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경희 증
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1 원저 J Korean Neurol Assoc / Volume 23 / August, 200 미요시근병증에서 Dysferlin 의면역세포화학검사와 Western Blot 의분석 안성의료원신경과, 연세대학교의과대학신경과학교실 a, 병리학교실 b 오승헌김승민 a 선우일남 a 김태승 b 최영철 a SeungHun Oh, M.D., Seung Min Kim, M.D. a, Il Nam Sunwoo, M.D. a, TaiSeung Kim, M.D. b, YoungChul Choi, M.D. a Department of Neurology, Anseong Medical Center, Anseoug; Departments of Neurology a and Pathology b, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea 서론 미요시근병증 (Miyoshi myopathy) 은 10대후반에서 30대초반의성인에서시작되는하지의점진적인근력약화와혈청크레아틴인산효소 (creatine kinase; CK) 의높은증가를특징으 로하는상염색체열성윈위부근병증의한아형이다. 근력약화는대부분하지의비복근 (gastrocnemius) 에서시작하여보행장애를호소하고서서히진행하며경과는다른근병증에비해양호하다. 최근유전학적연구에서미요시근병증은 2번염색체 13.3 locus 에위치하는 DYSF (MIM*603009) 유전자의돌연변이에의해유발된다고알려져있다. 1 DYSF 의돌연변이에의해서발생하는근육병으로는미요시근병증뿐만아니라제2B 형지대형근이양증 (limbgirdle muscular dystrophy type 2B; LGMD2B), 원위부전방구획근병증 (distal anterior compartment myopathy) 등의표현형 (clinical phenotype) 도있어이질환들을유전적명명에따라 dysferlinopathy 로분류하 J Korean Neurol Assoc Volume 23 No., 200

2 미요시근병증에서 Dysferlin 의면역세포화학검사와 Western Blot 의분석 기도한다. 2,3 또한동일한 DYSF의돌연변이를보이는한가족내에서미요시근병증과제2형근위지대형근이양증이혼합되어나타나는형질다양성 (phenotypical heterogeneity) 을보인다. 6 DYSF의돌연변이는근세포막 (sarcolemma) 에존재하는단백질인 dysferlin 의이상을초래하는데 dysferlin 은 2080 개의아미노산으로이루어져있으며 6개의 C2 domain 을포함하고 Cterminus 근처에한곳의 transmembrane domain을포함한다. C2 domain 은칼슘이결합하는부위를가지고있고이부위로칼슘에의해매개되는신호전달체계를가진다. 1 Dysferlin 은세포융합에필요한 nematode (Caenorhabditis Elegans) spermatogenesis factor FER1 단백질과유전적으로유사성을가지는것으로보아 (27% identity, 7% similarity), 세포막을구조적으로안정화시키는역할을한다고생각된다. 7,8 최근의연구에서는손상된세포막의복구에필요한세포막융합과정에 dysferlin 이중요한역할을한다고보고하고있다. 9 미요시근병증은 Miyoshi 등이처음보고한이래주로일본에서많이보고되고현재까지한국에서는임상적으로의심되는 2예가보고되었다. 10,11 그러나국내에서면역세포화학검사 (immunocytochemistry) 혹은 Western blot 를통하여 dysferlin 의결손을확인한예는없다. 이에저자는임상적으로의심되는미요시근병증환자 명에서면역세포화학검사와 Western blot 를하여미요시근병증을확진하였고이에임상적 병리학적특성을보고하는바이다. 대상과방법 1. 환자선별과근육생검 임상적으로미요시근병증으로진단받은 명의환자 ( 환자 1) 를대상으로환자의동의하에근육생검을하였다. 모든환자에서병력청취, 신경학적검사, 임상병리검사및신경생리검사를하였고, 신경전도검사에서정상신경전도속도 (nerve conduction velocity) 를보이고근전도검사 (electromyogram) 에서근육병소견을보였다. 환자 1, 2, 3은외측광근 (vastus lateralis) 에서, 그리고환자 는상완이두근 (biceps brachi) 에서부분마취하에근육생검을하여동결시킨후 (frozen), 10 µm 두께연속절편을 hematoxylin & Eosin (H&E), modified Gomori Trichrome, NADPHTR, ATPase PH.3/.6/9. 등으로염색하였다. 2. 면역조직화학염색 명에게서얻은근조직을 10 µm 연속절편으로잘라아세톤으로 에서 10분간고정시키고 0.0 mol/l Trisbuffered saline (ph 7.) 으로 1분간세척한후 2% bovine serum albumin 과 % goat serum 을함유한 blocking solution 에 30 분간 incubation 시켰다. 12 이후절편은각각 dystrophin (NCLDYS 1, NCLDYS 2, NCLDYS 3, 1:100 dilution, Novocastra), αsarcoglycan (NCLαSARC, 1:100 dilution, Novocastra), βsarcoglycan (NCLβSARC, 1:100 dilution, Novocastra), γsarcoglycan (NCLγSARC, 1:00 dilution, Novocastra), δsarcoglycan (NCLδSARC, 1:0 dilution, Novocastra), dysferlin (NCLHamlet, 1:20 dilution, Novocastra), βdystroglycan (NCLβDG, 1:100 dilution, Novocastra, Newcastle Upon Tyne, UK), and caveolin3 (1:0 dilution, Transduction Laboratory, Lexington, KU, USA) 의단클론 IgG 항체 (monoclonal IgG) 와함께하루동안 환경하에서 incubation 시켰다. Incubation 한절편을 Trisbuffered saline 으로 30분간세척후 peroxidase 로접합 (conjugation) 된 goat antimouse IgG 를사용하여 diaminobenzidine (DAB)peroxidase 반응 (Vector Labortories, CA., USA.) 을유도하여염색여부를관찰하였다 Dyferlin 단백질에대한 Western blot 생검조직이부족한한명 ( 환자 ) 을제외한나머지 3명 ( 환자 13) 에서이전에보고된실험방법에의거하여 dysferlin 단백질에대한정량적검사를하였다. 1 냉동근육생검조직를 1020 µm 두께의냉동절편 (cryosection) 20개를 lysis buffer (Tris 12 mm, ph 6.8, % SDS, 10% glycerol, % mercaptoethanol, 10 mm DTT, 0. mm PMSF) µl 를첨가하고초음파파쇄 (sonication) 하여검체를완전히분쇄한후 9 에서 분간열처리하고고속원심분리후사용할때까지 20 에냉동보관하였다. 보관된검체를 Bradford 방법으로정량한다음 0 µg의단백질에해당하는 lysate 를 SDSpolyacrylamide gel에점적하고전기영동하여 PVDF (polyvinykidine difluoride) memebrane 에 transfer 하였다. Memebrane을 % skimmed milk 와 0.0% Tween20 가함유된 TBS (0.M NaCl, 2mM NaPb ph 7.) 용액에서 blocking 시킨후 1차항체즉 antidysferlin antibody (1:1000, NCL DYSF, Novocastra, Newcastle Upon Tyne, UK) 를 TBS 용액에희석하여상온에서 1시간동안반응시켰다. 세척후 2차항체 ECLantimouse IgG (1:000, NA931, Amersham, UK) 로상온에서 1시간반응시켰다. 세척후 ECL (RPN2106, J Korean Neurol Assoc Volume 23 No., 200

3 오승헌김승민선우일남김태승최영철 Amersham, UK) 로 1분간반응후 Xray 필름으로감광하여 band 의유무를관찰하였는데예상되는 dysferlin 의 band 크기는 230 kda였다. 결과 1. 환자들의임상적특성 (Table 1) 명의증상발현은 1세에서 26세였고내원시유병기간은 년에서 1년이었다. 첫증상으로 3명은계단을오르내리기가불편함을호소하였고 1명은보행장애를호소하였다. 명모두주로하지말단부위의근력약화가뚜렷하였고비복근의위축이관찰되었다. 한명 ( 환자 2) 은상지의근력약화도호소하였다. 근력약화는유병기간에비해천천히진행하는양상을보였다. 한명 ( 환자 2) 은 1년전부터증상이발현되었으나현재독립적으로보행이가능하였고 명환자모두검사당시일상생활을수행하는데경미한장애를호소하였다. 그외에안면근육의침범이나골격계의이상은관찰되지않았다. 명모두가족력상이환된가족구성원은없었다. 혈청학적검사에서는 명모두혈청 CK가증가되었다 ( IU/l). 2. 병리학적소견 (Table 2) 명모두근육조직검사상근육세포내내핵 (internal nuclei) 의증가, 섬유크기의다양성 (variation of fiber size), 섬유괴사및퇴행성, 재생섬유 (degenerative and regenerative muscle fiber) 등이관찰되어비특이적인근병증소견을보였다. 1명 ( 환자 1) 에서는혈관주위와근세포내염증세포의광범위한침윤이관찰되었고괴사 (necrosis) 와섬유화 (fibrosis) 도일부동반되었다 (Fig. 1). 한명 ( 환자 3) 에서는염증세포의침윤은국소적으로나타났다. 그외에 fiber type predominance, rimmed vacuole 등은관찰되지않았다. 3. 면역세포화학검사와 Western blot 소견면약세포화학검사에서 명모두근세포막에 dysferlin 항체에대한면역염색이소실되었다 (Fig. 2). 반면 dystrophin, α, β, γ, δsarcoglycan, βdystroglycan, caveolin3에대한항체반응은정상적으로발현되었다. Western blot 에서는검사를시행한 3명모두 dysferlin 에해당하는 230 kda 크기의 band 가관찰되지않았다 (Fig. 3). Table 1. The clinical and laboratory characteristics of four patients with Miyoshi myopathy Patient No. Sex / Age Age of onset (yrs) Duration (yrs) Face Distribution of muscle weakness U/Ex L/Ex Neck Proximal Distal Proximal Distal Calf muscle atrophy Serum CK level (IU/L) M/20 M/1 F/38 F/ U/Ex; upper extremity, L/Ex; lower extremity, CK; creatine kinase Table 2. Routine pathological findings in patients with Miyoshi myopathy Pt 1 Pt 2 Pt 3 Pt Increased internal nuclei Variation of fiber size Degenerative muscle fiber Regenerative muscle fiber Inflammatory cell infiltration Fiber type predominance Fibrosis Rimmed vacuole (widespread) (focal) Pt; patient number, ; present, ; prominent, ; absent J Korean Neurol Assoc Volume 23 No., 200

4 미요시근병증에서 Dysferlin 의면역세포화학검사와 Western Blot 의분석 고찰 Figure 1. Pathology of vastus laterlis muscle in a patient with Miyoshi myopathy (patient 1). There are perivascular and endomysial infiltration of inflammatory cells with necrotic and regenerative fibers (H&E, left= 200, right= 100, magnification). Figure 2. Immunostaining in normal control and four patients with Miyoshi myopathy. Dysf; dysferlin, SG ; sarcoglycan, SG ; sarcoglycan, Cav3; caveolin3, DG; dystroglycan ( DG) ( 200 magnification) Figure 3. Western blot for dysferlin in three paitients (Patient 13) with Miyoshi myopathy. 230 kda band for dysferlin is absent in all three patients comparing with normal control (NL). 본연구의대상인 명모두발병시기, 근력약화의양상, 임상증상에비해현저히증가된혈청 CK 수치등을보여미요시근병증의전형적인임상양상을나타내었다. 이전의보고에서미요시근병증환자들은 10년이내에휠체어에의존하는환자가전체의 10% 미만으로보고하고있어비교적양호한예후를보이며그에비해진단초기부터혈청 CK 수치는현저히증가되는특징적양상을보였다. 1 이는 dysferlin 이비교적빠르게진행하는근이양증을유발하는 dystrophin 이나 sarcoglycan 과는다른기전으로근세포막의구조적안정성에관여함을시사한다. 최근의연구에서 dysferlin 이결핍되면손상된세포막을복구하는과정에서막융합에장애가생겨근세포자체의파괴보다는막안정성이약화되어근세포막에존재하는 CK가누출되어 ("CK leak") 근력약화에비해혈청 CK가매우증가하는소견을보인다고추측된다. 16 미요시근병증환자들은조직검사에서비특이적인근병증소견을보인다. 일부의환자에서 type I fiber predominance 를관찰할수있으나미요시근병증에서만나타나는특징적소견은아니다. 한연구에서 dysferlinopathy 환자들의조직검사상약 1020% 에서혈관주위와근세포내염증세포의침윤이관찰된다고보고하였다. 17 본연구대상중 2명의근육조직에서염증세포의침윤이관찰되었는데한환자에서혈관주위와근세포내염증세포의침윤은광범위하게관찰되어염증성근병증 (inflammatory myopathy) 과감별이요구되었다. 그러므로임상적으로원위부근병증이의심되는젊은성인에서근조직검사상염증세포의침윤이관찰되면면역세포화학검사로 dysferlin 의결핍유무를확인하여염증성근병증과미요시근병증을감별하는것이중요하다고생각된다. 본연구에서미요시근병증환자모두에서세포막에 dysferlin 이결손되어있었고 Western blot 상에서도 dysferlin 이소실되어있음을확인하였다. 면역세포화학검사상 dysferlin 의현저한감소혹은소실됨으로진단할수있으며대부분의미요시근병증환자들의근조직검사상근세포막에서 dystrophin, sarcoglycan, dystroglycan, caveolin3 의발현은정상적으로관찰된다. 이는 dysferlin 이이들세포막에안정성에관여하는단백질들과는다른기전으로근세포막의안정성에기여함을시사한다. 미요시근병증을포함한 primary dysferlinopathy 에서는대부분 dysferlin 은거의소실되어있거나그양이현저히감소 ( 정상인의 30% 이하 ) 되어있다. 1,18 그러나 sarcoglycanopathy 나 caveolinopathy 등다른근골격계질환의일부환자에서도 dysferlin 이일부감소되있거나비정상적인분포양상을나타 J Korean Neurol Assoc Volume 23 No., 200

5 오승헌김승민선우일남김태승최영철 낼수도있기때문에주의를요한다. 19,20 따라서 dysferlin 이거의소실되어있거나현저히감소되어있는경우진단에문제는없으나 dysferlin 양이일부감소되어있는경우에는 (>30% 이상발현되는경우 ) dysferlin 을포함한다른근세포에관여하는단백질들과같이면역조직화학검사를통해서 primary dysferlinopathy 인지다른질환에동반된 dysferlin 의이차적감소 (secondary dysferlinopathy) 인지감별하는것이중요하다. 최근의연구에서 caveolin3 가 dysferlin 과상호작용을통하여막안정성에관여한다고보고되고있는데, caveolin3 는 CAV3 유전자의이상으로우성유전양상을띠는근위지대형근이양증 1C형 (LGMD 1C) 을유발한다고알려져있다. 20,21 본연구에서 caveolin3 의발현은정상적으로관찰되었으나 Dysferlinopathy 환자의일부에서 caveolin3 의감소를관찰할수있기때문에 dysferlin 과 caveolin 은면역세포화학검사를병행해야할필요성이있다. 22 DYSF는 개의 exon 으로이루어져있고 DYSF의돌연변이는현재까지약 개이상보고되고있으며변이양상또한과오돌연변이 (missense mutation), 무의미돌연변이 (nonsense mutation), 결손 (deletion), 삽입 (insertion) 등으로매우다양하다. 이러한변이의차이와임상증상간의차이는관련성이없다고보고되어있다. 18,23,2 본연구에참여한한명 ( 환자1) 에서 DYSF의 12번째 exon 의 116 번째염기서열에서 guanine (G) 이 cytosine (C) 으로동형접합성 (homozygous) 치환이관찰되었다. 2 이는 DYSF의 389 번째단백질을합성하는부분에서 GAG 가 CAG 로변하여 gutamic acid (E) 가 glutamine (Q) 으로치환되게하였다. 미요시근병증을확진하기위해서는유전자검사로 DYSF의돌연변이를확인해야하지만 DYSF의 exon 자체가크고돌연변이의 hotspot 이없이각각의 exon 에서골고루돌연변이가나타나기때문에선별검사로서유전자검사를하기에는시간적, 경제적인부담이많다. 23 Dysferlin 단백질의결손을면역세포화학검사나 Western blot 를통하여단백질의소실혹은 30% 이하로결핍되어있으면 primary dysferlinopathy 로진단할수있으므로임상증상으로미요시근병증이의심되면선별검사로면역세포화학검사나 Western blot 를하는것이효과적이라고생각한다. 결론적으로, 저자들은면역세포화학검사와 Western blot 를통하여진단된미요시근병증환자들의임상적, 병리학적, 면역세포학적특성을분석하였다. 특히면역조직학적검사는염증성근육병및근이영양증환자의감별진단법이며, 이러한검사를통해서향후더많은 dysferlinoapthy 환자를진단할수있을것이고이환자들을대상으로임상적 병리학적특성을비교, 연구하는것이중요할것이다. REFERENCES J Korean Neurol Assoc Volume 23 No., 200

6 미요시근병증에서 Dysferlin 의면역세포화학검사와 Western Blot 의분석 J Korean Neurol Assoc Volume 23 No., 200

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<30342EC1F5B7CA2DB1E8B3B2C8F D E687770> 대한임상신경생리학회지 11(2):59~63, 2009 ISSN 1229-6414 Case Report 미요시근육병환자에서밝혀진 Dysferlin 유전자돌연변이 동국대학교의과대학신경과학교실 1, 부산대학교의과대학신경과학교실 2, 연세대학교의과대학신경과학교실 3 지명구 1 김남희 1 김대성 2 최영철 3 Identification of a Dysferlin Gene