특허청구의범위 청구항 1 하르파고피툼근추출물 100 중량부, 골쇄보 10 내지 300 중량부, 아교주 50 내지 500 중량부, 복령 50 내지 500 중량부, 생지황 10 내지 300 중량부및인삼추출물 10 내지 300 중량부를포함하는것을특징으로하는골대 사성질환의예방

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장우 구
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2012 년 06 월 18 일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2012년05월29일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/185 ( ) A61K 36/808 ( ) A61P 19/10 ( ) A61P 19/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2011 년 12 월 30 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 KR B1 KR B1 KR B 년 12 월 30 일 (73) 특허권자 신준식 서울특별시강남구언주로 858 ( 신사동 ) (72) 발명자 신준식 서울특별시강남구언주로 858 ( 신사동 ) 이진호 서울특별시강남구영동대로 114 길 56, 래미안 1 차아파트 ( 삼성동 ) (74) 대리인 김태선 전체청구항수 : 총 6 항심사관 : 이상진 (54) 발명의명칭하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물 (57) 요약 본발명은하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물에관한것으로, 더욱상세하게는조골세포 (osteoblast) 증식, 분화촉진활성, 및파골세포 (osteoclast) 분화억제활성을갖는하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물, 또는골강화또는성장발육촉진용식품또는건강기능식품조성물에관한것이다. 대표도 - 도 1-1 -

2 특허청구의범위 청구항 1 하르파고피툼근추출물 100 중량부, 골쇄보 10 내지 300 중량부, 아교주 50 내지 500 중량부, 복령 50 내지 500 중량부, 생지황 10 내지 300 중량부및인삼추출물 10 내지 300 중량부를포함하는것을특징으로하는골대 사성질환의예방및치료용약학조성물. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기골대사성질환의예방및치료용약학조성물은조골세포증식, 분화촉진활성, 및파골세포분화억 제활성을갖는것을특징으로하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물. 청구항 3 제 1 항에있어서, 상기하르파고피툼근추출물은하르파고피툼근의분말을물, 탄소수 1 내지 4 의저급알콜또는이들의혼합 용매중에서추출하여얻어지는것을특징으로하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물. 청구항 4 삭제 청구항 5 제 1 항에있어서, 상기골대사성질환은골다공증, 파제트병, 치주질환, 골전이암또는류마티스관절염을포함하는것을특징 으로하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물. 청구항 6 하르파고피툼근추출물 100 중량부, 골쇄보 10 내지 300 중량부, 아교주 50 내지 500 중량부, 복령 50 내지 500 중량부, 생지황 10 내지 300 중량부및인삼추출물 10 내지 300 중량부를포함하는골대사성질환의예방및 개선용건강기능식품. 청구항 7 제 6 항에있어서, 골대사성질환의예방및개선용건강기능식품은조골세포증식, 분화촉진활성, 및파골세포분화억제 활성을갖는것을특징으로하는골대사성질환의예방및개선용건강기능식품. 명세서 기술분야 [0001] 본발명은하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물에 관한것으로, 더욱상세하게는조골세포 (osteoblast) 증식, 분화촉진활성, 및파골세포 (osteoclast) 분화 - 2 -

3 억제활성을갖는하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학 조성물, 또는골강화또는성장발육촉진용식품또는건강기능식품조성물에관한것이다. [0002] [0003] 배경기술골조직은골량 (bone mass) 및골격의항상성 (skeletal homeostasis) 을유지하기위해흡수와형성이끊임없이일어나는동적인조직이다. 이러한뼈의재형성 (bone remodeling) 에는두종류의특수한기능을하는세포가관여한다. 파골세포는뼈를흡수하는반면, 조골세포는뼈기질을합성하고채우는역할을한다. 따라서, 골량은이러한세포의상대적인기능에의존하게된다. 정상성인에서는골흡수양과골형성양사이에는항상균형이유지되고있다. 골개조는일정한주기를통해일어나며국소적으로좁은부위에서일어남으로써골격계의구조가유지되는데이러한골격계의구조와기능은전신적인호르몬과국소적인자사이의복잡한상호작용에의해조절된다. 조골세포와파골세포활성간의불균형은전체적인뼈의감소 (osteoporosis) 나증가 (osteosclerosis) 로인한골격의이상으로나타난다. 이러한골대사불균형은일차적으로조골세포의기능저하에의한것인지, 혹은골흡수의증가즉, 파골세포의활성도강화에의한것인지에대하여는여러가지이론과주장이제기되고있으며골다공증의요인으로는연령의증가, 영양결핍, 운동부족, 칼슘섭취의부족, 유전적요소, 약물복용, 호르몬의영향등을꼽는다 [0004] 골대사질환중고령사회에서큰문제로대두되고있는골다공증은골의화학적조성에는큰변화없이단위용적내의골량이감소하여경미한충격에도쉽게골절을일으킬수있는질환이다. 노인특히폐경후여성들의경우에스트로겐 (estrogen) 의분비부족으로인하여가장그발생빈도가높게나타난다고알려져있다 (Jilka RL.Cytokines, bone remodeling and estrogen deficiency. Bone 23: (1998)). 그러나, 남성이라도노화에따라골질량이감소하는경향이나타나며 (Stein GS, Lian JB, van Wijnen AJ, Montechino M. Transcriptional control of osteoblast growth and differentiation. Physiol Rew. 76: (1996)), 최근 20년간초중학생의골절률은 2배이상증가하고있는실정이다. 골대사불균형으로인한골질환의예방또는치료측면에서, 젊은때부터골질량을높이는것이상당히중요하며, 이와같이뼈의건강을유지하는것은성별이나연령과관계없이중요한문제이다. [0005] 현재골다공증예방및치료에사용되고있는약제는대부분골흡수를억제하는작용을하기때문에이미진행된골소실을완전히회복할수없으며, 따라서궁극적인목표인골다공증의발생을완전히예방할수없는현실이다. 이에골다공증의예방과치료를위해골형성증가에관한연구가최근주목받고있으며골조직재생능력에미치는영향등에대한과학적인접근이필요한실정이다. [0006] 하르파고피툼근은아프리카칼라하리사막에서식하는일명 ' 악마의발톱 '(Harpagophytum procumbens DC.) 이라는별명을가지고있으며근경을아프리카와유럽에서민간약으로 `관절염에사용하고있는 Pelaliaceae과식물이다. 하르파고피툼근의성분으로는하르파지드 (harpagide), 하르파고시드 (harpagoside), 프로쿰비드 (procumbide), 8-O-( 파라-쿠마노일 )-하르파지드[8-O-(p-coumaroyl)-harpagide], 6'-O-( 파라-쿠마노일 )-프로쿰비드 [6'-O-(p-coumaroyl)-procumbide], 프로쿰보시드 (procumboside) 가알려져있으나, 이들성분의약리작용은알려져있지않다. 발명의내용 [0007] 해결하려는과제본발명은조골세포의증식및분화, 및골석회화를촉진시킴과동시에, 파골세포의분화를억제하여골대사성질환을효과적으로예방또는치료할수있는하르파고피툼근추출물을유효성분으로함유하는약학적조성물을제공하는것을목적으로한다

4 [0008] 또한본발명은상기하르파고피툼근추출물을포함하는성장기의골강화및성장발육에유용한건강기능식품 을제공하는것을목적으로한다. [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] 과제의해결수단본발명은상기와같은과제를해결하기위하여하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물을제공한다. 본발명에있어서, 상기골대사성질환의예방및치료용약학조성물은조골세포증식, 분화촉진활성, 및파골세포분화억제활성을갖는것을특징으로한다. 본발명에있어서, 상기하르파고피툼근추출물은하르파고피툼근의분말을물, 탄소수 1 내지 4의저급알콜또는이들의혼합용매중에서추출하여얻어지는것을특징으로한다. 본발명의상기골대사성질환의예방및치료용약학조성물은상기하르파고피툼근추출물 100 중량부당골쇄보 10 내지 300중량부, 아교주 50 내지 500중량부, 복령 50 내지 500중량부, 생지황 10 내지 300중량부및인삼추출물 10 내지 300중량부를포함하는것을특징으로한다. 골쇄보 ( 骨碎補 ; Drynaria fortunei (Kze.) J. sm.) 는고란초과에속하는여러해살이풀인넉줄고사리, 즉골쇄보의뿌리줄기를말린것이다. 성분이따뜻하고맛이쓰며독이없고파혈과지혈의작용을가지고있으며, 특히만성적인신경통을치료하는데중요한약물로알려져있으며, 주요성분으로는헤스피리딘 (hesperidin), 나린진 (naringin), 전분, 포도당등이있다. 일반적으로, 복령은소나무류를절제한 5~6년후송근주위에기생하는균핵으로담백색을백복령, 담갈색을적복령, 송근을포함하고있는것을복신이라한다. 한방의학에서복령추출물은진정제및이뇨제로분류된다. 또한, 복령추출물은기력회복을위한한방조제의중요한성분중의하나로서사용된다. 최근몇년동안의복령추출물의약제학적효능과관련된연구및실험에따르면, 복령추출물은종양억제에탁월한효능이있으며, 만성질환으로고통받는사람의면역력을향상시키는것으로밝혀졌다. 생지황 (Rehmannia glutinosa LIBOSCH.) 은현삼과에속하는약초로서, 주성분이이리도이드 (Iridoid) 배당체의일종인카탈폴 (Catalpol) 이며, 이뇨작용과사하작용등의생리활성을가지고있다. 특히, 근경은보혈강장효과가있어빈혈, 허약, 당뇨병의치료를목적으로하는여러가지한방처방이나생약배합제제에많이이용되고있다. 인삼은오가피나무과에속하는다년생약초로서각종생리활성을가지는사포닌 (Saponin) 계유도체화합물이주요약효를가지며, 진세노사이드 (Ginsenoside) 의함량이품질의지표가된다고보고되고있다. 한방처방에서는건위소화약, 정장지사약, 진통진경약으로되는처방등에사용되며약리작용으로는혈당강하작용, 항암효과, 혈청단백합성촉진, 항체생산촉진작용, 중추흥분작용, 항피로작용등이있다. 상기추출물각성분들은오랫동안생약으로사용되어오던약제로서이로부터추출된본발명의추출물들역시독성및부작용등의문제가없다. 각각의성분들은모두혼합한후한꺼번에추출하는방법및각각의추출물을혼합하는방법이모두사용될수있다. [0019] 본발명에있어서, 상기골대사성질환은골다공증, 파제트병, 치주질환, 골전이암또는류마티스관절염을 포함한다. [0020] [0021] 본발명의하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물은약학적조성물의제조에통상적으로사용하는적절한담체, 부형제및희석제를더포함할수있다. 본발명의하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물은, 각각통상의방법에따라산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸등의경구형제형, 외용제, 좌제및멸균주사용액의형태로제형화하여사용될수있으며, 화합물을포함하는조성물에포함될수있는담체, 부형제및희석제로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, - 4 -

5 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트및광물유를들수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는상기화합물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에마그네슘스티레이트탈크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테르등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴등이사용될수있다. [0022] [0023] 본발명의하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물의바람직한투여량은환자의상태및체중, 질병의정도, 약물형태, 투여경로및기간에따라다르지만, 당업자에의해적절하게선택될수있다. 그러나바람직한효과를위해서, 본발명의하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로투여하는것이좋다. 투여는하루에한번투여할수도있고, 수회나누어투여할수있다. 따라서, 상기투여량은어떠한면으로든본발명의범위를한정하는것은아니다. 본발명의조성물은쥐, 생쥐, 가축, 인간등의포유동물에다양한경로로투여될수있다. 투여의모든방식은예상될수있는데, 예를들면, 경구, 직장또는정맥, 근육, 피하, 자궁내경막또는뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에의해투여될수있다. [0024] [0025] [0026] [0027] 본발명은또한, 하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및개선용건강기능식품을제공한다. 본발명에있어서, 상기골대사성질환의예방및개선용건강기능식품은조골세포증식, 분화촉진활성, 및파골세포분화억제활성을갖는것을특징으로한다. 본발명은본발명의하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는건강기능식품을제공한다. 본발명의하르파고피툼근추출물자체는독성및부작용은거의없으므로예방목적으로장기간복용시에도안심하고사용할수있는화합물이다. 본발명의하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는건강기능식품은골대사성질환의예방및개선을위한약제, 식품및음료등에다양하게이용될수있다. 본발명의알파-토코페롤숙신산을첨가할수있는식품으로는, 예를들어, 각종식품류, 음료, 껌, 차, 비타민복합제, 건강보조식품류등이있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐또는음료인형태로사용할수있다. [0028] [0029] 본발명의하르파고피툼근추출물은골대사성질환의예방및개선을목적으로식품또는음료에첨가될수있다. 이때, 식품또는음료중의상기화합물의양은일반적으로본발명의건강식품조성물은전체식품중량의 0.01 내지 15 중량 % 로가할수있으며, 건강음료조성물은 100 ml를기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의비율로가할수있다. 본발명의건강음료조성물은지시된비율로필수성분으로서상기화합물을함유하는것외에액체성분에는특별한제한점은없으며통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물의예는모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등의디사카라이드, 예를들어말토스, 슈크로스등의및폴리사카라이드, 예를들어덱스트린, 시클로덱스트린등과같은통상적인당및자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이다. 상술한것이외의향미제로서천연향미제 ( 타우마틴, 스테비아추출물 ( 예를들어레바우디오시드 A, 글리시르히진등 ) 및합성향미제 ( 사카린, 아스파르탐등 ) 를유리하게사용할수있다. 상기천연탄수화물의비율은본발명의조성물 100 ml당일반적으로약 1 내지 20 g, 바람직하게는약 5 내지 12 g이다

6 [0030] [0031] 상기외에본발명의조성물은여러가지영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 합성풍미제및천연풍미제등의풍미제, 착색제및중진제 ( 치즈, 초콜릿등 ), 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의조성물들은천연과일쥬스및과일쥬스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 이러한성분은독립적으로또는조합하여사용할수있다. 이러한첨가제의비율은그렇게중요하진않지만본발명의조성물 100 중량부당 0 내지약 20 중량부의범위에서선택되는것이일반적이다. [0032] 발명의효과본발명에의한하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골대사성질환의예방및치료용약학조성물은조골세포 (osteoblast) 의증식및분화, 및골석회화를촉진시키며파골세포 (osteoclast) 의분화를억제하는효과를나타내어골다공증을포함하는골대사질환개선에유효한효과를나타낸다. [0033] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의실시예 1 의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2 의하르파고피툼근추출물을함유하는 조성물을처리한경우 MTT assay 를시행하여세포생존율을측정한결과를나타낸다. 도 2, 3은본발명의실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을처리한경우 ALP 활성을측정한결과를나타낸다. 도 4, 5는본발명의실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을처리한경우 AR 염색법에의한석회화형성도를측정한결과를나타낸다. 도 6, 7은본발명의실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을처리한경우파골세포에대한세포독성을측정한결과를나타낸다. 도 8, 9는본발명의실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을처리한경우 TRACP 염색에의한파골세포의활성억제정도를측정한결과를나타낸다. 도 10은본발명의실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을투여한흰쥐의체중의변화를나타낸다. 도 11, 12 는본발명의실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을투여한흰쥐에서분리한대퇴골의차원적인미세해면골과피질골의구조및미세구조의지표들을측정한결과를나타내었다. 도 13, 14는본발명의실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을투여한흰쥐의혈중에서의 bone biomarker 의활성을측정한결과를나타낸다. [0034] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하에서는본발명을실시예에의하여더욱상세하게설명한다. 그러나, 본발명이아래실시예에의하여 한정되는것은아니다. [0035] [0036] < 실시예 1> 하르파고피툼근추출물의제조하르파고피툼근분말 1,205 g에 70 % 에탄올 8 L 를넣고 6시간씩 4회추출하여하르파고피툼근엑스 598 g을얻었다. 상기하르파고피툼근엑스를물 1 L에현탁시키고부탄올 / 헥산혼합용매 1리터로 3회추출하고, 농축하여하르파고피툼근추출물 12 g을얻었다. [0037] < 실시예 2> 하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골다공증의예방및치료용약학조성물의제 - 6 -

7 조 [0038] 상기실시예 1 에서제조된하르파고피툼근추출물 10g 에골쇄보 10g, 아교주 5g, 복령 5g, 생지황 2g 및인 삼추출물 5g 을첨가하여하르파고피툼근추출물을유효성분으로포함하는골다공증의예방및치료용약학 조성물을제조하였다. [0039] [0040] [0041] < 실험예 1> 조골세포의활성화효능분석 < 실험예 1-1> 조골세포배양조골세포주로서는 MC3T3-E1 을 ACTC 로부터구입하여사용하였다. 상기 MC3TC-E1 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/mL 의페니실린및 100 μg /ml 을함유하고, 아스코르브산을함유하지않는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 37, 5% CO2 조건에서배양하여사용하였다. [0042] [0043] [0044] < 실험예 1-2> 조골세포에대한세포독성실험배양된 MC3T3-E1 을 96 웰플레이트에웰당 개의세포를넣고, 10% FBS-α-MEM 미디엄에서 24시간동안배양하였다. 배지를제거하고, 상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을일정농도로포함하는 α-mem 미디엄에서배양한후, MTT assay 를시행하여세포생존율을측정하였으며, 그결과를각각도 1의 A, B 에나타내었다. 도 1에서상기실시예 1의하르파고피툼근추출물은가장높은농도인 500 μm 농도로처리한경우 80% 이상의세포생존율을나타내었고, 상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을가장높은농도인 1000 μg /ml 농도로처리한경우 70% 이상의세포생존율을나타내었다 [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] < 실험예 1-3> ALP 염색법에의한조골세포활성도측정본실험예에서는상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물이조골세포의활성화에미치는영향을평가하기위해배양된 MC3T3-E1 을사용하여염기성인산분해효소의활성을측정하였다. 일반적으로염기성인산분해효소는조골세포의분화초기에활성이뚜렷하여, 초기조골세포의특이표지자로알려져있다. 배양된 MC3T3-E1 가단층을형성한후, 비타민 C 와 β glycerophosphate 를처리하여조골세포로의분화를유도하고, 상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을일정농도로포함하는 α-mem 미디엄에서배양하였다. 비교예로서, 현재골다공증치료제로사용되고있는 17β - estradiol 을일정농도로처리하였다. 4일후, 인산염식염수로세포층을세척하고, 3.7% 포름알데히드와 90% 에탄올로 2분간고정하여 10분간 TBS에세척하였다. ALP 염색은알칼린포스프타아제 (AP kit ; Sigma Chemical Co., USA) 를사용하였으며제조사의지침에따라우선, 배지를제거하고고정액 ( 구연산염-아세톤-포름알데히드 ) 을이용하여약 30초간실온에보관하였다가 45 초간증류수로씻어내었다. 준비된디아조니움용액 ( 아질산나트륨 : FRV-알칼리성 : 나프톨 AS-BI 알칼리성용액 =1:1:1) 을첨가하여약 15분간실온에서배양한뒤 2분간증류수로세척하고헤마톡실린용액 (hematoxylin solution) 으로 2분간다시염색한뒤흐르는물에염색액을철저히씻어내고현미경으로관찰, 촬영 ( 10) 하였으며, 그결과를도 2, 도 3에나타내었다. 도 2, 도 3 에서보는것처럼처리하지않은대조군은붉은색의효소가많이형성되지않은반면, 본발명의상기실시예 1의하르파고피툼근추출물을처리한군과상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물로처리한군에서농도의존적으로인산분해효소활성이유의적으로증가하였다. [0050] [0051] < 실험예 1-4> AR 염색법에의한석회화형성도검사 상기실험예 1-3 과동일하게조골세포로의분화를유도한후, 상기실시예 1 의하르파고피툼근추출물및 상기실시예 2 의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을일정농도로포함하는 α-mem 미디엄에서배양 - 7 -

8 하였다. 비교예로서, 현재골다공증치료제로사용되고있는 17β - estradiol 을일정농도로처리하였다. 플레이트의배지를완전히제거하고, PBS로세척한뒤, 70% EtOH로 4 에서 1시간동안고정시켰다. 알리자린레드용액 (Alizarine red solution) 은 10 ml의증류수에 40 mm 이되게농도를맞춘뒤칼슘은 ph 4.2에서염색이되므로 ph를조정하였다. 고정이끝나면준비한용액으로 10분간염색하고증류수로 2번세정하면서염색되지않은부분은 PBS로씻어주면서제거해주고표면이너무마르지않게 PBS로조금적셔주면서현미경으로단괴 (nodule) 형성정도를관찰하였다. [0052] [0053] 단괴형성정도는 10 mm 인산나트륨 (ph 7.0) 에 10% 세틸피리디늄클로라이드 (cetylpyridinium chloride) 를첨가하여 15 분간녹이고염색된정도를 562 nm에서흡광도로측정하여도 4, 도 5에나타내었다.. 도 4, 5에나타낸바와같이본발명의상기실시예 1의하르파고피툼근추출물을처리한군과상기실시예 2 의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물로처리한군에서농도의존적으로조골세포로의분화가진행되어염색된정도의흡광도값이유의적으로증가하였다. [0054] [0055] [0056] [0057] < 실험예 2> 파골세포의활성화효능분석 < 실험예 2-1> 파골세포분리파골세포의분화를연구하는데있어서가장큰어려운점은현재까지파골세포의기능을유지하고있는세포주가확립되어있지않다는것이다. 파골세포는골수기원의조혈모세포에서기원하고이들이분화를할때조골세포 / 기저세포의도움을받기때문에파골세포의분화모델시스템으로골수세포와조골세포의상호배양시스템이많이이용되고있다. 본발명에서는 3 주령수컷 ICR 생쥐를희생한후, 알코올로소독하여경골을분리하였다. 분리한경골의골수강에 26 gauge 1 ml 주사기를꽂은후 α-mem 미디엄을분사하여골수를얻었다. Histopaque(Sigma) 를이용하여단핵구를분리하였다. [0058] < 실험예 2-2> 파골세포에대한세포독성실험 [0059] 상기분리된생쥐골수대식세포를 96 웰플레이트에웰당 개의세포를넣고, 10% FBS-α-MEM 미디 엄에서 24 시간동안배양하였다. 배지를제거하고, 상기실시예 1 의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2 의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을일정농도로포함하는 α-mem 미디엄에서배양한후, MTT assay 를시행하여세포생존율을측정하였으며, 그결과를각각도 6, 7 에나타내었다. [0060] 도 6, 7 에서상기실시예 1 의하르파고피툼근추출물과, 상기실시예 2 의하르파고피툼근추출물을함유하는 조성물을가장높은농도인 1000 μg /ml 농도로처리한경우 50% 이상의세포생존율을나타내었다. [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] < 실험예 2-3> 파골세포의활성에미치는영향분석상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물의파골세포활성에미치는영향을보기위하여상기분리, 배양된생쥐골수대식세포를 cells/well의농도로 96 웰플레이트 (96 well plate) 에분주하였다. 분주 24 시간후파골세포분화유도는파골세포분화인자인랭클 (RANKL; receptor activator of nuclear factor- kb ligand) 이 50 ng/ml 첨가된, 10% FBS a-mem로 3일간 37, 5% CO2조건에서배양하였다. RANKL처리와동시에준비된상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을처리하여, 전구세포에서파골세포로유도되는과정중의파골세포의표식인자인산성인산화효소 (acid phosphatase) 의효소활성을측정함으로서파골세포의분화저해효과를평가하였다. 파골세포가있는배양접시에서배양액을제거하고세포를고정하기위하여 10% 포르말린으로 5분동안처리하였다. 포르말린을제거하고 0.1% 트립톤 X-100 (Triton X-100) 을 10초동안처리하였다. 트립톤 X-100 용액을제거하고 5분간 TRACP (tartrate-resistant acid phosphatase) 염색하였다. TRACP 염색은백혈구산포스파타제키트 (LEUKOCYTE ACID PHOSPHATASE KIT, Sigma, cat. No. 387-A) 를사용하였다. TRACP 염색용액제거하고증류수로 2번수세하고건조시킨다음 TRACP 양성인다핵의파골세포의수를광학현미경 - 8 -

9 (X100) 으로카운팅하였으며, 그결과를각각도 8, 9 에나타내었다. 도 8, 9 에서상기대조군의파골세포수 325개를 100% 로하였을때, 상기실시예 1의하르파고피툼근추출물을처리한경우 78.2%, 68.9%, 40.9%, 16.6% 과, 상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을처리한경우 82.2%, 71.4%, 53.2%, 8.3% 감소하였다. [0066] [0067] < 실험예 3> 동물모델을이용한하르파고피툼근추출물의임상조직실험본발명자들은상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물이골다공증의치료및예방에어떠한영향을미치는지알아보기위하여, 난소절제술 (Ovariectomy) 을시행하여골다공증이유도된자성백서 (female rat) 를실험모델로이용하여난소절제백서에척추 (L5) 및경골을절단하여조직관찰을수행하였다. [0068] [0069] [0070] < 실험예 3-1> 난소절제술 100 mg / kg의케타민 (Ketamine, Ketara) 과 2% 자이라진 (Xylazine; Rompun 0.15 ml / kg ) 로전신마취후통상의방법에따라제모및술전무균처리 (10% povidone-iodine scrub followed by a 70% alcohol wipe) 를수행하였다. 백서복측중앙에 1 cm가량을절개한뒤횡격막이나간등주요장기에손상이가해지지않도록주의를하며자궁을따라난소를확인하였다. 봉합용실로난소를결찰한뒤난소절제를양측으로수행하였다. 난소절제후각장기를복강내로재위치시킨후봉합용실로층별봉합을수행하였다. 수술후감염방지를위해 50 ml / kg의항생제세파졸린 (cefazolin) 을주사하였다. [0071] [0072] [0073] < 실험예 3-2> 하르파고피툼근추출물및하르파고피툼근함유조성물투여자성백서한마리에대한약물투여량은몸무게 250 g를기준으로시행하였다. 구체적으로, 대조군백서는고형사료와마리당 30 ml의물만을투여하였으며, 실험군백서는마리당상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을일정농도로경구투여하였고, 매일아침마다하루분량만큼의약물을제조하고남은양은버리지않고남은양에상관없이원액을마리수에따라넣고물은항상마리수기준으로채웠다. 물병은바뀌지않도록주의하며매일마리수를확인하고마리수에따라상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을제조하였다. 상기와같은방법으로본발명의추출물및조성물을투여하였으며 12 주동안상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을주 5회경구투여하면서사육하였다. [0074] [0075] < 실험예 3-3> 체중측정및식이효율실험기간동안일정시간에 4주간격으로몸무게를측정하였으며, 그결과를도 10에나타내었다. 도 10 에나타낸바와같이대조군과실험군간의체중의유의적인차이는없었다. 따라서, 본발명의실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물독성에의한성장의차이는없었다. [0076] [0077] < 실험예 3-4> 조직표본의광학현미경관찰본발명의추출물및조성물을투여한흰쥐로부터채취한대퇴골조직을 10% 포르마린용액에고정한수포름산 os에서탈회를실시하였다. 골조직의관찰부위를수술칼로절단한뒤 20 ~ 100% 알코올과아세톤에이르는단계별탈수과정을거쳐자일렌으로수세하고파라핀포매를실시하였다. 파라핀포매된골조직을마이크롬으로 5 μm로절단하고헤마톡실린및에오신 (hematoxyline and eosin, H&E) 염색과고모리 (gomori) 염색을실시하고, micro CT 로확인하였다

10 [0078] 도 11, 도 12 에 3 차원적인미세해면골과피질골의구조및미세구조의지표들을측정한결과를나타내었다. [0079] [0080] [0081] 골량의경우도 11, 도 12에서비교예의 OVX 군은 sham 군에비하여 64.5% 골량이감소하였으나, 상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을투여한군에서는각각골량이 309.9, 549.3% 증가한것을확인하였다. 비교예로서난소를절제하고본발명의추출물및조성물을투여하지않은흰쥐 (OVX군), 난소를절제하지않은흰쥐 (sham 군 ) 및기존에사용되는골다공증치료제인 17β - estradiol 을처리한군 (E2군) 의경우난소를절제하지않은흰쥐 (sham 군 ) 과유사하게나타났다. 해면골두께에있어서도, 도 11, 도 12에서보는바와같이 OVX 군은 sham 군보다 3.7 % 낮게나타났으며, 상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을투여한군에서는 OVX 군에비하여 7.7%, 24.4% 더두꺼운것으로확인되었다. 골밀도의경우 sham 군에비해난소절제술을시행한 OVX군에서대퇴골의골밀도가 38.1 % 더낮았다. [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] < 실험예 3-5 > 혈중 bone biomarker 함량측정본발명에의한골다공증치료효과를측정하기위한 bone biomarker 로서혈중칼슘의농도, 오스테오칼신 (osteocalcin) 의농도를정량하였으며, 파골세포활성지표로서 TRAP5b, 조골세포활성지표로서 ALP 활성을측정하였다. 실험 12 주째에테르로마취시켜개복한후혈액을채취하였다. 심장에서채혈한혈액은 4 에서 30분방치한다음 3,000 rpm에서 10분간원심분리하여혈청을분리한후혈청내 Ca 의함량을혈액분석기 Ektachem DTⅡ system을이용하여측정하고, 오스테오칼신 (osteocalcin) 은 OSTEOCALCIN MYRIA RIA 키트 (Techno genetics, ) 를사용하여측정하였으며, 그결과를도 13, 도 14 에나타내었다. 혈청내의 Ca 함량을비교해봤을때, 도 13, 도 14 에서보는바와같이, 본발명의추출물및조성물의투여농도에따라통계적으로유의성을나타냈다. OVX군의 Ca 농도는난소를절제하지않은 sham 군과유의한차이를나타내지않았고, 상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을투여한경우 12주후에도 Ca 농도의변화는관찰되지않았다. 혈청내의오스테오칼신 (osteocalcin) 의함량을비교해봤을때, 도 13, 도 14 에서보는바와같이, 본발명의추출물및조성물의투여농도에따라통계적으로유의성을나타냈다. OVX 군의경우유의하게증가하였으며, 상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을투여한군에서는농도의존적으로감소하였다. 조골세포활성지표인 ALP 활성의경우 OVX 군의경우유의하게증가하였으며, 상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을투여한군에서는농도의존적으로감소하였다. 파골세포활성지표인 TRAP5b 활성의경우 OVX 군이 sham 군에비하여유의하게증가하였으며, 상기실시예 1의하르파고피툼근추출물및상기실시예 2의하르파고피툼근추출물을함유하는조성물을투여한군에서는농도의존적으로감소하였다

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(52) CPC 특허분류 A23L 1/3002 ( ) A23L 1/337 ( ) A61K 2236/19 ( ) - 2 -

(52) CPC 특허분류 A23L 1/3002 ( ) A23L 1/337 ( ) A61K 2236/19 ( ) - 2 - (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/03 (2006.01) A23L 1/30 (2006.01) A23L 17/60 (2016.01) A23L 33/00 (2016.01) (52) CPC 특허분류 A61K 36/03 (2013.01) A23L 1/29 (2013.01) (21) 출원번호