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경미 곡
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1 종설 J Korean Neurol Assoc / Volume 24 / February, 2006 근이영양증에서면역조직화학염색의진단적의의 부산대학교병원신경과, 부산대학교병원의학연구소 김대성 Dae-Seong Kim, M.D. Department of Neurology, Medical Research Institute, Pusan National University Hospital, Busan, Korea 서론 근이영양증은일련의유전질환군으로서임상적으로는점진적으로진행하는근위축과근력저하를보이고, 근병리조직에서근섬유크기다양성의증가, 근섬유괴사, 근조직내지방조직과결체조직의비율증가등의소견이나타난다 (Fig. 1). 1 디스트로핀단백의결핍이듀센형근이영양증 (Duchenne's muscular dystrophy; DMD) 과베커형근이영양증 (Becker's muscular dystrophy; BMD) 을유발함이증명되고, 2 디스트로핀이골격근형질막 (sarcolemmar membrane) 에존재함이밝혀진이후 3 많은종류의근이영양증에서그발병유전자와결손되는단백들이알려지게되었다. 현재는각종근육단백들에대한항체를사용하여면역조직화학염색 (immunohistochemistry; IHC) 을실시해임상및병리학적소견만으로는감별진단이힘든근이영양증의많은아형들을진단할수있다. 저자는이논문에서근이영양증의아형분류에근거가되는단백질결손에관해간략히언급하고, 이의검출에사용되는 IHC 의필요성과방법, 그리고그결과의해석및의의에관해간단히논하고자한다.

2 김대성 는단백질을발견함에따라아형들의세부분류를조금씩보완해나가는형식의분류법이사용되고있다 (Table 2). 근이영양증에서의단백질결손 Figure 1. Typical pathology of muscular dystrophy. There is a marked size variation between fibers, increased content of the mixed connective tissue, and many basophilic regenerating muscle fibers (arrows). Hematoxylin and eosin stain, 200. 근이영양증의아형과그분류법 근이영양증에는여러가지아형이있는데분자생물학이본격적으로발전하기시작한 1980 년대이전까지는특징적인진찰소견과주로침범되는근육군이어떠한가하는임상적소견, 그리고유전되는양상이어떠한가하는점을조합한형태의분류법을사용해왔다 (Table 1). 1 이분류법은일부아형들의감별진단에매우유용하므로현재까지도여전히요긴하게사용된다. 하지만연계분석 (linkage analysis) 결과임상적으로유사하고유전양식이같은가족례들이서로다른유전자좌 (genetic loci) 로연계되어있음이밝혀지고나아가수많은발병유전자가규명되면서이전에사용하던분류법만으로는근이영양증의다양한아형을더이상합리적으로분류하기힘들게되었다. 즉, 과거에는임상적특징과유전방식이동일하여동일한아형이라고생각되던질환이서로다른유전자돌연변이에의해발병함이규명되는가하면 4,5 전혀다른아형이라고생각되던두질환이동일한발병유전자에의함이규명되기도하였는데, 6-9 이러한발견에힘입어최근에는기존에사용되던분류법의큰틀아래에서연계분석과발병유전자, 그리고발현장애가초래되 현재까지의연구에서밝혀진바와같이근이영양증은근육세포에존재하는단백질을코드하는유전자의돌연변이에의해발병한다 (Fig. 2). 이단백질들의분포를살펴보면어떠한기전에의해근이영양증이각각의단백결손에의해유발되는지그기전을추측하는데도움이될수있는데이들을큰범주로나누어보면다음과같다. 1) 근섬유분절단백 (sarcomeric protein); titin, myotilin, telethonin 2) 핵막단백 (nuclear membrane protein); lamins A and C, emerin 3) 세포질단백 (cytosolic protein); calpain-3, TRIM32 4) 골격근형질막단백 (sarcolemmar protein); dystrophin, sarcoglycan, dysferlin, caveolin 3 5) Glycosyltransferases; fukutin, POMGNT1, POMT1, FKRP 6) 세포외기질단백 (extracellular matrix protein); merosin (laminin α2 chain), collagen VI 근이영양증에서면역조직화학염색의의의 일부특징적인증상이나징후가나타나는아형들을제외하고는근이영양증을임상적소견만으로분류하기는매우힘들다. 또한일반적인조직화학염색으로관찰하는근병리소견은근이영양증을진단하기위해서반드시필요하지만다양한아형들을감별진단하는데는거의도움이되지않는다는한계점이있다. 근이영양증은유전자돌연변이에의한다양한근육단백들의결손으로인해발병하므로각증례에서결손된단백이어떤것인 Table 1. Past classification of muscular dystrophy Duchenne and Becker type Facioscapulohumeral type Limb-girdle type Distal type Oculopharyngeal type Congenital type Emery-Dreifuss type Muscle groups predominantly affected and other characteristic features Calf hypertrophy, girdles, proximal limbs, peroneal Face, shoulder, biceps, peroneal Girdles, proximal limbs Distal limbs Extraocular, facial, pharyngeal, girdles Generalized, neonatal or infantile onset Elbow contracture, shoulder girdle, proximal upper limb, peroneal, a families with other form (s) of inheritance pattern also have been reported Mode of inheritance X-linked Autosomal dominant Autosomal recessive a Autosomal recessive a Autosomal dominant Autosomal recessive X-linked a

3 근이영양증에서면역조직화학염색의진단적의의 Table 2. Current classification of muscular dystrophy Disease Inheritance Gene location Locus/disease symbols Gene symbol (protein) Duchenne/Becker XR Xp21.2 DMD/BMD DMD (dystrophin) Emery-Dreifuss X-linked Autosomal dominant XR Xq28 1q21 EMD EDMD- EMD (emerin) LMNA (lamin A/C) Facioscapulohumeral 4q35 FSHD? Limb-girdle Dominant 5q31 1q11-q21 3p25 6q23 7q LGMD1A LGMD1B LGMD1C LGMD1D LGMD1E TTID (myotilin) LMNA (lamin A/C) CAV3 (caveolin 3)?? Recessive 15q15.1 2p13 13q12 17q12-q q12 5q33 17q12 9q31-q34 19q13.3 2q31 LGMD2A LGMD2B LGMD2C LGMD2D LGMD2E LGMD2F LGMD2G LGMD2H LGMD2I LGMD2J CAPN3 (calpain-3) DYSF (dysferlin) SCGG (γ-sarcoglycan) SCGA (α-sarcoglycan) SCGB (β-sarcoglycan) SCGD (δ-sarcoglycan) TCAP (telethonin) TRIM32 (E3-ubiquitine ligase) FKRP (fukutin-related protein) TTN (titin) Congenital Merosin deficient CMD Fukuyama CMD CMD with integrin deficiency Muscle-eye-brain disease Walker-Warburg syndrome Rigid spine syndrome CMD with secondary merosin deficiency 1 CMD with secondary merosin deficiency 2 CMD with severe mental retardation and abnormal glycosylation of dystroglycan Ullrich syndrome 6q2 9q31-q33 12q13 1p3 9q34 1p36 1q42 19q1 22q12 21q22 2q37 MDC1A MEB WWS RSMD1 MDC1B MDC1C MDC1D UCMD UCMD LAMA2 (laminin α2 chain) FCMD (fukutin) ITGA7 (integrin α7) POMGNT1 (O-mannose β-1,2-nacetylglucosaminyl transferase) POMT1 (O-manosyl transferase 1) SEPN1 (selenoprotein N1)? FKRP (fukutin-related protein) LGE (like-glycosyltransferase) COL6A2 (collagen type VI subunit (2) COL6A3 (collagen type VI subunit (3) Distal Miyoshi myopathy Tibial muscular dystrophy (Udd) Hereditary inclusion body myopathy / distal myopathy with rimmed vacuoles Autosomal dominant distal myopathy Adult onset distal myopathy 2p q31 9p1-q1 14q11.2 8p22-q11 12q13-q22 MM TMD HIBM/ DMRV MPD1 MPD2 MPD3 DYSF (dysferlin) TTN (titin) IBM2 (GNE) (glucosamine (UDP-N-acetyl)-2-epimerase/ N-acetylman nosamine kinase G)??? 지를알아낸다면, 어느아형에속하는지알수있을뿐만아니라돌연변이를검출하기위해서는어떤유전자를검사하여야할것인지를알수있으므로연구에드는시간, 노력, 그리고비용을현저히절감할수있다. 현재이러한목적으로사용되는 단백검출방법은 IHC 와웨스턴블럿 (western blot; WB) 의두가지면역학적방법인데, IHC 는 WB 에비해검사시간이덜소요되고경제적이며단백의조직내분포를알수있다는장점이있어널리사용되고있다.

4 김대성 Figure 2. A schematic illustration showing the locations of muscle proteins (square boxes) affected by various types of muscular dystrophy. 근조직에서면역조직화학염색의방법 Laminin α2, collagen VI, emerin 등은피부등다른조직에서도발현되므로선천성근이영양증의일부와 Emery Dreifuss 형근이영양증은피부생검을통한 IHC 검사로도진단이가능하지만 10,11 대부분의근이영양증에서는 IHC 진단에근조직을사용하여야한다. 생검으로얻은근조직은즉시액체질소로냉각된 isopetane 에넣어급속냉동시킨후즉시, 혹은 -80 에보관하였다가 IHC 에사용한다. 12 조직절편은 -20 이하로온도가유지되는동결절편기내에서얻어슬라이드에부착하는데, 절편의두께는 5-6 µm가적당하고, 얻은절편은실온에서약 20분정도건조한후아세톤이나메틸알콜로고정시킨다. 항원 -항체반응에서나타나게되는배경 (background) 의비특이적인반응을억제시킬목적으로우혈청단백 (0.1% bovine serum albumin) 이나세정제인 0.2% Triton X 등의차단용액 (blocking solution) 을사용한다. 차단용액은일차항체와이차항체를투여하기전후에각각조직에배양시키는데, 그온도와시간은각검사실마다적정화하여야한다. 근이영양증에사용되는 일차항체들은다양한종류가시판되고있다 (Table 3). 일차항체는제조사에서권고하는배율로증류수에희석하여사용하는데대부분권고농도보다다소낮은농도에서도좋은결과가나타나므로희석배율은각검사실마다적정화할수있다. 항원 - 항체반응을검출하는방법은효소를부착한일차항체만을사용하는직접검출법 (direct method) 과일차항체와동종의면역글로불린에대한이차항체를사용하여검출하는간접검출법 (indirect detection method) 이있는데, 대부분검출강도가우수한간접검출법이사용된다. 대표적인방법으로는 biotin 이부착된이차항체를일차항체와반응시킨후효소 ( 예 ; peroxidase) 나형광색소 (fluorochrome) 에결합된 sterptavidin 이나 avidin 복합물을반응시키게된다. Sterptavidin 혹은 avidin 은 biotin 에대한친화성이매우높으므로이차항체와쉽게결합하여항원-항체반응의검출민감도를현저히높일수있다. 표지자로 peroxidase 와같은효소를사용하는경우에는기질 (substrate) 과색원체 (chromogen) 에다시반응을시켜야하지만 [peroxidase 를사용하는경우에는 peroxide( 기질 ) 와색원체로서 diaminobenzidine (DAB) 을주로사용 ] 형광색소를사용

5 근이영양증에서면역조직화학염색의진단적의의 Table 3. Antibodies used for studies of muscular dystrophy and their suppliers Antigen Supplier and code Dilution Application Dystrophin N-terminal NCL-Dys 3 1:20 Absent in DMD Reduced, uneven in BMD Mosaic in manifesting carrier Occasionally reduced in sarcoglycanopathies Dystrophin rod domain NCL-Dys 1 Neat As above Dystrophin C-terminal Utrophin (N-terminus) Emerin α-sarcoglycan β-sarcoglycan γ-sarcoglycan δ-sarcoglycan α-dystroglycan β-dystroglycan Dysferlin NCL-Dys 2 NCL DRP2 NCL EMERIN NCL a-sc NCL b-sc NCL g-sc NCL d-sc Upstate biotechnology VIA4-1 NCL b-dg NCL Hamlet 1:20 As above 1:2 High on regenerating fibers Overexpressed in DMD and BMD 1:40 Absent in X-linked EDMD 1:50 Reduced or absent in sarcoglycanopathies (LGMD2C-2F) and dystrophinopathies (DMD, BMD) 1:50 Reduced or absent in sarcoglycanopathies (LGMD2C-2F) and dystrophinopathies (DMD, BMD) 1:30 Reduced or absent in sarcoglycanopathies (LGMD2C-2F) and dystrophinopathies (DMD, BMD) 1:25 Reduced or absent in sarcoglycanopathies (LGMD2C-2F) and dystrophinopathies (DMD, BMD) 1:100 Reduced or lost in some congenital muscular dystrophies (FCMD, MEB, WWS, MDC1C) and LGMD2I 1:5 Reduced in dystrophinopathies (DMD and BMD) 1:40 Reduced or lost in LGMD2B and MM Caveolin 3 Transduction laboratories 1:500 Reduced or absent in LGMD1C Merosin (laminin α2 chain) NCL MEROSIN 1:100 Reduced or absent in merosin deficient congenital muscular dystrophy DMD; Duchenne's muscular dystrophy, BMD; Becker's muscular dystrophy, EDMD; Emery-Dreiffus muscular dystrophy, LGMD; limb-girdle muscular dystrophy, FCMD; Fukuyama type congenital muscular dystrophy, MEB; muscle-eye-brain disease, WWS; Walker-Warburg syndrome, MDC1C; congenital muscular dystrophy type 1C 하는경우에는이러한과정이불필요하다. 표지자로효소를사용하면염색결과를일반현미경으로도쉽게관찰할수있고오랫동안보존할수있으며조직의다른구조물도함께관찰할수있다는장점이있지만, 형광색소를사용하는경우에비해검사시간이오래걸리고염색의대비가뛰어나지못하며 DAB 등과같은유해한물질을사용하여야만하는단점이있으므로사용하는목적과여건에따라적절히선택하여야한다. 13 각종근이영양증에서의면역조직화학염색소견 1. 디스트로핀결손형근이영양증들 (dystrophinopathies; DMD, BMD, carriers of dystrophinopathies) 1) DMD 전체환자의약 40% 에서는 IHC 에서디스트로핀이완전히소실된형태로나타나고 (Fig. 3-B), 나머지환자들에서는다양한형태로디스트로핀의발현이감소된다. 즉, 어떤경우에는일부근육세포에서만발현이되고, 다른경우에는전체근육에광범위하게디스트로핀염색이감소된형태로나타나기도하는데이러한이유로디스트로핀염색의정도를등급화하여분류하기

6 김대성 Table 4. Grading system for dystrophin labeling 14 Grade Dystrophin labeling on sections 1 No labeling on any muscle fibers 2 Faint labeling on occasional fibers; majority of fibers negative 3 Clear labeling on occasional fibers; generally less than 1% 4 Low intensity labeling on up to 50% fibers (± occasional more strongly labeled fibers) 5 Low-intensity labeling on almost all fibers 6 Variable intensity labeling (variation between and/or within fibers) 7 Moderately and uniformly decreased labeling 8 Near-normal labeling intensity 도한다 (Table 4). 14 DMD 환자들의 IHC 에서종종발견되는일부디스트로핀양성근섬유를소위 'revertant fiber' 라고하는데 (Fig. 3-C), 일부근섬유에서이차적으로체세포돌연변이 (somatic mutation) 가일어나해독틀 (open reading frame) 이회복됨으로써디스트로핀이발현된것으로보인다. 15 하지만연속절편을만들어조사해보면디스트로핀양성인근섬유분절의길이는대부분 1 mm 이내에불과하며전체근섬유의 1% 미만인경우가대부분인것으로알려졌다. 한편디스트로핀의발현이전체적으로감소되어나타나는경우는완전히소실된경우에비해증상이경한경우가많다고한다. 14 Utrophin 은디스트로핀과상동단백 (homologue protein) 으로서정상성인에서는신경 -근접합부에서만발현되지만 DMD 에서는그발현이상향조절되어디스트로핀양성의근섬유를제외한거의모든골격근형질막에서나타난다. 16 하지만 utrophin 은그원인에관계없이모든재생근섬유 (regenerating fiber) 에서도발현되므로염증성근육병이나다른근이영양증을 DMD 나 BMD 로오진하지않도록주의하여야한다. 17 디스트로핀은 dystroglycan, sarcoglycan 등과함께연결되어근섬유의골격이되는디스트로핀 -당단백복합체 (dystrophinglycoprotein complex, DGC) 를이루고있으므로 dystrophin 이결손되면디스트로핀에연결된여러가지당단백의발현이심하게저하된다. 18 Figure 3. The immunohistochemical stain patterns of dystrophinopathies. (A) Normal control, (B) Muscle from a patient with Duchenne's muscular dystrophy shows complete loss of dystrophin immunoreactivity. (C) A few dystrophin-positive muscle fibers (revertant fibers) are seen in Duchenne's muscular dystrophy. (D) Reduced and irregular expression of dystrophin in Becker's muscular dystrophy. (E) Muscle from a patient with Becker's muscular dystrophy shows near-normal expression of dystrophin. (F) A mosaic staining pattern of dystrophin from a manifesting carrier of Duchenn's muscular dystrophy. Anti-dystrophin C-terminal antibody (NCL-dys2,, UK) was used for immunohistochemistry ) BMD DMD 의경우대부분의근섬유에서디스트로핀의발현이소실되거나현저히감소되므로 IHC 만으로진단이가능하지만 BMD 의경우모든근섬유에서디스트로핀발현이감소된경우부터거의정상으로발현되는경우까지다양하게분포하므로 IHC 만으로는다른근이영양증과감별이불가능한경우가있다. 19 이러한이유로 BMD 에서는 WB 를병행하여야만다른종류의근이영양증과확실하게감별할수있다. BMD 에서가장흔하게보이는 IHC 소견은근섬유간에디스트로핀발현이과도한변이성 (excessive variability) 을보이는것으로서 (Fig. 3-D) 전체 BMD 환자의 80% 정도가이범주에든다고하고, 모든근섬유에서디스트로핀발현이중등도로감소되는경우가그다음으로흔하며, 일부환자에서는거의정상적으로발현되는데 (Fig. 3-E) 이런경우는증상도비교적경하다고한다. 또한 BMD 에서디스트로핀분자의서로다른부위에대한항체들을사용해 IHC 검사를해보면크게모든항체들에서디스트로핀발현의과도한변이성을보이는경우와한가지종류의항체에서만심한이상소견을보이는경우로나눌수있다. 20

근이영양증에서면역조직화학염색의진단적의의 3) 디스트로핀결손형근이영양증의보인자 (carriers of dystrophinopathies) DMD 나 BMD 의여성보인자들의대부분은디스트로핀 IHC 검사에서정상소견을보이는데이는 X 염색체의무작위불활성화 (random X inactivation) 에의해약 50%

7 근이영양증에서면역조직화학염색의진단적의의 3) 디스트로핀결손형근이영양증의보인자 (carriers of dystrophinopathies) DMD 나 BMD 의여성보인자들의대부분은디스트로핀 IHC 검사에서정상소견을보이는데이는 X 염색체의무작위불활성화 (random X inactivation) 에의해약 50% 에달하는정상근섬유핵이디스트로핀을합성함으로써비정상근섬유핵의기능에충분한상보작용을일으킨결과이다. 21 하지만일부환자에서는디스트로핀이제대로발현되지않는근섬유들이발생하는데, 이런경우소위 ' 모자이크양상 (mosaic pattern)' 의디스트로핀 IHC 소견이나타나며 (Fig. 3-F), 이런환자들의상당수는근력저하의증상이있는여성보인자들 (manifesting carriers) 이다. 22 따라서특별한가족력이없는여성근이영양증환자에서는반드시디스트로핀 IHC 검사를하여 DMD 보인자일가능성을배제하는것이매우중요한데, 이를간과하면다른종류의근이영양증이나비유전성의근육병으로오진하게된다 Emery-Dreifuss 형근이영양증 X 염색체유전의 Emery-Dreifuss 형근이영양증 (X-linked Emery-Dreifuss muscular dystrophy; EMD) 은 emerin을부호화하는 STA 유전자의돌연변이로인해발생하는데 emerin 은핵막 (nuclear membrane) 에위치한다. Emerin 은피부에서도발현되므로피부생검을하여검사할수도있다. 환자에서는피부와근육모두에서모든핵의 emerin 발현이소실됨을관찰할수있고보인자의경우적게는 10% 정도의핵에서만 emerin 이발현되는것으로알려져있다. 11 이에반해상염색체우성으로유전되는 Emery-Dreifuss 형근이영양증 (EDMD-) 은 LGMD1B 와마찬가지로 lamin A/C 의결손에의해발병하므로두질환은상동질환으로간주되고있다. Lamin A/C는 emerin 과유사하게핵주위 (perinuclear) 에서발현되는데 IHC 의진단적의미는아직불투명하다 지대형근이영양증 (limb-girdle muscular dystrophy; LGMD) 지대형근이양증은주로사지근위부가침범되어점진적인근력저하가나타나는질환군으로서임상소견만으로는그아형분류가거의불가능하므로 IHC 를이용해각증례별로결손단백질을분석하는작업이필요하다. 특히몇가지발병단백질들에대한항체를동시에사용하여검사하면상당수의환자에서그아형을진단할수있으므로 IHC 검사가가장유용한근이영 양증군중하나이다. 25 결손단백질이확인되어아형이결정되면분자생물학적분석을하여그아형을유발하는유전자를검사함으로써돌연변이를최종적으로진단할수있다. 현재 LGMD 의아형중에서 IHC 검사가진단에유용한대표적인경우는 sarcoglycan 돌연변이에의한 LGMD2C-2F 형, dysferlin 돌연변이에의한 LGMD2B 형과 caveoolin 3 돌연변이에의한 LGMD1C 형등이있고, α-dystroglycan 의발현이이차적으로저하되는 LGMD2I 에관한설명은편의상선천성근이영양증에서언급하고자한다. 나머지아형들의경우 IHC 검사법이아직제대로확립되어있지않거나임상형과의상관관계가불명확하여진단에적극적으로활용되지못하고있는상황이다. 1) Sarcoglycan 결손형근이영양증 (sarcoglycanopathies, LGMD2C-2F) Sarcoglycan (SG) 복합체는디스트로핀및 dystroglycan 과결합하여디스트로핀 -당단백복합체 (dystrophin-glycoprotein complex, DGC) 를구성하는성분으로서골격근형질막에존재한다. 골격근의 SG 복합체는 α-sg, β-sg, γ-sg, 그리고 δ- SG의 4개의아단위로구성되는데각각의 SG 아단위들은별개 Figure 4. Immunohistochemical stain of sarcoglycanopathies. In a patient with -sarcoglycan mutation (-SGP), expression of -, -, and -sarcoglycan is markedly reduced, while the -sarcoglycan expression is only mild to moderately reduced. In a patient with -sarcoglycan mutation (-SGP), the expression of all sarcoglycan isoforms is completely lost. In a patient with a frameshift mutation of -sarcoglycan (-SGP), the expression of -sarcoglycan is completely lost, while others, especially -sarcoglycan, show some residual activities. From Kim et al. unpublished data. Dys-C; anti-dystrophin C-terminal antibody (NCL-dys2,, UK), -SG; anti- -sarcoglycan antibody (NCL a-sc,, UK), - SG; anti--sarcoglycan antibody (NCL b-sc,, UK), -SG; anti--sarcoglycan antibody (NCL g-sc,, UK), -SG; anti--sarcoglycan antibody (NCL d-sc,, UK).

8 김대성 의유전자에의해만들어진다. 26 이들 SG 아단위의돌연변이는각각 DMD 와유사한조기발병의심한근이영양증을유발하게되므로이전에는한때 ' 듀센양상염색체열성근이영양증 (Duchenne-like autosomal recessive muscular dystrophy)' 27 혹은 ' 중증소아상염색체열성근이영양증 (severe childhood autosomal recessive muscular dystrophy; SCMD)' 28 이라는이름으로불리기도하였다. IHC 검사는 sarcoglycanopathy (SGP) 의진단에유용하게사용되는데, SG 아단위하나의돌연변이는 SG 복합체전체의소실을일으키는경우가많다. 29 이러한현상은 β-sgp (LGMD2E) 와 δ-sgp (LGMD2F) 에서특히두드러지는데 (Fig. 4), 이러한이유로과거에는 α-sg 에대한항체하나만을사용하여 SGP 의검출에사용한연구들이많았다. 하지만 α-sgp (LGMD2D) 의일부와 γ-sgp (LGMD2C) 에서는돌연변이가일어난아단위가비교적선택적으로소실됨이알려짐으로써 30,31 최근에는 2가지이상의아단위에대한항체를동시에사용하도록권고하고있다. 이러한현상은 SG 복합체의합성과정에서 α- 및 γ-sg 가근간을이루는복합체를최초로형성하고, α- 및 γ-sg가 β- 와 δ-sg 의복합체에결합되는순서를취한다는사실과관계가있을것으로생각된다. 32 α-sgp (LGMD2D) 에서보이는전형적인 IHC 소견은 α-sg 의발현이완전히소실되고다른아단위들의발현은다양하게감소되는것이다. 하지만일부에서는 α-sg가완전히소실되지않고감소된형태로나타나는데이러한환자들의경우과오돌연변이 (missense mutation) 에의한경우가많고임상증상도상대적으로가벼운경우가많다고한다. 33,34 α-sg 에발생하는과오돌연변이중, 특히 R284C 돌연변이는일부 α-sg의발현이나타나면서상대적으로경한증상을유발하는것으로알려져있다. 35 γ-sgp (LGMD2C) 환자들의경우상당히특징적인 IHC 소견을보이는데, 대부분에서 γ-sg 가선택적으로소실되고나머지아단위들, 특히 α-sg과 δ-sg 의발현은비교적잘유지되므로네가지 SG에대한항체를모두사용하여 IHC 검사를하면돌연변이가어느아단위에서발생하였는지를가장쉽게예측할수있다 (Fig. 4). 31 SG 복합체는디스트로핀, dystroglycan 과함께 DGC 를구성하고있으므로디스트로핀의결손이있으면 SG 아단위들도이차적으로감소되거나소실된다. 따라서 SGP 의진단을위해서는반드시디스트로핀 IHC 를동시에검사하여디스트로핀이정상이라는것을확인하여야한다. Figure 5. Dysferlin immunohistochemistry in limb-girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) and Miyoshi myopathy (MM). Dysferlin activities are completely lost in both patients with LGMD2B and MM. Mutation analysis was not performed in these patients. Dys-C; anti-dystrophin C-terminal antibody (NCL-dys2,, UK), Dysf; anti-dysferlin antibody (NCL-hamlet,, UK). 2) Dysferlin 결손형근이영양증 (dysferlinopathy, LGMD2B and Miyoshi myopathy) LGMD2B 와미요시근병증 (Miyoshi myopathy; MM) 은공히 dysferlin 결손에의해발병하는상동질환이다. 36 Dysferlin 은골격근형질막에존재하는단백질로서 IHC 검사를하면 LGMD2B 와 MM 모두에서골격근형질막에서의발현이소실되거나현저히저하되어나타나는데 (Fig. 5), 한연구에서는해독틀돌연변이 (frameshift mutation) 에의한경우에는완전소실되나과오돌연변이가있는경우에는발현이저하된소견만을보였다고한다. 37 한편 LGMD2A 나 LGMD1C 에서도 dysferlin 의발현이이차적으로저하되는경우가있으므로그해석에주의하여야한다. 38 Dysferlin 결손형근이영양증은혈중 creatine kinase 가대개정상치의 10배이상으로현저히증가되고근생검조직에서염증세포의침윤이흔히발견되는특징이있다. 39 일본의경우 LGMD2B 형은 LGMD2A 형에이어두번째로흔한지대형근이영양증의아형으로알려져있는데, 38 우리나라에서도역시 LGMD2B 형이비교적흔한아형일것임을시사하는연구결과가있다. 40

9 근이영양증에서면역조직화학염색의진단적의의 3) Caveolin 3 결손형근이영양증 (caveolinopathy, LGMD1C) Caveolin-3 는골격근형질막에존재하는단백으로서세포신호 (cell signaling) 에관여하는것으로알려져있는작은함몰 (caveola) 의주요구성성분이다. 근육세포에서 caveolin-3 는 DGC 에결합하고여러가지신호경로 (signaling pathway) 에관여하고있다. 41,42 Caveolin-3 의돌연변이는 LGMD1C 43 뿐만아니라원인불명의크레아틴카이네이즈혈증 (hyperckemia), 44 원위형근이양증, 45 rippling muscle disease 46 등다양한형태의근육병을유발한다. LGMD1C 형의 IHC 검사에서 caveolin 3의발현은골격근형질막에서거의완전히소실되거나현저히감소하는경우가대부분이지만돌연변이가발견된환자에서거의정상으로발현되었던예도보고되어있다. 47 LGMD1C 형에서는이차적으로 dysferlin 의발현이저하되는것으로알려져있지만 38,48 LGMD2B 형이나 MM 에서는 caveolin 3이정상적으로발현된다 선천성근이영양증 (congenital muscular dystrophy; CMD) 선천성근이영양증은출생시혹은출생직후부터나타나서진행하는근위축및근력저하, 혈중 CK 의상승, 그리고근생검에서근세포괴사및재생의소견을보이는질환군으로서다양한중추신경계이상이흔히동반된다. 선천성근이영양증중에서 IHC 검사가유용한경우는 merosin (laminin α2) 결손형선천성근이영양증 (merosin deficient congenital muscular dystrophy; MDC1A), collagen VI 결손에의한 Ullrich 형선천성근이영양증 (Ullrich type congenital muscular dystrophy; UCMD) 과 Bethlem 근병증 (Bethlem myopathy), 그리고당전달효소 (glycosyltransferase) 의결손으로인해이차적으로 α- dystroglycan 의발현이저하되는질환들로서 Fukuyama 형선천성근이영양증 (Fukuyama type congenital muscular dystrophy; FCMD), muscle-eye-brain 병 (MEB), Walker-Warburg 증후군 (WWS), 선천성근이영양증 1C형 (congenital muscular dystrophy type 1C; MDC1C) 등이있다. 1) Merosin 결손형선천성근이영양증 (merosin deficient congenital muscular dystrophy; MDC1A) Merosin (laminin 2) 은 laminin의여러가지동종단백중하나로서 α2β1γ1 사슬 (chain) 로구성되어있는데이중 α2 사슬의돌연변이에의해발병한다. 49 Merosin 결손형선천성근이영양증은지능저하나뇌의구조적이상은동반되지않지만뇌자기공명영상에서광범위한백질의변화를보이는특징이있 Figure 6. Merosin immunohistochemistry in a patient with merosin deficient congenital muscular dystrophy. (A) Patient's brain MRI shows diffuse periventricular white mater change on T2 weighted images. (B) Hematoxylin and eosin stain shows findings compatible with muscular dystrophy ( 100). (C) Merosin is normally expressed in control muscle ( 100). (D) Patient's muscle showed marked reduction of merosin activity ( 100). This patient showed unusually mild phenotype of merosin deficient congenital muscular dystrophy. Mutation analysis was not performed. For immunohistochemistry, antimerosin antibody (NCL MEROSIN,, UK) was used. From Kim, et al., unpublished data. 다 (Fig. 6-A). Merosin 결손형선천성근이영양증환자들은 IHC 검사에서골격근형질막의 merosin 발현이완전히소실되거나현저히감소된소견을보인다 (Fig. 6-B). Merosin 은골격근, Schwann 세포, 피부, 영양막 (trophoblast) 등에분포하므로피부등을사용한 IHC 검사로도진단이가능하다. 10,50 2) Ullrich 형선천성근이영양증 (UCMD) 과 Bethlem 근병증 UCMD 는출생직후부터발생해진행하는근력저하, 근위부의관절구축 (proximal joint contracture), 원위부관절의이완 (distal joint laxity)(fig. 7), 그리고정상지능이특징인질환으로서 collagen VI 유전자의열성돌연변이에의해발병한다. 51 이에반해 Bethlem 근병증은비교적경한근력저하와함께경부, 팔꿈치, 무릎등의관절에다발성의굴곡구축 (flexion contracture) 이발생하며 collagen VI 유전자의우성돌연변이에의한다. 52 Collagen VI는세포외기질 (extracellular matrix) 에존재하는단백질이므로근육조직외에도결체조직을포함하는다른

김대성 조직 ( 예 ; 피부 ) 에서 IHC 검사를할수있다. 따라서정상인의근육조직에서 collagen VI는근육다발막 (perimysium) 과근섬유막 (endomysium) 에서관찰할수있는데, UCMD 에서는그발현이완전히소실되거나감소되고 53 Bethlem 근병증에서는감소된다. 54 Figure 7.

Collagen VI immunohistochemistry was not performed in this patient. Figure 8. The immunohistochemical findings in a patient with Walker Warburg syndrome (WWS).

10 김대성 조직 ( 예 ; 피부 ) 에서 IHC 검사를할수있다. 따라서정상인의근육조직에서 collagen VI는근육다발막 (perimysium) 과근섬유막 (endomysium) 에서관찰할수있는데, UCMD 에서는그발현이완전히소실되거나감소되고 53 Bethlem 근병증에서는감소된다. 54 Figure 7. Joint hyperlaxity at first metatarso-phalangeal joint from a patient with Ullrich congenital muscular dystrophy. Muscle biopsy was compatible with muscular dystrophy (not shown). Collagen VI immunohistochemistry was not performed in this patient. Figure 8. The immunohistochemical findings in a patient with Walker Warburg syndrome (WWS). A complete loss of the immunoreactivity is observed against the monoclonal antibody VIA4-1 against -DG, while it appears normal around muscle fibers when the polyclonal antibody GT20G against -DG was used. Antibody VIA4-1 specifically recognizes glycosylated epitope of -DG, while the polyclonal antibody GT20G recognizes its core protein. Thus, this finding strongly suggests the defect of glycosylation in -DG, rather than the primary defect. -DG (-dystroglycan) is well preserved but the laminin 2 chain shows mild reduction. Bar=20 µm. From Kim DS, Hayashi YK, Matsumoto H, Ogawa M, Noguchi S, Murakami N, et al. POMT1 mutation results in defective glycosylation and loss of laminin-binding activity in alpha-dg. Neurology 2004;62: ) α-dystroglycan 의결손이이차적으로발생하는선천성근이영양증들 (congenital muscular dystrophies associated with secondary deficiency of α-dystroglycan, α-dystroglycanopathies) α-dystroglycan (α-dg) 은 DGC 의구성원으로서골격근형질막에분포하고, 기저막 (basal lamina) 에고정되어있는 merosin의 laminin α2 chain, 그리고 β-dystroglycan (β- DG) 에결합한다. α-dg 는당화 (glycosylation) 가많이되어있는단백으로서 laminin α2 chain 과의결합은당화과정에서합성된글리칸 (glycan) 에의해매개되는것으로알려져있는데, α-dg 에서의당화과정은척추동물의단백에서흔치않은 O-mannosylation 에의한다고알려져있다. 55 FCMD, MEB, WWS, MDC1C, LGMD2I 등은모두가당전달효소혹은잠정적으로당전달효소로생각되는단백들의돌연변이에의해발병한다는공통점을가지고있는데 α-dg 의당화된항원결정기 (glycosylated epitope) 에반응하는항체 (VIA4-1, Upstate biotechnology, USA, Table 3) 를사용하면 IHC에서모두그발현이소실된다는공통점이있어최근에는이들을 α-dystroglycanopathy 라고부르기도한다. 56 하지만이러한현상은실제로 α-dg 가소실되어나타나는것이아니라단백표면의당화과정의장애로인해나타나는현상이므로 α-dg 의핵심단백 (core protein) 에반응하는항체를사용하면정상적으로발현됨을확인할수있다 (Fig. 8). 57 결론 이상에서살펴본바와같이근이영양증에서의 IHC 검사는임상소견과일반적인조직화학염색법만으로진단하기힘든근이영양증아형들의감별진단에대단히유용할뿐만아니라환자의임상형과그중증도를예측하는데에도도움이된다. 또한특정단백의결손이 IHC 에서증명되면그발병유전자를예측할수있으므로근이영양증의유전학적연구에도반드시필요한검사법이다. 하지만돌연변이가발생하지않은단백들에서도이차적으로발현이소실되거나감소되는경우가흔히있으므로그판정에주의하여야한다. 역설적으로이러한현상이 α- dystroglycanopathy 와같은일련의질환들을인지하는데도

11 근이영양증에서면역조직화학염색의진단적의의 움이되기도하지만정확한진단을위해서는충분한종류의항체들을동시에사용하여 IHC 검사를할필요가있다. IHC 는기술적으로는비교적간단한검사법이지만다양한종류의일차항체를동시에사용하여검사하려면시간과비용의소모가크고검출의효율이떨어진다는단점이있다. 따라서각검사실은의뢰되는검체의수와검사인력등을감안하여 IHC 검사의대상과사용하는항체의종류를결정할필요가있겠다. 예를들어디스트로핀결손형근이영양증 (DMD, BMD) 은전체근이영양증환자의절반이상을차지하므로가능하다면근이영양증이의심되는모든검체에디스트로핀 IHC 검사를하는것이좋겠다. 하지만 LGMD 의경우저자의경험으로는약 25-30% 에서만 IHC 검사로그아형을검출할수있으므로추가로 5-6 가지이상의항체를사용해검사하는것은비용과시간에비해그효율이떨어진다. 또한여러가지항체를사용한 IHC 검사결과의질적인측면을유지하려면대상검체의수가일정수준이상꾸준히유지되어야하고숙달된인력이필요하므로근생검을자주하지않는의료기관에서는시행하기가힘들다. 저자가속한의료기관의경우모든근이영양증환자들에서디스트로핀 IHC 검사를하고있지만다른종류의항체들을사용한 IHC 검사는연구목적으로만하고있다. 요약하자면근이영양증에서 IHC 검사는그아형진단을위해서, 그리고근이영양증연구의시발점이라는점에서매우중요한검사기법이지만, 일부아형만을검출할수있다는한계점이있고해석에혼동을줄수있는여러가지요인들이있으므로검사에필요한인력과비용을감안해각의료기관의여건이나연구자의목적에따라적절히선택하여야할것이다. REFERENCES

12 김대성 α γ

13 근이영양증에서면역조직화학염색의진단적의의

04-(최영철)16-23.hwp

04-(최영철)16-23.hwp Korean Journal of Neuromuscular Disorders Vol. 4, 2012 ISSN 2092-5077 Korean Journal of Neuromuscular Disorders Vol. 4, June 2012 팔다리이음근육디스트로피의진단및치료 연세대학교의과대학신경과학교실 박형준정주리최영철 Diagnosis and Therapy of Limb