn-,dl5sl0-) 위에표시한 ish del(l5)(q11.2q11.2) 는세포분열중기동소교잡법에의해염색체 l5번장완의 1l.2 염색대의결실이확인되었다는표시이고, 뒤에나온 D15S10, SNRPN 등은실험에이용된특정 DNA 염기서열소식자 (specific DNA sequence probe) 의명칭과각각의반응여부를 + 와 -로표시한것이다. 이경우는고식적인염색체검사에서는정상소견이었음을같이기술하였다. 3. 세포분열간기동소교잡법 (Interphase/nuclear in situ hybridizatin: nuc ISH) i. 세포분열간기동소교잡법은세포배양이나염색체의추출과정을 31

32 거치지않고, 세포를슬라이드에도말한후세포에직접여러종류의소식자를반응시켜염색체또는유전자의변이를관찰하는방법이다 ( 그림 65-8). 이검사법은특히분열세포를얻기어려운악성종양세포의유전적변화를관찰하는데매우유용하며, 최근에는혈액종양에서질환의진단뿐아니라잔존암을정량화하거나재발을조기에발견할목적으로활발히사용하고있다. III-6. 대표적인염색체질환염색체의수적또는구조적이상으로인한선천성질환은, 다운증후군처럼일반에잘알려져있는질환으로부터그렇지않은것까지많은종류의질환들이존재한다. 크게는상염색체질환과성염색체질환, 염색체불안전성으로인한절단증후군등으로분류하며각각에해당하는주요질환들은다음과같다. 1. 염색체의수적이상에의한질환 i. 상염색체가증가된경우 1 다운증후군 (Down syndrome) 혹은 Trisomy 21 Incidence : around 1 in 650 live births 산모의나이증가와연관 발생원인 : 난자의감수분열 1단계에서일어나는 21번염색체의비분리 32

33 부모염색체가정상이라면 1% 미만의재발위험성 부모중의 Translocation carrier에의한것이라면재발빈도가더높음 - 염색체이상 : Trisomy 21(93%); Mosaicism: 2-3%, 46,XX/47,XX+21; Translocation: 3-5%, Robertsonian translocation(14, 22, 13, 15, 21), reciprocal translocation 2 Trisomy 18(Edward syndrome) Incidence: around 1 in 6,000-8,000 live births 대부분임신중유산또는사산되어출생하는율은낮음 95% 에서모체감수분열 2단계에서의비분리현상이원인 산모의나이증가와연관 부모염색체가정상이라면 1% 미만의재발위험성 부모중의 Translocation carrier에의한것이라면재발빈도가더높음 3 Trisomy 13(Patau syndrome) Incidence: around 1 in 12,000 live births 모체내감수분열비분리현상이원인 임신중유산또는사산되어출생하는율은낮음 2. 성염색체 (X 염색체혹은 Y 염색체 ) 의수적이상에의한질환 2 Klinefelter syndrome(47,xxy) Incidence : around 1 in live male births 33

34 Infertility, atrophic testes, aspermia, female breast 50% 가부계의감수분열 1단계과오에의해발생하나아버지의나이는발생빈도에영향을주지않음 산모의나이는어머니유래의 47,XXY 발생빈도에매우큰영향을미침 3 Triple X syndrome(47,xxx) Incidence : around 1 in 800 live female births 정상적인수정능력과정상적인자녀를가짐 모체의감수분열 1단계의과오로인하여산모의나이와연관 4 Turner syndrome(monosomy X/ 45,X) Incidence : around 1 in 2,500 live female births 대부분은임신초기에유산 감수분열단계의비정상적성염색체분배 아버지유래의성염색체소실이가능성더높음 45,X(monosomy X) 45,X/46,XX or 45,X/46,XY(increased gonadoblastoma risk) 46,X,i(X)(q10) or Xp and Xq deletion 3. 염색체의구조적이상에의한질환 i. 염색체결실 (deletion) 1 Cri-du-chat syndrome (5p-) Cat cry syndrome 34

35 비정상적인후두발달로인한고양이울음소리 85%: sporadic de novo deletion 15%: 부모중의 translocation carrier에의하여이차적으로발생하며다음출산시재발위험성이높음 Critical region: 15p15.2 and 15p Wolf-Hirschhorn syndrome(4p-) 특징적인얼굴기형, 소두증, frontal bossing, hypospadia 87%: sporadic de novo deletion 13%: 부모중의 translocation carrier에의하여이차적으로발생하며다음출산시재발위험성이높음 ii. 미세결실증후군 (Microdeletion syndrome 혹은 contiguous gene syndrome): 염색체에서한개내지두개의아주작은부분의염색대 (band) 소실에의하여발생하는여러가지질환들을통칭하여염색체미세결실증후군 (micro-deletion syndrome) 또는 contiguous gene syndrome으로분류한다. 이에속하는질환들은고정도분염법 (high resolution banding technique) 이일반화되기이전에는현미경상에서거의염색체이상을확인할수없었던질환들로서, Prader-Willi 증후군, Angelman 증후군, retinoblastoma, Miller-Dieker 증후군, Di George 증후군, WAGR 증후군등이이에속하는질환들이다. 1 CATCH22(DiGeorge syndrome, del 22q11.2) 35

36 - Cardiac anomaly, Abnormal face, Thymic aplasia/hypoplasia, Cleft palate, Hypocalcemia 2 Williams syndrome(del 7q11.23) 심기형, 요정같은얼굴 (elfin face), 사교적인성격, 지능저하혹은성상홍채 3 Prader-Willi syndrome / Angelman syndrome(del 15q ) - Prader-Willi 증후군은 15q 염색대의결실을보이는질환이다. 발생빈도는 25,000 출생중한명꼴로보고되고있으며, 전체환자의약 65% 에서특징적염색체이상이관찰된다. Prader-Willi 증후군환자들은비정상적행동이나식습관, 비만, 정신박약등으로소아정신과영역에서발견되는일이높고, 염색체의결실이매우작기때문에판독에많은경험이필요한질환이다. 최근에는 fluorescent in situ hybridizatin(fish) 기법을이용한진단법이개발되어, 진단에큰도움이되고있다. 4. 염색체전위 (Translocation) 1 Robertsonian translocation Relatively common and found in about 1 in 1000 people Only involve acrocentric chromosome : 13, 14, 15, 21, 22 2 Reciprocal translocation Occurring in around 1 in every 930 people 36

37 3 Balanced: any loss or gain of chromosome material 부모가무증상이면서 translocation carrier 일경우자녀가같은염색체이상을물려받더라도문제가되지않음 자녀가염색체이상을보이는데부모의핵형이정상일경우에는문제가될수도있음 염색체의전좌가생기는부분에중요한유전자가존재하는지여부가중요 부부가이러한염색체이상을가진경우산전검사등이권장됨 4 Unbalanced translocation Balanced reciprocal translocation 을가진배우자의경우유산이나 unbalanced translocation을가진자녀가출생할수있는위험이존재함 Robertsonian translocation 을가진배우자가있을경우유산과남성불임의위험이존재함 5. Ring, Inversion, and Insertion 1 Ring chromosome: 말단의결실에의하여염색체의양끝이붙어서생성 2 Inversion Pericentric inversion : centromere 포함 Paracentric inversion: centromere 의어느한쪽에서만 37

38 일어남 Inversion 9: normal polymorphism 3 Insertion: 어떤염색체의일부가다른염색체부위에끼어들어간형태 6. Chromosome breakage syndrome i. 염색체절단증후군은정상인보다염색체의손상이자연적으로또는여러가지영향인자에의해좀더쉽게일어나고, 이로인한여러증상을나타내는일련의질환군을통칭하는것이다. 이에속하는대부분질환들은상염색체열성 (autosomal recessive) 으로유전한다. i. 예 : Fanconi anemia, Bloom syndrome, Ataxia-Telangiectasia, Xeroderma pigmentosa ii. 염색체절단을유발하는약제인 mitomycin C, diepoxybutane 등을처리하여배양한다음, 염색체절단정도를정상인과비교하여분석. 7. 취약 X 증후군 (fragile X syndrome) i. 취약 X 증후군은염색체의획득이나결실이없이발생하는유전성질환으로조산이나경기, 발육지연, 지능저하, macroorchidism, 성격장애등의증상을갖는다. 이질환은남성은 1,200~1,500명, 여성은 2,000명의출생아당한명의빈도로발생하는드물지않은유전성질환이다. 이질환은 38

39 분자유전학적으로 familial mental retardation 1 (FMR1) 유전자의반복염기서열인 (CGG)n 의길이가증가하여발생하고, 최근에는이를직접분자유전학적방법으로검사하여진단할수있다. 여성보인자 (carrier) 의진단과산전진단이필요하다. Table III-2. 주요염색체질환 1. 주요상염색체질환 A. 염색체수의이상 1) Down 증후군 (trisomy 21) : 47, XX(XY), +21 2) Edwards 증후군 (trisomy 18) : 47, XX(XY), +18 3) Patau s 증후군 (trisomy 13) : 47, XX(XY), +13 B. 염색체의구조적이상 1) Cri-du-chat 증후군 : del(5)(p15) 2) Retinoblastoma : del(13)(q14) 3) Parder-Willi 증후군 : del(15)(q11.2q12) 4) Miller-Dieker 증후군 : del(17)(p13.3) 2. 주요성염색체질환 1) Klinefelter 증후군 : 47, XXY 2) Turner 증후군 : 45, X 3) Triple X female : 47, XXX 4) Double Y male : 47,, XYY 3. 취약 X 증후군 (Fragile X syndrome) 4. 염색체절단증후군 (Chromosome breakage syndrome) 39

40 1) Spontaneous Chromosome Breakage : Ataxia-telangiectasi, Fanconi 증후군, Bloom 증후군, Xeroderma pigmentosa 2) Induced Chromosome Aberrations Irradiation, Chemical agents, biological factors III-7. 참고문헌 1. Van Dyke DL. Cytogenetics In: MaClatchey KD, ed. Clinical Laboratory Medicine 2002 pp Rooney DE, Czepulkowski BH, editors. Human Cytogenetics: A Practical Approach. Oxford: IRL Press at Oxford University Press; ISCN (2005): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaffer LG, Tommerup N.(eds); S. Karger, Basel Heim S, Mitelman F. Cancer cytogenetics. New York; Wiley-Liss; 1995 IV. 유전검사 - 분자유전검사및다양한기법들익혀야할내용 : 분자유전검사의개요를이해한다. 임상적으로흔히이용되는분자유전검사기법들을이해한다. 40

41 염기서열분석법을이해한다. 7 염기서열변이가관찰되었을때에그임상적미를부여하기위하여활용할수있는각종 resources 들을알고이들을이용하여해석할수있다. IV-1. 개요최근유전학이급속도로발전함에따라다양한유전자의기능과질환과의관련성이밝혀지고있다. 또한, 분자유전학적기법의발전으로질환의원인유전자를분석하여돌연변이를확인하는과정이비교적간편해지고빨라지게되었다. 이처럼유전성질환, 특히멘델유전질환의원인유전자가밝혀지고이를분석하는기법이발전함에따라, 유전학실험실에서연구목적으로시행되던염기서열분석기법이임상검사실에도입, 활용되기시작하였으며, 다양한질환들의진단에대한수요가증가하고있다. 다음에서는분자유전검사의목적및의의를알아보고염기서열분석법을포함하여임상적으로흔히사용되는분자진단기법들이다. IV-2. 분자유전검사의목적과의의멘델유전질환을분자유전학적으로검사하는목적은증상이있거나질환이의심되는환자의진단 (diagnostic testing) 이나질환에이환될가능성이있는가족에대한증상전진단 (predictive testing), 보인자진단 (carrier testing), 산전진단 (prenatal testing), 착상전진단 (preimplantation testing), 그리고신생아선별검사 (newborn screening) 등이있다. 이처럼분자유전학적 41

42 검사를이용한진단법은다양한목적으로시행될수있으며, 일반적으로임상검사실에서시행되는다른검사들과같은방법으로검사를의뢰받아서시행하게된다. 그러나, 분자유전학적검사는비용이비싸고, 검사과정이비교적복잡하며생화학유전검사또는세포유전검사결과와함께해석해야하는경우가빈번하고, 특히검사결과가환자본인뿐만아니라환자가족에게도영향을미치기때문에유전검사에대한검사전상담 (pre-testing consultation 또는 counseling) 및사전동의서작성등의과정이필요하다. 또한, 검사결과에대한해석, 유전양상에따른가족들의위험도분석, 증상전진단, 보인자진단및산전진단등에대한검사후상담 (post-testing consultation 또는 counseling) 도가급적시행되어야한다. 유전검사는때로임상검사 (clinical test) 혹은연구용검사 (research 또는 investigational test) 로분류하기도한다. 임상검사는환자의진단, 예방및치료의목적으로검사비용을받고시행되며반드시정해진기간내에검사결과를보고하는검사를말하는반면, 연구용검사는질환의연구나임상검사의개발을위해시행되거나, 임상적의의가불분명한검사로서환자에게검사의결과를알려줄의무가없는검사를말한다. 올해시행된생명윤리및안전에관한법률에서 유전자검사 와 유전자연구 라는용어를사용하여이를구분하고있다. IV-3. 직접검사 (Direct Test) 와간접검사 (Indirect Test) DNA 혹은 RNA 를직접검사하는분자유전검사의경우원인유전자를직접 검사하는직접검사법 (direct testing) 과원인유전자주위의 42

43 표지자 (marker) 를이용하여질환의유전여부를판정하는간접검사법 (indirect testing) 혹은연관분석 (linkage analysis) 으로분류할수있다. 직접검사법을이용한분자유전학적진단은특정질환이의심되는환자의말초혈액등으로부터분리한 DNA 혹은 RNA를이용하여해당질환의원인유전자전체혹은일부를중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction; PCR) 등의방법으로증폭한후염기서열을분석하는과정으로진행된다. 이러한과정에서주로사용되는분자유전학적기법은염기서열분석법 (sequencing analysis) 을이용하여유전자염기서열을분석하거나염기서열변이를스캐닝하는방법, 그리고이미알려진돌연변이만을확인하는방법등이있다 (Table 2). 염기서열분석법은표준방법으로인정되고있는반면유전자전체염기서열을분석할경우비용과시간이많이들기때문에염기서열변이를스캐닝하여변이부위를빠르게탐색하는방법들도이용되고있다. 특정염기서열변이만을확인하는방법은직접염기서열분석법으로발견된변이를다시확인하거나, 이미돌연변이가발견된환자의가족들을검사하거나, 특정인종이나민족에서흔히발견되는돌연변이를선별적으로검사할때이용된다. IV-4. Polymerase chain reaction and others 1. Polymerase chain reaction i. 변성 (denaturation) Annealing Extension 2. PCR의응용기법 i. Reverse transcriptase PCR(RT-PCR) 43

44 1 RNA reverse transcriptase 효소를이용 cdna 합성 PCR 2 BCR/ABL fusion transcript 검출 ii. Nested PCR 1 일차 PCR 후에두번째 primer set로이차 PCR 시행 2 미량존재하는 mrna 검출하거나 PCR의민감도를높이기위해 3 오염의기회가높은단점 iii. PCR-RFLP 1 돌연변이를포함한부위를 PCR 증폭 2 돌연변이부위에작용하는특정제한효소처리 3 전기영동상에서 PCR 산물의절단유무관찰 4 Ex) Wilson disease 의대표적인돌연변이인 R778L 검출 iv. Allele-specific PCR or amplification refractory mutatin system(arms) 1 Point mutation 검출 v. Multiplex PCR 1 한검체에서단일반응으로여러개의대상핵산을동시에검출 2 Ex) Duchenne muscular dystrophy vi. Quantitative PCR 1 Competitor를대상핵산과함께하나의반응시험관내에서 44

45 증폭하여비교하여정량측정 vii. Real-time PCR 1 대상핵산증폭과검출과정을단일시험관내에서동시에진행 2 실시간으로확인가능 3 Post-PCR 단계가없어시간단축, 증폭산물에의한오염이없고, PCR의 log phase 초기에분석이가능하므로정량분석에용이 4 Ex) virus PCR (CMV, EBV, Parvovirus B19) viii. PCR을이용한선별기법 1 Single stranded conformational polymorphism(sscp) 2 3 단일가닥은염기서열에따라특유의입체구조를가짐 전기영동하여이동상의차이를보여돌연변이선별에 이용 4 짧은 DNA 조각만분석가능하고민감도와정확도가 낮음 ix. Heteroduplex analysis(ha) 1 하나의대립유전자에서만돌연변이를가진보인자의분석에유용 x. Denaturing gradient gel electrophoresis(dgge) 1 이중가닥의 PCR 산물 변성물질의농도가증가하는 gel 에전기영동 이중가닥이변성되면서 gel의어떤지점에 45

46 정지 2 보인자의경우정상과돌연변이염기가닥이서로다른 위치에서분리되어확인가능 IV-5. Sequencing analysis 1. 단일가닥 DNA 상에서염기서열을분석 2. DNA polymerase가상보적인 deoxynucleotides(dntp) 를결합시킴 3. 염기서열복제 4. Dideoxynucleotides(ddNTP) 를결합시키는순간마다반응이정지 5. 주형 DNA 의각 bas4e 자리에반응이정지된다양한길이의 DNA 조각생성 6. 이 DNA 조각을전기영동하여길이순서대로분리하여읽으면그것이곧합성된 DNA 의염기서열 IV-6. 염기서열분석반응 (Sequencing Reaction) 분자유전학기법중 DNA의서열을밝히는염기서열분석법은중합효소연쇄반응 (PCR) 과함께가장중요한기법중하나이다. DNA의염기서열을결정하는방법에는화학제를이용하여 DNA 내의특정염기부위를절단한후그조각을분석하는 Maxam과 Gilbert 방법과, Sanger가개발한효소반응을이용한방법이있다. Sanger 방법은중합효소연쇄반응과유사한방법으로, dideoxyribonucleotides를이용한 chain termination 원리를이용하여분석하는방법이다. Sanger 방법은 46

47 Maxam-Gilbert 방법에비해자동화가가능한장점덕분에최근에는특수한목적이아닌경우 Sanger의방법이주로쓰이고있다. Sanger의효소반응을이용한 chain termination 방법의원리는다음과같다. 중합효소연쇄반응에서 DNA 중합효소가주형 DNA에상보적인 DNA를합성할때사용하는기질은 dntp (datp + dttp + dgtp + dctp) 이다. dntp의 3 위치탄소에는 -OH기가붙어있는데, 이 -OH기의산소원자에다음 dntp가연결되어이어지게된다 (Fig. 1). 그런데, 만약 3 위치에산소원자가없는 dideoxy NTP (ddntp) 를넣어주면다음 dntp를붙일수없으므로 DNA 합성이정지 (termination) 된다. 이원리를이용한것이 dideoxy chain termination 방법이다. 즉, 기질로 dntp (datp + dttp + dgtp + dctp) 외에 ddntp (ddatp + ddttp + ddgtp + ddctp) 를조금섞어사용하면 dntp가들어갈자리들중일부 ( 보통 40번에한번 ) 에 ddntp가들어가게되고반응이정지된다. 따라서, 주형 DNA의각 base 자리에서반응이정지된다양한길이의 DNA 조각들이만들어지게되며, 이 DNA 조각들을전기영동하여길이순서대로분리한후, 순서대로읽으면그것이곧합성된 DNA의염기서열이다 (Fig. 2). IV-7. 염기서열데이터분석 (Sequencing Data Analysis) 과거에는방사성동위원소가포함된 ddntp를이용하여염기서열분석반응을시행한후전기영동을시행하고다시 X-ray 필름에노출시켜 A, T, G, C 각 lane을하나씩읽어감으로써염기서열데이터를얻을수있었다. 그러나, 최근에는형광색소를이용한 cycle sequencing 반응을시행한후 47

48 레이저신호감지장치가장착된자동염기서열분석기 (automatic sequencer) 에서염기서열데이터를얻는방법이보편화되면서많은염기서열데이터를짧은시간에얻을수있게되었다 (Fig. 3). 특히모세관전기영동 (capillary electrophoresis) 기법을이용한자동염기서열분석기의개발로인해모세관수에따라많게는 96개의검체에대한염기서열데이터를한시간정도면얻을수있을정도로고속대용량염기서열분석이가능해졌다. 또한, 수작업에의존하던과거와는달리대부분의검사과정이표준화, 자동화되면서이제는염기서열분석을위한검사과정보다는검사를통해얻은염기서열데이터를분석하는일이더중요해졌다. 자동염기서열분석기를이용하여얻은염기서열데이터를분석하기위해서는표준염기서열자료가필수적이다. 표준염기서열은미국 NIH와 NCBI에서구축한 GenBank 또는다양한데이터베이스들 ( 이나영국 Wellcome Trust Sanger Institue와 EBI에서구축한 Ensembl 데이터베이스 ( 등에서유전자명을키워드로하여찾을수있다. 이렇게확보한표준염기서열자료와분석하고자하는염기서열데이터를비교하여표준서열과다른변이가있는지를확인하는작업이염기서열분석과정의핵심이라고할수있는데, 과거에는전기영동결과그림 (electrophoerogram) 을인쇄한후표준서열과하나씩대조하는수작업에의존하였으나, 최근에는 SeqScape (Applied Biosystems), Sequencher (Gene Codes), Mutation Surveyor (Softgenetics) 등자동화된소프트웨어를이용함으로써분석효율과정확성을높일수있다. 48

49 이러한염기서열분석과정에서표준서열과의다른변이가있는지를 발견되면, 먼저변이를 Human Genome Variation Society (HGVS; 의권고기준에맞게정확하게표기한후 질환과의 관련성을 확인한다. 일반적으로 특정 유전자에서 변이가 발견되었을 때 질환과 관련된 변이 ( 돌연변이 ) 인지 알아보기 위해서는 Human Gene Mutation Database (HGMD; 또는 Locus-Specific Mutation Database (LSMD; 를 검색하여 기존에 알려진 돌연변이인지를 확인하는 한편, single nucleotide polymorphism (SNP) database (dbsnp; 또는 genewindow ( 등의 웹사이트에서 단일염기다형성 (SNP) 여부를확인한다. 만약 HGMD에이미등재되어있고, dbsnp에는등재되어있지않은변이라면돌연변이일가능성이매우높고, 반대로 HGMD에는없지만 dbsnp에등재되어있다면질환과의관련성은 매우낮다고할수있다. IV-8. 임상적의의가불분명한변이의해석기존에알려진염기서열변이만을검사하는분자유전학적기법과달리염기서열분석과정에서는한번의검사에서적어도 bp 이상의서열에대한정보를얻을수있다. 이러한염기서열분석법의특성과함께특정질환의원인유전자에서질환의원인이되는돌연변이가다수 49

50 발견되는현상 (allelic heterogeneity) 으로인해임상적으로의의가불분명한변이가발견될경우그의미를해석하는데많은주의가필요하다. HGVS에서는기존에보고되지않은염기서열변이가발견된경우반복검사를통해검사과정의오류를배제하고, 가족검사 (family study) 를시행하여질환의유전양상과일치하는지확인하며, 50명의정상대조군에서동일한변이가관찰되는지파악하도록권장하고있다. 그러나, 이런과정을거쳤음에도불구하고여전히임상적의의가불분명한경우가있으며, 특히염기서열변이에의해아미노산서열에변이가초래되는과오돌연변이 (missense mutation) 에서이러한경우가많다. 즉, 변이의결과로서정상적인단백질의생성되지않는넌센스돌연변이 (nonsense mutation) 나삽입혹은결실돌연변이 (insertion/deletion mutation) 의경우질환과관련되었을것으로추정하는데무리가없으나, 단백질을구성하는많은아미노산중하나가다른아미노산으로치환된경우이러한변이가질환과관련되었을가능성을추정하는것은매우어렵다. 이러한경우정상단백질과변이단백질의기능을평가하는과정이필요하지만, 모든변이에대해이런실험을시행하는것은현실적으로불가능하다. 다른방법으로동일한단백질의서열을여러가지다른종에서비교하여발생학적으로보존된아미노산서열임을확인하는방법이사용되고있으나그유용성은제한적이다. 최근에는생물정보학 (bioinformatics) 기법을이용하여아미노산서열변화가단백질의기능에미치는영향을추정하는방법들이소개되고있으나, 아직까지임상적으로활용하기에는무리가있다. 50

51 IV-9. Southern blot analysis 1. Southern blot analysis i. 제한효소에의해절단되는 DNA 의구조분석 ii. DNA 추출 제한효소처리하여 DNA 절단 전기영동하여크기순으로배열 gel 속의 DNA 조각들을나일론막이나 nitrocellulose 막으로옮기는 blot 과정 probe를 DNA 에교잡 필름에감광 (autoradiography) 시키거나발색반응을이용하여판독 iii. Restriction fragment length polymorphism(rflp) iv. 염기서열의차이인다양성으로인해제한효소로처리한제한조각들의길이가다양 v. Southern blot 방법이진단에이용되는질환들예 : - Trinucleotide repeat disease - fragile X syndrome - myotonic dystrophy IV-10. 국내현황우리나라에서도이미많은임상검사실에서다양한유전성질환의분자유전학적진단을시행하고있으며, 한예로건강보험요양급여행위로인정받은대사성유전질환에대한검사는윌슨병, 혈색소침착증 (hemochromatosis), 당원축적병제 1a형 (glycogen storage disease type Ia), 갈락토즈혈증 (galactosemia), 요소회로장애 (urea cycle 51

52 disorders), 레쉬-니한증후군 (Lesch-Nyhan syndrome), 선천성부신과형성증 (congenital adrenal hyperplasia), 가족성고콜레스테롤혈증 (familial hypercholesterolemia), 유전성당뇨 (maturityonset diabetes of the young 또는 MODY 3), 크리글러-나자증후군 (Crigler-Najjar syndrome) 등 10가지이상이있다. 최근에는각종암, 신경계질환, 혈액및응고질환, 발달장애질환등다양한질환군에대하여염기서열분석법을이용한분자진단검사가도입, 활용되고있다. IV-11. 참고문헌 1. Andersen PS, Jespersgaard C, Vuust J, Christiansen M, Larsen LA. Capillary electrophoresis-based single strand DNA conformation analysis in high-throughput mutation screening. Hum Mutat 2003;21(5): Ganguly A. An update on conformation sensitive gel electrophoresis. Hum Mutat 2002;19(4): In: GeneTests: Medical Genetics Information Resource (database online). Educational Materials: What is Genetic Testing? Copyright, University of Wasington, Seattle (Accessed Nov 17, 2005, at 4. Kristensen VN, Kelefiotis D, Kristensen T, Borresen-Dale AL. High-throughput methods for detection of genetic variation. Biotechniques 2001;30(2):

53 5. Metzker ML. Emerging technologies in DNA sequencing. 6. Ng PC, Henikoff S. Predicting deleterious amino acid substitutions. Genome Res 2001;11(5): Strom CM. Mutation detection, interpretation, and applications in the clinical laboratory setting. Mutat Res 2005;573(1-2): Sunyaev S, Ramensky V, Koch I, Lathe W, 3rd, Kondrashov AS, Bork P. Prediction of deleterious human alleles. Hum Mol Genet 2001;10(6): Xiao W, Oefner PJ. Denaturing high-performance liquid chromatography: A review. Hum Mutat 2001;17(6):

54 Table IV-1. 삼성서울병원진단검사의학과에서시행중인분자검사항목들 Autosomal-dominant Neurological disorders Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) Hereditary neuropathy with liability to pressure palsies (HNPP) Myotonic dystrophy 1 (DM1) Huntington disease Spinocerebellar ataxia 1, 2, 3, 6, 7, 8 Dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA) Neurofibromatosis 1, 2 Hereditary spastic paraplegia type 4 and 3A CADASIL (Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy) Torsion dystonia Musculoskeletal system disorders Marfan syndrome Achondroplasia Hereditary multiple exostoses type 1, 2 Inherited metabolic disorders Maturity-Onset Diabetes of the Young Type III (MODY) Glucocorticoid-remidable aldosteronism Familial hypercholesterolemia Neuro-developmental disorders Noonan syndrome Hearing impairment disorders Nonsyndromic hearing loss and deafness, DFNA3 (GJB2) Malignant disorders Hereditary breast/ovarian cancer (BRCA1/BRCA2) Lynch syndrome (Hereditary non-polyposis colon cancer) Familial adenomatous polyposis Von Hippel-Lindau syndrome Multiple endocrine neoplasia, type 2 (MEN2) Li-Fraumeni syndrome 54

55 Autosomal-recessive Inherited metabolic disorders Wilson disease Gaucher disease Glycogen storage diseases Citrullinemia Neurological disorders Spinal muscular atrophy Juvenile Parkinsonism (PARK2) Episodic ataxia 2 Neuromuscular disorders Distal myopathy with rimmed vacuoles (Nonaka myopathy) Miyoshi myopathy Hearing impairment disorders Pendred syndrome Miscellaneous Cystic fibrosis X-linked Inherited metabolic disorders Hunter syndrome Lesch-Nyhan syndrome Ornithin transcarbamylase deficiency (OTC) Neurological disorders Fragile X syndrome Fragile XE syndrome Kennedy disease (Spinal and bulbar muscular atrophy) Neuromuscular disorders Duchenne muscular dystrophy Mitochondrial inheritance Neurological disorders Leber hereditary optic neuropathy (LHON) MELAS (Myopathy, Mitochondrial-Encephalopathy-Lactic Acidosis-Stroke) MERRF (Myoclonic Epilepsy Associated with Ragged-Red Fibers) Miscellaneous Neuro-develomental disorders Prader-Willi syndrome Angelman syndrome Rett syndrome 55

56 Table IV-2. 돌연변이확인을위한다양한분자유전학적검사기법 Category Direct sequencing Methods Entire coding region Selected exons Mutation scanning Single-strand conformation polymorphism (SSCP) Targeted analysis mutation Denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC) Restriction fragment length polymorphism (RFLP) Amplification refractory mutation system (ARMS) Minisequencing (e.g. SNaPshot, MALDI-TOF MS) 56

57 Figure IV-1. Structure of deoxyribonucleotide (dntp) and dideoxyribonucleotide (ddntp) 57

58 Figure IV-2. Illustration of sequencing and gel electrophoresis 58

59 Figure IV-3. Automated DNA sequencing using fluorescent dye-labeled ddntp. (A) Principles of automated DNA sequencing. (B) Example of DNA sequence output. ======================================================== V. 분자유전검사 생화학유전익혀야할내용 : 유전성대사질환에대한전반적개념및발병기전에대해이해한다. 유전성대사질환이의심되는환자들에대한접근방법및진단과정에이해한다. 59

60 V-1. 개요유전성대사질환또는선천성대사질환은, 대사과정의유전적결함으로인해체내비정상적으로대사산물이축적됨으로써뇌를비롯한장기및조직에손상을가져오는질환이다. 이질환군에는수백가지종류의질환들이속하며각개별질환의빈도는낮지만전체적으로보면상당히높은빈도를보인다. 침범되는장기나손상정도에따라임상상은매우다양하게나타날수있다. 조기진단및치료하면비가역적손상을예방할수있는질환들도있으며, 정확한진단은적절한치료, 예방, 산전진단등을위해매우중요하다. 진단을위해서는각종대사산물및조직을이용한유전생화학검사나유전자분석등이이용된다. 치료는식이요법및약물요법으로독성대사산물의축적을막고, 필요한성분의결핍을보충하여증상발현및장애를최소화하는것이기본이며, 이식이나효소보충요법을적용하는경우도있으며유전자치료에대한관심도증가하고있다. V-2. 기본적개념효소는지속적인체내조직의재생성및분해과정에관여하는모든화학반응을포함한대사과정에있어서매우중요한역할을한다. 즉, 대사과정에서촉매제로작용하여한가지성분을다른성분으로전환하거나에너지원으로부터반응에필요한적절한에너지를얻어낼수있도록한다. 해당유전자에돌연변이가발생할경우, 효소활성도에영향을미치게되는데, 이는필요한단백효소의생성에장애가생기거나혹은돌연변이단백의분해가비정상적으로과다하게일어남으로써, 또는 60

61 양적으로는문제가없더라도효소의특정작용부위에결함을가져옴으로써초래된다. 이외대사산물들이세포내외막을통과하는데관여하는운반단백의양이나기능에문제가생기는경우도있다. 그러나, 각돌연변이가유전자산물에미치는영향은매우다양할수있다. 즉, 전혀단백질생성이안되어심한질환을초래하는돌연변이가있는가하면, 전혀기능적인영향을미치지않는것들도있어서, 유전형과질환표현형과의상관성은매우복잡다양한형태로나타날수있다. 또한질환의표현형은환자마다, 심지어는동일가족내에서도매우다양하게나타날수있는데이는단지질환원인이되는돌연변이이외에도다른유전자와의상호작용, 환경적요인에의한것으로생각된다. 대부분의유전성대사질환은상염색체열성유전양식을따르는데, Hunter disease (Mucopolysaccharidosis type II) 나 Ornithine transcarbamoylase (OTC) deficiency와같은일부의질환은 X염색체열성유전양식을따른다. 유전성대사질환에있어서병인론적및진단적으로중요한여러가지유형의결함에대해살펴보면다음과같다 (Figure V-1). - Accumulation of substrate - Accumulation of a normally minor metabolite - Deficiency of product - Secondary phenomena V-3. 임상적소견 61

62 유전성대사질환은매우다양한임상양상으로나타난다. 심한산혈증이나간기능장애, 또는발달지연이나경련발작을주요증상으로내원하는경우도있다. 동일질환이라도발현양상이나발병시기가다르며, 동일환자에서도질병상태나검사시기에따라관찰되는대사이상의양상이나정도는다를수있다. 페닐케톤뇨증을비롯해신생아를대상으로시행한선별검사를통해, 또는가족력이있는경우특정질환에대한검사과정을통해증상발현전에유전성대사질환을발견하는경우도있으나, 이외아래와같은임상적소견을보이는환자에서유전성대사질환의가능성을의심해볼수있다. - Acute symptoms in the neonatal period - Later-onset acute and recurrent attacks fo disorders, such as coma, ataxia, vomiting, or acidosis - Chronic and progressive general symptoms, which can be mainly digestive, neurological, or muscular - Specific and permanent organ symptoms suggestive of an inborn error of metabolism such as cardiomyopathy, hepatomegaly, lens dislocation, etc. 그러나, 유전성대사질환과비슷한임상양상을보일수있는다음의질환들에대하여반드시감별하여정확한진단및치료가이루어지도록해야한다. - Infections: hepatitis, infectious mononucleosis, enterovirus infection, congenital CMV infection, postinfectious 62

63 encephalopathy - Intoxications: CNS depressants, antihistaminics, antivonvulsants, ethanol, methanol, ethylene glycol, salicylism, valproic acid intoxication, ACTH reaction - Nutritional deficiencies : vitamin B12 deficiency, thiamine deficiency - Hematopoietic disorders : hemoglobinopathies, lymphoma, malignant histiocytosis, familial erythrophagocytic lymphohistiocytosis V-4. 유전성대사질환의분류및종류 유전성대사질환의분류방법은여러가지가있으나그병인론에따라다음과같이크게 3가지군으로분류할수있다. 1. 1군 : Disorders involving complex molecules 복합분자물의합성또는이화과정의장애로인해생기는질환들이다. 임상증상은영구적이고, 점진적으로진행하며식이섭취와무관하다. 예로 lysosomal storage disease, peroxisomal disorders, disorders of intracellular trafficking and processing, inborn errors of cholesterol synthesis 등이있다. 2. 2군 : Disorders that give rise to intoxication 문제가되는대사과정의전단계물질이측적됨으로인해급성, 또는 63

64 점진적인독성증상이발현되는질환들이다. 예로 aminoacidopathies, organic academia, congenital urea cycle defect, sugar intolerance 등이있다. 임상증상은간헐적으로나타날수도있고발현이늦을수도있다. 진단에있어혈중및요중의아미노산분석, 유기산분석이중요하다. 치료에는제한식이, 교환수혈, 투석등이이용된다. 3. 3군 : Disorders involving energy metabolism 간, 근육, 뇌에서의장애때문에생긴에너지생성또는이용의결함이증상발현과관련되는질환이다. Glycogenosis, gluconeogenesis defects, congenital lactic academia, fatty-acid oxidation defects, Kerb s cycle and mitochondrial respiratorychain disorder 등이이에포함된다. 임상적증상은성장장애, 저혈당증, 고락트산혈증, 심한전반적근력저하, 근병증, 심근병, 순환장애, 신생아돌연사망증후군, 기형등으로나타난다. V-5. 대표적인유전성대사질환들의종류 1. Disorders of carbohydrate metabolism i. Glycogen storage disease ii. Disorders of galactose metabolism iii. Disorders of fructose metabolism iv. Persistent hyperinsulinemic hypoglycemia 2. Disorders of mitochondrial energy metabolism 64

65 i. Disorders of pyruvate metabolism ii. Disorders of fatty acid oxidation iii. Disorders of kettogenesis and ketolysis iv. Disorders of respiratory chain 3. Disorders of amino acid metabolism and transport i. Hyperphenylalaninemia ii. Disorders of tyrosine metabolism iii. Branched-chain organic acidurias iv. Disorders of urea cycle v. Disorders of sulfur amino acid metabolism vi. Disorders of ornithine and creatine metabolism vii. Disorders of lysine catabolism viii. Nonketotic hyperglycinemia ix. Disorders of proline and serine metabolism x. Transport defects of amino acids at the cell membranes : Cystinuria, Hartnup disease, Lysiuric protein intolerance 4. Vitamin-responsive disorders 5. Neurotransmitter and small peptide disorders 6. Disorders of lipid and bile acid metablism 7. Disorders of nucleic acid and heme metabolism i. Disorders of purine and pyrimidine metabolism: Lesch-Nyhan disease 65

66 ii. Porphyrias 8. Disorders of metal transport 9. Organelle-related disorders : lysosomes, peroxisomes, Golgi- and pre-golgi systems i. Disorders of sphingolipid metabolism ii. Mucopolysaccharidoses & oligosaccharidoses iii. Peroxisomal disorders iv. Congenital defects of glycosylation v. Cystinosis vi. Primary hyperoxalurias vii. Leukotrien-C4-synthesis deficiency V-6. 진단과정및검사들 유전성대사이상질환은혈액이나소변중특징적인대사산물의축적을특징으로한다. 따라서다양한생체시료를대상으로비정상적인대사산물의축적또는정상성분의결핍등을측정하기위해여러가지유전생화학적인진단기법이이용되고있다. 또한확진을위해서해당유전자에대한분석이나효소활성도의측정이이용되는경우도있다. 질환의병인기전과특징에따라진단에중요한분석대상을결정하고최적의분석방법을선택하는것, 적절한검체의확보및검사의신뢰성유지, 그리고여러가지검사결과및환자임상정보를종합적으로해석하고 66

67 정확한진단및감별진단을하는것은환자의진단과치료, 예후와연관된 중요한과정일것이다. 유전성대사이상질환이의심되는환자가있을경우 work-up 을위해 필요한검체와검사들은 Table V-1 과같으며, 유전성대사이상질환의 진단에이용되는대표적인검사들에대하여간략히살펴보면아래와같다. 1. 일반적검사검사실에서일반적으로수행하는검사중에서동맥혈가스분석, 전해질, 혈당요산, 크레아티닌, 간기능검사, 일반혈액검사, 갑상선호르몬등의내분비호르몬검사, 요검사등이대사이상질환의가능성과추가검사의결정을위해기본이되는검사들이다. 2. Ammonia, lactate, pyruvate, ketone body 혈중 ammonia, lactate, pyruvate, ketone body 분획측정, 그리고 lactate/pyruvate ratio(l/p ratio) 나 ketone body ratio (3- hydroxybutyrate/acetoacetate) 는대사이상질환의진단및감별진단에유용한정보를제공할수있다. 고암모니아혈증의감별진단을위한접근방법은 Fig. 2 과같다. 대부분의검사실에서혈중 ammonia 측정은자동화학분석기를이용한응급검사로서제공하고있다. 혈중 ammonia 측정에있어가장문제가되는것은채혈및검체취급부주의로인한검사전과정의오류이다. 즉, 정맥혈을토니켓없이바로채혈하여튜브를즉시얼음에넣어운반해서 15 분이내혈장분리및 67

68 검사할수있도록해야만정확한결과를얻을수있다. 토니켓사용이나검체운반지연시 lactate 수치도상승하며, pyruvate 역시매우불안정하여검체취급이검사결과에매우결정적인영향을미친다. 요시험지봉에의한 ketone 검사는 acetoacetate 만을감지하며반정량적인결과를얻을수있다. 3-hydroxybutyrate 와 acetoacetat 를동시에정확히측정하여비를산출하기위해서는가스크로마토그래피-질량분석기 (gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS) 검사가이용된다. Hyperlacticacidemia 는 organic acidemia, congenital hyperammonemia, fatty acid oxidation defect 와같은대사이상질환에서 2 차적으로발생하는 경우도있다 (Table V-2). 1 차성 hyperlacacidemia 중에서 pyruvate carboxylase deficiency 의경우는 L/P ratio 가증가하고 ketone body ratio 는정상또는감소하는반면, pyruvate dehydrogenase complex deficiency 에서는 L/P ratio 가정상이고, mitochondrial respiratory chain defect 시는 L/P ratio 및 ketone body ratio 상승을관찰할수있다. 3. 아미노산및유기산분석 아미노산 분석에 있어서는 비특이적인 화학반응이나 박층크로마토그래피 (Thin layer chromatography, TLC) 의이용도가능하나 민감도및특이도가떨어지며, 최근에는대개이온교환크로마토그래피나 고성능액체크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography, HPLC) 를이용한정량분석이이루어지고있다. 68

69 혈중및요중아미노산의농도는심한간장애, 신세뇨관장애, 비타민결핍, 영양실조, 종양, 감염등으로인해 2 차적인변화를보이기도한다. 또한유전성대사이상질환으로인해전신적인조직및장기의장애가발생하기도하며, 유기산이나지방산, 탄수화물대사이상질환에서아미노산대사의장애가 2 차적으로뒤따르는경우도있다. 따라서아미노산대사이상질환때문인지다른질환때문인지의감별이어려운경우도많으므로결과해석에주의를요하며추가적인검사가요구되기도한다. 각종아미노산대사이상질환의특징적인아미노산증감소견과임상양상에대한이해는결과해석에물론필수적이다 (Table V-3). 운반과정의이상인경우아미노산의재흡수결함때문에혈중아미노산보다는요중아미노산의변화가특징적일수있으므로, 아미노산분석은혈액과소변검체를모두의뢰하는것이바람직하다. 구조나대사경로상관련이있는 2 가지이상의아미노산농도가동시에변화를보일때는 1 차적인유전성아미노산대사이상질환의가능성이높다. 유기산분석에있어서는요검체가가장널리이용되며유용한정보를제공할수있다. 요검체는분석전까지냉동보관하면유기산성분에큰변화가없다. 유기산분석은다양한아미노산및유기산대사이상질환의진단에매우유용하지만, 임상적으로증상이심하지않고식이조절이잘되고있는환자에서는유기산성분의증가소견이뚜렷하지않을수있다. 또한 1 회의검사로유기산대사이상의가능성을배제하기에충분하지않을 69

70 수도있으므로임상상을고려하여필요하다면검사를다른시기의다른검체로반복해볼필요가있다. 아미노산분석과마찬가지로연령이나복용약물, 식이요인, 세균감염등이유기산분석결과에도큰영향을미칠수있다. 질환별로진단에중요한유기산성분이있기는하지만 (Table V-4), 결과해석에있어서비특이적또는 2 차적인증감이가능한점과, 한가지성분의증가보다는전체적인유기산의증감양상과성분간의상대적인비율의중요성도고려하여야한다. 4. 탠덤질량분석기 (tandem mass spectrometry, MS/MS) 를이용한검사 과거페닐케톤뇨증이나갑상선기능저하증등의 2-5 종에국한되던신생아 선별검사대신, 40 여종의대사이상질환을포함하는광범위신생아 선별검사가등장하였다 (Table V-5). 이는한검체에서수십가지성분을수분이내동시에정확히측정할수있는 MS/MS 의등장에힘입은것이며, 과거에는증상발현전의조기진단이불가능하였던각종아미노산, 유기산, 지방산대사이상질환의조기진단및치료, 예방이가능해졌다. 최근에는신생아외에도대사이상질환이의심되는경우나대사이상질환의가능성을배제하기위한경우 MS/MS 에의한선별검사결과를우선적으로확인하고나서혈중또는요중아미노산분석, 유기산분석등을의뢰하는경향이다. 점차 MS/MS 의응용분야가확대되고있어앞으로는유전성대사이상질환의진단에더큰변화와발전이기대된다. 예로 steroid profile 분석을통한스테로이드대사질환의진단, monosaccharide 및 disaccharide 측정을 70

71 통한뮤코다당증진단, 리소좀축적질환진단을위해효소작용에의한기질의화학적변화를 MS/MS 로측정하는방법도소개된바있고, 10 가지이상의대사산물을동시해측정하여 purine 및 pyrimidine 대사질환을진단하는방법도나와있다. 5. 기타유전생화학적검사 GC-MS 에의한 very long chain fatty acid 의측정은 Peroxisomal disorder 의진단에필수적인데각각의농도뿐아니라 C24/C22, C26/C22 molar ratio 가중요하다. 이외 phytanic acid, pristanic acid, bile acid 측정도도움이된다. 요중 glucose 뿐아니라 fructose, galactose, lactose 와같은환원물질은체내영양과대사에중요한성분으로서 TLC 에의해구분할수있다. 요중 galactose 는 classic galactosemia, galactokinase deficiency 등에서, fructose 는 hereditary fructose intolerance, hereditary tyrosinemia 등에서, lactose 는 lactose intolerance 에서관찰될수있다. 페닐케톤뇨증의선별검사로도이용되는 Ferric chloride test 는소변을이용하여발색반응을관찰하므로써 oxo-acid 를검출하는것이다. Nitroprusside test 는요중 sulfur containing acid 가있을경우복합체가형성되어보라색을띄는지관찰하는것으로 cystinuria, homocystinuria 의선별에이용될수있다. 뮤코다당증 (Table V-6) 의선별에는무작위소변을이용한정성 spot test 과정량검사가이용되는데위양성및위음성도가능하다. 선별검사상 71

72 양성인경우는 TLC 를이용한검사로진행하면 dermatan sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, chondroitin sulfate 를구분하여관찰할수있다. 이에따라잠정적으로아형을구분한다음해당결핍효소에대한분석을시행한다. 이외당원축적병 (Table V-7) 진단을위해서는혈액및조직검체에서의글리코겐농도를측정하면진단및아형구분에도움이된다. V-7. 치료 1. 유전성대사질환의일반적치료원칙은다음과같다. i. Supportive measures ii. Control of accumulation of substances 1 restricted dietary intake : PKU, galactosemia, propionic academia 2 control of endogenous production of substrate : NTBC treatment of hepatorenal tyrosinemia, Treatment of glycosphingolipid storage diseases by substrate depletion 3 acceleration of removal of substrate : dialysis, treatment of urea cycle enzyme defect with sodium benzoate and sodium phenylbutyrate, treatment of homocystinuria with betaine, treatment of organic acidopathies with carnitine or glycine iii. Replacement of product 72

73 1 Reaction product replacement: thyroid treatment of congenital goitrous hypothyroidism, treatment of hyperammonemia-hyperornithinemia-homocitullinemia syndrome with ornithine, treatment of argininosuccinic aciduria with argienine 2 Gene product replacement : enzyme replacement therapy of Gaucher disease iv. Cofactor replacement therapy 1 Pyridoxine-responsive homocystinuria 2 Vitamin B12-responsive methylmalonic academia 3 Biotin-responsive multiple carboxylase deficiency v. Mitochondrial electron transport defects : dietary manipulation, vitamin supplements, drugs or physical therapy - disappointing vi. Gene transfer therapy 1 Organ transplantation 2 Single gene transfer therapy V-8. 참고문헌 1. Blau N, Duran M, Blaskovics ME, Gibson KM. Physician's guide to the laboratory diagnosis fo metabolic diseases. 2nd ed. Springer- Verlag Berlin Heidelberg

74 2. Fernandes J, Saudubray JM, van den Berghe G. Inborn metabolic diseases. 3rd ed. Springer-Verlag Berlin Heidelberg Clarke JT. A clinical guide to inherited metabolic diseases. 2nd ed. Cambridge University Press Table V-1. Emergency protocol for investigations. 74

75 Table V-2. Clinical classification of lactic acidosis 75

76 Table V-3. Disorders associated with abnormal amino acid levels Table V-4. Key and problem organic acids requiring special attention 76

77 Table V-5. Inherited metabolic disorders detectable in the newborn period by MS/MS screening 77

78 Table V-6. Mucopolysaccharidoses 78

79 Table V-7. Glycogen storage diseases 79

80 ======================================================== VI. 유전상담의실제 ( 부제 : Genetic Counseling and Resources for Patients and Family) 익혀야할내용 : 유전상담의정의를이해한다. 유전상담의목적을이해한다. 유전상담의기술을이해한다. 유전상담의과정을이해한다. VI-1. 유전상담의정의 1. Harper - 유전성이라고예상되어지는질환의위험을가진환자와가족 ( 친척 ) 들에게질환의발생과유전가능성, 예방, 개선방법에대해조언하는일련의과정 i. 유전상담을하는사람은특정결과에대해성공이나실패냐에대한판단을해서는안된다. ii. 상담자는가족들의결정이어떤것이냐에상관없이가족들을지지해주어야한다. 2. Epstein et al. (American Society of Human Genetics 1975) - 가족내발생하는유전질환의발생, 발생위험도등과관련한문제들을다루는의사소통과정 (Communication process which deals with the human problems associated with occurrence, or risk of 80

81 occurrence, of a genetic disorder in a family ). i. 상담자는질환자체의진단, 경과, 가능한치료등의의학적사실들에대한이해를가져야한다 ii. 그질환의유전방식과특정친족에서의재발위험도에대한평가를해야한다. iii. 재발위험에대한대안을이해하여야한다. iv. 가족에서의위험도와가족이추구하는목표, 가족내에서의윤리적종교적기준에근거하여일련의행동들을선택하여야한다. v. 이환된가족들에서의질환에대한최상의가능한조정을해주고그질환에대한재발위험도에대해서도최상의가능한조정을해주어야한다. 3. Kelly - 질환의위험을가지는개개인들에게유전질환의특징, 유전질환의유전양상, 치료와가족계획에대해그들에게열려진선택권들에대해이해하도록하고도와주고자하는일련의교육과정. VI-2. 유전상담의목적 : 개인과가족을돕는것 1. 유전성향에대한지식을이해하여야한다. 2. 유전양상과재발위험도를평가할수있어야한다. 3. 가능한대안들을이해하여야한다. 81

82 4. 개인적으로나가족환경에합당한결정을하여야한다. 5. 질환과위험에대해최상의가능한조정을하여야한다. VI-3. 유전상담의목적을달성하기위한방법 1. 정확한진단과가족력 i. 명확한진단을어렵게하는흔한요인들 1 관련진단법들을이용할수없었던시기에생존해있었을경우질환에이환되있더라도이환여부를확인할수없다. 2 질환에이환되있더라도질환진단에필수적인평가를하지않고사망한경우또는사망하더라도부검등을통해규명되지않은경우. 3 이환되있을거라고예상은되지만확정진단을받지않은경우. 4 진단이잘못된경우. ii. 광범위하고정확한진단정보 1 가능한질환에이환된구성원은그사람이이미모든진단에대한평가를받았다고하더라도직접볼수있게약속을잡고, 가능하다면이환지있지않은가족원들도직접볼수있게약속을잡는다. 2 경미하게질환에이환된경우나조기에발생한질환을제외하기위해질환발생의위험이있는무증상구성원은항상검사하도록한다. 82

83 3 가족들에게처음방문에서상담자의질문에대한답을모두할수없음을주지시키고, 이환된가족구성원에대한특히같은집에거주하지않는구성원에대한가능한많은정보를가져오도록부탁한다. 4 사망한가족구성원에대한정보를알기위해연로하거나먼친척을인터뷰하기위한준비를해야한다. 이럴경우가정방문이유용하다. 5 상담에있어서다음약속을정할때기록과정보를얻을수있도록충분한시간여유를두고잡는다. 6 방사선학적소견, 생화학적결과, 염색체결과등과같은여러가지특수검사에대한기록들을조사하고보관한다. 2. 질환의상태와유전양상, 가능한대안들에대해서적절하게시각적정보나문서화된정보, 설명들을제공한다. 3. 질문을유도하여정보에대한감정적인영향들에대한의논을활성화시킬뿐아니라이해할수있도록한다. open ended questions 4. 법적으로행해지는서비스나그렇지않은여러가지서비스들에대한정보를제공하고그러한기관에의뢰한다. VI-4. 유전상담의과정 1. 정보의수집과평가 i. 환자와가족에대한조사 83

84 1 의뢰사유 2 유전학에대한이해 3 의심되는질환 4 질환상태와위험에대한인식 5 질환원인에대한신념 6 질환이주는 burden의인식 ii. 환자의출생력, 과거 medical history와현재상태를기록한다. iii. 표준기호를사용한가계도로부터 directed family history 를 얻는다. 1 일촌과이촌까지는기본으로하고가능하다면더먼친척까지의가계도를작성 2 현재임신상태 3 윤리적배경 4 동성동본의여부 iv. 추가적인의학적자료를수집하고검토한다. ( 환자와이환된가족 구성원에대한진단검사결과 ) v. 가족의사회적이력과교육정도, 고용상태와사회적기능정도 들을검토한다. vi. 대상가족의정신 / 사회적인지지기반을평가 ( 단체, 종교, 가족 ) vii. 문제가될수있는윤리적쟁점들을확인한다. viii. 환자의 다른 가족 구성원에 대한 physical examination을 시행한다. 84

85 2. 검토 : 의학적혹은가족병력, 신체검사, 및여러가지검사결과의해석 i. 관련과나관련참고기관에문의 ii. 환자의과거력과알려진진단명에대한검사소견들을비교 iii. Diagnostic impression에대한논의 1 정확한진단 2 감별진단 3 진단이불분명할때 3. 의사소통 : 상태에대한정보를공유한다. i. 대상이되는질환에대한세부사항검토 1 질환의예상경과 2 환자의치료방침및방향성 3 기저유전질환 ( 유전양상 ) ii. 가족구성원의위험도를일반인구의위험도와비교하여기술해 준다. iii. 추후재생산 ( 아이를가지는데 ) 에대한논의 1 임신과관련하여산전검사 2 산전검사없이임신 3 임신을하지않음 4 입양 85

86 5 난자혹은정자기증에의한임신 6 착상전유전진단 (Preimplantation genetic diagnosis) 후의임신 4. 지지 : 가족들의대처를돕는다. i. 상담자가제공한정보들에대한가족구성원들의감정적인반응들을인식하고논의한다. ii. 가족들로부터포괄적인병력을청취하며처한상황이가족원들에게어떤의미를가지는지, 어떤영향을미칠지등을살핀다. iii. 정보를다른가족구성원특히위험을가질수도있는사람들에게의사소통할때의전략을개발한다. iv. 가족구성원들을지지하기위한 written materials과 referrals을제공한다. 5. 추적관찰 : 계속적인의사소통을유지한다. i. 추적관찰을위한진단검사또는치료약속을정하거나 healthcare provider에게의뢰하는데대한필요성을의사소통한다. ii. 의뢰에대한상담내용을문서화한다. iii. 상담의이해정도와결정에대한반응을평가하기위해환자와 contact 86

87 iv. 가족들이임신을고려하거나최신의정보를위해클리닉을다시방문할수있도록격려한다. v. 앞으로있을질문에대한대답을위한준비가가능하도록하여야한다. ======================================================== VII. 유전질환의산전진단 익혀야할내용 : 산전진단시고려하여야할사항들을이해한다. 유전상담의목적을이해한다. 법적으로산전진단이허용되는질환의범위를안다. VII-1. 개요 최근유전학이급속도로발전함에따라다양한유전자의기능과질환과의관련성이밝혀지고있다. 또한, 분자유전학적기법의발전으로질환의원인유전자를분석하여돌연변이를확인하는과정이비교적간편해지고빨라지게되었다. 이처럼유전성질환, 특히멘델유전질환의원인유전자가밝혀지고, 이를분석하는기법이발전함에따라이들질환을가진환자에대한진단과더불어산전진단의수요도증가하고있다 (Table 1). 본 87

88 연제에서는멘델유전질환의산전진단과관련하여유전검사의정의, 분자유전검사의목적과의의, 진단기법과한계및산전진단시고려되어야 할사항들에대해알아보고자한다. VII-2. 산전진단시고려되어야할사항 1. 산전유전자검사를시행하기전에는다음과같은점이반드시고려 되어야한다. i. 질환의검증특정질병이과연유전적인성향으로발생하는질병인지아니면유전과는전혀관계가없는질병인지를파악하여야한다. 즉, 유사한임상양상을보이는환자라도상세한가족력조사및임상진단과정을통해유전적요소 (genetic factor) 가질환의발병과관련되어있음이확인되어야한다. ii. 질환의원인특정질병이유전적인성향으로발생하는질병임이확인이된다면, 이러한유전질환을가진가족에서질병의발생과관련이있다고알려진유전자의이상이있는지를태아의검체를얻기전에가급적일찍확인해야한다. 예를들어정신지체의가족력이있는경우취약 X 증후군에의한경우와다운증후군또는기타 88

89 다른질환에의한경우가모두진단적접근법이다르므로정확한 산전유전진단을위해서는각가족마다고유한유전질환의종류와 원인을임신계획을세우기전이나임신초기에확인하여야한다. iii. 검사법선택산모의가족중에특정유전질환을가진분의원인이확인된경우적절한시기에양수검사또는융모막검사등을통해시행하게되는데, 질환의종류와산전진단의목적에따라적절한방법을선택하여야한다. 즉, 매우치명적인유전질환의경우융모막검사를시행하여보다빠른시기에태아의질환유전여부를확인하는것이좋으며, 그렇지않은경우양수검사를시행하는것이좋겠다. iv. 검사전 / 후유전상담산전유전진단과정은무엇보다부부의적극적인이해와협조가필수적이며, 검사의목적이나진행과정에대한이해가반드시필요하므로적절한유전상담과검사에대한설명이반드시시행되어야한다. v. 윤리적, 법적고려 산전진단의경우윤리적, 법적고려가반드시선행되어야한다 년 1 월발효된생명윤리및안전에관한법률에서는배아 89

90 또는태아를대상으로유전자검사를할수있는유전질환을 명시하고있다 (Table 2). 2. 분자유전검사를이용한산전진단시고려할사항분자유전검사를이용한산전진단과정에서고려해야할사항은다음과같다. i. Proband에대한분자유전검사및재확인검사분자유전검사를이용한산전진단시가장먼저확인되어야할사항으로는가족내질환을가진 proband가분자유전학적으로진단을받았고, 원인돌연변이가발견되었는지, 발견되었다면해당질환과의관련성은확립된것인지를확인하는것이다. 또한, proband가산모의자녀인경우유전양상을고려하여산모와 proband의아버지에대하여유전검사를시행한후동일한돌연변이의보유여부를검사해두어야만태아에서의정확한유전위험도를판정할수있다. ii. Proband에서발견된변이와질환과의관련성확인염기서열분석을비롯한분자유전학적기법이보편화되면서임상적으로의의가불분명한변이가자주발견된다. Human Genome Variation Society에서는기존에보고되지않은염기서열변이가발견된경우반복검사를통해검사과정의오류를배제하고, 가족검사 (family study) 를시행하여질환의 90