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현우 신
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1 한국환경농학회지제26권제3 호 (2007) Korean Journal of Environmental Agriculture Vol. 26, No. 3, pp 연구보문 ph조절분배추출에의한식물체중 Methoxyfenozide와 Bentazone 의 HPLC 분석 노석초 황철환 유기용 한성수 * 원광대학교생명환경학부 (2007년 7월 4 일접수, 2007년 9월 19 일수리) Analysis of Methoxyfenozide and Bentazone in Plant with HPLC by ph-adjusted Liquid-liquid Partition Cleanup Seog-Cho Lo, Cheol-Hwan Hwang, Ki-Yong Yoo, and Seong-Soo Han * (Division of Bio-Environmental Science, Wonkwang University, Iksan, , Korea) ABSTRACT: This study was performed to enhance the cleanup efficiency of methoxyfenozide and bentazone by ph adjustment in the course of liquid-liquid partition and to develop an optimum analytical conditions using HPLC coupled with DAD for two matrices, brown rice and rice straw. Preparation procedure of brown rice sample was "extraction coagulation liquid-liquid partition florisil C.C", and this procedure was samely applied to two compounds. In rice straw, preparation procedure of methoxyfenozide sample was "extraction alkalization liquid-liquid extraction coagulation florisil C.C", and in the case of bentazone, "extraction alkalization liquid-liquid partition acidification liquid-liquid extraction florisil C.C". All these purified samples were redissolved in the mobile phases, acetonitrile : 20 mm sodium acetate (75:25, v/v) for methoxyfenozide and acetonitrile : 75 mm sodium acetate, ph 6.0 (40:60, v/v) for bentazone. Recoveries of methoxyfenozide analysis in brown rice and rice straw were and %, and detection limits were 0.02 and 0.04 mg/kg, respectively. Recoveries of bentazone in brown rice and rice straw were and % and detection limits were and 0.01 mg/kg, respectively. This methods seem to be usefully applied to the residue analysis of two compounds in the view of producing stable analytical condition and fair reproducibility. Key Words: methoxyfenozide, bentazone, residue analysis, ph, HPLC 서 Methoxyfenozide[N-tert-butyl-N'-(3-methoxyo-toluoyl)-3,5-xylohydrazide] 는 1996년개발되어 1998년 1) Rohm & Haas사가상품화한 diacylhydrazine계의곤충생장조정(igr) 계살충제로곤충molting hormone인20-2) hydroxyecdysone의 agonist 로작용하여벼의이화명나방과흑명나방, 목초지의멸강나방및배추, 고추, 파, 감, 사과, 감귤, 수박, 고구마, 딸기의나방류해충방제에폭넓게사용되고있다 3). 1972년독일 BASF사에서개발된 bentazone [3-isopropyl-1H-2,1,3-benzothiadiazin-4(3H)-one 2,2- 론 * 연락저자 : Tel: Fax: seshan@wonkwang.ac.kr dioxide] 은광합성의 Hill 반응을저해하여살초효과를나타내는 enzothiadiazinone계접촉형제초제 4) 이며, 논잡초방동사니과와광엽잡초방제에유효하다 5). 국내에서는단제또는 합제로수도일년생및다년생잡초와보리와옥수수의광엽잡초방제약제로현재까지널리사용되고있다 3). Methoxyfenozide의분석은과실과채소를대상으로 SPE 나액액분배추출에의한정제후 LC-MS/MS 6,7) 또는 HPLC- UV 8) 를이용한분석법이주로사용되며, 토양시료의경우분배추출후 Florisil 또는 silica gel column chromatogrphy 하여 HPLC-UV 9) 로분석하는방법등소수의보고가이루어져있다. 이동상으로대부분 acetonitrile과물혼합액을사용하였으며 6), 컬럼상태에따라 ammonium acetate가첨가되기도하였다 7). 그러나 methoxyfenozide의회수율폭은최소 27.8% 에서최대 73.9% 로상당히큰것으로조사되어분석법 246

2 식물체중 methoxyfenozide와 bentazone의 HPLC 분석 247 개선의여지가있었다 7,24). Bentazone은약산성의화합물로 diazomethane에의한 methylation에의해 methyl ester로의유도체화과정을거친 후 GLC-ECD에의한분석법이제시되어있긴하지만 10,11), 액 액분배와 SPE에의한정제후 HPLC로분석하는것이보편 화되어있다. 이동상으로는 triethylamine(tea) 을이용한 ion- pairing(or buffering) 을 SPE에의한정제과정과역상컬럼을 이용한분리에적용하거나 12), 산해리상수(pKa) 이하에서약산 성화합물의이온화를억제하여역상컬럼에머무름과분리도가향상되도록 hydrochloric acid 13),formicacid 14),acetic acid 15), phosphoric acid 16,17) 등에의한산성화를통한이온화억제(ionization-suppression) 법도적용되고있으나 ph 2~3 이하의강산성에서컬럼의 silanol기를분해시켜컬럼 고정상에손상을줄수있어중성의온화한조건에서분리가이루어지고있다 18).Bentazone 이외의기타산성화합물에대하여phosphate buffer(ph ) 와같은산성완충액을사용하여이온화억제와완충작용을동시적용하거나이온화억제와 ion-pairig을동시에적용하는방법도제시되어있으며 19), 새로운컬럼지지체개발을통한분리력을향상시키려는시도도이루어지고있다 13). 또한근래에액액분배(LLP), 초임계유체추출(SFE), 겔크로마토그래피 (GPC), 고체상추출 (SPE) 과같은방법이방해성분의제거와검출한계를낮추기위한간편한정제도구로사용되고있고 20), 더불어역상컬럼을이용한이온성성분의분리를위해여러 buffering 시약의소개와함께, 위와같이실제분석에이용되고있다 21). 본연구에서는 HPLC-UV 분석시회수율이낮거나반복간회수율변동이큰경향을보여개선의여지가있는 methoxyfenozide의회수율변동폭을줄이고볏짚과같이방해성분이다량함유되어있어정제에어려움이있는시료에대한 methoxyfenozide와 bentazone의정제도를높이고자현미와볏짚에대하여응고법적용과액액분배시 ph조절을통한 methoxyfenozide와 bentazone 의정제가능성을모색하고, 완충작용과 ion화억제효과가가능한 sodium acetate buffer를이용, 중성영역의 ph에서안정되고효율적인 reversed-phase HPLC 분리조건을설정하고자수행한연구결과를보고하고자한다. 로사용하였다. 사용한 2종농약의표준품은순도 97.0% 의 methoxyfenozide와순도 99.6% 의 bentazone 을동부한농화학 ( 주) 로부터분양받아사용하였다(Fig. 1). 잔류분석을위해사용된 acetone, n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate 등의유기 용매는잔류분석용으로 J. T. Baker(USA) 사제품을구입하 여사용하였고, 추출시여과보조제로사용한 celite는 Hyflo Super Cel R medium(fluka, USA) 을, 정제를위해사용한흡착제는 60~100 mesh의 Florisil(Aldrich, USA) 을사용하였 으며, 탈수를위해 Merck(Germany) 사의 10~60 mesh의무수황산나트륨을사용하였다. 기기분석시이동상으로 J. T. Baker사의 HPLC급 water와 acetonitrile 을사용하였고, 기타완충액조제및응고법에사용된분석용고체및액체시약들은모두Shinyo(Japan) 와Showa(Japan) 사의일급또는잔류용특급시약을사용하였다. 분석기기및장치분석에사용된고성능액체크로마토그래프는 diode-array UV/VIS detector(ns 2100-D), degasser(uniflows, Japan), dual piston pump(ns-2004 GP), column oven (AT 3000) 으로구성된국산 Futecs HPLC system(futecs, Korea) 이었다. 각각의성분분리를위한역상(reversed-phase) 컬럼은 methoxyfenozide 분석시 Gemini C18, Particle size 5 μm, mm I.D.(Phenomenex, USA) 를, 그리고 ben- tazone 분석시는 Luna C18(2), Particle size 5 μm, mm I.D.(Phenomenex, USA) 를사용하였으며, 25 로유지되는 column oven에장착하여항온조건에서재현성있게분리되도록하였다. 또한두컬럼모두 mm I.D. 의 guard 컬럼 (Phenomenex, USA) 을장착하여보호하였다. 이외에시료의전처리과정중현미겸용정미기 DA-888( 동아산업, Korea) 을이용하여도정하였으며, 볏짚의마쇄에사용한 cutting mill은 J-NCM(Jisico, Korea), 회전진탕기는 SK-20 재료및방법 공시재료및분석용시약공시재료인현미와볏짚무처리시료는원광대학교시험포장에서재배된남평벼를 10월중수확시기에맞추어 sampling한뒤탈곡하여현미와볏짚으로분리한뒤 3일간건조하였다. 현미는정미기로도정하여 1분도로왕겨를벗긴현미를 cutting mill 로마쇄하였고, 볏짚은 cutter로잘게절단한볏짚을 cutting mill 로마쇄하였으며, 각마쇄시료를 40 mesh 체를통과시켜지퍼백에담아 -20 에냉동보관하면서시료 Methoxyfenozide Bentazone Fig. 1. Structural formulae of methoxyfenozide and bentazone.

3 248 노석초 황철환 유기용 한성수 (Hanshin, Korea), rotary vacuum evaporator 및 aspirator는 R-114(Büchi, Germany) 와 SB-651(Eyela, Japan) 기종을사용하였다. 이동상및기기운용조건 Methoxyfenozide와 bentazone 분석을위한 HPLC 이동상으로 sodium acetate buffer와 acetonitrile 혼합액을사용하였다. 물, acetonitrile 및 acetonitrile : water(50:50, v/v) 를각각1시간이상흘려보내column conditioning을 실시한후 methoxyfenozide의분리조건을설정하기위해 acetonitrile 함량을 45, 60, 75, 90% 의비율로조제후각각 의혼합조제액에대하여 HPLC 를운용, 4 mg/kg 이되도록 희석된표준용액을 5회연속주입하여 peak height의재현성 을체크하였다. Bentazone 의경우는 AOAC법에제시된제품 분석방법 22) 을적용, sodium acetate buffer의ph를 6으로 조절한 acetonitrile : 75 mm sodium acetate(40:60, v/v) 혼합액을이동상으로사용하였으며, 마찬가지로 2 mg/kg이 되도록희석된표준용액을조제하여 5회연속주입하여재현 성을체크하였다.UV검출파장과이동상의유속은두약제모 두 220 nm와 0.5 ml/min 이었으며, 시료주입은 Rheodyne 7125i valve injector에 20 μl loop를장착하여 20 μl가주 입되도록하였다.HPLC운용전이동상으로사용된모든용 매와시료는체크밸브또는컬럼오염등을방지하기위해 0.45 μm Nylon66membranes(Altech,USA) 을통과시켰으며, 이동상을 degasser 를통과시켜탈기시키면서분석하였다. 표준용액조제및검량선작성 표준용액은두약제모두 100 mg/kg 이되도록 methoxy- fenozide 표준품은 10.3 mg, bentazone 표준품은 mg 을평량하여 100 ml의 acetonitrile 에녹여조제하고, 호일로 빛을차단하여 4 에저장하면서분석조건설정을위한희 석액조제에사용하였으며, 표준검량선작성을위한 working solution은 methoxyfenozide의경우 acetonitrile에용해된 100 mg/kg 표준용액 4 ml와 acetonitrile : 20 mm so- dium acetate(75:25, v/v) 혼합액 96 ml를혼합하여 4 ng/ ml 용액을조제하였으며, 이용액을 acetonitrile : 20 mm sodium acetate(75:25, v/v) 로 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 ng/ml 의농도가되도록희석하여조제하였다. Bentazone 은 acetonitrile에용해된 100 mg/kg 의표준용액 2 ml와 75 mm sodium acetate(ph 6.0) : acetonitrile(60:40, v/v) 혼합액 98 ml를혼합하여 2 ng/ml 용액을조제하였으며, 이용액을 75 mm sodium acetate(ph 6.0) : acetonitrile (60: 40, v/v) 로 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0 ng/ μl의농도가 되도록희석하여조제하였다. 표준검량선은각성분의희석조 제액 20 μl씩을 HPLC 에주입하여얻어진 chromatogram상 의 peak height 를기준으로작성하였다. 시료전처리및정제과정 현미와볏짚시료에서대상성분의추출 Methoxyfenozide 분석시현미시료와볏짚시료는각각 20 g과 10 g 을, bentazone 분석시는각각 40 g과 10 g을평량하여250 ml Erlenmeyer flask에취한후증류수 40 ml와 acetone 100 ml을가하여 40 에서 30분간진탕추출한후 이추출액을 celite 에통과시켜감압여과하고, acetone 50 ml 로용기및잔사를씻어감압여과한뒤감압농축하여 acetone 을유거한수용액을추출액으로하였다. 응고법에의한현미시료의분배추출현미에대하여 ph만을조절하여액액분배할경우유화하여층분리가이루어지지않아분석과정에서적용하지않았고, 응고법을적용한후액액분배하였을때에는유화없이유기용매층으로 methoxyfenozide와 bentazone의 95% 이상이전용되었으며, 응고법적용만으로충분한정제효과가인정되어두약제모두응고법만을적용하였다. 전처리과정은두약제모두 acetone 이유거된각각의현미추출수용액에 acetone 10 ml, 응고촉진제[H 3PO 4:NH 4Cl:H 2O(20 ml:10 g:780 ml)] 50 ml 및 celite 2 g을가하여 30분이상방치한후 celite와함께여과하여고형침전물을제거하고 acetone 10 ml와응고촉진제 50 ml 로용기및잔사를씻어감압여과하였다. 이여과액을합하여 300 ml 분액여두에옮기고 methoxyfenozide는 n-hexane 100 ml와 50 ml로각각 2회분배추출하 고bentazone 의경우, dichloromethane 100 ml와70 ml 로각각 2회분배추출한후무수황산나트륨을넣은여과지를 통과시켜수분이제거된 n-hexane 추출액과 dichloromethane 추출액을농축건고하여각각 n-hexane 5 ml와 acetone : n- hexane(30:70, v/v) 5 ml에용해시켜 Florisil column chro- matography 정제용시료로하였다. 볏짚시료의 ph 조절을통한분배추출 Methoxyfenozide는액액분배시수용액층을알칼리성 으로조절하여 3회반복추출하였을때유기용매로전용되는 양이증가하였던결과를토대로추출액을알칼리화한후수용성불순물을제거하고 methoxyfenozide 만을추출하였다. 즉, acetone이유거된수용액을 10% NaCl 용액 50 ml로씻어 300 ml 분액여두에옮긴뒤 1 M NaOH 용액 1 ml을가하여혼합한뒤 n-hexane 100 ml씩으로 3회분배추출한후무수황산나트륨을넣은여과지를통과시켜수분이제거된추출액을감압농축하였다. 그러나 HPLC 분석을위해서는잔여불순물로인해직접주입이불가하여정제과정이더필요하였는데, 산성화하였을때 ph에따라 methoxyfenozide가 n-hexane 층으로일부가전용되어, 추출또는정제과정에적용할수없어산성화에의한추출과정은생략하고응고법을적용하였다. 적용과정은알칼리화한후추출한 n-hexane 농 축액을 acetone 10 ml로용해시킨다음응고촉진제 50 ml

4 식물체중 methoxyfenozide와 bentazone의 HPLC 분석 249 및celite 2 g을가한후1시간이상방치하여색소및응고물 을침전시킨뒤 celite 와함께여과하였으며, acetone 10 ml와응고촉진제 50 ml로용기및잔사를씻어앞의여과액과합하였다. 이여과액을 300 ml 분액여두로옮기고 n-hexane 100 ml와 50 ml로 2회분배추출하고무수황산나트륨을넣은여 과지를통과시켜수분을제거한다음 n-hexane 추출액을농축 건고하여 n-hexane 5 ml에재용해시켜컬럼크로마토그래피 정제용시료로하였다. Bentazone 분배추출의경우알칼리성 에서유기용매로전용되지않았던결과를토대로알칼리화한후지용성불순물을제거하였다. 이를위해 acetone이유거된수용액을 5% NaCl 용액 50 ml로씻어 300 ml 분액여두에옮기고 1MNaOH용액 1mL을가하여혼합한뒤 dichlormethane 100 ml로 2분간 1회진탕한다음 dichlormethane 층을버렸다. 다음으로 bentazone은산성조건에서유기용매층으로전용되며,2회추출만으로도충분한회수율을얻었던결과에의거, 알칼리화된수용액층을산성화하여유기용매층으로전용시켜추출해내기위해 12 M HCl 1 ml을가하여혼합하고 dichlormethane 100 ml와 50 ml로 2회분배추출한후무수황산나트륨을넣은여과지를통과시켜수분을제거하였다. 수분이제거된 dichloromethane 추출액을농축건고하여 acetone : n-hexane(30:70, v/v) 5 ml로재용해시켜 컬럼크로마토그래피정제용시료로하였다. 여검출한계의 10배와 40배의농도로 spiking하고 3반복으로회수율실험을수행하였다. Methoxyfenozide는무처리현미시료(20 g) 에 0.2 mg/kg과 0.8 mg/kg, 볏짚시료(10 g) 에 0.4 mg/kg과 1.6 mg/kg이되도록 5 mg/kg과 20 mg/kg 표준용액 800 μl를각각가하고균일하게혼합하여상기시료 의분석절차에따라추출, 정제한후 HPLC로분석하여회수 율을구하였으며, bentazone 의경우는무처리현미시료(40 g) 에0.05 mg/kg과0.2 mg/kg이되도록4 mg/kg과16 mg/ kg 표준용액 500 μl, 볏짚시료(10 g) 에 0.1 mg/kg과 0.4 mg/kg이되도록 2 mg/kg과 8 mg/kg 표준용액 500 μl를 각각가하고균일하게혼합하여상기시료의분석절차에따라추출, 정제한후 HPLC 로분석하여회수율을구하였다. 회수율은 HPLC 분석후얻어진크로마토그램상의 peak height 의값을직선회귀식에대입, 각성분양으로환산하여구하였다. 현미와볏짚시료의 column chromatography Glass column( cm) 에활성화시킨 Florisil 5 g을 n-hexane 으로습식충전하고상단에무수황산나트륨 1 g을넣은후용매가무수황산나트륨과의경계면에오도록하였다. 이컬럼에 methoxyfenozide는상기의 n-hexane 5 ml에용해된시료를 column에 loading시킨후 n-hexane : ethyl acetate (90:10, v/v) 50 ml 로세정하여버리고, n-hexane : ethyl acetate (60:40, v/v) 50 ml로 methoxyfenozide 를용출하였으며, 이용출액을감압농축하여 acetonitrile : 20 mm sodium ace- tate(75:25, v/v) 4 ml( 현미와볏짚) 로정용하고, 이중 20 μl 를 HPLC(UVD) 에주입하여분석하였다. 또한 bentazone 은상기의 acetone : n-hexane(30:70, v/v) 5 ml에용해된시료를 column에 loading시킨후 acetone : n-hexane(30:70, v/v) 50 ml 로세정하여버리고, n-hexane : ethyl acetate (80:20, v/v) 50 ml로 bentazone 을용출하였다. 이용출액을감압농축하여 75 mm sodium acetate(ph 6.0) : cetonitrile(60:40, v/v) 4 ml( 현미) 와 2 ml( 볏짚) 로각각정용하고, 이중 20 μl를 HPLC(UVD) 에주입하여분석하였다. 두약제 의전체전처리과정을그림 2 에요약비교하였다. 분석법의적합성검정 위와같이설정된두성분에대한분석방법이적합한지검정하기위해 methoxyfenozide와 bentazone 두성분에대하 Fig. 2. Extraction and purification procedures of methoxyfenozide and bentazone in brown rice and rice straw.

5 250 노석초 황철환 유기용 한성수 HPLC 분리조건및재현성 결과및고찰 Bentazone의경우AOAC법 22) 에의한acetonitrile : 75 mm sodium acetate(ph 6.0) (40:60, v/v) 혼합액에서안 정적으로분석되었다. 그러나 methoxyfenozide의경우 buffer와 acetonitrile의비율에따라반복주입하였을때재현 성이떨어져 sodium acetate buffer와 acetonitrile 의조성비 를변동시켜실험한결과그림 3에나타낸바와같이 acetonitrile 75% 수준에서변이가적고안정적인조건을나타내어이 동상조성비를 acetonitrile : 20 mm sodium acetate(75:25, v/v) 로설정하였다. 위이동상을사용하여분석한결과 methoxyfenozide와 bentazone의머무름시간은각각 6.2 min. 과 6.3 min. 이었으며반복주입시우수한재현성을보였다. 분배추출시 분배추출시 ph조절의영향 ph에따른영향을검토하고자각성분의일 정농도를 spiking한후산과알칼리조건하에서두성분의유기용매층으로의전용정도를시험한결과표 1의결과와같 이 methoxyfenozide는알칼리조건에서추출횟수가증가함 에따라유기용매로전용되는양이증가하였으며, bentazone 은전용되지않았다. 또한두성분을산성화하여추출하였을때 methoxyfenozide 는 ph 변화에따라전용되지않거나전용 되어도전용되는양이적었으나,bentazone의경우추출횟수가증가함에따라 90% 이상이유기용매로전용되었다. 또한 응고법적용을위한시험에서는두약제모두응고법적용으로유기용매로의전용이용이해진결과를얻었다( 자료미제시). 위의두결과를토대로현미무처리추출액시료에대하여알칼리화나산성화를통한 ph 조절후분배추출하였을때분배용매가유화하여층분리에어려움이있었고, 두약제모두응고법적용이가능하다는위결과를근거하여응고법을적용한뒤분배추출하였을때는유화현상없이층분리가이루어졌다. 볏짚추출액에대해서는 methoxyfenozide의경우알칼리화하여 n-hexane 으로분배추출하고, bentazone은알칼리조건에서액액분배한후산성화하여 dicholromethane으로분배추출한뒤hplc에주입하였을때두성분의크로마토그램상에서상당량의방해성분이제거되는효과가있었다. 표준검량선작성결과그림 4에나타낸바와같이최소자승법에의해구한 methoxyfenozide와 bentazone의직선회귀식은검량선작성범위인 2-80 ng과 1-40 ng에서각각 y=880.76x 와 y= x 이었으며, 두약제의결정계수는두약제모두 이상으로검량선작성농도범위에서주입농도와 peak height 간에직선적정의상관관계가인정되었다. Fig. 3. Effect of acetonitrile content in the mobile phase for methoxyfenozide analysis. 분석법의회수율및검출한계 Methoxyfenozide와 bentazone 두성분에대한분석방법의적합성을검정하기위한회수율실험을수행한결과,methoxyfenozide의경우표 2에나타낸바와같이현미시료와볏짚시료의반복간회수율범위는각각 83.5~97.4% 와 86.4 ~97.3% 로, Codex 분석기준에서 0.1 mg/kg 이상의농도인 경우의회수율허용범위인 %(C.V. 20%) 에적합하였을뿐만아니라 23),Hall등 7) 의연구에서의 mint를제외한과일과채소분석시회수율(81~129% 및 72~124%) 과 Pest Management Regulatory Agency 24) 의regulatory note에 Table 1. Extraction efficacy by liquid-liquid partition frequencies after ph adjustment Compound Spiking (mg/kg) Methoxyfenozide a) 0.4 ph adjustment Recovery (%) by partition frequency once twice thrice alkalization 63.2 ± ± ± 3.0 acidification 13.4 ± ± ± 1.5 alkalization NR c) NR NR Bentazone b) 0.4 acidification 83.3 ± ± ±3.8 a) Extraction volume; 100 ml (once), 100 ml (twice), 100 ml (thrice) b) Extraction volume; 100 ml (once), 50 ml (twice), 50 ml (thrice) c) Not recovered

6 식물체중 methoxyfenozide와 bentazone의 HPLC 분석 251 서의 57.1~131%(pome fruits), % 범위내(grapes, peppers, tomatoes), %(cotton) 회수율범위에비 해안정되고변이폭이작은양호한회수율을보였다. 또한본 연구에서 methoxyfenozide의평균회수율은현미와볏짚에서각각 92.1% 와 93.7% 로김등 8) 이분석한목초중회수율 85.7% 와비교하여향상된결과를나타내었다. Bentazone 의경우각각88.3~101.9% 와88.3~94.5% 범위로농촌진흥청농약잔류분석기준 25) 에준하는결과와함께방해성분을대부분제거하는결과를얻었다. 볏짚중 methoxyfenozide와 bentazone 분석크로마토그램은그림 5에나타낸바와같이현미분석시와동일한크로마토그램양상을보였으며, 정량에 문제가없어충분한정제가이루어졌음을알수있었다. 전분석과정을거쳐해당성분의 peak가명확히확인될수있는조건에서 signal대 noise 비(S/N) 의 3배로한최소검출량과분석시료량, 정용액양, 주입량에의해계산한두성분의검출한계는현미와볏짚에서 methoxyfenozide의경우각각 0.02와 0.04 mg/kg, bentazone의경우0.005와0.01 mg/kg이었다. 위결과에서와같이 ph에의해해리상태에영향을받는약제의경우,ph조절을통한분배추출로불순물을효과적으로제거하고목적화합물이효율적으로추출되는부분정제효과를얻을수있으며,hplc분석시 column 고정상의특성과분석성분의해리성을고려한적절한 buffer 선택및용매와의 Table 2. Linearity, minimum detectable amount (MDA), limit of detection (LOD) and recoveries for the determination of methoxyfenozide and bentazone residues from brown rice and rice straw a) b) c) d) e) f) Compound Methoxyfenozide Linear range (ng/20 μl) 2~80 Bentazone 1~40 Matrix Brown rice Rice straw Brown rice Rice straw Spiking level (mg/kg) Percent recovered±standard deviation of 3 replicates (SD/Mean of recovery) 100 2ng 4mL/20μ L 1/20g=0.02ppm 2ng 4mL/20μ L 1/10g=0.04ppm 1ng 4mL/20μ L 1/40 g = ppm 1ng 2mL/20μ L 1/10g=0.01ppm Recovery(%) Mean±SD a) C.V. b) ± ± ± ± ± ± ± ± LOD (mg/kg) MDA (ng) 0.02 c) d) e) f) 1 Fig. 4. Calibration curve, regression equation and coefficient of determination of methoxyfenozide (left) and bentazone (right) for the analysis of brown rice and rice straw.

7 252 노석초 황철환 유기용 한성수 [Methoxyfenozide] Standard Brown rice Rice straw ng Control Spike 0.8 mg / kg Control Spike 1.6 mg / kg [Bentazone] Standard Brown rice Rice straw ng Control Spike 0.2 mg / kg Control Spike 0.4 mg / kg Fig. 5. HPLC chromatograms of standard, control and spiked samples in the analysis of methoxyfenozide and bentazone. 혼합비율선정을통한최적완충조건이, 볏짚과같이방해성 분이많은시료의경우불순물을효과적으로제거함과동시에안정적분석을위한중요한요인으로작용할것으로판단하며, 본연구결과에서얻은위방법은안정적분석조건을제공하고재현성이뛰어나다는점에서두약제의잔류분석에유용하게적용될수있을것으로사료된다. 더불어다른식물체에대한분석에의적용과기타이온성또는 ph의영향을받는농약의다성분동시분석을위한분석조건확립에관한연구도병행되어야할것이다. 요 이연구는액액분배과정중 ph 조절에의한 diacylhydrazine 계의곤충생장조정(IGR) 계살충제 methoxyfenozide와 benzothiadiazinone계의제초제 bentazone의분배효율을향상시키기위하여수행하였다. 현미시료는두약제모두 추출 응고법 분배추출 florisil column chromatography 의동일한과정을거쳤다. 볏짚시료에있어서 methoxyfenozide 는 추출 1 M-NaOH 용액에의한알칼리화 분배추출 응 약 고법 florisil column chromatography 의과정을거친후 용리액인 acetonitrile : 20 mm sodium acetate(75:25, v/ v) 로정용, HPLC 로분석하였다. Bentazone 의경우는 추출 1M-NaOH 용액첨가에의한알칼리화 유기용매세척 12 M-HCl에의한산성화 분배추출 florisil column chro- matography 의과정을거쳤으며, acetonitrile : 75 mm sodium acetate(ph 6.0) (40:60, v/v) 로정용, HPLC로분석하였다. Methoxyfenozide의회수율은현미 %, 볏짚 % 였으며, 분석법의검출한계는현미 0.02 mg/kg, 볏짚 0.04 mg/kg 이었다. Bentazone 의회수율은현미 %, 볏짚 % 였으며, 분석법의검출한계는현미 mg/kg, 볏짚 0.01 mg/kg 이었다. 본연구결과에서얻은위방법은재현성있는안정적분석조건을제공한다는점에서두약제의잔류분석에유용하게적용될수있을것으로생각된다. 감사의글 이논문은 2007년도원광대학교의교비지원에의해서수행되었으며, 이에감사드립니다.

8 식물체중 methoxyfenozide와 bentazone의 HPLC 분석 253 참고문헌 1.Tomlin,C.D.S.(2000)Thepesticidemanual12th edition, The British Crop Protection Council, Farnham, United Kingdom, p Smagghe, G., Carton, B., Wesemael, W., Ishaaya, I. and Tirry, L. (1999) Ecdysone agonists -Mechanism of action and application on spodoptera species, Pesti. Sci. 55, Korea Crop Protection Council (2005) Pesticides application manual, Seoul, Korea, pp Tomlin, C. D. S. (2000) The pesticide manual 12th edition, The British Crop Protection Council, Farnham, United Kingdom p Kim, K. U. (1998) Principles of weed science, Kyungpookuniversitypress,Korea,p Choi,B.K.,Hercules,D.M.andGusev,A.I.(2001) Effect of liquid chromatography separation of complex matrices on liquid chromatography-tandem mass spectrometry signal suppression, J. Chromato. A. 907, Hall, G. L., Engebretson, J., Hengel, M. J. and Shibamoto, T. (2004) Analysis of methoxyfenozide residues in fruits, vegetables, and mint by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(lc- MS/MS), J. Agric. Food Chem. 52, Kim,S.S.,Lee,S.M.,Koo,M.Y.,Park,D.S.and Hur, J. H. (2003) Residual analysis and safety uses of methoxyfenozide and etofenprox in pastures, J. Agri. Sci. 14, Wu, S., Stein, R., Desai, T. B., Hofmann, C. K. and Burnett, T. F. (1998) Rohm and Haas Technical Report No ; Residue analytical method for parent RH-2485 in soil, Philadelphia, USA, p Research group for pesticide residue analysis method (1995) Recent pesticide analysis method, Chuohoki publishers, Tokyo, Japan, p Vink, M. and van der Poll, J. M. (1996) Gas chromatographic determination of acid herbicides in surface water samples with electron-capture detection and mass spectrometric confirmation, J. Chromato. A. 733, Balinova, A. (1996) Ion-pairing mechanism in the solid-phase extraction and reversed-phase highperformance liquid chromatographic determination of acidic herbicides in water, J. Chromato. A. 728, Fontanals, N., Galiá, M., Marcé, R. M. and Borrull, F. (2004) Solid-phase extraction of polar compounds with a hydrophilic copolymeric sorbent, J. Chromato. A. 1030, Lee, P. W., Aizawa, H., Barefoot, A. C. and Murphy, J. J. (2003) Handbook of residue analytical methods for agrochemicals, Wiley, Delaware, USA, p Aguilar, C., Ferrer, I., Borrull, F., Marcé, R. M. and Barceló, D. (1999) Monitering of pesticides in river water based on samples previously stored in polymeric cartridges followed by on-line solidphase extraction-liquid chromatography-diode array detection and confirmation by atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry, Analytica Chimica Acta. 386, Hogendoorn, E. A., Westhuis, K., Dijkman, E., Heusinkveld, H. A. G., den Boer, A. C., Evers, E. A.I.M. and Baumann, R. A. (1999) Semi-permeable surface analytical reversed-phase column for the improved trace analysis of acidic pesticides in water with coupled-column reversed-phase liquid chromatography with UV detection determination of bromoxynil and bentazone in surface water, J. Chromato. A. 858, Choi,J.C.,Lee,Y.J.,Kim,S.H.,Choi,S.Y.,Choi, H.J.,Jeong,S.W.,Park,H.J.andKimW.S.(2005) Multiresidue analytical method of pesticides in rice by HPLC, J. Environ. Sci. 14 (4), Dollan, J. W. (2002) Mobile-phase buffers, Part IIbuffers selection and capacity, LCGC NORTH AMERICA. 20 (12), Dollan, J. W. (2003) Mobile-phase buffers, Part IIIpreparation of buffers, LCGC NORTH AMERICA. 21 (1), Tekel, J., Hudecová, T. and Pecníková, K. (2001) Isolation and purification techniques for pesticide residue analyses in samples of plant or animal origin, Eur. Food Res. Technol. 213, Neue, U. D. (2002) HPLC troubleshooting guide. Waters.USA.p Horwitz, W. (2000) Official methods of analysis of AOAC international 17th edition. AOAC international, Gaithersburg, USA, p Choi, D. M, Jeong, J. Y, Chang, M. I., Im, M. H., Park,K.S.andHongM.K.(2005)Determination of tetracycline antibiotics in food, Anal. Sci & Tech. 18(3) : Pest management regulatory agency (2004) Regulatory note; REG , Canada, pp Rural development administration & Korea crop protection association (2003) Text book for pesticide registration experiment, Korea, pp

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