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대호 운
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1 Journal of the Korean Chemical Society 2004, Vol. 48, No. 2 Printed in the Republic of Korea 전기자극에의한알콜산화효소의활성도와안정도연구이강민 * 김경숙 박충웅전북대학교자연과학대학분자생물학과 ( 접수 ) Activity and Stability of Alcohol Oxidase from Hansenula sp. by Electrostimulation Kang-Min Lee*, Kyung-Suk Kim, and Chung-Ung Park Department of Molecular Biology, College of Natural Science, Chonbuk University, Chonju , Korea (Received December 22, 2003) 요약. 전기자극에서알콜산화효소의활성도와안정도를연구하였다. 알콜산화효소의활성도와안정도는전기출력전압, 자극시간, 자극기간, 자극간격에따라달라진다. 전기자극에의하여비활성화효소활성도는당, 중합체, 히드로젤과같은안정화첨가제에의하여회복되었다. 이효소에전기자극을 40 V, 10분주었을때완충용액에서는활성도가전혀없었지만 10% 트레할로스용액에서는 52% 의활성도를유지하였다. 전기자극하에서효소를안정화시킬수있음은효소를생물공학과의료공학에널리이용할수있는가능성을보여준다. 주제어 : 전기자극, 알콜산화효소, 안정도 ABSTRACT. We investigated the activity and stability of alcohol oxidase from Hansenula sp. under the electric stimulation. The activity and stability of alcohol oxidase depended on electric output voltage, stimulation time, pulse duration and pulse interval. This inactivation of the enzyme under electric stimulation could be recovered by stabilizing additives such as sugars, polymers and hydrogels. The enzyme activity retained about 52% in 10% trehalose solution under electric stimulation with 40 V and 10 min. The stabilizing of enzymes against electric stimulation showed a great potential use of enzymes in biotechnology and medical engineering fields. Keywords: Electrostimulation, Alcohol Oxidase, Stability 서 전기자극은생명현상에많은영향을준다. 전기자극은세포수준에서세포내의단백질합성, 핵산의변형, 효소의활성화, 호르몬분비, 세포의막투과성, 골모세포의활성화에많은영향을주며조직수준에서골격근수축, 평활근수축, 피부조직재생에효과가있음이밝혀졌다. 1-5 최근생물공학에서효모와같이세포벽이두꺼운세포에유전자를주입한다든지세포의증식을가속화하는데전기자극이이용되고있으며의료공학에서근육마비환자의재활치료나신경마비환자의신경치료에 론 전기자극을널리응용하고자시도하고있다. 그러나이들전기자극이생체물질에어떠한영향을주며, 어떠한기작에의해서작용되는지구체적인연구는거의진행되어있지않다. 본연구는전기자극이생체단백질인효소의활성도와안정도에어떠한영향을주는가를연구하고비활성효소를여러가지안정화첨가제를사용하여안정화시키는방법을연구하였다. 본연구에사용한효소는최근바이오센서에널리사용하고있는알콜산화효소이다. 알콜산화효소는보조인자가필요없이자체적으로 FAD 를가지고있는 octamer 이다

2 172 이강민 김경숙 박충웅 실 Hansenula sp. 로부터분리한알콜산화효소, peroxidase는 Sigma(St. Louis, USA) 에서구입하였다. 완충용액은 50 mm Potassium phosphate(ph 7.0) 완충용액을사용하였다. 효소안정화에필요한 CMC (carboxymethylchitosan), agarose, carbopol, trehalose, mannose, maltose, sucrose, fructose, inisitol, Dulcitol, BSA(bovine serum albumin), TritonX-100, Tween-80은 Sigma에서구입하여사용하였다. 전기자극기는 BDS- 301 Digital Stimulator (Biotron, 한국 ) 모델을사용하였다. 전기자극기. 국내바이오트론에서제작한 BDS-301 Digital Stimulator 모델을사용하였다. 이실험기구는생리학, 생물학, 임상연구에사용하는것으로출력전압은 0.01 V~100 V, 자극의강도, 양상, 시간을조절하여연구하였다. 알콜산화효소활성도결정. 알콜산화효소활성도는 couple assay 방법으로측정하였다. 알콜산화효소는산소존재하에알콜을산화시키고과산화수소를만든다. 과산화수소는 peroxidase 존재하에 ABTS(2,2- azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 와반응하여생성되는물질을 UV-visible 분광기를사용하여 420 nm에서활성도를측정하였다. 전기자극하에서알콜산화효소활성도결정. 전기자극실험은완충용액의최종농도가 5ug 알콜산화효소, 250 mm methanol, 25 ug peroxidase, 50 um ABTS 조건에서효소활성도을결정하였다. 효소안정도실험은 1ml 반응조에완충용액, 1 mg 효소를넣은후전기자극기를사용하여출력전압, 강도와시간을조절하면서자극을주었다. 자극후효소용액을 5ul 취하여위와같은조건에서효소활성도를측정하였다. 전기자극하에서히드로젤에의한알콜산화효소안정화. 전기자극을받으면효소는비활성화된다. 비활성화된효소가여러가지히드로젤에의하여안정화되는연구를하였다. 히드로젤은 CMC, agarose, carbopol 을사용하였다. 히드로젤은농도가증가할수록점성도가증가해서어느농도이상에서는효소활성도를측정할수없기때문에 1% 농도에서실험하였다. 1% 히드로젤용액에효소를넣고자극을준후기질물질을넣고위와같은효소활성도실험조건에서반응시켜생성되는물질을 UV-visible 분광기를사용하여 420 nm 에서활성도를측정하였다. 히드로젤을넣지않고전기 험 자극을가한효소활성과비교하였다. 전기자극하에서당에의한알콜산화효소안정화. 여러가지당을사용하여효소안정화를연구하였다. 사용한당으로 trehalose, mannose, maltose, sucrose, fructose, inisitol, dulcitol 를사용하였다. 20% 당용액에효소를넣고자극을준후기질물질을넣고위와같은효소활성도실험조건에서반응시켜 UV-visible 분광기를사용하여 420 nm 에서효소활성도를측정하였다. 전기자극하에서계면활성제에의한알콜산화효소안정화. 효소안정화물질로 BSA, TritonX-100, Tween- 80 과같은계면활성제를사용하였다. 효소활성도는위와같은방법으로결정하였다. 1% 계면활성제용액에효소를넣고자극을준후기질물질을넣고반응시켜위와동일한실험조건에서효소활성을측정하였다. 결과및고찰 전기자극의출력전압, 자극지속시간, 자극지속간격을다양하게변화시켜가며알콜산화효소의활성도를확인하였다. 먼저자극시간과자극의지속간격을동일하게설정하고, 출력전압을변화시켜가며그효과를확인하였다. Fig. 1 에서보는바와같이출력전압이 0.5 V 이하에서 80 분이상전기자극을주어도알콜산화효소의활성도는변하지않았다. 그러나전기자극의전압이 1V 이상가해지면알콜산화효소의활성도는감소하기시작하였다 (Fig. 1) 전압을 1V 에서는 40 분자극을 Fig. 1. Stability of alcohol oxidase from Hansenula sp. as variation of output voltage and incubation times. Electropulse is a single pulse repeating type and both pulse interval and pulse duration are 1 sec. Final concentrations of enzyme reaction mixture were 5 ug alcohol oxidase, 250 mm methanol, 25 ug peroxidase, 5 0uM ABTS in 50 mm phosphate buffer (ph 7.0). 1mg/ml enzymeswere stimulated at 0.5volt( ), 1volt( ), 5volt(x), 20volt( ). The activity was determined at 420 nm. Journal of the Korean Chemical Society

3 전기자극과효소안정도 173 Fig. 2. Stability of alcohol oxidase from Hansenula sp. as variation of pulse duration(pd), pulse interval(pi) and output voltage. Electropulse is a single pulse repeating type and maintains for 10 min. Final concentrations of enzyme reaction mixture were 5 ug alcohol oxidase, 250 mm methanol, 25 ug peroxidase, 50 um ABTS in 50 mm phosphate buffer(ph 7.0). 1mg/ml enzymes were stimulated for 10min from 10 to 40V with PD and PI were equally each PD=PI=0.01 msec(x), PD=PI=0.1 msec ( ), PD=PI=1 msec( ), PD=PI=1 sec( ). The activity was determined at 420 nm. 주면 30% 이상의활성도가감소하였다. 20 V로자극을주면 10분만에 50% 이상의활성도가감소하였다. 전기자극의전압이증가할수록효소는비활성화됨을알수있었다. 전기자극에의한효소의비활성도가전해질속의효소에전기가전해짐에따라발생할수있는열에의해활성이억제될수있다는가능성도배제할수없을것이다. 알콜산화효소는출력전압 10 V, 자극지속시간 80분, 자극지속간격 1초의동일한실험조건조건하에서전해질의온도는거의변하지않았다. 그러므로효소의비활성화전기자극의전압에의존함을알수있었다. 효소의활성도가전기자극의형태에의존하는가를알기위하여 10분동안자극유지시간 (PD) 과자극간격시간 (PI) 를동일하게 0.01 msec 1 변화시켜가면서출력전압의증가에따른알콜산화효소의활성을측정하였다 (Fig. 2) Fig. 2에서보는바와같이자극유지시간과자극간격시간이작을수록알콜산화효소활성은더욱저하되어전기자극의효과가미세하게증가함을확인할수있었다. 자극지속시간과간격의변화에따른알콜산화효소활성은그차이가미세하여경향을명확하게규정하기는어려우나, 자극유지시간과자극간격시간이작을수록알콜산화효소에전기자극이더욱지속적으로가해지기때문에전기자극의전달이효과적일수있다. sec 까지 전기자극에의하여비활성화된효소를안정화하기위하여히드로젤을사용하였다. 8 Fig. 3 에서보는바와 Fig. 3. Stability of alcohol oxidase Hansenula sp. from in 1% hydrogel solution. Electropulse is a single pulse repeating type and maintains for 10 min. Final concentrations of enzyme reaction mixture were 5 ug alcohol oxidase, 250 mm methanol, 25 ug peroxidase, 50 um ABTS in 50 mm phosphate buffer(ph 7.0). 1 mg/ml enzyme were stimulated in 1% hydrogels, CMC ( ), agarose( ), carbopol(x), without hydrogel( ) from 10 to 80 V. The activity was determined at 420 nm. 같이비활성화된효소는 1% CMC, agarose, carbopol 용액에서거의같은비율로안정화되었다 (Fig. 3) 효소를 20 V 에서 10 분전기자극을주었을때활성도는거의 80% 를상실했지만 1% CMC, agarose, carbopol 용액에서는 25-30% 밖에상실되지않았다. 이와같이히드로젤은효소를안정화할수있다. 리파제와혈청알부민 (BSA) 같은단백질도히드로젤에의하여구조적으로안정화됨이보고되었다 전기자극에의하여비활성화된효소를당을사용하여안정화하는방법을연구하였다. Table 1 에서보는바와같이 trehalose, mannose, maltose, sucrose, fructose, inisitol, dulcitol 과같은여러가지당을사용하여안정 Table 1. Relative activity of alcohol oxidase from Hansenula sp. in 10% sugar solutions. Final concentrations of enzyme reaction mixture were 5 ug alcohol oxidase, 250 mm methanol, 25 ug peroxidase, 50 um ABTS in 50 mm phosphate buffer(ph 7.0) Mediator Relative activity No sugar 51 Trehalose 78 Mannose 72 Maltose 62 Sucrose 60 Fructose 58 Inisitol 57 Dulcitol , Vol. 48, No. 2

4 174 이강민 김경숙 박충웅 화효과를살펴보았다. Table 1에서보는바와같이 10% 당용액에서 10분동안전기자극을준다음측정한효소활성도는당이없는용액에서보다증가하였다. 효소는안정화되었다. 당에의한효소의안정화는많은연구가진행되고있다. Chitosan, sucrose, raffinase, sorbitol, mannitol, glycerol이 invertase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, xylanase 효소를안정화함이알려져있다. 이효소는 % trehalose 용액에서 10분간전기자극을주면자극을없는상태에서보다 78% 의효소활성도를갖는다. 그러나이것은 10% trehalose 용액에서당이없는상태에서보다효소활성도가 53% 증가되었음을의미한다. 이와같이당은효소를전기자극으로부터안정화한다. 당에의한효소의안정화는 trehalose, mannose, maltose, sucrose, fructose, inisitol, dulcitol 순서대로효과있었다. 이중제일효과있는 trehalose, mannose, maltose를선택하여 20% 당용액에서전기전압을 80 V까지증가시키면서효소의활성도를측정하였다 (Fig. 4). Fig. 4에서보는바와같이 trehalose 용액에서효소는제일안정화되었다. 20% trehalose 용액에서는수용액에서활성도가전혀없는 40 V 전기자극조건에서도 75% 의활성도를유지하였다. 알콜산화효소의안정화효과가가장우수한 trehalose을선택하여동일한전기자극조건에서각당의농도에따른안정화효과를살펴보았다. 출력전압을 20 V, 자극지속시간은 10분, 자극지속간격을 1초의조건으로전기자극을가했을때, trehalose의농도가증가함에따라, 전기자극에 Fig. 4. Effect of 20% sugars on alcohol oxidase from Hansenula sp. under electric stimulation. Electropulse is a single pulse repeating type and maintains for 10 min. Final concentrations of enzyme reaction mixture were 5 ug alcohol oxidase, 250 mm methanol, 25 ug peroxidase, 50uM ABTS in 50mM phosphate buffer(ph 7.0). 1mg/ml enzyme were stimulated in the presence of 20% of trehalose( ), mannose( ), maltose(x), without sugar ( ) from 10 to 80volt. The activity was determined at 420 nm. Fig. 5. Effect of trehalose on the stability of alcohol oxidase from Hansenula sp. under electric stimulation. Electropulse is a single pulse repeating type and maintains for 10 min. Final concentrations of enzyme reaction mixture were 5 ug alcohol oxidase, 250 mm methanol, 25 ug peroxidase, 50 um ABTS in 50 mm phosphate buffer(ph 7.0). 1 mg/ml enzymes were stimulated in the presence of 10% of trehalose ( ) and no trehalose ( ) from 10 to 80 volt. The activity was determined at 420 nm. 대하여효소를안정화함을확인할수있었다 (Fig. 5). trehalose 의농도가 10% 인상태의알콜산화효소에자극지속시간을 10 분, 자극지속간격을 1 초로고정하고출력전압을 10 V, 20 V, 40 V, 80 V 로증가시키며전기자극을가했을때 40 V 에서는주어진조건의전기자극이알콜산화효소활성거의없지만 10% trehalose 가존재하면알콜산화효소활성도는 52% 이상을유지하였다. 이와같이 trehalose 는단일항체, subtilisn 와같은단백질을구조적으로안정화할수있다. 15,16 계면활성제는효소를안정화시킬수있다 (Fig. 6). 당뿐만아니라계면활성제역시단백질을안정화할수있으므로 SDS, CTAB, BSA, TritonX-100, Tween80 와같은여러가지 1% 계면활성제를함유하는용액에서효소안정도를보았다. CTAB, SDS 와같은이온계면활성제에서는효소는불안정하였다. 그러나 Fig. 6 에서보는바와같이 1% BSA, TritonX-100, Tween 80 용액에서거의비슷하게효소는안정하였다. 1% BSA 용액에서다른비이온계면활성제에서보다약 20% 이상안정하였다. 이와같이 BSA, TritonX-100, Tween 80 와같은비이온계면활성제는다른효소들도안정화하였다. 17,18 생체물질에미치는전기자극의영향은세포생물학과생물공학에서기본적인기작연구외에도그의응용면에서매우관심있는분야이다. 최근전기자극이세포분열, 효소반응, 효소합성, 막이동이변화할수있음이 Journal of the Korean Chemical Society

5 Fig. 6. Stability of alcohol oxidase from Hansenula sp. in 1% surfactants solutions. Electropulse is a single pulse repeating type and maintains for 10min. Final concentrations of enzyme reaction mixture were 5 ug alcohol oxidase, 250 mm methanol, 25 ug peroxidase, 50 um ABTS in 50 mm phosphate buffer (ph 7.0). 1 mg/ml enzymes were stimulated in 1% surfactants, BSA ( ), TritonX-100( ), Tween 80(x), without surfactant( ) from 10 volt to 80 V. The activity was determined at 420 nm. 알려져있다. 이러한생명체와전기자극에대한연구는아직시작단계이며 Berg교수에의하여처음연구되었다. 19 Berg교수는 glutamic acid를생산하기위하여발효에서많이사용되는세포인 Corynebacterium glutamicum 은전기자극하 glutamic acid를생산하는데많은영향을받는다는사실을발표하였다. 또한전기자극에 19,20 의하여면역도증가될수있다. 전기자극은대식세포에서면역에관련되어있는막에부착되어있는 NADPH 산화효소를활성화하여면역을증가시킨다. 전기자극 21 에서세포분화속도도달라질수있다. 인간 AMA 세포와섬유조직은 50 Hz, 0.8 mt 전기장에서, 30분에서노출되었을때분화속도가 180% 증가하였다. 비슷하게생체물질이자기장에도영향받을수있는데예를들면인간 lymphocyte도 PEMP(Pulsed electromagnetic field) 에서 3일동안배양했을때분화속도가증가하였다. 이러한효과는젊은사람의 lymphocyte 보다나이든사람의경우에더확실하였다. 22,23 이와같이전기자극이생체물질에주는영향은연구가되고있으나아직효소단백질에미치는전기자극의효과는연구되고있지않다. 전기자극과생체물질의연구는산업적으로매우광범위하게이용될수있다. 특히제약및의료산업에있어서그파급효과는막대할것이다. 효소반응에전기자극을사용하는연구결과는의약품을합성하는반응조건에서부터발효, 의약품산업에이르기까지광범위하게이용될수있다. 2004, Vol. 48, No. 2 전기자극과효소안정도 175 결 효소반응은환경과조건에따라상이한활성도를나타내며, 이러한조건에서효소들의연구는효소의활성을인위적으로조절할수있게되었다. 전기자극에의하여효소는비활성화되었다. 비활성화정도는전압의세기전기자극의형태즉 PI, PD 에의존적이었다. 전기자극에의하여비활성화된효소는당, 히드로젤, 계면활성제에의하여안정화되었다. 전기자극하에서효소의안정화에대한연구는생물공학, 단백질공학, 의료공학분야에널리이용될수있으리라사료된다. 이논문은 2001 년도전북대학교의지원연구비에의하여연구되었음. 론 인용문헌 1. Hood, D. A.; Zak, R.; Pette, D. Eur. J. Biochem. 1989, 179, Stebbins, C. L.; Brown, B.; Levin. D.; Longhurst, J.C. J. Appl. Physiology, 1988, 65, Rowley, B. Proc. Soc. Exp. Biolo. Med., Beg, H. Bioelectrochem. Bioenerg. 1995, 38, Gamaley, I.; Augsten, K.; Berg, H. Bioelectrochem. Bioenerg. 1995, 38, Boteva, R.; Visser, A.; Filippi, B.; Vriend, G.; Veenhuis, M.; Klei, I.J. Biochemistry 1999, 38, Salomons, F.A.; Kiel, J.; Faber, K.; Veenhuis, M.; Klei, I.J. J. Biol. Chem. 2000, 275, Demers, N. Agostinelli, E. Averill-Bates, D.A.; Fortier, G. Biotech. and Appl. Biochem. 2001, 33, Basri, M.; Samsudin, S.; Bin, Ahmad M.; Razak, C.; Salleh, A.B. Applied Biochem. and Biotech. 1999, 81, Akiyoshi, K.; Sasaki, Y.; Sunamoto, J. Bioconjugate Chemistry 1999, 10, Zhang, L.; Li, L.; An, L.; Hoffman, R.M.; Hofmann, G.A. Bioelectrochem. Bioenerg. 1997, 42, Gomez, L.; Ramirez, H.; Villalonga, R. Biotechnology Letters 2000, 22, Davidson, P.; Sun, W.Q. Pharmaceutical Research, 2001, 18, George, S.P.; Ahmad, A.; Rao, M.B. Bioresource Technology, 2001, 78, Draber, P.; Draberova, E.; Novakova, M. Journal of Immunological Methods, 1995, 181, DePaz, R.A.; Dale, D.A.; Barnett, C.; Carpenter, J.F.;

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