RESEARCH ARTICLE Kor. J. Aesthet. Cosmetol., Vol. 13 No. 5, , October 2015 노화피부에서나타나는현상에봉독이미치는효과 최춘설 1, 박진규 2, 안창기 2, 이은희 1, 안규중 3 * 1 서경대학교미용예

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유이 어금
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1 RESEARCH ARTICLE 노화피부에서나타나는현상에봉독이미치는효과 최춘설 1, 박진규 2, 안창기 2, 이은희 1, 안규중 3 * 1 서경대학교미용예술학과, 2 비센, 3 건국대학교의학전문대학원피부과학교실 Multiple Benefits of Bee Venom in Aged Skin Manifestations Chun Seol Choi 1, Jin Kyu Park 2, Chang Gi An 2, Eun Hee Lee 1, Kyu Joong Ahn 3 * 1 Department of Beauty Art, Seokyeong University, 2 Beesen Co., Ltd. 3 Department of Dermatology, Konkuk University School of Medicine Abstract Bee venom, also known as apitoxin, is a bitter colorless liquid, which has a quite stability in temperature. It has been used for many years in traditional therapy as relieve pain and treat inflammatory. The skin goes change due to aging by environmental factors, divided in to intrinsic and extrinsic. ultraviolet (UV), one of extrinsic factor, is known as a main inducer of skin aging. Especially, UVB reported that lead to DNA damage, sun burn, and ROS creation. In this study, researcher investigated that whether bee venom affects to aging manifestations, such as wrinkle, sagging, skin tone, and evenness. To evaluate efficacy on aging skin phenomena, clinical efficacy trials were conducted using Antera 3D, Robo skin analyzer CS50, KONG PC Camera, and spectrophotometer. Improvement of wrinkle, sagging, and skin evenness were assessed using ANTERA 3D. Robo skin analyzer CS50 and spectrophotometer assessed improvement of skin tone. KONG PC Camera used to measuring facial keratinized cell. Measurements were taken three times, namely, before application, immediately after treatment, and 1 week after treatment. Through cellular efficacy trials, using human dermal fibroblasts (HDFs), researchers verified that bee venom has protective effects on UVB induced gene expression of MMP1 and COL1A1, which known as extracellular matrix (ECM) regulated genes. In conclusion, bee venom improves UVB-induced cellular damage, including ECM regulated gene expression, and aged skin manifestations. These results suggest bee venom as a new, effective anti-aging cosmetic ingredient. Keywords: Bee, Venom, Anti-aging, Wrinkle, Evenness, UV, Collagen 노화는유전적, 환경적인다양한요인들에의한자극과손상 의축적으로세포와조직, 기관의기능이망가지고종국에는질 병과사망에이르게하는현상이다 (Viña et al., 2007). 노화를 유발하는원인은내재적원인과외재적원인으로나뉘며이에 해당하는다양한요인들을명확히구분짓기는쉽지않으나, 두 *Corresponding author: Kyu Joong Ahn, Department of Dermatology, Konkuk University School of Medicine, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul , Republic of Korea Tel.: , Fax: kjahn@kuh.ac.kr Received September 12, 2015; Revised October 12, 2015; Accepted October 19, 2015; Published October 30, 2015 가지요인모두구조적, 생리학적기능을떨어뜨리는공통점이있다 (Farage et al., 2008; Landau et al., 2007). 의학의발전과더불어경제, 사회, 문화의발달로아름다운피부와건강에대한욕구는증가하고있고, 시간과돈을들여노화를늦추고자하는노력을하고있지만, 그효과가입증된결과는많지않다 (Zouboulis & Makrantonaki, 2011). 외인성노화의가장큰원인인광노화는 UV에의해일어나는데, UV는파장대에따라 UVA, UVB, UVC로나눌수있다 (Kammeyer & Luiten, 2015). 이중에서도 UVB는 nm의파장대를가지고피부에일광화상을일으키거나피부세포의 DNA에손상을입히고, 활성산소 (Reactive oxygen species, ROS) 생성을야기하여피부노화를일으킨다고알려져있다 (Diffey, 2002). 인체의최외각에위치하는피부조직은표피, 진피, 피하지방 679

2 층의 3개층으로구성되어있는인체에서가장넓은기관으로피부의노화는육안으로확인할수있는기능적, 구조적변화가증상으로나타난다 (Gkogkolou & Böhm, 2014). 피부노화의대표적인현상인주름형성은진피조직내에존재하는 collagen 의감소가주된원인으로, 진피층을구성하는진피섬유아세포는 collagen과 elastin, matrix metalloproteinases의발현을조절하는데 UV 조사는 collagen이나 elastin과같은구조단백질의합성을감소시키고, matrix metalloproteinases의발현을증가시킨다 (Gu et al., 2011; Iovine et al., 2009; Naru et al., 2005; Pascual-Le Tallec et al., 1998; Petersen et al., 1992; Trautinger et al., 1994; Watanabe et al., 2004). 주름이외의피부노화로인한임상학적증상으로는탄력감소로인한피부의늘어짐, 노랗고어두운피부톤과색소침착, 거친피부결이대표적이다 (Jenkins, 2002; Chiu et al., 2007; Chung et al., 2001; Gilchrest, 1996; Kligman et al., 1986; Lavker, 1979; Lee et al., 2005). 봉독은꿀벌의독낭에들어있는무색투명하고점성이있는액체로, 강한쓴맛을가진방향성물질로알려져있다 (Eiseman et al., 1982). 통증완화와염증치료에대한효능으로민간에서는오래전부터사용되어져왔다 (Billingham et al., 1973). 열에매우안정하여끓이거나얼려도고유의특성은그대로유지되며물과산에는용해되지만알코올에서는거의용해가되지않는것으로알려져있다 (Choi et al., 2003; Kwon et al., 2001). 봉독의알려진성분은약 40여가지로각각 Enzyme, Peptide, Non peptide component, Physiologically active amine, Lipids, Amino acid 등으로구분할수있으며대표적으로는 Phospholipase A2 (PLA2), Hyauronidase, Melittin, Apamin, Histamin, Dopamine 등이있다 (Bankes & Shipolini, 1986; Lee et al., 2001). 봉독에대한연구는 inos의발현을조절하여조직의손상및부종을완화시킨보고가있으며, 그밖에도항염효과, 신경염증억제효과, 신경퇴화억제효과등이알려져있다 (Han et al., 2007; Moon et al., 2007; Han et al., 2005; Lee et al., 2012). 항암연구에서는전립선, 난소, 망막, 폐암종에서효과를확인하였고그람양성및음성균과장내세균등에대한항균효과도밝혀져있다 (Park et al., 2011; Jo et al., 2012; Vento et al., 2000; Han et al., 2010; Han et al., 2009). 정제봉독에대한선행연구에따르면, 자외선에의한광노화억제, tyrosinase의 mrna 및단백질발현억제를통한멜라닌생성억제, 피부재생및상처회복능촉진이확인되었으나다양한노화피부의증상에대한연구는부족한실정이다 (Han et al., 2014; Han et al., 2007; Han et al., 2011). 본연구는봉독을함유한화장료의세포효능실험과인체적용시험을통해정제봉독의노화피부개선효과를과학적이고객 관적으로규명하여봉독의기능성화장품원료로서의가능성을제시하고자한다. 1. 시약처리정제봉독추출물은 비센으로부터얻었다. 수집한봉독을각기성분의특성으로분류하고일정비율로배합한정제봉독은건조후 powder 형태로얻었으며, 세포처리시상온에서 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, USA) 로일정농도로용해하여처리하였다. 세포실험에서양성대조군으로사용한 adenosine (Sigma-Aldrich) 도세포처리시 DMSO에용해하여일정농도로처리하였다. 2. 진피섬유아세포구입및배양인간진피섬유아세포 (normal human dermal fibroblasts) 는 Lonza (Basel, Switzerland) 사에서구입하였으며, Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM; Gibco-BRL, Invitrogen Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA) 에 10% fetal bovine serum (FBS; Sigma-Aldrich) 이포함된배지에배양하였다. 3. 진피섬유아세포자외선조사인간진피섬유아세포에자외선을조사하는방법은선행논문의방법으로수행하였다. 먼저인간진피섬유아세포를 96-well 배양 plate에분주한후, overnight 배양하였다. 세포밀집도 (cell confluence) 가 80% 정도도달하였을때 UVB를조사하였으며 UVB조사세기는 30 mj/cm 2 으로고정하여사용하였다. 자외선을조사하기직전, phosphate-buffered saline (PBS) 로 1회세척하여, 배지를제거하였으며세포배양접시덮개를제거한상태로자외선을조사하였다. 자외선조사가끝나면, PBS를배양배지로교환하고 24 h 추가배양을하였다. 정제봉독추출물의처리는 UVB 조사가끝난직후에정제봉독을처리한배양배지를세포에처리하여 24 h 추가배양하는것으로수행하였다. 4. 세포생존율조사정제봉독의세포독성실험은인간진피섬유아세포를 cells/well 의밀도로 96-well 세포배양 plate에분주한후수행하였다. Water-soluble tetrazolium salt (WST-1) assay (EZ-cytox cell viability assay kit; Korea) 를이용하여수행한독성실험은실험의마지막단계에서배양배지의 1/10 부피의 WST-1 용액을세포에처리하여추가적으로 37 C에서 30 min 배양하였다. 세포생존율은 imark microplate reader 680

3 봉독의항노화효과 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 장치를사용하여, 450 nm에서흡광도를측정함으로써결정하였다. 5. Quantitative real-time PCR Quantitative real-time PCR (qrt-pcr) 이 cdna를주형으로세포내에서일어나는유전자의발현변화를정량적으로확인하는방법이기때문에, qrt-pcr을진행하기에앞서정제봉독과 UVB, 양성대조군으로 adenosine을처리한진피섬유아세포에서 RNA추출을수행하였다. 배양이끝난세포에 TRIZOL reagent (Invitrogen, USA) 를이용하여용해후, 0.2 ml chloroform (Biopure, Canada) 를첨가하여상온에방치한다. 12,000 rpm, 4 조건으로 20 min간원심분리하여단백질이포함된하등액과 mrna가포함된상등액을분리한다. 상등액은 0.5 ml isopropanol을첨가하여 10 min간상온에방치한다음 12,000 rpm, 4 조건으로원심분리하여 RNA를침전시키고 80% ethanol을이용하여세척후 ethanol을제거하고상온에서건조시킨다. 건조된 mrna는 diethylpyrocarbonate (DEPC, Biopure) 를처리한 water로녹여정제하였으며, 추출된 RNA는 nanodrop (Nanodrop, USA) 을이용하여 260 nm, 280 nm의 ratio 1.8 이상의순도의 RNA만을실험에사용하였다. 추출된 RNA는 M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics, Korea) 을이용한 reverse transcriptase PCR 을통하여 cdna로합성하였다. 이렇게합성한 cdna는 SYBR green (HOT FIREPol EvaGreen PCR Mix Plus; Invitrogen) 과각각의유전자별 primer를활용하여 qrt-pcr을진행하였으며, PCR과정은 40 cycle 수행하였다. 각유전자의발현은 GAPDH 유전자발현양을통해비교분석하였으며실험에사용된 primer는 Table 1과같다. 피시험자로선정하였다. 이들에게는본인체적용시험과관련된모든정보를충분히알렸으며, 피시험자는자의에따라동의서를작성하고시험에참가하였다. (2) 피시험자선정제외기준임신또는수유중인여성과임신가능성이있는여성, 스테로이드가포함된외형제를 1개월이상사용한여성, 민감성 과민성피부를가진여성, 동일한시험부위에유사효능이있는화장품및의약품을 3개월이내에사용한여성, 연구시작 6개월내에시험부위에시술을받은여성, 피부이상소견이있는여성은피시험자선정에제외시켰다. 7. 인체적용시험설계피시험자를대상으로한인체적용시험은총 1주에걸쳐진행되었다. 총 23명의여성피시험자는 1주동안매일저녁세안후정제봉독이 1% 포함된에센스제형의화장료를마스크팩으로안면부위에고르게밀착시켜 30 min간적용하였다. 피험자의피부상태에대한측정및평가는시험제품의사용전 (0 주차 ), 사용후 1주차에실시하였다. 또한시험이종료된이후모든피험자를대상으로주관적설문평가를진행하였다. 8. 정제봉독함유화장료의제조본연구에시료로사용한정제봉독 (Beesen, Korea) 은 Table 2와같은조성의에센스제형으로제조하였다. 화장료에는 1.0% 의정제봉독이포함되도록제조하였으며시험부위인안면부에는 100% 면시트를이용하여마스크팩으로제작후적용하였다. 마스크시트제조에는봉독함유화장료가각각 25 ml 씩들어가도록하였다. 6. 피시험자의선정 (1) 피시험자의선정기준 본연구는자발적으로모집된만 30 세이상의서울및수도 권에거주하는성인여성중에서피부질환을포함하는급, 만 성신체질환이없고, 자발적으로동의서를작성하고서명한사 람이면서선정제외기준에해당사항이없는여성 23 명을최종 Table 1. List of primers Gene Primer Sequence GAPDH COL1A1 MMP-1 Forward Reverse Forward Reverse Forward Reverse 5 -CGC TCT CTG CTC CTC CTG TT-3 5 -CCA TGG TGT CTG AGC GAT GT-3 5 -GCT GTC TTA TGG CTA TGA TGA G-3 5 -CTT CCC CAT CAT CTC CAT TC-3 5 -CTG CTT ACG AAT TTG CCG ACA GA-3 5 -GTT CTA GGG AAG CCA AAG GAG CTG-3 Table 2. Components for use cosmetics (%) Distilled water Ethanol Glycerin EDTA-4Na ,3-Butylene glycol PEG-60 Hydrogenated Castor Oil Carbopol Tri Ethanol Amine Sorbitol Fragrance Bee venom Total

4 9. 안면피부측정및분석피시험자의피부상태분석시측정값의오차를최소화하기위해, 피시험자는측정할안면부위를동일한세안제로세안후 30 min간항온항습실 ( 온도 : 22±1, 습도 : 45±5%) 에서안정을취하도록하고눈꼬리주름, 볼광대리프팅, 피부톤, 피부결변화를측정하였다. 측정기기는학계에서가장보편적으로많이사용되고있는과학적피부분석시스템인전안촬영시스템 Robo Skin Analyzer (CS50, Inforward Inc, Japan), ANTERA 3D (Miravex, Ireland), 분광광도계 (Spectrophotometer, CM-2600D, Konica Minolta, Japan) 를사용하였다. (1) 눈꼬리주름깊이측정피시험자 23명을대상으로눈꼬리주름깊이변화에대한분석을실시하였다. 기기측정은시험제품사용전과 1주사용후에이루어졌으며, ANTERA 3D를적용하여눈가주름깊이개선평가를확인하였다. 측정부위는피험자의오른쪽눈꼬리부위였으며, 측정한이미지는 ANTERA 3D 전용소프트웨어인 ANTERA pro software를이용하여분석하였다. 측정및분석의단위는 mm이며측정된수치가감소할수록눈가주름이개선된것을의미한다. (2) 볼광대리프팅효과피시험자 23명을대상으로시험제품사용전과직후, 1 주사용후의볼광대리프팅개선평가를실시하였다. 측정은 ANTERA 3D를사용하여모든피험자의오른쪽볼부위에대해이루어졌고, 촬영된이미지는 ANTERA 3D 전용소프트웨어인 ANTERA pro software를이용하여분석하였다. 측정값은피부의함몰된부피를나타내는 depression medium을이용하였으며, 단위는 mm 2 이다. (3) 피부톤개선평가시험제품의피부톤개선평가를위하여분광광도계와전안촬영시스템을적용하였다. 분광광도계를이용한측정에는모든피시험자의왼쪽볼부위가 3회연속으로측정되었고, 분석에는평균값을사용하였다. 피부톤개선평가를위해분광광도계를이용한측정값중, 명암 (Brightness) 을의미하는 L value 만을분석에사용하였으며측정값이증가할수록피부톤이개선되었음을의미한다. 전안촬영시스템은모든피험자의안면부위를균일한조명과동일한자세에서촬영하여이루어졌으며피부톤개선평가는시험제품사용전과직후, 1주사용후의시점에서이루어졌다. (4) 피부결개선평가시험제품의피부결개선평가를위해 ANTERA 3D를이용하 였다. 모든피시험자의오른쪽볼부위를시험부위로하여진행되었으며, 촬영된이미지는 ANTERA 3D 전용소프트웨어인 ANTERA pro software를이용하여분석하였다. 측정은시험재품사용전과 1주사용후에이루어졌고, 피부거칠기를나타내는 texture samll값을측정변수인 Sa를이용하여분석하였다. 측정값이감소할수록거친피부결이개선되었음을의미한다. (5) 피부진정효과본연구에서는시험제품의피부진정효과를평가하기위하여분광광도계와전안촬영시스템을적용하였다. 분광광도계를이용한측정에는모든피시험자의왼쪽볼부위가 3회연속으로측정되었고, 분석에는평균값을사용하였다. 피부진정효과를평가를위해분광광도계를이용한측정값중, 피부붉은기 (redness) 을의미하는 a value 만을분석에사용하였으며측정값이감소할수록붉은기가개선되었음을의미한다. 전안촬영시스템은모든피험자의안면부위를균일한조명과동일한자세에서촬영하여이루어졌으며피부톤개선평가는시험제품사용전과 1주사용후의시점에서이루어졌다. (6) 각질개선효과시험제품의안면각질개선평가를위해서 KONG PC Camera (Bomtech, Korea) 와이미지분석프로그램 (Image J, National Institutes of Health, USA) 을이용하였다. 일관된이미지촬영을위해균일한조명과동일한포지션에서한명의시험담당자가모든피시험자의왼쪽볼부위를측정하였으며기기측정은시험제품사용전과사용직후, 1주사용후의시점에서이루어졌다. 10. 유해사례에대한상시평가유해사례평가는피시험자가피부상태측정및분석을위해방문할때마다문진과육안으로홍반 (Erythema), 부종 (Edema), 인설생성 (Scaling), 가려움 (Itching), 자통 (Stinging), 작열감 (Burning), 뻣뻣함 (Tightness), 따끔거림 (Prickling) 및다른이상이발생하는지평가하였다. 정도를약한정도인지, 중간정도인지, 심한정도인지를구분하여기록하였다. 그리고시험중지또는탈락사항이발생하는지점검하여증례기록서에기입하였다. 방문하는날이아니더라도시험에더이상참가할수없게되는경우는본인의서명이첨부된 시험참가포기동의서 를작성하도록하였다. 11. 통계처리본연구의통계처리는 SPSS 17.0 for Windows 프로그램을이용하여분석하였다. 다양한피부개선도에대한기기측정결과의유의한변화여부를분석하기위하여 paired t-test 분석 682

5 봉독의항노화효과 을실시하였다. 각평가항목의개선율을분석하기위해아래와 같은공식을사용하여계산하였다. 사용후측정값 - 사용전측정값 개선율 (%) = 100 사용전측정값 1. 정제봉독의세포독성분석인간진피섬유아세포에서정제봉독의세포독성을확인하기위해 0, 0.75, 1.5, 3, 6 μg/ml의정제봉독을처리한후 24 h 배양하였다. 인간진피섬유아세포의세포생존율분석결과, 0.75, 1.5, 3, 6 μg/ml 처리시, 각각 107.0%, 95.8%, 94.0%, 81.8% 의세포생존율을나타냈다. 본연구를통하여, 3 μg/ml 이하의정제봉독에서인간진피섬유아세포가 90% 이상의세포생존율을기록하는것을확인하였다 (Figure 1). Figure 1. Cytotoxicity of bee venom on HDFs. 2. 정제봉독에의한유전자발현변화분석 UVB를처리한인간진피섬유아세포에정제봉독을처리하여세포외기질 (ECM) 을구성하고조절하는주요유전자인 COL1A1, MMP1의발현을확인하였다. 주름기능성원료로사용되고있는 adenosine을양성대조군으로정제봉독과의효능을비교한결과, Figure 2 (A) 에서보는것처럼 collagenase인 MMP1의 mrna가 UVB 조사에따라무처리군에비해 6.8배상승한것을확인할수있다. 흥미롭게도 10 μm adenosine 처리군에서는 MMP1의발현이 11배까지상승하여 adenosine이 MMP1의유전자발현에는영향을미치지못하는것을확인할수있었으며, 정제봉독 0.25 μg/ml 처리군에서는발현양이 1.8 을기록하여 UVB 조사로인한 MMP1의발현을효과적으로조절하는것을확인하였다. 이어서 procollagen인 COL1A1 유전자발현양을확인한결과, UVB 조사에의해 0.14까지발현이감소하는것을확인할수있었다 (Figure 2 (B)). UVB를조사한세포에 10 μm adenosine 을처리하였을때에는 COL1A1의발현이 0.71까지증가하는것을확인할수있었으며, 정제봉독을 0.25 μg/ml 처리하였을때에는 0.76까지발현양이증가하는것을확인할수있었다. 이러한결과로말미암아, 정제봉독의처리는앞서주름기능성원료로밝혀진 adenosine에비해, 인간진피섬유아세포내 MMP1과 COL1A1의유전자발현을효과적으로조절하는것을알수있었다. 3. 피시험자의선정본연구에참가한피시험자의평균연령은 (±7.77) 세 Figure 2. Analysis of mrna gene expression on HDFs. (A) Relative MMP1 mrna level on HDFs, (B) Relative COL1A1 mrna level on HDFs (Ade; Adenosine 10 μm, B.V; 정제봉독 0.25 μg/ml). 이며, 피부상태의기초지표로는피시험자가주관적으로대답한 본인의피부타입, 홍조상태, 색소침착정도, 탄력도등을살펴 보았다. 최종선정된 23 명의피시험자에대하여안면부를시험 683

6 Figure 3. The effects of bee venom containing essense on crow s feet. (A) Measurements of depth on crow s feet, (B) Improvement rate of depth of crow s feet (%). Figure 5. The effects of bee venom containing essense on skin tone. (A) Measurement of skin tone, (B) Improvement rate of skin tone (%). Figure 4. The effects of bee venom containing essense on sagging. (A) Measurement of sagging volume of Cheek, (B) Improvement rate of sagging volume (%). 부위로하여노화피부에서시험제품사용전과후안면부의주 름, 탄력, 피부톤, 피부결및진정효과를확인하여보았다. 4. 눈가주름깊이분석 눈가주름깊이를시험물질사용전과 1 주사용후 2 번에걸 쳐측정하였다. 봉독이함유된마스크팩을사용하기전의경 우, 피시험자들의평균눈가주름깊이가 (±0.034) 로관 찰되었다. 일주일동안봉독이함유된마스크팩을사용한피시 험자들의눈가주름깊이는 (±0.032) 로사용전에비해 감소한것을확인할수있으며, 마스크팩사용후눈가주름깊 이의개선율은 11.66% 로나타났다 (Figure 3). 이러한결과를 종합해볼때, 봉독을함유한화장료의사용은눈가주름깊이 의개선효과가뛰어난것으로분석된다. 5. 볼광대리프팅분석볼광대리프팅은피부의함몰된부피를나타내는 Depressions medium값을측정하여확인하는방법으로본연구에서는시험물질사용전과, 직후, 1주사용후 3번에걸쳐볼광대리프팅을측정하였다. ANTERA 3D를이용하여피험자들의오른쪽볼광대피부함몰도를분석한결과, 시험물질사용전 (±8.30), 사용직후 (±7.42), 1주사용후 (±7.29) 으로관찰되었다. 사용전과사용직후의리프팅효과를개선율로확인해보았더니, 3.51% 증가하였으며, 1 주사용후에는 7.79% 의개선율이확인되었다. 이러한결과를종합해볼때, 봉독을함유한화장료의사용은안면리프팅에유의한효과를나타내고있음을확인하였다 (Figure 4). 6. 피부톤분석피부톤을봉독이함유된마스크팩을사용하기전, 직후, 일주일사용후 3번에걸쳐측정하였다. 분광광도계와전안촬영시스템을이용하여측정한마스크팩을사용하기전피부톤은 (±2.16) 로관찰되었다. 마스크팩사용직후에는 (±2.87), 일주일사용후에는 (±2.66) 로확인되었다. 사용직후와일주일사용후피부톤의변화를개선율을통해확인한결과, 각각 3.60%, 4.72% 로사용전에비하여상승한것을확인할수있었으며, 이러한변화가통계적으로유의한결과임이분석되었다 (Figure 5). 7. 피부결분석 ANTERA 3D를이용한 Texture small값의측정으로봉독이함유된마스크팩을사용하기전과 1주후의피부결을분석한결과사용전 6.44 (±1.51) 에서 1주사용후 6.13 (±1.25) 로관찰되었다. 피부의거칠기를나타내는 Texture small 값을이 684

7 봉독의항노화효과 Figure 6. The effects of bee venom containing essense on skin evenness. (A) Measurement of skin evenness, (B) Improvement of skin evenness (%). Figure 7. The effects of bee venom containing essense on facial flush. (A) Measurement of facial flush, (B) Improvement of facial flush (%). 용하여피부결의개선율을계산해보았더니봉독이함유된마스크팩을 1주사용후피부거칠기가 4.80% 개선된것으로확인되었다. 피부결개선율은통계적으로유의한결과로분석되어봉독이함유된화장료가피부결개선에도움을주는것을확인하였다 (Figure 6). 8. 안면홍반분석분광광도계와전안촬영시스템을이용하여봉독이함유된마스크팩의피부진정효과를확인해보았다. 봉독을함유한마스크팩을사용하기전피시험자의왼쪽볼부위에서측정한피부붉은기는 (±1.69) 였으며, 1주사용후 (±1.56) 로관찰되었다. 홍반완화효과를개선율로계산하여보았더니 1주사용후 19.96% 로분석되었고, 이러한홍반완화효과가통계적으로유의하게나타나봉독이함유된화장료가안면붉은기개선에도움을주는것으로확인되었다 (Figure 7). 9. 각질개선도분석비디오마이크로스코프와이미지분석프로그램을이용하여봉독이함유된마스크팩의각질개선효과를확인해보았다. 봉독을함유한마스크팩을사용하기전피시험자의왼쪽볼부위의피부각질도는 6.41 (±3.94) 였으며, 사용직후 2.19 (± 1.02), 1주사용후 1.45 (±0.76) 으로관찰되었다. 피부각질도측정결과를개선율로계산하여분석해보았더니사용직후 65.84%, 1주사용후 77.33% 로통계적으로유의하게나타나봉독이함유된화장료가각질개선에도움을주는것으로확인되었다 (Figure 8). 10. 피부이상반응평가피시험자를대상으로시험부위에서피부이상반응인홍 Figure 8. The effects of bee venom containing essense on facial keratinization. (A) Measurement of facial keratinization, (B) Improvement rate of facial keratinization (%). 반 (Erythema), 부종 (Edema), 인설생성 (Scaling), 가려 움 (Itching), 자통 (Stinging), 작열감 (Burning), 뻣뻣함 (Tightness), 따끔거림 (Prickling) 의여부를설문조사하였고, 매회피시험자가측정할때마다문진과육안으로유해사례 ( 홍 반, 부종, 인설, 가려움, 자통, 작열감, 뻣뻣함, 따끔거림 ) 나다 른이상반응이발생하는지평가하였다. 본연구에참여한피 시험자모두에게서특별한피부이상반응은관찰되지않았다 (Table 3). Table 3. Adverse skin reactions reported by the subjects Abnormal reaction Severity Abnormal reaction Severity Erythema 0 Stinging 0 Edema 0 Burning 0 Scaling 0 Tightness 0 Itching 0 Prickling

8 본연구는수집한봉독을화장료로사용가능하도록정제한후, 그효능을인간진피섬유아세포와인체적용시험을통해확인한연구결과이다. 세포효능시험에서는정제봉독의농도별처리에의한인간진피섬유아세포의생존율을확인하는실험과, 노화의가장주요한원인으로꼽히는광노화유발인자인 UVB 를세포에조사하여일어나는유전자변화에봉독이미치는효과를확인하였다. 정제봉독의세포독성실험결과, 1.5 μg/ml 이하의정제봉독처리에서인간진피섬유아세포는 90% 이상의세포활성과생존율을보이는것을검증하였다. 이어서, 주름생성기전과밀접한연관을지니며진피섬유아세포내에서발현이조절되는 COL1A1과 MMP1의유전자발현변화를확인하였다. UVB 조사로인해발현이크게떨어진 COL1A1은 adenosine 과정제봉독의처리로발현이 UVB 처리군과비교하였을때각각 5배이상증가하였다. 흥미롭게도 MMP1의발현변화에서는 adenosine처리군에서발현양이오히려증가하였고, 정제봉독처리군에서만 UVB 처리군에비해 1/4, 즉 0.25배정도발현양이감소하여인간진피섬유아세포에서세포외기질을조절하는유전자발현에는정제봉독이효과적인것을확인하였다. 인체적용시험을통해정제봉독을함유한화장료를마스크팩으로적용하여안면피부에미치는영향을검증하였다. 본연구에서는만 30세이상의안면부노화증상이육안으로확인되는피시험자를선별하여봉독을함유한마스크팩을 1주동안 1일 1회, 저녁에 30 min간사용하도록지시하였으며안면피부의변화는제품사용전 (0주차), 사용직후, 사용완료후 (1주차) 에측정하였다. 매측정때마다피험자들은동일한세안제로세안을하고항온 항습이유지되는실내환경에서 30 min간안정을취한후동일한조명과각도로피부개선도를측정하였다. 봉독이함유된마스크팩을사용하였을때 ANTERA 3D를사용하여측정한눈가주름의깊이는사용전과비교하여사용 1 주차에서 11.66% 개선되었다. 볼광대리프팅또한사용 1주차에서 7.79% 로개선되었으며, 피부톤개선도를분석한결과봉독이함유된마스크팩사용직후에는 3.60%, 1주사용후에는 4.72% 로개선되었다. 피부결의경우 1주사용후 4.80% 의개선도를보였으며안면홍반은 19.96% 개선된효과를확인하였다. 각질개선평가에서는사용직후 65.84%, 1주사용후 77.33% 로높은개선율을확인할수있었다. 노화피부개선평가항목에대하여모든피시험자들에게서특별한피부이상반응이관찰되지않음을확인하였다. 본연구결과를토대로세포수준에서정제봉독처리가 UVB 로인해발현양이변화하는대표적인주름생성연관유전자인 COL1A1과 MMP1의발현에미치는영향을확인하였다. 특히, 주름기능성원료로사용되고있는 adenosine과비교하였을때 유전자발현조절에더뛰어난효과를보이는것을확인할수있었다. 더불어인체적용시험을통해정제봉독을함유한화장료가안면피부개선에미치는긍정적인영향을확인하였다. 이러한결과를통하여봉독을기능성화장품유효성분으로의가능성을모색할수있으며피부개선효과에도기여할수있게되기를기대한다. Akdis CA, Akdis M, Blesken T, Wymann D, Alkan SS, Müller U, Blaser K. Epitope-specific T cell tolerance to phospholipase A2 in bee venom immunotherapy and recovery by IL-2 and IL-15 in vitro. J. Clin. Invest., 98: , Banks BE, Shipolini RA. Chemistry and pharmacology of honeybee venom. In: Piek T. (Ed.). Venoms of the Hymenoptera. Academic Press London, , Billingham ME, Morley J, Hanson JM, Shipolini RA, Vernon CA. Letter: An anti-inflammatory peptide from bee venom. Nature, 245: , Chiu PC, Chan CC, Lin HM, Chiu HC. The clinical antiaging effects of topical kinetin and niacinamide in Asians: a randomized, double-blind, placebocontrolled, split-face comparative trial. J. Cosmet. Dermatol., 6: , Choi SH, Cho SK, Kang SS, Bae CS, Bai YH, Lee SH, Pak SC. Effect of apitherapy in piglets with preweaning diarrhea. Am. J. Chin. Med., 31: , Chung JH, Seo JY, Choi HR, Lee MK, Youn CS, Rhie G, Cho KH, Kim KH, Park KC, Eun HC. Modulation of skin collagen metabolism in aged and photoaged human skin in vivo. J. Invest. Dermatol., 117: , Diffey BL. What is light? Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., 18: 68 74, Eiseman JL, von Bredow J, Alvares AP. Effect of honeybee (Apis mellifera) venom on the course of adjuvant-induced arthritis and depression of drug metabolism in the rat. Biochem. Pharmacol., 31: , Farage MA, Miller KW, Elsner P, Maibach HI. Intrinsic and extrinsic factors in skin ageing: a review. Int. J. Cosmet. Sci., 30: 87-95, Gilchrest BA. A review of skin aging and its medical 686

9 봉독의항노화효과 therapy. Br. J. Dermatol., 135: , Gkogkolou P, Böhm M. Skin disorders in diabetes mellitus. J. Dtsch. Dermatol. Ges., 12: , Gu W, Liu W, Yang X, Zhao X, Yuan X, Ma H, Tian Y, Meng R. Effects of intense pulsed light and ultraviolet Aon metalloproteinases and extracellular matrix expression in human skin. Photomed. Laser Surg., 29: , Han S, Lee K, Yeo J, Kweon H, Woo S, Lee M, Baek H, Kim S, Park K. Effect of honey bee venom on microglial cells nitric oxide and tumor necrosis factor-alpha production stimulated by LPS. J. Ethnopharmacol., 111: , Han SM, Lee KG, Yeo JH, Baek HJ, Park KK. Antibacterial and anti-inflammatory effects of honeybee (Apis mellifera) venom against acne-inducing bacteria. J. Med. Plants Res., 4: , Han SM, Yeo JH, Baek HJ, Lin SM, Meyer S, Molan P. Postantibiotic effect of purified melittin from honeybee (Apis mellifera) venom against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. J. Asian Natural Products Res., 11: , Han SM, Kim JM, Pak SC. Anti-melanogenic properties of honeybee (Apis mellifera L.) venom in a-mshstimulated B16F1 cells. Food Agr. Immunol., / , Han SM, Lee KG, Yeo JH, Kweon HY, Woo SO, Baek HJ, Park KK. Inhibitory effect of bee venom against ultraviolet B induced MMP-1 and MMP-3 in human dermal fibroblasts. J. Apic. Res., 46: 94-98, Han SM, Lee KG, Yeo JH, Kweon HY, Woo SO, Lee ML, Lee MY, Kim SY, Baek HJ, Park KK. Antineuroinflammatory effect of the venom from honeybees (Apis mellifera L.) on nitric oxide and tumor necrosis factor-α production in BV-2 cell line. J. Apicultural Res., 20: , Han SM, Lee KG, Yeo JH, Kim WT, Park KK. Biological effects of treatment of an animal skin wound with honeybee (Apis mellifera L.) venom. J. Plast. Reconstr. Aesthet. Surg., 64: e67-72, Iovine B, Nino M, Irace C, Bevilacqua MA, Monfrecola G. Ultraviolet B and A irradiation induces fibromodulin expression in human fibroblasts in vitro. Biochimie., 91: , Jenkins G. Molecular mechanisms of skin ageing. Mech. Ageing Dev., 123: , Jo M, Park MH, Kollipara PS, An BJ, Song HS, Han SB, Kim JH, Song MJ, Hong JT. Anti-cancer effect of bee venom toxin and melittin in ovarian cancer cells through induction of death receptors and inhibition of JAK2/STAT3 pathway. Toxicol. Appl. Pharmacol., 258:72-81, Kammeyer A, Luiten RM. Oxidation events and skin aging. Ageing Res. Rev., 21: 16-29, Kligman AM, Grove GL, Hirose R, Leyden JJ. Topical tretinoin for photoaged skin. J. Am. Acad. Dermatol., 15: Kwon YB, Lee JD, Lee HJ, Han HJ, Mar WC, Kang SK, Beitz AJ, Lee JH. Bee venom injection into an acupuncture point reduces arthritis associated edema and nociceptive responses. Pain, 90: , Landau, M. Exogenous factors in skin aging. Curr. Prob. Dermatol., 35: 1 13, Lavker RM. Structural alterations in exposed and unexposed aged skin. J. Invest. Dermatol., 73: 59-66, Lee CW, Li GS, Park SC, Eun HC, Cho KH, Kim KH, Cho SY, Chung JH. A study of dermatosis and characteristics of the skin in the super-old ages and centenarians. Kor. J. Dermatol., 43: , Lee JH, Kwon YB, Han HJ, Mar WC, Lee HJ, Yang IS, Beitz AJ, Kang SK. Bee venom pretreatment has both an antinociceptive and anti-inflammatory effect on carrageenan-induced inflammation. J. Veterinary Med. Sci., 63: , Lee SM, Yang EJ, Choi SM, Kim SH, Baek MG, Jiang JH. Effects of bee venom on glutamate-induced toxicity in neuronal and glial cells. J. Evidence-Based Complementary and Alternative Med., 1: 9, Moon DO, Park SY, Lee KJ, Heo MS, Kim KC, Kim MO, Lee JD, Choi YH, Kim GY. Bee venom and melittin reduce proinflammatory mediators in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglia. Int. Immunopharmacol., 7: , Naru E, Suzuki T, Moriyama M, Inomata K, Hayashi A, Arakane K, Kaji K. Functional changes induced by chronic UVA irradiation to cultured human dermal fibroblasts. Br. J. Dermatol., 153: 6-12, Park MH, Choi MS, Kwak DH, Oh KW, Yoon DY, Han SB, 687

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