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매리 한
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1 원저 연세대학교의과대학신경과학교실 Dysferlin Expression in Skeletal muscles of Patients with Myopathy and Cultured Human Myoblast/Myotube Eung Young Lee, M.S., Young-Chul Choi, M.D., Ph.D. Departments of Neurology, Brain Korea 21 Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Background: Dysferlin is a 230 kda protein of the sarcolemma. This encoding gene is mutated in patients with dysferlinopathy (limb-girdle muscular dystrophy 2B and Miyoshi myopathy), which is characterized byan active muscle degeneration and regeneration process. Dysferlin is known to play an essential role in muscle signaling and muscle fiber repair. We studied the gene to define its functional role in muscle repair and differentiation in human skeletal muscle of the patients with myopathies and cultured human myoblast. Methods: An immunohistochemical analysis of dysferlin and N-CAM in biopsied muscle tissue obtained from eleven patients with myopathies [six patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD), two patients with dermatomyositis (DM), two patients with polymyositis (PM), and one patient with dysferlinopathy (MM)] and eight normal controls. Cultured human myoblast obtained from normal muscle tissue was also analyzed by the expression of dysferlin through immunocytochemical staining and western blot. Results: The immunoreactivity of dysferlin was strongly expressed in regenerative muscle fibers of myopathies except dysferlinpathy, which was co-localization with N-CAM by double immunohistochemistry. By western blot analysis, the expression level of dysferlin was variable in myopathies compared to normal controls, but no expression in dyferlinopathy. The expression of dysferlin in myotubes was significantly increased compared to that in myoblast by immunostaining and western blot analysis. Conclusions: These results indicated that the expression of dysferlin increased in regenerative and degenerative muscle fibers and also increased in myoblast differentiation. Our study supports that dysferlin not only has a role in skeletal muscle development but also in regeneration/repair process. J Korean Neurol Assoc 25(4): , 2007 Key Words: Dysferlin, Myopathy, Myoblast, Degeneration, Regeneration, Differentiation 서론 Dysferlin 유전자는 1994 년지대형근이영양증 2B 형 (limb- Received June 25, 2007 Accepted August 2, 2007 *Young-Chul Choi, M.D., Ph.D. Department of Neurology, Yongdong Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, Dogok-dong, Gangnam-gu, Seoul, , Korea Tel: Fax: ycchoi@yuhs.ac * This work was supported by the Brain Korea 21 Project for medical Science, Yonsei University. girdle muscular dystroph y 2B; LGMD2B) 을연구하던 Bashir 등과 1998 년미요시근병증 (Miyoshi myopathy) 을연구하던 Liu 등에의해클로닝되면서연구되기시작하였다. 이유전자는제2번염색체단완 2p13 에위치하며 55개의엑손 (exon) 으로구성되어있다. 1-3 Dysferlin 단백질은 230kDa 크기의분자로서골격근, 심장, 신장에높은농도로존재하고, 근섬유조직의경우근섬유막에존재하나 dysferlinopathy 환자의경우에는 dysferlin 유전자의돌연변이로인하여근골격에서단백질이결핍되어지대형근이영양증 2B형과미요시근병증등을일으킨다. 4 Dysferlin은 dystrophin glycoprotein complex J Korean Neurol Assoc Volume 25 No. 4,

2 (DGC) 를구성하지않으며, C-말단영역이세포막을가로질러근섬유의표면에발현된다. 5,6 Dysferlin 의기능은단백질결핍시에나타나는근섬유의괴사와퇴화를이유로치유및재생과의관련성이주장되고있고, 7 최근에는골격근막재생에관련된다고연구되었다. 8,9 Dysferlin 이결핍된미요시근병증또는지대형근이영양증 2B 형환자의근육은근섬유의퇴화뿐만아니라근병증과관련된염증반응도동반된다. 10 이러한염증과이와관련된보체반응경로의활성은근육재생의표지로여겨진다. 11 또한 dysferlinnull mice 를사용한최근연구는 dysferlin 이막융합과회복절차를수반한다고제안하고있으며, 8 활성화된위성세포의수를확인한실험결과는 dysferlinopathy 환자의경우위성세포의수가정상인대조군에비해서는증가하였으나다른근병증을가진환자에비해서는적게증가하여재생과정에서 dysferlin 이중요한역할을한다는의견을제기하고있다. 12 이런결과에서 dysferlin 이결핍된근육의퇴화가근육을치유하는기관의파괴로인한것이라는점은질환의발병시세포막보전을위해작용하는세포기전의중요성을잘보여주는좋은예이다. 13 또한미세배열기술 (microarray) 을사용하여근육발생및세포내단백이동, 단백분해과정동안의유전자과발현을보여준 dysferlinopathy 유전자발현프로파일링 (geneexpression profiling) 은활성화된근육의퇴화와재생과정을암시하고있다. 14 Dysferlin 의기능을추측할수있는것중하나는칼슘의존인지질결합 (calcium dependent phospholipid binding) 과관련된 C2 영역의존재이다. 2,15 근육모세포융해와세포막재봉합과정은특정화된소포 (caveolae) 를사용하며, 이소포의칼슘민감도에의해융해과정이조절될것이라고여겨진다. 이는 dysferlin 이칼슘감지장치로서활동할것이라고추측할수있다. 16 또한이와관련하여근섬유소포내의막통과단백질인 caveolin-3 와 dysferlin 사이의상호작용인소포의신호표시기능도 dysferlin 의역할로제안되고있다. 17 Mouse cell line C2C12 를사용해수행된연구결과에따르면 dysferlin 이근육모세포에서는낮게, 성숙된근관세포에서는높게발현되었다. 18 그리고정상인의근세포배양에서 dysferlin 의 mrna 와단백질발현이근육모세포단계보다다핵화된근관세포에서더높아진다고보고되었다. 이는 dysferlin 이근육분화과정시에중요한역할을한다고추측할수있다. 19,20 근육은재생이가능한기관이며, 근육손상후일어나는재생과정은근육발생과정의일부와유사하다. 16 따라서본연구에서는배양된근세포에서발생및분화시의 dysferlin 발현과 증감을알아보고, 이와관련하여정상인과다양한근병증환자의골격근에서 dysferlin 이근조직의괴사, 염증반응시갖는특징및퇴화와재생에따른분포, 증감등의관계를확인하여그의의를알아보고자한다. 대상과방법 1. 대상 실험대상으로는정상인의근조직에서얻어배양한근육모세포및이를분화시킨근관세포와뒤시엔느형근이영양증환자 6명, 다발성근염환자 2명, 피부근염환자 2명, dysferlin 발현음성대조군으로 dysferlinopathy 환자 1명, 정상인 8명의근조직을사용하였다. 대상환자및정상대조군의근조직은모두진단목적으로근생검을시행하여얻었고, 환자의동의를얻어실험을진행하였다. 2. 방법 1) 세포배양및분화정상인의근조직 1-2 g을 phosphate buffer ph 7.2 (Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA) 로씻어낸후가위와칼을이용해잘게다졌다. 이조직을 20 ml 분해용액 [ 조성 : 2 ml 0.05% trypsin-0.53 mm ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA; Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA), 4 ml 0.2% collagenase type IV (Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA), 14 ml ph osph ate buffer (no Cl, Mg, ph 7.2)] 에담아 37, 5% CO 2 에서 분간처리하였다. 이차분해작용을위해 10 ml 0.05% trypsin-0.53 mm EDTA를첨가하고 37, 5% CO 2 에서 30분간처리한후 10 ml dulbecco s modified eagle medium (DMEM; Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA) -20% fetal bovine serum (Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA) 을첨가하여 trypsin 을중화시켰다. 40 μm 세포여과기 (Becton Dickson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA) 로걸러내세포를얻어내고 10 ml DMEM-20% fetal bovine serum 을첨가하여배양하였다. 세포분화를위하여세포밀도가 70% 이상자라면 DMEM-2% horse serum (Gibco BRL, Carlsbad, CA, USA) 으로배양액을교체하여주었다. 2) 골격근검체동결박절질소용액이담긴용기에 isopentane (Junsei Chemical Co, 522 대한신경과학회지제 25 권제 4 호, 2007

3 Tokyo, Japan) 이반쯤채워진비커를중탕시키고, isopentane 이점성이생길정도로온도가낮아지면, 준비된근조직생검을동결박절하기좋게정리하여몇초간담근후 -20 냉동고에서 30분간보관후 -70 냉동고로옮겨보관하였다. 조직의슬라이드제작을위하여동결시킨검체를 7 μm 두께로동결박절하였다. 3) 면역조직화학염색세포배양한슬라이드를차가운메탄올 (Junsei Chemical Co, Tokyo, Japan) 과아세톤 (Junsei Chemical Co, Tokyo, Japan) 1:1 혼합용액에고정시킨후, 2% bovine serum albumin (BSA; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA) 용액으로블로킹시켰다. Dysferlin 항체 (Novocostra Lab, Newcastle, UK) 를실온에서 1시간 30분간반응시킨후세척하고, biotin conjugated anti-mouse IgG (Vector Lab, burlingame, CA, USA) 를실온에서 30분간반응시켰다. 다시세척후 fluorescein avidin D (Vector Lab, burlingame, CA, USA) 를 30분간실온에서붙인후세척하고봉합하였다. 근조직의경우에는슬라이드를차가운아세톤에고정시킨후위의세포배양한슬라이드와동일한과정의첫번째염색을하고난뒤, 두번째블로킹을앞의조건과같이시행한후 N- CAM 항체 (Santa cruz Biotechnology, Santa cruz, CA, USA) 를 4 에서 24시간동안반응시켰다. 반응후세척하고 rhodamin conjugated anti rabbit IgG (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) 를 1시간붙였다. 마지막으로세척하고슬라이드를말린후봉합하고결과를현미경상에서확인하였다. 4) 단백질추출및웨스턴블롯팅 (western blotting) 배양한근세포와동결박절한근조직을같은방법으로 tris base 125 mm ph6.8 (Sigma aldrich Co, St. Louis, MO, USA), sodium dodecyl sulfate 4% (SDS; Amresco Co, Solon, OH, USA), glycerol 10% (Amresco Co, Solon, OH, USA), mercaptoethanol 5% (Sigma aldrich Co, St. Louis, MO, USA), dithiothreitol 100 mm (DTT; Amresco Co, Solon, OH, USA), phenylmethylsulfonyl fluoride 5 mm (PMSF; Amresco Co, Solon, OH, USA) 가함유된용액에넣고얼음위에서초음파처리하여균질화시킨후 5분간가열하고 13,000 rpm 으로 5분간원심분리하였다. 상층액을분리하여 -70 에보관하였다가사용직전 Bio-rad protein assay kit (Bio-rad, Hercules, CA, USA) 를이용하여 bradford 방법으로정량하였다. Bromophenol blue (Sigma aldrich Co, St. Louis, MO, USA) 를첨가한동량의단백질을 Bio-rad mini-protean II cell (Bio-rad, Hercules, CA, USA) 을이용하여 acryl-amide gel (Bio-rad, Hercules, CA, USA) 에전기영동하고 polyvinylidene fluoride (PVDF; Millipore, Bedford, MA, USA) 막 (membrane) 으로이동시켰다. 이동된막을 5% skim milk (Becton Dickson, Sparks, MD, USA), 0.05% tween 20 (Amresco Co, Solon, OH, USA) tris base 용액에실온에서 1시간블로킹시킨후 dysferlin 항체또는 actin 항체 (Santa cruz Biotechnology, Santa cruz, CA, USA) 를실온에서 3시간동안반응시키고세척하였다. 세척후 peroxidase conjugated anti mouse IgG (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) 또는 peroxidase conjugated anti rabbit IgG (Amersham, Arlington Heights, IL, USA) 를실온에서 1시간반응시키고다시세척후발색반응은 enhanced chemi-luminescence (ECL; Amersham, Arlington Heights, IL, USA) 를이용하여필름에감광시키고광학밀도 (optical density; O.D) 는 Quantity one 소프트웨어 (Bio-rad, Hercules, CA, USA) 를이용하여측정하고비교하였다. 결과 1. 근세포에서의 dysferlin 발현 정상인의근조직을이용하여얻어진근육모세포와근관세포의 dysferlin 발현정도를면역조직화학염색법으로비교하여보면근육모세포에서근관세포로의분화시세포막과세포질에서의단백발현이증가한것을볼수있었다 (Fig. 1). 세포배양시의세포수증가등으로인한오차를확인하기위하여웨스턴블롯팅을이용해정량적으로단백발현을확인해보았다. 일정한양을보이는 actin 의사진과비교하여보면, 근육모세포에서는 dysferlin 의발현이적어거의밴드를확인할수없었고근관세포에서는발현된양의증가로진한밴드를볼수있었다. 이를농도계 (densitometer) 를이용하여측정해본결과를그래프상으로보면근육모세포에서근관세포로분화하면서 7배가까이 dysferlin 이증가한것을확인할수있었다 (Fig. 2). 2. 정상인근조직에서의 dysferlin 발현근병증을가진환자와의 dysferlin 발현양상을비교하기위하여, 8명의정상인근조직을대조군으로사용하여 dysferlin J Korean Neurol Assoc Volume 25 No. 4,

Figure 1. Immunohistochemical staining of myoblast/myotube for dysferlin. ( 200 magnification) Figure 2.

단백의발현분포와증감을확인하였다. 실험방법은배양된근 세포와같이면역조직화학염색법과웨스턴블롯팅을시행하였다.

단백이일정하게발현되는것을볼수있었다 (Fig. 3, 4). 3. 뒤시엔느형근이영양증환자근조직에서의 dysferlin 발현 Figure 3.

4 Figure 1. Immunohistochemical staining of myoblast/myotube for dysferlin. ( 200 magnification) Figure 2. Western blotting in myoblast(a), myotube(b) for dysferlin. Graph shows the relative density of dysferlin in myoblast/myotube. 단백의발현분포와증감을확인하였다. 실험방법은배양된근 세포와같이면역조직화학염색법과웨스턴블롯팅을시행하였다. Dysferlin 항체를이용한면역조직화학염색슬라이드상에서는근섬유막에일정한형태와농도로 dysferlin 이염색된모습을관찰할수있었으며, 이를웨스턴블롯팅법으로정량적인확인을하여 8명의정상인근조직에서모두비슷한양의 dysferlin 단백이일정하게발현되는것을볼수있었다 (Fig. 3, 4). 3. 뒤시엔느형근이영양증환자근조직에서의 dysferlin 발현 Figure 3. Immunohistochemical staining of normal control for dysferlin. ( 200 magnification) 뒤시엔느형근이영양증환자군의 dysferlin 과 N-CAM 을이용한이중염색사진을보면괴사와재생이진행되는근섬유조직에 dysferlin 이강하게발현된모습을볼수있었다. 또한근조직의재생표지인자인 N-CAM 항체를이용해염색한사진과비교하여보면 dysferlin 과정확하게염색된부위가공통으 524 대한신경과학회지제 25 권제 4 호, 2007

Figure 4. Western blotting in normal control groups for dysferlin. Graph shows the relative density of dysferlin in normal control groups. (Average of relative density: 1.01) Figure 5.

6명의뒤시엔느형근이영증환자군의단백발현을정량적웨스턴블롯팅에서 1번정상인대조군과비교하여보면농도의전체적인평균치는 1.01 로정상인대조군과거의차이가없으나 3번의큰증가와 5번의감소등 dysferlin 단백발현양이환자마다큰차이를보이는것을확인할수있었다. 또한, 음성대조군으로사용된 dysferlinopathy 환자의단백이발현되지않은모습도 2번에서볼수있었다 (Fig.

5 Figure 4. Western blotting in normal control groups for dysferlin. Graph shows the relative density of dysferlin in normal control groups. (Average of relative density: 1.01) Figure 5. Double immunohistochemical staining of DMD patients for dysferlin & N-CAM. A/D: Dysferlin, B/E: N-CAM, C/F: Double. ( 200 magnification) 로지역화되어겹치어지는모습을확인할수있었다 (Fig. 5). 6명의뒤시엔느형근이영증환자군의단백발현을정량적웨스턴블롯팅에서 1번정상인대조군과비교하여보면농도의전체적인평균치는 1.01 로정상인대조군과거의차이가없으나 3번의큰증가와 5번의감소등 dysferlin 단백발현양이환자마다큰차이를보이는것을확인할수있었다. 또한, 음성대조군으로사용된 dysferlinopathy 환자의단백이발현되지않은모습도 2번에서볼수있었다 (Fig. 6). 4. 다발성근염과피부근염환자근조직에서의 dysferlin 발현다발성근염과피부근염을가진두환자군의이중면역조직화학염색한사진을보면뒤시엔느형근이영양증환자군과같이재생하고있는근섬유조직에서 dysferlin 이강하게발현되고 N-CAM 과정확하게공통으로지역화한모습을확인할수있었다. 특히, 피부근염환자의경우염증이심한부위가다른부위에비해전체적으로세포질에진하게염색된모습을볼수있었다 (Fig. 7). J Korean Neurol Assoc Volume 25 No. 4,

Figure 6. Western blotting in DMD patients for dysferlin. Graph shows the relative density. 1: Normal control, 2: dysferlinopathy, 3-8: DMD. (Average of relative density in DMD: 1.01) Figure 7.

( 200 magnification) 2명의다발성근염환자군과 2명의피부근염환자군의정량적단백분석결과를확인하여보면, 1번정상인근조직의 dysferlin 단백발현과비슷하거나낮아진농도를보였고, 전체적인평균치는 0.81 로감소하였다. 특히다발성근염환자중한명에서는 dysferlin 의발현이크게감소하였고, 이로인해전체적인평균치의감소를가져왔다.

6 Figure 6. Western blotting in DMD patients for dysferlin. Graph shows the relative density. 1: Normal control, 2: dysferlinopathy, 3-8: DMD. (Average of relative density in DMD: 1.01) Figure 7. Double immunohistochemical staining of PM and DM patients for dysferlin & N-CAM. A/D: Dysferlin, B/E: N-CAM, C/F: Double. ( 200 magnification) 2명의다발성근염환자군과 2명의피부근염환자군의정량적단백분석결과를확인하여보면, 1번정상인근조직의 dysferlin 단백발현과비슷하거나낮아진농도를보였고, 전체적인평균치는 0.81 로감소하였다. 특히다발성근염환자중한명에서는 dysferlin 의발현이크게감소하였고, 이로인해전체적인평균치의감소를가져왔다. 이환자의경우근육조직이이미파괴가많이진행되어이와같은현상을보인것으로추측되고, 따라서이로인한평균치의감소는질환의유무와는관계가없으며크게유의하다고생각되지않는다 (Fig. 8). 고찰 Dysferlin 은 DGC 와관계없이독립적으로근섬유막에위치하는단백질이다. 근섬유막에존재하는 DGC 는세포외부의기질과세포내부의세포골격을연결하는단백질다구조단위복합체로서, 구성요소중하나의손실은근섬유막전체구조의안정화를깨뜨리고세포외기질과세포내세포골격간의막을통해생기는연결의손실원인이된다. 21,22 최신연구에따르면 dysferlin-null mice 에서 DGC 의기능이유지되고원형질막의 526 대한신경과학회지제 25 권제 4 호, 2007

Figure 8. Western blotting in PM & DM patients for dysferlin. Graph shows the relative density. 1: Normal control, 2: dysferlinopathy, 3/4: PM, 5/6: DM. (Average of relative density in PM & DM: 0.

7 Figure 8. Western blotting in PM & DM patients for dysferlin. Graph shows the relative density. 1: Normal control, 2: dysferlinopathy, 3/4: PM, 5/6: DM. (Average of relative density in PM & DM: 0.81) 구조도안정화되어있었으나, 느리게전개되는진행성근이영양증은근세포원형질막의치유상결함에의해서발생한다. 결과적으로 DGC 관련근이영양증과반대로 dysferlin 관련근이영양증은구조적이상이아닌원형질막의손상시치유부위가변성되어유도되는새로운분류의질병이다. 이것이 dysferlin 이결핍된근이영양증의병리학적기전이다. 8,12,23,24 본실험에서정상인으로이루어진대조군에서는 dysferlin 이면역조직화학염색에서일정하게분포및발현되고, 웨스턴블롯팅정량실험결과에서도 8명의정상인근조직에서표현된단백양이거의비슷한일정량을보였다. 그러나이와대조적으로음성대조군으로사용된 dysferlinopathy 환자의근조직에서는예상대로면역조직화학염색과웨스턴블롯팅실험상에서단백질발현이되지않았다. 뒤시엔느형근이영양증환자군의경우, DGC 의중요구성요소인 dystrophin 이손실되어이미세포의형태가파괴되고괴사가일어나이를치유하기위해위성세포라추측되는세포들이생성된모습을볼수있었다. 또한위성세포와재생중인근조직의표지인자로여겨지는 N-CAM 25 은이중면역조직화학염색한사진상에서보면, dysferlin 과공통지역성을띄며거의비슷한모습으로증가한것을볼수있었다. Dysferlin 은근병증을가진근조직에서활성화된위성세포를증가시킨다고보고된바있다. 20 이는 dysferlin 이소포를형성하여재봉합하고위성세포를활성화시켜파괴된근조직을치유하려는과정으로추측되어진다. Dysferlin 이발견되었을때, 유일하게알려져있던연관된유전자는 Caenorhabditis elegans의 fer-1 이었다. fer-1 의돌연변이는정자세포의원형 질막융합을일으키는막구조로된세포소기관의결핍을일으켜불임을유발한다. 26 Dysferlin 은 fer-1 과유사한다수의 C2 영역과 C-말단의세포막을가로지르는영역을가진큰단백질 (230kDa) 이다. 이 C2 영역은일반적으로칼슘의존인지질결합 (calcium dependent phospholipid binding) 과단백질-단백질상호작용에연관되어있다. Dysferlin 의 C2영역은신경전달물질이방출되는동안막융합을위한칼슘감지장치로서관련된 synaptotagmins 의 C2A 영역과매우높은상동관계를가지고있다. 27 이런자료로부터, dysferlin 은근세포의발생과유지과정동안융합의중요한역할을할것이라는가정을할수있다. 근조직내융합은두가지유형으로분류가능한데, 첫번째융합은근육내에서단핵의근육모세포가다핵의합포체근관세포를형성하기위하여일어나는것이고, 두번째유형의근육막융합은운동과근육손상시에생긴막의찢어진곳을치유하는데필요한재봉합과연관이있다. 원형질막의치유는막파괴시재봉합을위해필요한기초적인세포생성과정이다 막융합의두유형이진행되는과정에서소포는나란히존재하는막의융합을촉진하기위하여원형질막과융합한다고생각되어진다. 31,32 뒤시엔느형근이영양증환자군의웨스턴블롯팅결과는정상인의근조직에서표현된단백질의양과는다르게심한증가와감소의모습을보이는데, 이는각조직에서표현된단백질양의증감이근조직의파괴정도에따라보이는차이라여겨진다. 파괴가심하게되어더이상의재생이힘든경우나퇴화가많이진행되지않은조직에서의능동적치유과정을보여주는것이라추측된다. J Korean Neurol Assoc Volume 25 No. 4,

8 또한, 다발성근염과피부근염환자군의실험결과자료는전체적으로뒤시엔느형근이영양증의경우보다일정한크기와형태의세포가유지되는모습을보여주었다. 그러나정상인의근조직과는다르게특정부위나세포에 N-CAM 과 dysferlin 이면역조직화학염색에서강한반응을나타내었다. 특히, 피부근염환자군의경우거의정상조직과같은모습을보였으나염증반응이심한쪽에서만전체적으로세포막뿐만아니라세포질까지 dysferlin 이증가한모습을보였다. 이전에보고된연구들에따르면, 세포질내의 dysferlin 축적이퇴화 / 재생하고있는근섬유조직에서발견되었으며, 이것은재생과같은근섬유의능동적과정시에 dysferlin 이중요한역할을한다는것을보다더지지해주는것이다. 33 이를웨스턴블롯팅하여정량측정한결과를보면다발성근염환자 1명을제외하고는정상인과거의차이가나지않는모습을볼수있었다. Dysferlin 과 C2 영역을포함하여비슷한구조의여러유전자들을공유하는단백질들인 ferlin family 중 myoferlin 은 dysferlin 과가장유사하다. Mouse cell line C2C12 에서시행된 myoferlin 과 dysferlin 이관련된이전실험결과에따르면, myoferlin 은융합반응이있기전길어진근육모세포에서많이발현되었고, 반면에 dysferlin 은근육모세포가근관세포를형성한융합반응후에최고로많이발현되었다. 17 Myoferlin 과 dysferlin 의이와같은뚜렷한표현형은근육융합의특정과정에따라단백질이전문화될수있다고제안한다. 따라서 myoferlin 은근발생과정동안중요한역할을하고, 반면 dysferlin 은성숙한근섬유에서치유를담당할것이라여겨진다. 그러나그들의높은상동성으로인하여서로를보완할것이라고도제안되고있다. 32 본실험에서근세포배양결과를보면, myoferlin 의경우는실험을시행하지않아확인할수없었으나 dysferlin 이면역조직화학염색에서뿐만아니라웨스턴블롯팅실험결과에서도근육모세포가근관세포로분화되면서 7배가까이증가한것을볼수있었다. 이는근세포의발생과유지, 분화과정동안의융합반응시에 dysferlin 이중요역할을한다는것을지지해주는것이다. Dysferlin 과관련된대표적인단백질인 caveolin-3 의경우에는, dysferlin 이완벽하게결핍된지대형근이영양증 2B형 / 미요시근병증환자 4명중 3명의환자에서이차적 caveolin-3 의감소를나타냈고, caveolin-3 결핍증인지대형근이영양증 1C형 (primary caveolin-3 deficiency; LGMD1C) 에서는 dysferlin 의두드러진감소가발견되었다. 이는골격근내의 caveolin-3 와 dysferlin 사이의상호작용을제안하고있다. 또한이과정은정상의근이영양증이없는근육의용해물내의 dysferlin 과 caveolin-3 의공통면역침강반응에의해서보다더지지되는바이다. 34,35 이상의결과들을정리해보면, 질환에따른전체적인일정한증감의양상은없으나파괴로인한세포의치유를위하여염색된세포각각에서 dysferlin 이증가한모습을볼수있었다. 또한근육모세포가근관세포로분화되는과정인융합시에도증가한 dysferlin 의발현을볼수있었다. 이는치유와재생과정그리고근세포의분화과정에서 dysferlin 이중요한역할을한다는그동안의여러연구들을지지하는바라여겨진다. 이러한연구결과는 dysferlin 발현증가와관련된근병증치료법연구에도움이될수있을것이라사료되며, 또한이를좀더빨리실용화하기위해서는 dysferlin 의기능과관련된것으로알려진 myoferlin, caveolin-3 등의다른요소나칼슘신호, 염증반응등과관련된연구가보다더필요하다고생각되는바이다. REFERENCES 1. Bushby KM. Making sense of the limb-girdle muscular dystrophies. Brain 1999;122: Liu J, Aoki M, Illa I, Wu C, Fardeau M, Angelini C, et al. Dysferlin, a novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi myopathy and limb girdle muscular dystrophy. Nat Genet 1998;20: Illa I, Serrano-Munuera C, Gallardo E, Lasa A, Rojas-Garcia R, Palmer J, et al. Distal anterior compartment myopathy: A dysferlin mutation causing a new muscular dystrophy phenotype. Ann Neurol 2001;49: Bushby KM. Dysferlin and muscular dystrophy. Acta Neurol Belg 2000;100: Selcen D, Stilling G, Engel AG. The earliest pathologic alterations in dysferlinopathy. Neurol 2001;56: Britton S, Freeman T, Vafiadaki E, Keers S, Harrison R, Bushby K, et al. The third human FER-1- like protein is highly similar to dysferlin. Genomics 2000;68: Fanin M, Angelini C. Muscle pathology in dysferlin deficiency. Neuropath Appl Neurobiol 2002;28: Bansal D, Miyake K, Vogel SS, Groh S, Chen CC, Williamson R, et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature 2003;423: Lennon NJ, Kho A, Bacskai BJ, Perlmutter SL, Hyman BT, Brown RH Jr. Dysferlin interacts with annexins A1 and A2 and mediates sarcolemmal wound-healing. J Biol Chem 2003;278: De Palma S, Morandi L, Mariani E, Begum S, Cerretelli P, Wait R, et al. Proteomic investigation of the molecular pathophysiology of dysferlinopathy. Proteomics 2006;6: Cenacchi G, Fanin M, De Giorgi LB, Angelini C. Ultrastructural changes in dysferlinopathy support defective membrane repair mechanism. J Clin Pathol 2005;58: 대한신경과학회지제 25 권제 4 호, 2007

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