394 김윤선 김유미 이상화 skin barrier. We found that ZE decreased the UVB-induced IL-6 and IL-8 in NHEK cells. In human study, ZE protected skin against UV-B i

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신영 남
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1 1) pissn J. Soc. Cosmet. Sci. Korea eissn Vol. 42, No. 4, December 2016, 초피나무열매추출물의 COP1 및 PPAR-α 조절을통한자외선에대한피부보호효과 김윤선 김유미 이상화 ( 주 ) LG생활건강기술연구원 (2016년 11월 2일접수, 2016년 12월 1일수정, 2016년 12월 6일채택 ) Effect of Zanthoxylum piperitum Extract on Human Skin Protection from UVB by Regulation of COP1 and PPAR-α Yun-Sun Kim, Yumi Kim, and Sanghwa Lee Research Park, LG Household & Healthcare Ltd., 175 Gajeong-ro, Youseong-gu, Daejeon 34114, Korea (Received November 2, 2016; Revised December 1, 2016; Accepted December 6, 2016) 요약 : 자외선은피부노화를가속화하여피부광노화를유발하고, 일광화상, 피부암등을유발한다. 자외선차단제를사용하더라도일부자외선에의하여피부손상은유발될수있기때문에자외선에대한피부자체의방어력을올려주는것이필요하다. 최근, 식물에서자외선보호기능을하는것으로알려진 COP1 이사람의피부에서도자외선에대한반응들을조절한다고새롭게밝혀졌다. 본연구에서는, COP1 과그의결합단백질 DET1 이사람피부의각질형성세포에서자외선에대한시그날조절물질인 c-jun 단백질양을조절하는것을확인하였다. 자외선에노출시 COP1 과 DET1 발현이감소하였고, 그영향으로 c-jun 단백질이증가하였다. 반대로 COP1 과 DET1 을발현하는 DNA 를 transfection 시켜줄경우 c-jun 단백질양이감소하였다. 피부각질형성세포에서 COP1 과 DET1 의발현을조절할수있는물질을탐색한결과, 초피나무열매추출물이 COP1 과 DET1 의발현을증가시켜주었다. 초피나무열매추출물은 c-jun 시그날에의해서도조절되는 MMP1 이자외선에의해유도되는것을억제하였다. 뿐만아니라, 초피나무열매추출물 PPAR-α 활성이있어장벽강화를통한피부보호효과가있는데, 자외선에의하여염증유발물질인 IL-6 와 IL-8 의발현이증가하는것도억제하였다. 사람의팔에자외선을쪼여준경우에도초피나무열매추출물이홍반이생기는것을억제하고홍반에의한색소침착도억제하였다. 종합적으로, 초피나무열매추출물은다양한메카니즘을통하여자외선으로부터피부를보호해줄것으로기대된다. Abstract: Ultraviolet (UV) irradiation from the sun is the primary environmental factor that causes skin damages including skin cancer and premature skin aging. Because, even the most powerful sunscreen can t always afford enough protection, it is necessary to enhance the defensive power of skin against UV. Recently, constitutive photomorphogenic protein-1 (COP1) has shown to contribute to the regulation of UVB response of keratinocytes. In this study, we represent that COP1 and its associated protein, de-etiolated 1 (DET1), might participate in photoaging process in human skin as Arabidopsis COP1 does sun-protective function in plants. After UVB irradiation, the decrease of COP1 and DET1 mrna expression was followed by the increase of c-jun total protein. Moreover, transfection with DNA vectors expressing COP1 and DET1 down-regulated the c-jun total protein. We found that Zanthoxylum piperitum extract (ZE) up-regulated the expression of COP1 and DET1 on human keratinocytes, and inhibited the expression of MMP1 which is one of the genes regulated by c-jun signal. In addition, ZE has been reported to stimulate PPAR-α and strengthen the 주저자 ( yunsunkim@lgcare.com) call: 042)

2 394 김윤선 김유미 이상화 skin barrier. We found that ZE decreased the UVB-induced IL-6 and IL-8 in NHEK cells. In human study, ZE protected skin against UV-B induced erythema and erythema-induced pigmentation. These results indicate that ZE could be useful for the protection against the adverse effects of UV irradiation through various mechanisms. Keywords: COP1, DET1, photoaging, PPAR-α, Zanthoxylum piperitum extract 1. 서론피부는환경에노출되어있기때문에환경적요인에의하여손상되기쉽다. 특히, 태양광에의한자외선노출은피부암을일으키거나피부노화를촉진시키는등피부에미치는영향이크다 [1]. 자외선노출이반복될경우피부처짐, 거칠어짐, 건조함, 색소침착, 주름과같은현상이일어나며, 이러한태양광에의해피부노화현상이가속화되는것을광노화라고일컫는다 [2]. 자외선은피부의분자생물학적물질들의작용을변화시켜광노화가진행되게한다. 대표적으로, 자외선에노출되면피부세포에서활성산소의작용이증가되며, 증가된활성산소는세포표면의수용체에결합하여신호전달체계를활성화시켜전사인자인 NF-κB와 AP-1 이활성화된다 [3]. NF-κB 가활성화되면 IL-1, IL-6, VEGF과같은사이토카인의분비가증가하고, 이러한물질들은섬유아세포에서콜라겐분해효소인 matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) 분비를촉진시키며, matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) 을분비하는호중구의진피로의유입을촉진하여세포외기질의분해를가속화할수있다. AP-1이활성화되면섬유아세포의콜라겐합성이감소하고섬유아세포및각질세포에서 MMP1 등의진피층세포외기질분해효소의발현이증가한다 [1,4]. 그결과, 피부진피층의세포외기질의분해가촉진되어피부의탄력이감소하고주름이증가될수있다. 그밖에도자외선은피부세포에서많은유전자의발현에변화를주는데, human constitutive photomorphogenic protein-1 (COP1) 에의하여자외선에대한피부의반응들이조절됨이최근에보고되었다. COP1은 Arabidopsis에서처음발견되었으며, 식물이자외선에대한내성을갖도록하고광형태형성 (photomorphogenesis) 을조절한다 [5]. 사람의경우에서는 COP1은 E3 ligase 기능을가지고있으며, human de-etiolated-1 (DET1) 와복합으로 p53이나 c-jun 단백질 의분해에관여한다 [6,7]. 자외선에의하여각질형성세포및섬유세포에서 COP1과 DET1 발현이자외선에의하여감소하였으며 [6,8,9], 결과적으로 p53과 c-jun 단백질을세포내에축적시킬수있음이보고되었다 [5]. 자외선에의한 c-jun 단백질의축적은 AP-1 활성화에기여한다. AP-1은 c-jun과 c-fos로이루어진헤테로다이머인데, c-jun은자외선노출후단백질양이증가하는반면 c-fos는일정수준을유지한다 [10,11]. 따라서자외선에의한자외선에의한 AP-1 활성화는주로 c-jun 증가에의해유발된다고볼수있다. 이때 c-jun 의증가는주로전사후과정에서조절된다. c-jun 단백질은자외선노출후 1 h 후부터증가하여최대증가치가 24 h 후까지유지된다 [10-12]. 반면에 c-jun mrna 발현은일시적으로만증가하는데, 자외선노출후 1 h 후에증가했다가 6 h 후면평소상태로다시돌아온다 [6,12]. 본연구에서는 COP1이식물에서자외선에대한보호기능을하는것처럼, 사람피부에서도 DET1과함께 c-jun 단백질양을조절하여 AP-1 시그널을통한광노화과정에관여할것이라가설을세우고, 이를확인하였다. 또한초피나무열매추출물이 COP1과 DET1의발현을증가시켜자외선에대한피부반응을조절할뿐만아니라, 다양한메카니즘을통해서자외선에의한광노화및광손상을억제하는것을확인하였다. 2. 재료및방법 2.1. 세포배양인간각질형성세포세포주인 HaCaT은 10% FBS를포함하는 DMEM 배지에서키웠으며, 각질형성세포 1 차세포 (normal human epidermal keratinocytes, NHEK) 는 Lonza (USA) 에서구입하여 Clonetics TM keratinocyte growth media (Lonza, USA) 배지에서배양하였다. 세포들은 37 의 5% CO 2 세포배양기에서키웠다. 대한화장품학회지, 제 42 권제 4 호, 2016

3 초피나무열매추출물의 COP1 및 PPAR-α 조절을통한자외선에대한피부보호효과 In Vitro 자외선조사인간각질형성세포를 60 mm dish에키운후자외선을조사하기전에배지를제거하고 PBS 500 µl를넣어주었다. RMX-300 (Vilber Lourmat, France) 자외선조사기를이용하여 312 nm에서 10, 20 또는 40 mj/cm 2 세기로자외선을조사하였다. 자외선조사직후에 serum이들어있는세포배양액으로교환해주었다. 대조군의경우자외선조사과정을제외한동일한처리를해주었다 mrna 추출및 Real-time PCR RNeasy mini kit (Qiagen, Germany) 를이용하여제조사가제안하는실험방법대로 total RNA를추출하였다. M-MLV reverse transcriptase (Lifetechnology, USA) 를이용하여 reverse transcription을수행하여 cdna를제작하였으며, SYBR-Green PCR master mix (Applied Biosystems (AB), USA) 와 AB StepOne plus real time PCR systems 을이용하여 real time PCR을수행하였다. 타겟유전자의발현을측정하기위하여아래시퀀스의프라이머를사용하였다. COP1; 5 -GCA TGA GAA GAG GTG TTG GAG TGT-3, 5 -GCT TGC CAC TGA GTT GTC TAG ATT GG-3, DET1; 5 -GTG AGG ATG TAG TAA CAC TGC GAG TC-3, 5 -AGC AAT CAC CTC TGT CGT CAC CAT-3 GAPDH; 5 -TCG ACA GTC AGC CGC ATC TTC TTT-3, 5 -ACC AAA TCC GTT GAC TCC GAC CTT-3. mrna 발현양은 GAPDH 발현양에대한상대값으로보정하여표현하였다 COP1, DET1 과발현클로닝을통하여 COP1과 DET1을각각발현하는벡터를제작하였다. pcdna3.1/flag 벡터와 pcdna3.1/ myc-his A 벡터에 (Lifetechnology, USA), COP1과 DET1 의 cdna (Dharmacon, USA) 를각각삽입하여 pcdna3.1 -COP1-Flag와 pcdna4.1-det1-myc-his를만들었다. Lipofectamine TM 과 Plus TM reagent (Lifetechnology, USA) 를이용하여 HaCaT 세포에제작한벡터를 transfection 하였다. 4 h 후에시료를제거한후새배지로교체해주고 20 h 추가로배양하였다 c-jun ELISA InstantOne TM ELISA assay kit (ebioscience, USA) 를이용하여토탈 c-jun 양을측정하였다. 간단히요약하 면, 24-well 에서부착하여자란세포를 PBS로간단히세척한후키트에들어있는 cell lysis buffer mix (1X) 로세포를용해시켰다. 총단백질양을일정하게한세포용해액과, capture antibody 그리고 detection antibody를동시에 microplate wells에넣어주고 1 h 반응을시켰다. 세척액으로세척해준후발색시약을넣어주고 460 nm에서흡광도를측정하였다 초피나무열매추출물초피나무열매추출물을 OBM lab (Daejeon, Korea) 에서구매하였다. 건조한초피나무열매를경동시장에서구입하여 10배볼륨의 95% 에탄올에담가실온에서 3일간추출하였다. 에탄올추출액은진공농축기를이용하여농축한후건조중량 5% 가되도록 70% 에탄올에녹였다 자외선에대한피부보호효능인체평가 LG 생활건강임상시험심사위원회에서 IRB 심사를받은후 (( 제5939-A-N-01호 ) LG-SKEP , ( 제5939-A-N-01 호 ) HRL ), 30대및 40대남성자원자의동의를받은후헬싱키선언의윤리적기준에따라인체효능평가를실시하였다. 본실험에앞서, 초피나무열매추출물에대하여세포독성, 알러지유발가능성이없음을 in vitro에서확인하였으며, patch test를통하여초피나무열매추출물을건조중량 0.5% 가되도록 70% 디프로필렌글리콜 (DPG) 에녹인시험물질과초피나무열매추출물건조중량 0.4% 가되도록제조한크림에대해서피부자극성이없음을확인하였다 (data not shown). 또한자원자별로최소홍반량 (minimal erythema dose, MED) 를측정하였다. 본실험을위하여자원자상완의 2 cm 2 cm 영역에초피나무열매추출물함유시험물질을 10 µl씩하루 2회씩 7일간발라주었다. 그리고 solar simulator (LG 생활건강, Korea) 로 1.5 MED의광량으로 UVB를쪼여주었다. 자외선조사후 24 h, 72 h 그리고 96 h 후에 Mexameter (Courage-Khazaka Electronic, Germany) 로홍반생성정도를 erythema value로측정하였으며, 96 h 후에홍반에의한색소침착정도를 melanin value로측정하였다. 피부의붉어짐정도는색차계 CR-300 (Konica Minolta, Japan) 를이용하여측정하였다. J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, Vol. 42, No. 4, 2016

통계분석본연구의실험은두번이상수행하였으며, 이때결과값들은 mean ± standard deviation (S.D.) 으로나타내었다. 실험군에따른데이터사이의통계적유의성검정은 two-tailed Student s t-test를통하여검증하였고, P 값이 0.05 이하일경우통계학적으로유의적인차이가있는것으로판단하였다. 3. 결과및고찰 3.1.

4 396 김윤선 김유미 이상화 A B C D Figure 1. Expression of COP1 and DET1 after UVB irradiation. HaCaT cells were irradiated with UVB. The mrna expression levels of COP1 and DET1 were measured 4 h (A, B) and 24 h (C, D) after UVB irradiation ( ** p < 0.005, *** p < ) 통계분석본연구의실험은두번이상수행하였으며, 이때결과값들은 mean ± standard deviation (S.D.) 으로나타내었다. 실험군에따른데이터사이의통계적유의성검정은 two-tailed Student s t-test를통하여검증하였고, P 값이 0.05 이하일경우통계학적으로유의적인차이가있는것으로판단하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 자외선에의한 hcop1 과 hdet1 의발현양감소최근보고된논문에의하면배양된인간각질형성세포에서 COP1이검출되고자외선에의하여그발현양이감소하였다 [6,8,9]. 이를확인하기위하여 HaCaT 세포주를 0, 10 그리고 20 mj/cm 2 세기의자외선으로조사한후 COP1 mrna 발현양을측정해보았다. 그결과 COP1 뿐만아니라 E3 ligase로작용하는데보조인자로작용하는 DET1[6] 의 mrna 발현도자외선에의하여감소하였다. COP1과 DET1 모두자외선조사후 4 h 후에가장많이감소했다가 24 h 후에는정상상태로돌아오거나다소증가한상태가되었다 (Figure 1) 자외선에의한세포내 c-jun 단백질및 MMP1 발현증가 COP1은세포에서 c-jun 단백질양을낮은수준으로유지하는작용을한다 [6]. COP1 이결핍된마우스의경우피부에 c-jun이증가되어있고, AP-1 활성도증가되어있는것이보고되었다 [7]. 이러한보고와일맥상통하게각질형성세포에자외선을조사할경우토탈 c-jun 의양이증가하였다 (Figure 2A). COP1과 DET1 발현양이자외선조사후 24 h 만에정상으로돌아오는것과는달리 (Figure 1), c-jun 단백질양은 24 h 후에도증가된상태에있었다. 또한자외선조사후 MMP1 발현이증가되었는데, 자외선조사후 4 h 후에는오히려발현이감소하는경향이있었으나 24 h 후에는증가되는현상을보여주었다 (Figure 2A, B). 이는 COP1과 DET1 이자외선에대한피부세포의반응과정에서초기조절자로작용하는요소일가능성이있음을시사한다. 대한화장품학회지, 제 42 권제 4 호, 2016

초피나무열매추출물의 COP1 및 PPAR-α 조절을통한자외선에대한피부보호효과 397 A Figure 3. Decrease of c-jun protein after overexpression of COP1 and DET1. HaCaT cells were transfected with pcdna3.1- COP1-Flag and pcdna4.

5 초피나무열매추출물의 COP1 및 PPAR-α 조절을통한자외선에대한피부보호효과 397 A Figure 3. Decrease of c-jun protein after overexpression of COP1 and DET1. HaCaT cells were transfected with pcdna3.1- COP1-Flag and pcdna4.1-det1-myc-his simultaneously. The amount of total c-jun was measured 24 h after transfection using InstantOne TM ELISA assay kit ( * p < 0.5). Figure 2. Increase of c-jun protein and MMP1 mrna after UVB irradiation. (A) HaCaT cells were irradiated with 20 mj/cm 2 of UVB. The amount of total c-jun was measured 24 h after UVB irradistion using InstantOne TM ELISA assay kit. (B, C) The mrna expression level of MMP1 was measured 4 h (B) and 24 h (C) after UVB irradiation ( * p < 0.5, ** p < 0.005, *** p < ) COP1 증가에의한 c-jun 감소 COP1과 DET1의발현을조절함으로써각질형성세포에서 c-jun 단백질양을조절할수있는지확인하기위하여 COP1과 DET1을발현하는벡터를 transfection 하여 HaCaT 세포에 COP1과 DET1을과발현시킨후 c-jun 단백질양을측정하였다 (Figure 3). 그결과, COP1과 DET1의발현양을증가시킬경우토탈 c-jun B C 양이감소되었다. Anzi 연구팀도 COP1을과발현시키고 c-jun의양을비교하는연구를보고하였는데, COP1 만증가시켜주는것은 c-jun 양의증가를억제하지못하였다. 본연구팀은, COP1이 E3 ligase로써작용할때보조인자역할을하는 DET1을동시에과발현시켜주었고, 그결과 c-jun 단백질양을감소시킬수있었다. COP1과 DET1은 c-jun이인산화된상태에따라조절자역할을하는 Fbw7과 Itch와는달리인산화상태와상관없이 c-jun 단백질양을조절하므로 [6,13], 자외선노출되지않은상황에서도 COP1과 DET1의증가가 c-jun 의감소를야기했다. 종합적으로, COP1과 DET1은 c-jun 매게반응을조절할수있는타겟이될가능성이있음을알수있었다 초피나무열매추출물에의한 COP1 과 DET1 발현증진및 MMP1 억제효과인간피부의각질형성세포에서 COP1과 DET1의발현을증가시키는것이피부광노화현상을줄여줄수있을것으로기대되어, 인간각질형성세포에서 COP1 과 DET1의발현을동시에증가시켜줄수있는소재를탐색하였다. 그결과초피나무열매추출물이 in vitro에서각질형성세포에처리시 COP1과 DET1의발현을증가시켜주는것을확인할수있었다. NHEK 세포에초피나무열매추출물 (ZE) 을 20, 50 µg/ml 농도로처리해주었더니 COP1과 DET1 mrna 발현이농도의존적으로증가하였고, 50 µg/ml 처리시약 3배정도증가하였다 (Figure 4A, B). HaCaT 세포주에서는효능이좋았던 50 µg/ml 조건에서다시확인하였는데, J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, Vol. 42, No. 4, 2016

398 김윤선 김유미 이상화 A B C D E Figure 4. ZE regulated the expression of COP1 and DET1. (A, B) NHEK cells were treated ZE for 24 h and then the mrna expression levels of COP1 and DET1 were measured.

After irradiation with 20 mj/cm 2 of UVB, the cells were incubated in the ZE containg culture media for 24 h. And then, the mrna expression level of MMP1 was measured ( * p < 0.5, ** p < 0.

6 398 김윤선 김유미 이상화 A B C D E Figure 4. ZE regulated the expression of COP1 and DET1. (A, B) NHEK cells were treated ZE for 24 h and then the mrna expression levels of COP1 and DET1 were measured. (C, D) HaCaT cells were treated with 50 µg/ml of ZE for 72 h and RNA was prepared to measure the mrna expression levels of COP1 and DET1. (E) NHEK cells were pre-treated with 50 µg/ml of ZE for 24 h. After irradiation with 20 mj/cm 2 of UVB, the cells were incubated in the ZE containg culture media for 24 h. And then, the mrna expression level of MMP1 was measured ( * p < 0.5, ** p < 0.005, *** p < ). 72 h 이상처리해줄경우 COP1과 DET1 발현이약 2 배증가되었다 (Figure 4C, D). 세포주에따라정도의차이는있었지만, 초피나무열매추출물이각질형성세포에작용하여 COP1과 DET1의발현을증가시킬수있음을확인하였다. 초피나무열매추출물이각질형성세포에서는 COP1과 DET1의발현을증가시켰지만진피층을구성하는섬유아세포에서는 COP1과 DET1의발현에영향을주지않았다 (data not shown). 그리고초피나무열매추출물을미리처리해준경우, 자외선에의하여 MMP1 이증가되는것이억제되었다. NHEK에초피나무열매추출물을 50 µg/ml 농도 로 24 h 처리해주고자외선조사하였더니, 초피나무열매추출물을처리하지않은경우 MMP1 발현이약 3배증가하였으나, 초피나무열매추출물을처리해준경우자외선에노출되지않은대조군수준으로유지되었다 (Figure 4E) 초피나무열매추출물의자외선에대한피부보호효과본연구팀은이전연구에서, 산초약재가 peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-α 활성이있음을보고한바있다 [14]. PPAR-α 활성물질은피부각질층의분화를조절하여피부장벽을강화해줄수있는 대한화장품학회지, 제 42 권제 4 호, 2016

초피나무열매추출물의 COP1 및 PPAR-α 조절을통한자외선에대한피부보호효과 399 A B Figure 5. ZE regulated UVB-induced inflammation. NHEK cells were pre-treated with 50 µg/ml of ZE for 24 h.

7 초피나무열매추출물의 COP1 및 PPAR-α 조절을통한자외선에대한피부보호효과 399 A B Figure 5. ZE regulated UVB-induced inflammation. NHEK cells were pre-treated with 50 µg/ml of ZE for 24 h. After irradiation with 20 mj/cm 2 of UVB, the cells were incubated in the ZE containg culture media for 24 h. And then, the mrna expression levels of IL-6 and IL-8 were measured. Figure 6. ZE reduced UVB-induced erythema. Two subjects were pre-treated with 0.5% ZE twice a day for 7 days on their upper arm. For control, 70% DPG was applied. Following 1.5 MED UVB challenge, the erythema value was measured using Mexameter after 1, 3 and 4 days. 데, 자외선에의한염증반응으로부터피부를보호할수있다는보고가있다 [15]. 초피나무열매는산초약재에속하기때문에, 초피나무열매추출물이 COP1과 DET1 조절작용뿐만아니라자외선으로부터피부를보호하는데도움을주는다른효능도있을것으로기대되었다. 이를확인하기위하여자외선에의해유도된염증반응에어떤영향을주는지평가를해보았다. 자외선조사시각질형성세포에서염증성싸이토카인인 IL-6와케모카인인 IL-8 발현이증가하였는데, 초피나무열매추출물처리군에서는증가폭이유의적으로감소되었다 (Figure 5). 종합하면, 초피나무열매추출물은광노화과정에관여할것으로여겨지는 COP1과 DET1 증진효과뿐만아니라자외선에의한염증반응을억제하는복합적인기능을가지고있어, 자외선으로부터피부를보호하는데도움이될것으로여겨진다. 초피나무열매추출물이실제사람피부에서자외선으로부터피부를보호하는데도움이되는지확인하기위하여인체실험을실시하였다. 건강한 40대남성 2명의팔안쪽에초피나무열매추출물을 0.5% 농도로 70% DPG 용매에녹인시험물질을 10 µl씩 7일간아침과저녁으로두번씩발라준후 1.5 MED로 UVB를쪼여주었다. 자외선에의한피부보호지표로홍반생성정도와홍반에의한색소침착정도를측정하였다. 그결과, 개체차이로인해홍반생성정도와홍반이유지되는정도는차이가있었지만, 피험자모두에서초피나무열매추출물을발라준부위가대조군보다홍반이약하게생긴것을확인하였다 (Figure 6). 자외선을쪼인후 96 h 후에홍반에의해색소침착되어어둡게변한정도를 melanin value로측정하여비교한경우에도초피나무열매추출물을발라준부위가대조군을바른부위와비교시피부가어둡게변하는정도가 J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, Vol. 42, No. 4, 2016

8 400 김윤선 김유미 이상화 Table 1. Zanthoxylum piperitum Extract Reduced Erythema-induced Pigmentation Melanin value (A.U.) Control ZE 0.5% Inhibition rate (%) Subject Subject Two subjects were pre-treated with 0.5% ZE or 70% DPG for control twice a day for 7 days on their upper arm. Following 1.5 MED UVB challenge, the melanin value was measured using Mexameter after 4 days. Figure 7. Cream containing ZE reduced UVB-induced redness. Three subjects were pre-treated with creams containing 0% or 0.4% ZE twice a day for 7 days on their upper arm. Following 1.5 MED UVB challenge, skin redness was measured using color measurement after 24 h. 8.5%, 17.6% 씩억제되었다 (Table 1). 화장품제형에초피나무열매추출물을 0.4% 처방하여초피나무열매추출물함유크림을제조하였다 대건강한남성피험자 3명에게 7일간발라주고, 자외선조사후피부가붉어지는정도를색차계를이용하여측정하였다. 화장품크림자체는자외선에의해피부가붉어지는것을억제하지않았다. 반면, 초피나무열매추출물함유크림은자외선에의해피부가붉어지는것을방지하는효과가있었다 (Figure 7). 참여한피험자수가적어통계처리가불가능하였으나, 초피나무열매추출물이자외선으로부터피부를보호하는경향성이있음을확인할수있었다. 4. 결론자외선은피부노화를일으키는주요인자이고심하면피부암도유발할수있기때문에자외선으로부터피부를보호해야한다고한다. 가장일반적인방법은자외선차단제를사용하는것이지만, 자외선차단제도완벽하게피부를보호할수없다 [16]. 따라서피부자체의자외선에대한방어능력을올려주는것이필요하다. 이를위하여자외선이피부안에서어떤메카니즘 으로피부노화및손상을일으키는지많은연구가되어왔고 [1-4], 그메카니즘은자외선으로부터피부를보호하는물질을개발하는타겟이되었다. 레티노익산이자외선에의한 AP-1 시그날을억제하여광노화를예방개선할수있다고알려져있지만 [10-12], 레티노익산은피부자극이있고, 여러부작용이있어보다안전한물질개발이요구되어왔다. 본연구에서는 COP1과 DET1이자외선노출후각질형성세포에서발현이감소하는데, 이는 c-jun 단백질축적을야기하여피부광노화및광손상과정에관여할가능성이있음을확인하였고, 자외선으로부터피부를보호하기위하여 COP1과 DET1을조절하는것이새로운타겟이될수있음보여주고있다. 그리고초피나무열매추출물이각질형성세포에서 COP1과 DET1의발현을증가시키고, 자외선조사시콜라겐분해효소인 MMP1 발현을감소시키는것도확인하였다. 초피나무열매추출물이속하는산초가 PPAR-α 활성작용도보고된바있는데 [14], 초피나무열매추출물은각질형성세포에서자외선에의하여 IL-6와 IL-8의발현이증가하는것도억제하였다. 초피나무열매추출물이다양한기전을통하여자외선으로부터피부를보호하는데도움이될것으로보여이를인체실험을통해확인해본결과에 대한화장품학회지, 제 42 권제 4 호, 2016

9 초피나무열매추출물의 COP1 및 PPAR-α 조절을통한자외선에대한피부보호효과 401 서도, 자외선에의하여홍반이생기고이로인해피부가붉어지거나어둡게변하는현상을예방해주는효과가있었다. 따라서초피나무열매추출물은자외선에의한피부손상및광노화를억제하는용도로유용하게활용될수있을것이다. Reference 1. G. J. Fisher, S. Kang, J. Varani, Z. Bata-Csorgo, Y. Wan, S. Datta, and J. J. Voorhees, Mechanism of photoaging and chronological skin aging, Arch. Dermatol., 138(11), 1462 (2002). 2. G. Jenkins, Molecular mechanisms of skin ageing, Mech. Ageing Dev., 123(7), 801 (2002). 3. M. Yaar and B. A. Gilchrest, Photoageing: mechanism, prevention and therapy, Br. J. Dermatol., 157(5), 874 (2007). 4. A. Peter, S. Axel, and S. K. Marina, Function and regulation of AP-1 subunits in skin physiology and pathology, Oncogene, 20(19), 2413 (2001). 5. J. J. Favory, A. Stec, H. Gruber, L. Rizzini, A. Oravecz, M. Funk, A. Albert, C. Cloix, G. I. Jenkins, E. J. Oakeley, H. K. Seidlitz, F. Nagy, and R. Ulm, Interaction of COP1 and UVR8 regulates UVB-induced photomorphogenesis and stress acclimation in Arabidopsis, EMBO J., 28(5), 591 (2009). 6. S. Anzi, S. Finkin, and E. Shaulian, Transcriptional repression of c-jun s E3 ubiquitin ligases contributes to c-jun induction by UV, Cell Signal., 20(5), 862 (2008). 7. D. Migliorini, S. Bogaerts, D. Defever, R. Vyas, G. Denecker, E. Radaelli, A. Zwolinska, V. Depaepe, T. Hochepied, W. C. Skarnes, and J. C. Marine, Cop1 constitutively regulates c-jun protein stability and functions as a tumor suppressor in mice, J. Clin. Invest., 121(4), 1329 (2011). 8. A. Kinyό, Z. Kiss-Laszlό, S. Hambalkό, A. Bebes, M. Kiss, M. Szѐll, Z. Bata-Csȍrgo, F. Nagy, and L. Kemѐny, COP1 contributes to UVB-induced signaling in human keratinocytes, J. Invest. Dermatol., 130(2), 541 (2010). 9. B. Fazekas, H. Polyanka, A. Bebes, G. Tax, K. Szabό, K. Farkas, A. Kinyό, F. Nagy, L. Kemѐny, M. Szѐll, and E. Adam, UVB-dependent changes in the expression of fast-responding early genes is modulated by hucop1 in keratinocytes, J. Photochem. Photobiol. B, 140, 215 (2014). 10. G. J. Fisher, S. C. Datta, H. S. Talwar, Z. Q. Wang, J. Varani, S. Kang, and J. J. Voorhees, Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism, Nature, 379, 335 (1996). 11. G. J. Fisher, H. S. Talwar, J. Lin, P. Lin, F. McPhillips, Z. Wang, X. Li, Y. Wan, S. Kang, and J. J. Voorhees, Retinoic acid inhibits induction of c-jun protein by ultraviolet radiation that occurs subsequent to activation of mitogen-activated protein kinase pathways in human skin in vivo, J. Clin. Invest., 101(6), 1432 (1998). 12. G. J. Fisher, S. Datta, Z. Wang, X. Li, T. Quan, J. H. Chung, S. Kang, and J. J. Voorhees, c-jun-dependent inhibition of cutaneous procollagen transcription following ultraviolet irradiation is reversed by all-trans retinoic acid, J. Clin. Invest., 106(5), 663 (2000). 13. W. Wei and W. G. Kaelin, Good COP1 or bad COP1? in vivo veritas, J. Clin. Invest., 121(4), 1263 (2011). 14. Y. H. Chang and S. Lee, Development of PPAR reagent, The Journal of Skin Barrier Research, 14(2), 56 (2012). 15. S. Kippenberger, S. M. Loitsch, M. Grundmann-Kollmann, S. Simon, T. A. Dang, K. Hardt-Weinelt, R. Kaufmann, and A. Bernd, Activators of peroxisome proliferator-activated receptors protect human skin from ultraviolet-b-light-induced inflammation, J. Invest. Dermatol., 117(6), 1430 (2001). 16. D. Brain, Sunscreens: expectation and realization, Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., 25(5), 233 (2009). J. Soc. Cosmet. Sci. Korea, Vol. 42, No. 4, 2016

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