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지한 풍
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1 대한생식의학회지 : 제 34 권제 3 호 2007 삼핵산반복서열질환인헌팅톤병, 척수소뇌성운동실조증, X- 염색체취약증후군의착상전유전진단방법에대한연구 관동대학교의과대학제일병원생식생물학및불임연구실 1, 산부인과학교실 2 김민지 1 이형송 1 임천규 1 조재원 1 김진영 2 궁미경 2 송인옥 2 강인수 2 전진현 1 * Optimized Methods of Preimplantation Genetic Diagnosis for Trinucleotide Repeat Diseases of Huntington's Disease, Spinocerebellar Ataxia 3 and Fragile X Syndrome Min Jee Kim 1, Hyoung-Song Lee 1, Chun Kyu Lim 1, Jae Won Cho 1, Jin Young Kim 2, Mi Kyoung Koong 2, In Ok Song 2, Inn Soo Kang 2, Jin Hyun Jun 1 * 1 Laboratory of Reproductive Biology and Infertility, 2 Department of Obstetrics and Gynecology, Cheil General Hospital and Women's Healthcare Center, Kwandong University School of Medicine, Seoul, , Korea Objectives: Many neurological diseases are known to be caused by expansion of trinucleotide repeats (TNRs). It is hard to diagnose the alteration of TNRs with single cell level for preimplantation genetic diagnosis (PGD). In this study, we describe methods optimized for PGD of TNRs related diseases such as Huntington's disease (HD), spinocerebellar ataxia 3 (SCA3) and fragile X syndrome (FXS). Methods: We performed the preclinical assays with heterozygous patient's lymphocytes by single cell PCR strategy. Fluorescent semi-nested PCR and fragment analysis using automatic genetic analyzer were applied for HD and SCA 3. Whole genome amplification with multiple displacement amplification (MDA) method and fluorescent PCR were carried out for FXS. Amplification and allele drop-out (ADO) rate were evaluated in each case. Results: The fluorescent semi-nested PCR of single lymphocyte showed 100.0% of amplification and 14.0% of ADO rate in HD, and 94.7% of amplification and 5.6% of ADO rate in SCA3, respectively. We could not detect the PCR product of CGG repeats in FXS using the fluorescent semi-nested PCR alone. After applying the MDA method in FXS, 84.2% of amplification and 31.3% of ADO rate were achieved. Conclusions: Fluorescent semi-nested PCR is a reliable method for PGD of HD and SCA3. The advanced MDA method overcomes the problem of amplification failure in CGG repeats of FXS case. Optimization of methods for single cell analysis could improve the sensitivity and reliability of PGD for complicated single gene disorders of TNRs. [Korean. J. Reprod. Med. 2007; 34(3): ] Key Words: Preimplantation genetic diagnosis (PGD), Trinucleotide repeats disease, Huntington's disease (HD), Spinocerebellar ataxia 3 (SCA3), Fragile X syndrome (FXS) 인간의보조생식술 (assisted reproductive technology, ART) 의발달로인해최근체외수정및배아이식술 주관책임자 : 전진현, 우 ) 서울특별시중구묵정동 1-19, 제일병원생식생물학및불임연구실 Tel: (02) , Fax: (02) junjh55@hanmail.net 분야에서, 유전적으로이상이있는환아를출산할확률이높은부부들에게정상아의출산기회를제공하고, 또한습관성유산이나염색체의수적, 구조적이상으로인해임신예후가좋지않은부부들을위해서착상전유전진단 (preimplantation genetic

2 삼핵산반복서열질환에대한착상전유전진단방법 대한생식의학회지 diagnosis, PGD) 방법이도입되어적용되고있다. 이러한착상전유전진단은기존의산전진단 (prenatal diagnosis) 에비하여유전적으로비정상인배아의이식을배제하고정상적인배아만을선별적으로이식하여, 유전질환을갖는태아의임신과비윤리적인유산으로인한정신적, 육체적부담을감소시킬수있는장점이있다. 이러한착상전유전진단의개념은 Edwards와 Gardner (1968) 에의해처음으로제안되었으며, 1 그후착상전유전진단의성공적인임상적용은 1990 년 Handyside 등에의해최초로보고되었다. 2 현재착상전유전진단은염색체전좌와같은염색체구조적이상에따른습관성유산환자를대상으로한염색체검사와여러종류의단일유전자이상또는 X-염색체연관유전질환의이환가능성이높은부부를대상으로전세계적으로약 50곳의착상전유전진단센터에서시행되고있다. 국내에서도 1990년대중반이후착상전유전진단이시행되고있으며, 염색체의수적이상이나구조적이상을대상으로형광직접보합법 (fluorescent in situ hybridization, FISH) 을이용하여시행한사례들과 3~6 근이영양증 (Duchenne muscular dystrophy, DMD), ornithine transcarbamylase (OTC) deficiency, lactic acidosis 그리고 epidermolysis bullosa (EB) 등단일유전자이상에의한유전질환을대상으로착상전유전진단을시행한결과가보고된바있다. 7,8 여러종류의단일유전자이상에의한질환들가운데, 현재까지 14종류의신경계질환이불안전한삼핵산반복서열 (trinucleotide repeats, TNRs) 의확장 (expansion) 으로인해발병하는것으로알려져있다. 9 이들중헌팅톤병 (Huntington's disease, HD), X- 염색체취약증후군 (fragile X syndrome, FXS), 척수소뇌성운동실조증 (spinocerebellar ataxia 3, SCA3) 그리고근육긴장성장애 (myotonic dystrophy) 의경우각각의삼핵산반복서열의확장정도를확인할수있는단일세포 PCR 방법이개발되어성공적인착상전유전진단이시행되었다. 10~12 단일유전자이상에대한착상전유전진단시행 에서가장중요한점은하나또는두개의할구에있는극소량의 DNA 시료를이용한 PCR에서오염과 allele drop-out을최소화하면서성공적으로시료를증폭하여진단의정확성을높이는것이다. 이러한극소량의 DNA 시료에서기인하는여러가지문제점들을해결하기위해 primer extension preamplification (PEP)-PCR, degenerative oligonucleotide primed (DOP)-PCR 방법등을이용한 whole genome amplification이시도되기도하였다. 13,14 최근에는기존의방법외에바이러스에서유래한 phi 29 polymerase를이용한 DNA 시료증폭방법인 multiple displacement amplification (MDA) 를착상전유전진단에도입하여그효용성이확인되었다. 15,16 본연구에서는삼핵산반복서열질환인헌팅톤병, 척수소뇌성운동실조증, X-염색체취약증후군등을대상으로착상전유전진단을시행하기위한전임상검사로서단일림프구 (single lymphocyte) 를이용한 fluorescent seminested PCR 방법과 MDA 방법을이용하여실제적인착상전유전진단방법을최적화하는과정에서얻은결과들에대해기술하고자한다. 연구대상및방법 1. 헌팅톤병 (Huntington's disease, HD) 헌팅톤병 (HD; OMIM ) 은점진적인신경퇴화성질환 (neurodegenerative disease) 으로상염색체우성유전방식으로이환되며, 10,000명당 1명의발병률을보이는것으로알려져있다. 이질환은 Huntingtin 유전자의 5' 말단에위치하는 CAG TNRs 의불안전한확장에기인하며, 지금까지의연구결과에따르면 CAG TNRs이 11~34 repeats일경우정상, 35~39일경우는증상이나타날가능성이있으며, 40 repeats 이상으로 CAG repeats이확장된경우발병하는것으로보고되고있다. 17 본연구에서의헌팅톤병가계의경우남편은 28/31 CAG repeats로정상이었지만, 부인의경우 CAG repeats가 27/62로하나의 allele이확장되어있었다

3 제 34 권제 3 호, 2007 김민지 이형송 임천규 조재원 김진영외 4 인 2. 척수소뇌성운동실조증 (Spinocerebellar ataxia 3, SCA3) 척수소뇌성운동실조증 (SCA3; OMIM ) 은상염색체우성유전방식으로이환되는신경퇴화성질환으로 MJD1 (Machado-Joseph disease) 유전자의 CAG TNRs 확장에의해발병된다. 이 CAG TNRs 는정상인에서도매우다양하여 12~43 repeats를나타내며, SCA3 환자의경우보통 62~84 CAG repeats 를보이는것으로알려져있다. 18 본연구에서의척수소뇌성운동실조증가계에서는남편의 CAG repeats이 27/69로서하나의 allele이확장되어있었으며, 부인의경우에는 26/32 repeats로정상이었다. 3. X-염색체취약증후군 (Fragile X syndrome, FXS) X-염색체취약증후군 (FXS; OMIM ) 은정신박약또는지체를보이는 X-염색체연관질환으로발병원인으로는 fragile X mental retardation- 1 (FMR1) 유전자의 5' untranslated region (5' UTR) 에위치하는 CGG TNRs의확장이나과메틸화 (hypermethylation) 와관련이있다고알려져있다. 19,20 연구결과에의하면 200 repeats 이상일경우 full mutation 으로질환이발병하고, 55~200 repeats 사이일경우 premutation range로임상적으로질환의소견은보이지않으나다음세대로그 X 염색체가유전되면서 CGG repeats이더욱확장되어결국은질환을일으키는것으로알려져있다. 21 본연구에서의 X-염색체취약증후군가계의경우남편은 31 CGG repeats 로정상이었으며, 부인의경우정상적인 28 repeats 와 100 repeats 이상의비정상 allele을가지고있는것으로확인되었다. 이들부부의첫번째임신에서양수검사결과 200 repeats 이상의 full mutation을가지고있는것으로확인되어인공유산후본센터에내원하였다. 4. Genomic DNA의분리와 single lymphocytes 준비각부부의혈액으로부터 AquaPure Genomic DNA Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 을이용하여 genomic DNA를추출한후사용전까지 -20 에보관하였으며, 이를이용하여각질환에대한부부의관련유전자의 TNRs의수를재확인하였다. 일차적으로 genomic DNA를이용하여각각의 TNRs 유전자에대한효과적인 primers를선정하고 PCR 조건을확립하였다 (Table 1). 이러한조건의효용성을단일세포수준에서확인하기위해각환자의혈액으로부터 Ficoll-Paque density gradient separation (Ficoll-Paque TM PLUS, Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) 방법으로단일림프구를분리하였다. 배양접시에 Ca 2+ /Mg 2+ -free phosphate buffered saline (PBS) 로소적을만들고그소적에분리된림프구의일부를넣어희석한후현미경하에서미세유리관을이용하여각각의단일림프구를 3 µl의 lysis buffer (200 mm KOH, 50 mm DTT) 가들어있는각각의 PCR tube에넣었다. 준비된단일림프구시료는사용전까지 -70 에보관하였으며, 이를이용하여각 primers의 PCR 조건을재확인하고, 증폭성공률그리고 allele drop-out (ADO) rate를조사하는착상전유전진단에대한전임상검사를실시하였다. 그러나 X-염색체취약증후군의경우환자의 100 repeats 이상의비정상 allele은일반적인 PCR 방법으로증폭하기가어렵기때문에, 28/34 repeats 를가지고있는 heterozygous type의정상인의단일림프구를동일한방법으로준비하여분석하였다. 5. Fluorescent semi-nested PCR analysis and fragment analysis 준비된단일림프구는 alkaline lysis buffer를이용하여용해시키고, neutralization buffer (900 mm Tris- HCl, ph 8.3, 300 mm KCl, 200 mm HCl) 를넣어중화시켰다. PCR 특이성을높이고 ADO rate을줄이기위해 fluorescent semi-nested PCR 방법을사용하였으

4 삼핵산반복서열질환에대한착상전유전진단방법 대한생식의학회지 Table 1. Primers used for preclinical assays of HD, SCA3 and FXS Sequences of primers References Huntington's disease (HD) HD-forward (outer) 5'-AGGCCTTCGAGTCCCTCAAGT-3' Sermon et al. 25 HD-forward (inner) * 5'-CTGAGGCAGCAGCGGCTGTG-3' HD-reverse 5'-GGCGGCTGAGGAAGCTGAGGA-3' Spinocerebellar ataxia 3 (SCA3) SCA3-forward (outer) 5'-TCAGACTAACTGCTCTTGCATTC-3' Kawaguchi et al. 26 SCA3-forward (inner) * 5'-CCAGTGACTACTTTGATTCG-3' SCA3-reverse 5'-TGGCCTTTCACATGGATGTGAA-3' Fragile X syndrome (FXS) FXS-forward (outer) 5'-ACGTGACGTGGTTTCAGTGTTTAC-3' O'Connell et al. 27 FXS-forward (inner) * 5'-GCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT-3' FXS-reverse 5'-AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA-3' * Primers are 5'-6-FAM labeled. 며, 이때사용한 primers의염기서열은 Table 1에나타내었다. 일차 PCR의경우, 10 mm Tris-HCl (ph 8.3), 50 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.2 mm dntps, 10 pmol primers, 1 unit Taq DNA polymerase (GeneCraft Co, Munster, Germany) 를혼합한후전체반응액이 30 µl가되게하였다. 일차 PCR은 DNA thermal cycler (ABI 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를사용하여 96 에서 10분, 94 에서 40초 ( 처음 10 cycles에서는 96 에서 40초 ), 각 primer의 annealing temperature에서 40초, 72 에서 40초의 cycle을 25회수행한후최종적으로 72 에서 10분간반응시켰다. 일차 PCR의증폭산물 1 µl를사용하여다음과같은조건에서 fluorescent semi-nested PCR을진행하였다. 전체반응액은 10 mm Tris-HCl (ph 8.3), 50 mm KCl, 1.5 mm MgCl 2, 0.2 mm dntp [fragile X syndrome의경우 7-deasa-dGTP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 를사용 ], 1 pmol FAM - labeled primers (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 1 unit Taq DNA polymerase를혼합한후 20 µl가되게하였다. Semi-nested PCR의반 응조건은 94 에서 10분, 94 에서 40초, 각 primer 의 annealing temperature에서 40초, 72 에서 40초의 cycle을 40회수행한후최종적으로 72 에서 10분간반응시켰다. 증폭산물은 ABI 3100 Avant automatic genetic analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를이용하여 capillary electrophoresis한후, GeneScan Analysis software version 3.7 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 과 GeneScan-ROX 1000 Size Standard (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를이용하여 PCR fragment analysis를수행하였다. 착상전유전진단의오진원인중하나인오염여부를확인하기위하여 PCR 시 2개이상의음성대조군시료를포함하여모든실험을진행하였다. 6. Multiple displacement amplification (MDA) Fluorescent semi-nested PCR 방법으로대상유전자의분석이어려운경우 MDA 방법으로 whole genome amplification을시도하였다. FMR1 CGG repeat 의수가 28/34 repeats인 heterozygous type 정상인과 X-염색체취약증후군환자 (28/>100 repeats) 의혈

5 제 34 권제 3 호, 2007 김민지 이형송 임천규 조재원 김진영외 4 인 Table 2. Amplification and allele drop-out rates of preclinical assays for HD, SCA3 and FXS Applied methods Huntington's disease (HD) Fluorescent semi-nested PCR Spinocerebellar ataxia 3 (SCA3) Fluorescent semi-nested PCR Fragile X syndrome (FXS) MDA * and fluorescent PCR No. of single lymphocytes No. of amplified cells Amplification rate 100.0% 94.7% 84.2% Allele drop-out rate 12/86 (14.0%) 3/54 (5.6%) 5/16 (31.3%) * Multiple displacement amplification. 액을이용하여단일림프구시료를준비하였으며, REPLI-g Mini Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) 을사용하여 MDA를수행하였다. 간단하게 MDA 방법을설명하면, 준비된단일림프구시료를각각 2.5 µl PBS가들어있는 0.2 ml PCR tube에넣어준비하였고, denaturation lysis buffer 2 (DLB 2 : 200 mm DTT, 400 mm KOH and 10 mm EDTA) 3.5 µl를첨가한후얼음에 10분간방치하여융해된세포의 DNA 를변성시켰으며 stop buffer (stop solution in REPLI-g Mini Kit) 3.5 µl를넣어반응을중단시켰다. 이후 cell lysates에 40 µl의 master mix (DW 10 µl, reaction buffer 29 µl, phi 29 DNA polymerase 1 µl) 를첨가하여 30 에서 16시간동안반응시켰다. 그후 phi 29 DNA polymerase의불활성화를위해 65 에서 3분간방치하였으며, 최종적으로약 100 ng/µl의증폭된 MDA 산물을얻었다. MDA 산물을 1/50 비율로희석하여, 위에서기술한방법으로 FMR1 CGG repeats에대한 fluorescent PCR을수행하였다. 결과 1. 헌팅톤병 (Huntington's disease, HD) 헌팅톤병질환의원인유전자인 huntingtin 유전자의 5' 말단에위치하는 CAG repeat를증폭하기위해 outer primers와 inner primer 를각각고안하여 fluorescent semi-nested PCR을수행하였다. Genomic DNA를이용한검사에서남편은각각 28개와 31개 의 CAG repeats를가지고있는정상임을재확인할수있었으며, 헌팅톤병환자인부인의경우 27개의 CAG repeats과 62개의비정상 CAG repeats를가지고있음을재확인하였다. 단일세포에서의진단효용성을확인하기위해정상의 CAG repeats를가지는남편의림프구 40개, 확장된 repeats를가지고있는부인의림프구 46개, 총 86개의단일림프구시료를이용하여착상전유전진단에대한전임상검사를실시하였다. 그결과 PCR 증폭성공률은남편 (40/40) 과부인 (46/46) 모두에서 100.0% 를나타내었으며, ADO rate는남편의경우 15.0% (6/40), 부인의경우 13.0% (6/46) 로확인되었다. 결과적으로총 86개의단일림프구시료모두증폭에성공하여 100.0% 의증폭성공률을나타내었으며, 이중 12 개의시료에서 ADO가관찰되어 14.0% (12/86) 의 ADO rate를나타내었다 (Table 2, Figure 1). 2. 척수소뇌성운동실조증 (Spinocerebellar ataxia 3, SCA3) 부부의 genomic DNA를이용하여각각의 MJD1 유전자의 CAG repeats를 fluorescent semi-nested PCR 방법으로조사한결과남편은 27/69 repeats, 부인은 26/32 repeats를가지고있음을재확인할수있었다. 실제적인척수소뇌성운동실조증에대한착상전유전진단을위해확장된 CAG repeats를가지고있는남편의혈액으로부터 57개의단일림프구시료를준비하여 fluorescent semi-nested PCR 방법으로

6 삼핵산반복서열질환에대한착상전유전진단방법 대한생식의학회지 Female partner 27 Mutant allele 62 Male partner Figure 1. Electropherograms of the CAG repeats in the preclinical assay with fluorescent semi-nested PCR using female and male partner's lymphocytes for Huntington's disease. An arrow indicates the expanded mutant allele. Numbers represent the number of the CAG repeats. Female partner Male partner 27 Mutant allele 69 Figure 2. Electropherograms of the CAG repeats in the preclinical assay with fluorescent semi-nested PCR using female and male partner's lymphocytes. An arrow indicates the expanded mutant allele. Numbers represent the number of the CAG repeats. 전임상검사를수행하였다. 그결과총 57개의시료중 54개에서증폭에성공하여 94.7% 의증폭성공률을보였으며, 이중 3개에서 ADO가관찰되어 5.6% (3/54) 의 ADO rate를나타내었다 (Table 2, Figure 2). 3. X-염색체취약증후군 (Fragile X syndrome, FXS) 일차적으로부부의 genomic DNA를이용하여 FMR1 유전자의 CGG repeats를 fluorescent seminested PCR로조사한결과남편은 31개의정상 CGG repeats를확인할수있었다. 부인의경우 28개의정상 CGG repeats은확인되었으나, 예상한바와같이부인의 100 repeats 이상의 mutant allele은확인하지못하였다. 따라서정확한 ADO rate의확인을위해 28/34 TNRs를가지는정상인의단일림프구시료를전임상검사에사용하였다. 그러나기존의 fluorescent semi-nested PCR 방법으로전임상검사를

7 제 34 권제 3 호, 2007 김민지 이형송 임천규 조재원 김진영외 4 인 A Female partner 28 Not detected fully expanded allele Male partner 31 B Control Figure 3. Electropherograms of the CGG repeats in the preclinical assay with multiple displacement amplification and fluorescent PCR using female and male partner's lymphocytes (A) and control (B). Expanded mutant allele (more than 100 repeats) of female partner was not detected (A). Normal 28/34 alleles of control were detected (B). Numbers represent the number of the CGG repeats. 실시하였으나, genomic DNA에서얻은결과와는달리 heterozygous type (28/34 allele) 의단일림프구시료에서도기대했던결과를확인할수없었다. 따라서이러한문제점을해결하기위해 MDA 방법을이용하여 whole genome amplification을시도하였고, 그 MDA 산물을이용하여 FMR1 유전자에대한 fluorescent PCR을수행하였다. 그결과총 19개의단일림프구 MDA 산물에서 CGG repeats를조사한결과 16개의시료에서정확한 CGG repeats 수를확인할수있어 84.2% (16/19) 의증폭성공률을보였으며, 이중 5개의시료에서 ADO가관찰되어 31.3% (5/16) 의 ADO rate를나타내었다 (Table 2, Figure 3). 고찰단일유전자이상에대한착상전유전진단분야 는지속적으로발전하고있는분자생물학적인분석방법을효과적으로접목하면서그적용범위가계속확장되어가고있다. 그러나하나또는두개의할구에서유래한극소량의 DNA 시료를사용하여 PCR을수행하기때문에모든착상전유전진단논문들에서언급하듯이외부 DNA로부터의오염 (contamination), 전체적인 PCR 증폭실패 (amplification failure), 그리고 ADO와같은문제가착상전유전진단을실시하는데가장큰장애가되고있다. 이러한문제점들을최소화하고실제임상에서착상전유전진단을성공적으로진행할수있는최적의조건들을확립하기위해, 각환자와그의배우자또는가족등의단일림프구시료등을이용하여각각의특정유전자에대한증폭성공률을높이고 ADO rate를낮추어진단의정확성을높이기위해전임상검사가반드시진행되어야한다. 22 이러한전임상검사의기간은각연구실연구원의숙

8 삼핵산반복서열질환에대한착상전유전진단방법 대한생식의학회지 련도, 장비등여러조건에따라차이가있지만, 경험이많은착상전유전진단센터에서도보통 1~2 개월정도소요되고있다. 23 본센터에서도환자가처음내원한후그가계에서유전질환의원인이되는돌연변이의확인, 착상전유전진단방법결정, 적절한 primers의고안및선정, PCR 조건의최적화, 단일림프구시료에서의 PCR 조건재확인, 단일림프구시료에서의증폭성공률과 ADO rate 조사등의일련의과정을거쳐실제착상전유전진단을시행할수있을때까지보통약 2달정도의시간이소요되고있다. 근래에 DNA의구조적불안전성에기인한 TNRs 이확장되어질환이발생하는헌팅톤병, 척수소뇌성운동실조증, X-염색체취약증후군등에대한성공적인착상전유전진단사례가보고되고, 11 국내에서도이러한질환들에대한착상전유전진단이요구됨에따라본연구실에서도이에대한단일세포를이용한전임상검사를수행하였다. 일반적인유전자에비해 TNRs에대한분석은상대적으로 primers의선정과 PCR 조건의최적화에있어많은어려움이발생하게된다. 특히, X-염색체취약증후군의 mutant allele의경우 FMR1 유전자의 CGG PCR 반응시에높은변성온도를요구하고 PCR 과정에서증폭산물들이 2차적인구조를형성할가능성이높아 PCR 방법으로증폭이매우어렵다고알려져있다. 24 따라서 mutant allele에대한직접적인분석이쉽지않기때문에보다정확한진단을위해 linked markers에대한동시적인분석이시행되어왔다. 16 이와같은이유로단일세포에서 X-염색체취약증후군의 TNRs 분석에소요되는기간이 3개월정도로길어지게되었으며, PCR 방법으로는 100 repeats 이상의 mutant allele에대한직접적인확인이어려웠다. 본연구에서척수소뇌성운동실조증의경우증폭성공률은 94.7%, 헌팅톤병의경우 100.0% 의성공률을보여다른질환의전임상검사결과와비슷한성공률을보였으며, ADO rate 또한각각 5.6% 와 14.0% 로나타나헌팅톤병에서약간높은경향 을보였지만 TNRs에대한진단의어려움을고려하면실제적인착상전유전진단의시행이가능할것으로판단된다. 그러나 X-염색체취약증후군의경우다른질환과는다르게 genomic DNA에서는 fluorescent semi-nested PCR 방법으로예상했던결과를확인할수있었지만, 단일세포를대상으로시행할경우에는기대했던결과를얻을수없었다. 이는 FMR1 유전자의 CGG repeats이위치하는부위의 GC-rich 염기서열의특이성때문에적절한 primers 고안과효과적인 PCR에어려움이있으며, 또한단일세포라는극소량의 DNA를사용하기때문으로생각된다. 따라서이질환에대한정확한착상전유전진단을위해서는 whole genome amplification을통해충분한양의 DNA를확보한후 PCR을수행하는것이더욱좋은결과를얻을수있을것이라판단되었다. 최근에 Burlet 등은 16 X- 염색체취약증후군의착상전유전진단에 MDA 방법을사용하여증폭성공률을 85~95% 로높였으며, ADO rate 또한 7~34% 로낮췄다고보고하였다. 이들은 X-염색체취약증후군에대한 8사례의착상전유전진단에서 41~66% 의증폭성공률을보였으며, MDA를시행하지않았을경우약 45% 정도는결과를얻을수없었던반면, MDA를시행한후진단을하였을경우 86% 에서성공적인진단이가능하였다고보고하였다. 본연구에서도 MDA와 fluorescent PCR을적용하여 84.2% 의증폭성공률과 31.3% 의 ADO rate를얻을수있었다. 다른질환의경우와비교해 ADO rate가다소높은경향을보이지만, 실제적인착상전유전진단과정에서는여러개의 polymorphic linked markers를동시에분석하면보다정확한진단이가능하리라생각된다. 이러한 MDA 방법을이용하면충분한양의 DNA 시료를확보할수있어, 여러종류의 polymorphic linked markers에대한분석이가능하며본연구실에서도이에대한효용성을확인할수있었다 (data not shown). 결론적으로헌팅톤병과척수소뇌성운동실조증에대한단일림프구시료를이용한전임상검사에

9 제 34 권제 3 호, 2007 김민지 이형송 임천규 조재원 김진영외 4 인 서 fluorescent semi-nested PCR의진단효용성을확인할수있어, 이방법을이용한실제적인착상전유전진단이가능함을확인하였다. 또한, 단일림프구시료를대상으로시행한 X-염색체취약증후군의전임상검사에서는기존의 fluorescent semi-nested PCR 방법으로는진단이불가능하였으며, MDA를이용한 whole genome amplification 과 fluorescent PCR 방법을병행하였을때진단이가능하였다. 이와같이유전자의변이에대한분석이쉽지않은 TNRs 관련단일유전자이상에대한착상전유전진단의경우다양한유전자분석방법을이용한단일세포에서의진단방법의최적화연구가필수적으로선행되어야할것으로사료된다. 참고문헌 1. Edwards RG, Gardner RL. Choosing sex before birth. New Scientists 1968; 38: Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, Winston RML. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature 1990; 344: 임천규, 한미현, 전진현, 송견지, 김정욱, 박소연등. 균형전좌또는 Robertsonian 전좌보인자의체외수정및배아이식술에서형광직접보합법을이용한착상전유전자진단의임상적적용. 대한산부인과학회지 2000; 43: 김진영, 임천규, 송인옥, 유근재, 양광문, 한국선등. 유전질환및염색체이상의예방을위한착상전유전진단의결과. 대한불임학회지 2002; 29: 임천규, 민동미, 이형송, 변혜경, 박소연, 류현미등. 형광직접보합법을이용한착상전유전진단기법의최적화와경험축적에의한임신율의향상. 대한불임학회지 2004; 31: Lim CK, Jun JH, Min DM, Lee HS, Kim JY, Koong MK, et al. Efficacy and clinical outcome of preimplantation genetic diagnosis using FISH for couples of reciprocal and Robertsonian translocations: the Korean experience. Prenat Diagn 2004; 24: 최수경, 이은호, 이호준, 전진현, 강인수, 백은찬등. 근이양증가계에서의 PEP-PCR을이용한착상전유전자 진단. 대한불임학회지 1996; 23: 이형송, 최혜원, 임천규, 민동미, 변혜경, 김진영등. OTC 효소결핍증, 수포성표피박리증및 lactic acidosis 가계에서 duplex nested PCR 방법을이용한착상전유전진단 : OTC 효소결핍증가계에서의정상아임신및출산. 대한산부인과학회지 2004; 47: Masino L and Pastore A. A structural approach to trinucleotide expansion diseases. Brain Res Bull 2001; 56: Drusedau M, Dreesen JCFM, de Die-Smulders C, Hardy K, Bras M, Dumoulin JCM, et al. Preimplantation genetic diagnosis of spinocerebellar ataxia 3 by (CAG)n repeat detection. Mol Hum Reprod 2004; 10: Sermon K, Seneca S, De Rycke M, Goossens V, Van de Velde H, De Vos A, et al. PGD in the lab for triplet repeat diseases? Myotonic dystrophy, Huntington's disease and Fragile-X syndrome. Mol Cell Endocrinol 2001; 183: S Stern HJ, Harton GL, Sisson ME, Jones SL, Fallon LA, Thorsell LP, et al. Non-disclosing preimplantation genetic diagnosis for Huntington disease. Prenat Diagn 2002; 22: Telenius H, Carter NP, Bebb CE, Nordenskjold M, Ponder BA, Tunnacliffe A. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer. Genomics 1992; 13: Zhang L, Cui X, Schmitt K, Hubert R, Navidi W, Arnheim N. Whole genome amplification from a single cell: implication for genetic analysis. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: Hellani A, Coskun S, Tbakhi A, Al-Hassan S. Clinical application of multiple displacement amplification in preimplantation genetic diagnosis. Reprod Biomed Online 2005; 10: Burlet P, Frydman N, Gigarel N, Kerbrat V, Tachdjian G, Feyereisen E, et al. Multiple displacement amplification improves PGD for fragile X syndrome. Mol Hum Reprod 2006; 12: Ramaswamy S, Shannon KM, Kordower JH. Huntington's disease: pathological mechanisms and therapeutic strategies. Cell Transplant 2007; 16: Manto MU. The wide spectrum of spinocerebellar ataxias (SCAs). Cerebellum 2005; 4: Yu S, Pritchard M, Kremer E, Lynch M, Nancarrow J, Baker E, et al. Fragile X genotype characterized by an unstable

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Microsoft Word - 3-전진현.DOC 大韓不妊學會誌 : 第 32 卷第 1 號 2005 Kor. J. Fertil. Steril., Vol. 32, No. 1, 2005, 3 근이영양증에대한착상전유전진단에서 Duplex-nested PCR 과 Fluorescent PCR 방법의효용성 성균관대학교의과대학삼성제일병원생식생물학및불임연구실 1, 유전학연구실 2, 산부인과학교실 3 이형송 1 최혜원 1 임천규