정력자(葶藶子) 기원종별 HepG2 세포주 및 HEK293 세포주에 대한 독성 평가

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창엽 옹
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1 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1): pissn / eissn 정력자( 葶藶子 ) 기원종별 HepG2 세포주및 HEK293 세포주에 대한독성평가 김성배 *, 김효선, 문병철 한국한의학연구원한약연구부 Cytotoxic effects of Original species of Lepidii seu Descurainiae Semen on the human hepatocarcinoma (HepG2) cell line and human embryonic kidney 293 (HEK293) Sung-bae Kim *, Hyo Seon Kim, Byeong Cheol Moon Herbal Medicine Research Division, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, 34054, Republic of Korea Abstract Here, we evaluated toxicity effects of Lepidii seu Descurainiae Semen and its adulterant species. Authentic Lepidii seu Descurainiae Semen and closely related inauthentic plant materials were evaluated for their cytotoxicity induction in human hepatocarcinoma (HepG2) as compared to normal human kidney epithelial (HEK293) cell lines. In this study, we compared 5 species of plant seeds, Lepidium apetalum (LA), Descurainia sophia (DS), Draba nemorosa (DN), Lepidium virginicum (LV), and Erysimum cheilanthoides (EC). Five species were tested with MTT assay for their cytotoxicity after 24 hours of exposure to the cells. Among the five species, EC possessed the most robust toxicity, with specific selectivity against HepG2 and HEK293 cells. MTT assay alone cannot establish toxicity, and further studies on toxic mechanism are needed. However, it is anticipated that it will be possible to evaluate the toxicity of Korean herbal medicine with high prediction ability, and it is expected to be utilized as toxicological data before in vivo experiment. Keywords: Lepidii seu Descurainiae Semen, Human hepatocarcinoma (HepG2), Human kidney epithelial (HEK293), Cytotoxic Correspondence: Sung-bae Kim Herbal Medicine Research Division, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, 34054, Republic of Korea Tel: , suaa10@kiom.re.kr Received , revised , accepted , available online doi: /khmi

2 김성배외. 정력자기원종별 HepG2 세포주및 HEK293 세포주에대한독성평가 서론 정력자는예로부터담연옹폐( 痰涎壅肺 ), 천해담다( 喘咳痰多 ), 흉협창만( 胸脇脹滿 ), 부득평와( 不得 1) 平臥 ), 흉복수종( 胸腹水腫 ), 소변불리( 小便不利 ) 등을치료하는약물로이용되어왔다. 현재한국과 중국에서정력자의기원은십자화과(Brassicaceae, Cruciferae) 식물인다닥냉이(Lepidium apetalum Willd.) 또는재쑥[Descurainia sophia (L.) Webb ex Prantl] 의씨로규정하고있다 1,2) 년대한 민국약전외한약( 생약) 규격집이개정되기이전에정력자의기원은십자화과식물인꽃다지(Draba nemorosa L.) 또는다닥냉이(Lepidium apetalum Willd.) 의씨로규정되어있었다 3). 한약재관능검사 해설서에따르면공정서의개정으로제외된꽃다지의종자가정력자의위품으로지정되어사용의주의 를요구하고있다 4). 또한다닥냉이와형태가매우유사하고국내에널리분포하는동속근연종인 콩다닥냉이 (Lepidium virginicum L.) 및재쑥과유사한환경에서자라는쑥부지깽이(Erysimum cheiranthoides L.) 의종자도혼입되어유통되고있어주의가필요한약재이다 천연물의기능성식품으로의응용및천연물신약의개발은국내외적으로높은관심을가지고있으며 7), 우리나라에서는약용식물을일상생활에다양한방법으로섭취해온전통의학과민간요법이있기 때문에한약의사용량과사용인구는지속적으로증가하고있는추세이다 8,9). 그러나일부한약자원의 경우잠재적독성을가지고있어장기간복용할경우인체에치명적인영향을초래할수있으므로 한약의안전성에대한문제제기가지속되고있는것이현실이다 10). 따라서한약자원이의약품및 건강식품으로서의기능을수행하기위해서그활성에대한규명은물론독성에관한체계적인연구가 필수적이다 10,11). 특정물질에대한효능및생리활성을평가하거나새로운약품을개발하기위해서는 동물실험과생체적용단계이전에세포내에서독성및활성변화를알아보는과정을거쳐야한다 11). 일반적으로독성평가를위해세포증식및사멸도변화를측정하며, 현재많이사용하고있는방법 중하나인 MTT 법은많은시료를비교적빠르고정확하며객관성있게판독할수있어대량검색이나 1 차독성평가에널리사용되고있다 12,13). 최근한약과관련된안전성연구보고에따르면, 우리나라에서약용으로사용할수있도록규격이 설정되어있는한약 515 종가운데독성평가가필요한것으로 33 종이선정되었다. 이들중에서정력 자는본초학적활용에있어서독성이의심되거나부작용이우려되는품목중하나이다 14). 한약의독성 은사용량또는사용방법과깊은연관성이있는것으로알려져있고, 최근에는정품이아닌유사품의 부적절한사용으로인한경우도적지않게보고되고있다 15). 따라서본연구는정력자의안전성을검토할목적으로약전수재종인다닥냉이와재쑥의종자, 다닥 냉이와유사한동속근연종중국내에분포량이많은콩다닥냉이, 종자의형태가재쑥과유사한쑥부지 깽이, 약전개정전기원종으로위품으로유통될가능성이있는꽃다지종자를포함한 5 종추출물의 in vitro 세포독성여부를확인하기위하여, 인간간암세포주 HepG2 와신장세포주 HEK293 를 MTT 법을이용한세포독성을평가하고정력자의독성을 in vitro 상에서 pre-screening 할수있는독성자 료로활용하고자하였다. 5,6). 106

3 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1): pissn / eissn 본론 1. 재료및방볍 1) 약재 본연구에사용된다닥냉이종자는중국산( 길림성) 의건조된시료를국내약재시장에서구입하여 사용하였으며, 재쑥종자( 전북무주군), 꽃다지종자( 대전유성구용산동), 콩다닥냉이종자( 대전시유 성구봉산동), 쑥부지깽이종자( 충북단양군적상면) 는채집하여통풍이잘되는그늘에말린후사용하 였다. 각시료는한국한의학연구원한약표준표본관(herbarium code KIOM) 에표본번호를부여하여 약재표본으로보관하였다 (Table 1). Table1. Yield value (%) and number of voucher of five samples. Scientific name of herb Voucher No. Yield (%) Lepidium apetalum Willd. 다닥냉이 Descurainia sophia (L.) Webb ex Prantl 재쑥 Draba nemorosa L. 꽃다지 Lepidium virginicum L. 콩다닥냉이 Erysimum cheiranthoides L. 쑥부지깽이 ) 시약 Fetal bovine serum (FBS) 및항생제(Gaithersburg, USA), penicillin/streptomysin (P/S; Gibco, USA), Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Gibco, USA) 배지와 Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640; Gibco, USA) 배지는 Gibco/BRL 로부터구입하였다. 세포배양플레이트는넌크사(Nunc, Inc, Ung protein, USA) 로부터구입하여사용하였다. 3) 정력자추출물제조 추출은다닥냉이종자 760 g, 재쑥종자 293 g, 꽃다지종자 144 g, 쑥부지깽이종자 435 g, 콩다닥냉 이종자 209 g 을 70% 에탄올 4L 에넣어 80 에서 3 시간환류냉각추출후여과액을걸러내는 과정을 3 회반복하였다. 이를감압농축한후동결건조하여다닥냉이종자(23.69 g, yield 8.07%), 재쑥종자(56.64 g, yield 7.44%), 꽃다지종자(18.69 g, yield 12.94%), 쑥부지깽이종자(48.15 g, yield 11.06%), 콩다닥냉이종자(17.68 g, yield 8.45%) 의 70% 에탄올추출물을얻었다. 추출물은 4 에 저장하면서실험에적용하였다 (Table 1). 4) 세포배양 인간간암세포주(human hepatoma cell line) 인 HepG2 세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA) 에 1% P/S 를포함한 DMEM 배지에서배양하였고, 인간신장세포주(human embryonic kidney) 인 HEK293 세포배양은 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, USA) 에 1% P/S 를포함한 RPMI 1640 을사용하여 37, 5% CO2 조건하의배양기(Forma Scientific, USA) 에서수행하였다. 세 107

4 김성배외. 정력자기원종별 HepG2 세포주및 HEK293 세포주에대한독성평가 포는 100 mm cell culture dish 바닥에세포가 80% 정도자랐을때계대배양하여유지하였다. 5) MTT 분석 Thiazoly Blue Tetrazolium (sigma, St. Louis, MO, USA) 은 5 mg/ml 농도로생리식염수에녹여 MTT 용액을준비하였다. HepG2 세포와 HEK293 세포( cells/well) 를 96-well culture plate 에 각각배지와함께 24 시간세포단층이될때까지배양하였다. 5 종의추출물을 ug/ml 의 농도로 24 시간배양한후, MTT assay 를실시하였다. 증식을관찰할세포의배양배지를제거하고 FBS 를포함하지않은배지에 MTT 용액(0.5 mg/ml) 을 20uL 씩넣은후 3 시간동안 37 에서방치 하였다. 3 시간후세포에있는 MTT 용액을제거하고세포내에있는 MTT 용액을용출시키기위해 100% DMSO (sigma, St. Louis, MO, USA) 를넣은후 10 분동안방치하였다. 10 분후세포에서용출 된용액을 96 well 의접시에 100 ul 씩넣고 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 세포독성(cell tox- icity) 은세포만배양한무처리군의생존도를 100% 기준으로약물처리군의상대적인 cell viability 를 계산하였다. 6) 통계분석 데이터값은평균 ± 표준오차(SEM) 로표시하였다. 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어버전 7.0(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) 을사용하였다. 2. 결과및고찰 1) 정력자추출물이 HepG2 세포생존률에미치는영향 간독성평가는주로 HepG2 세포에시료를처리하여나타나는독성인자를확인하는것이일반적이 므로, 정력자의독성평가를위하여 HepG2 세포를이용하였다 위한 16). HepG2 세포에서세포독성평가를 MTT assay 결과, 각각의 IC 50 값은정력자기원종인다닥냉이종자는 620 ug/ml, 재쑥종자는 683 ug/ml 의농도에서세포독성이관찰되었으며, 유사종인꽃다지종자는 652 ug/ml, 콩다닥냉이 종자는 785 ug/ml, 쑥부지깽이종자는 525 ug/ml 의농도에서세포독성을보였다. 5 종중쑥부지깽 이의독성이가장높았으며, 다닥냉이, 꽃다지, 재쑥순으로콩다닥냉이에서가장낮은세포독성농도가 관찰되었다 (Fig. 1, Table 2). 2) 정력자추출물이 HEK293 세포생존률에미치는영향 신장에서의 in vitro 독성평가는 HEK293 세포가대표적인세포주로이용된다 16). HEK293 세포에서 5 종추출물의독성평가를실시한결과, 각각의 IC 50 값은정력자의기원종인다닥냉이종자는 621 ug/ml, 재쑥종자는 598 ug/ml, 유사종인꽃다지종자는 650 ug/ml, 콩다닥냉이종자는 669 ug/ml, 쑥부지깽이종자는 201 ug/ml 의농도에서세포독성을나타냈다. 5 종중쑥부지깽이의독성 이가장높았으며, 재쑥, 다닥냉이, 꽃다지순으로콩다닥냉이의세포독성농도가가장낮게확인되었다 (Fig. 2, Table 2). 108

5 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1): pissn / eissn Table 2. IC 50 values of five samples on HepG2 and HEK293 cells. Scientific name of herb HepG2 IC 50 ( μg/ ml) Cell line HEK293 Lepidium apetalum Willd. 다닥냉이 ± ± 0.67 Descurainia sophia (L.) Webb ex Prantl 재쑥 ± ± 0.21 Draba nemorosa L. 꽃다지 ± ± 0.16 Lepidium virginicum L. 콩다닥냉이 ± ± 0.54 Erysimum cheiranthoides L. 쑥부지깽이 ± ± 0.08 Figure 1. Cell viability of 70% ethanol extract of five samples on HepG2 cells. Cell proliferation by MTT assay in HepG 2 cells exposed to concentrations of DN (A), DS (B), LA (C), LV(D), and EC (E); 0: control, 3.9, 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500 and 1000 ug/ml. Data represent the mean ± SD (n=6). Abbreviations: Draba nemorosa (DN); Descurainia Sophia (DS); Lepidium apetalum (LA); Lepidium virgincum (LV); Erysimum cheilanthoides (EC) 109

6 김성배외. 정력자기원종별 HepG2 세포주및 HEK293 세포주에대한독성평가 Figure 2. Cell viability of 70% ethanol extract of five samples on HEK293 cells. Cell proliferation by MTT assay in HEK 293 cells exposed to concentrations of DN (A), DS (B), LA (C), LV(D), and EC (E); 0: control, 3.9, 7.8, 15.6, 31.3, 62.5, 125, 250, 500 and 1000 ug/ml. Data represent the mean ± SD (n=6). Abbreviations: Draba nemorosa (DN); Descurainia Sophia (DS); Lepidium apetalum (LA); Lepidium virgincum (LV); Erysimum cheilanthoides (EC) 결론 본연구의목표는유독한한약재로알려진정력자의독성을 in vitro 상에서 pre-screening 할수 있는기초자료제공을위한것으로, 정력자의기원종인다닥냉이및재쑥종자, 유사품인꽃다지종자, 콩다닥냉이종자, 쑥부지깽이종자를대상으로인간의간암세포주 HepG2 와신장세포주 HEK293 을 이용하여 in vitro 세포독성평가를실시하였다. MTT assay 를이용하여 5 종추출물의 HepG2 와 HEK293 세포에대한세포독성을평가한결과, 두세포모두에서콩다닥냉이종자의독성이가장낮게 확인되었으며, 쑥부지깽이종자의독성이가장높은것으로관찰되었다. 이로써유사품인쑥부지깽이 종자는독성이높아사용의주의가필요하며, 독성이가장낮게확인된다닥냉이의동속근연종인콩다 닥냉이종자는비록약전에서인정하지않는종이지만국내에널리분포하므로한약자원의효율적인 공급면에서정품과의효능비교연구가필요할것으로보인다. 또한정력자를안전하고효과적으로 복용할수있는과학적근거를마련하기위하여, 독성을유발하는성분의규명및독성과관련된기전 을파악하는추가연구가필요한것으로사료된다. 110

7 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(1): pissn / eissn 감사의글본연구는한국한의학연구원주요사업 대체한약자원의유효성평가 과제(K18402) 의지원에의해수행되었습니다. 참고문헌 1. 주영승. 증보운곡본초학. 전주: 도서출판우석. 2013: Korea Institute of Oriental Medicine. Defining Dictionary for Medicinal Herbs [Korean, 'Hanya k Giwon Sajeon'] (2016). Published on the Internet; (accesse d ). 3. 박종철, 최고야. 대한민국약전및대한민국약전외한약( 생약) 규격집수재한약재현황검토. 한약정 보연구회지. 2016;4(2): 식품의약품안전처. 한약재관능감별해설서. 서울:( 주) 이문기업. 2009: 양선규, 김욱진, 최고야, 여상민, 문병철. 한약재정력자기원식물에대한형태학적감별연구. 한약 정보연구회지. 2016;4(3): 최고야. 한약재위품목록. 한국한의학연구원. 2016: 김인보, 정주성, 윤택준, 김종배. 한국산겨우살이추출물의안전성평가. 한국식품영양학회지. 2013; 26(3): 김정균, 강영미, 엄광식, 고영민, 김태영. 천연한약재( 목통, 삼릉, 치자) 추출물의항산화효과및항균 활성효과. 농업생명과학연구. 2003;37(4): 박해모, 장인수, 이선동. 국내에서보고된한약및민간요법, 건강식품관련약인성간손상에대한 체계적고찰. 대한한의학회지. 2005;26(2): Nan Mei, Volker M. Arlt, David H. Phillips, Robert H. Heflich, Tao Chen. DNA adduct formati on and mutation induction by aristolochic acid in rat kidney and liver. Mutation Research. 2006;602(1-2): 안인정외 12 명. 랫드에서백두옹괴청호의경구투여에의한반복투여독성시험과면역활성 평가. 한국식품위생안전성학회지. 2012;27(1): 다인바이오연구소. 세포증식및사멸도변화평가( Ⅰ. MTT assay). published on the interne t; ed ). 13. 고병섭. 한약재의품질관리와안전성확보를위한연구( 제 5 장한약재세포독성에관한연구). 한국한의학연구원. 1998; 양기화. 생약재의안전성검토. 대한의사협회의료정책연구소. Published on the internet; /synapse.koreamed.org/synapse/data/pdfdata/1119jkma/jkma pdf (accessed ). 15. 이선구외 7 명. 한약유통모니터링사업. 우리한약재살리기운동본부. 2010: 한의식외 11 명. KNTP/KGLP 독성시험 평가기반연구(II)-ECVAM 등의국제독성시험법국내 111

8 김성배외. 정력자기원종별 HepG2 세포주및 HEK293 세포주에대한독성평가 확립및적용. 국립독성과학원일반독성과. 2008; 제 7 권:7-16. c The Author(s) 2018, khmi.or.kr 112

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,