Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 름이생성되고피부면역세포인랑게르한스세포와진피의교원섬유가감소한다는공통점이있으나 ( 한정선, 2013; Chiba et al., 1999), 자연노화에서는피부가얇아지는반면, 외인성노화의대부분을차지하는광노화의경우에는탄력섬유의변

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1 RESEARCH ARTICLE Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 알리인 (Alliin) 의인간진피섬유아세포보호효과및 Collagen 발현증가, MMP1 발현억제효과에관한연구 전소현, 이동희 건국대학교일반대학원생물공학과 Effects of Alliin on Cellular Protection, Up-regulation of Collagen and Down-regulation of MMP1 in Human Dermal Fibroblasts So-Hyun Jeon, Dong-Heui Yi Department of Bioengineering, Graduate School of Konkuk University Abstract The attention to aging has been reflected in various aspects. In the cosmetics industry, the development of anti-aging products has been in a steady progress. Anti-inflammatory and antioxidant research has been conducted using garlic extract, but relevant research and development have been insufficient due to the difficulties to use garlic as a cosmetic ingredient due to its characteristics such as the distinctive scent of garlic. Thus, based on the need for development of an ingredient to complement the weaknesses, alliin was selected as the research subject as it is heat-stable and also its activity is maintained in the dry state. The present study aims to examine the effect of alliin in inhibition of aging by giving normal human dermal fibroblast (NHDF) H 2 -oxidative stress. In order to test the efficacy of alliin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-dipheyltetrazolium bromide thiazolyl blue assay, enzyme-linkes immunosorbent assay, and quantitative real-time polymerase chain reaction were performed. It was demonstrated that treating H 2 -treated NHDF with alliin was effective in restoring damaged cells as the treatment increase the survival rate of the cell. It was also demonstrated that alliin treatment given to the NHDF treated with H 2 -oxidative stress facilitated the generation of procollagen type I and inhibited the generation of MMP1 protein. In addition, the alliin treatment was found to facilitate the gene expression of the COL1A1 and inhibit the gene expression of MMP1. Taken together, the effect of alliin in improving aged skin was demonstrated in the cell efficacy test, and alliin is expected to have a value as an excellent anti-aging ingredient for functional cosmetics. Keywords: Alliin, Cellular protection, Collagen, MMP1, Human dermal fibroblast 노화 (aging) 는누구라도피할수없는생리현상으로, 인간 의신체구조와기능은시간의흐름에따라피할수없는변화가 나타나게되는데즉노화현상이라고할수있다. 이러한노화 는모든생물체에서필연적으로일어나는것이며, 모든인간은 늙지않고건강하게살기를원하고있다. 자연피부노화현상 Corresponding author: Dong-Heui Yi, Department of Bioengineering, Graduate School of Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjingu, Seoul , Republic of Korea Tel.: , dhyi@konkuk.ac.kr Received February 24, 2014; Revised April 4, 2014; Accepted April 9, 2014; Published April 30, 2014 은햇빛에노출되지않은피부에서관찰되는피부노화현상으로내인성피부노화 (intrinsic skin aging, chronological skin aging) 라고도부른다. 내인성노화는피부에존재하는세포내에서세포의대사과정중에생성되는 reactive oxygen species (ROS) 등에의해서발생하고, 외인성노화 (extrinsic aging) 는 ultraviolet (UV), 공해와같은외부요인에의해발생하며 ( 손명수등, 2013), 광노화의경우가외인성노화의대부분을차지하고있다. 이러한내인성노화의특징으로는잔주름, 창백한피부색, 피부건조증, 경미한탄력감소등을들수있고, 반면에광노화된피부는굵고깊은주름이발생하며피부건조, 탄력성감소, 색소침착이나타나게된다 ( 최현경, 2009). 피부는크게표피, 진피, 피하지방층으로구성되어있다. 자연노화와광노화모두주 249

2 Kor. J. Aesthet. Cosmetol., 름이생성되고피부면역세포인랑게르한스세포와진피의교원섬유가감소한다는공통점이있으나 ( 한정선, 2013; Chiba et al., 1999), 자연노화에서는피부가얇아지는반면, 외인성노화의대부분을차지하는광노화의경우에는탄력섬유의변성이심하며, 그수와두께가더욱감소되고, collagenase 발현이증가되어있으므로, 피부가두꺼워지고변형된탄력섬유가증가하는특징을갖고있다 (Waller & Maibach, 2006). 특히진피는표피와피하지방층사이에있는결합조직으로피부에유연성, 탄력성및장력을제공하며표피를구조적으로지지한다. 진피층의섬유아세포 (fibroblast) 는진피층의섬유상단백질인 collagen ( 콜라겐 ) 과 elastin ( 엘라스틴 ) 의발현을담당하고있는데 ( 김나미외, 2007), 나이가증가함에따라진피층에존재하는섬유아세포의작용과그수가감소하여 collagen과 elastin 등의구조단백질의합성이감소하고, 피부세포내수분이손실되며, 각질층의구조가변화된다 (Kim et al., 2008). 세포외기질단백질은 collagen, elastin이주성분으로세포사이를채워주는물질이며, matrix-metalloproteinases (MMPs) 의과다한발현증가로세포와세포외기질의변형이관찰되며, 그결과로콜라겐섬유의길이와분포에손상을준다 ( 배인순, 2008). MMP1은 interstitial collagenase 로피부노화과정에서진피의 collagen 분해에중요한역할을하고, collagen은신체곳곳에존재하는대표적인섬유상단백질로 14개의 type이존재하는데, 이중피부에는 type I collagen 이주로존재한다 (Uitto et al., 1989). UV에오랫동안노출된피부는세포독성을일으키고세포사멸을촉진하며 MMP1 발현을증가시켜교원질분해를촉진하게되는것은 ( 김나영외, 2013) 외인성노화뿐만아니라내인성노화에의해서도발생되는대표적인현상이다 (Hachiya et al., 2009). 생체의정상적유지를위해서는항상성과과도한스트레스의억제가중요한데조직세포의지질, 단백질, 핵산의산화적손상을방어하는시스템이매우중요하다. 이러한활성산소의산화적손상에관계하는것이항산화시스템이다. 항산화시스템으로서체내에는이들활성산소의산화적스트레스에대항하는방어시스템이존재하고있는데활성산소제거효소와 glutathione 등이존재하고있고 (Chung, 2003), 주로음식물을통해섭취하는비타민C, 비타민E, 폴리페놀등의항산화제가있고, 그밖에해독작용을하는 methionine, cysteine, taurine 등의황아미노산 (sulfur-containing amino acid) 의 sulfhydryl group (SH group) 등이관계하고있다. 이러한항산화효과에대한연구는식품, 화장품소재개발등연구로이어지고있는데, 자연지향적이고환경친화적인소비추세에따라다양한천연소재를이용한미백, 항노화, UVB 차단기능을가진기능성화장품의개발이활발히이루어지고있다 (Lee & Chang, 2007). 마늘 (Allium sativum) 은오래전부터독특한맛과향을지 닌식품으로많이사용되어왔고, 항균, 항진균, 항바이러스, 면역반응개선, 항산화제로서의기능을가지고있다고알려져왔다 (Iciek et al., 2009). 마늘은강력한항산화효과로인해혈액순환을촉진하고피부의탄력성을부여하는기능이있어기능성화장품소재로의가능성을보이고있다 (Kwon, 2003; Lee & Chang, 2007). 마늘의효능을나타내는주요성분은황화합물들로알려져있고 (Ariga & Seki, 2006), 마늘의생리적활성은식물체내에서불활성인전구체로부터세포가파괴되면서효소적으로생성된 allicin 때문이며, 이 allicin은생리활성이잘알려진성분이다 (Banerjee et al., 2002). 그러나생마늘에는 allicin이존재하지않으며, 마늘을잘게파쇄하거나분쇄할경우아미노산의하나인 cysteine에서유래한 sulfoxide인 alliin이 allicin으로변환된다 (Iberl et al., 1990; Kourounakis & Rekka, 1991). 최근에박애영 (2011) 은마늘추출물의항균성과두피건강에미치는영향을보고하였고, 윤혜영 (2005) 은마늘추출물로제조한화장품의여드름억제효과에관한연구를보고하였으나황함유물, 비타민, 알리신등을함유한유용성성분들을추출, 농축하는형태로연구가되어왔다. 마늘의다양한유효한성분들의효과는오랫동안많은연구자들에의해진행되어왔고중요성에대해서도인식되어왔다. 그러나단독순수물질로 alliin의효과를규명하는연구는상대적으로미비한실정이다. 따라서본연구에서는 H 2 산화적스트레스에의한피부및세포노화억제물질로써마늘의주요성분인 alliin의효능을검증하고자하였다. 1. 세포배양본연구에서는인간진피섬유아세포인 normal human dermal fibroblast (NHDF; Lonza, Switzerland) 를사용하였다. 세포배양액은 Dulbecco s Modified Eagle Medium (DMEM; Lonza) 배지에 10% fetal bovine serum (FBS; Sigma-Aldrich, USA), 1% penicillium과 streptomycin (Lonza) 을첨가하여사용하였고, 37, 5% C 조건에서세포배양기를통해서배양하였다. 2. 시료처리세포실험에서사용된 alliin (Sigma-Aldrich) 은 3 차증류수에녹여사용하였으며, 양성대조군으로사용된 epigallocatechin gallate (EGCG) 도 Sigma-Aldrich에서구입하여 alliin과같은방식으로처리하였다. 본실험에활성산소유발인자로사용된 H 2 (Sigma-Aldrich) 는증류수에희석하여사용하였다. NHDF를접종후 24시간배양하여안정화시 250

3 알리인의인간진피섬유아세포보호효과및 Collagen 발현증가, MMP1 발현억제효과 킨후, H 2 를적정농도로처리후 2시간동안배양하였다. 그후배지성분을제거하고 phosphate-buffered saline (PBS) 로세척한후, 새로운배지를첨가하여실험을실시하였다. 3. 세포생존율분석 Alliin이세포생존율에미치는영향을알아보기위해 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheyltetrazolium bromide thiazolyl blue (MTT; Sigma-Aldrich) 분석을실시하였다 (Mosmann, 1983). NHDF를 96 well plate에 3 10³ cells/well의농도로 100 μl씩접종하여 24시간배양후각 well에시료적정농도를처리하고 24시간동안배양하였다. 배양된세포에 MTT solution을 0.5 mg/ml의농도로첨가하여 2시간 37, 5% C 조건에서배양하였다. 배양이끝난후각 well의배지를제거하고배지가제거된각 well에 demethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) 100 μl를놓고 microplate reader (Bio-Rad, USA) 를이용하여 595 nm 에서흡광도를측정하였다. 실험은 3회반복실시하였으며평균값을도출하였다. 4. ELISA assay Procollagen type I 과 MMP1의생성량을확인하기위하여 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 법을사용하였다 (Youngren et al., 1999). Procollagen type I과 MMP1은세포밖으로분비되는물질이므로세포배양액을이용하여발현변화를확인하는측정법으로시료가처리된세포배양액을회수하여실험에적용하였다. MMP1과 procollagen type I 항체 (Santa Cruz Biotechnology, USA) 를 carbonate/bicarbonate (15 mm Na 2 CO 3, 35 mm NaHCO 3, ph9.6) buffer에 1:100으로희석하여 96-well immulon-1 flat-bottomed-plate 에 coating 을한후 1% BSA를처리하여상온에서 1시간 blocking 하였다. Blocking이끝난 plate에세포배양액을넣고 4 에서 18 시간동안반응처리하였다. 반응후 0.05% Tween 20이함유된 PBS로세척하고. 각각의항체를첨가하여상온에서 1시간반응후 100 μl PBS로세척하였다. 그리고각각의항체에해당하는 2차항체 (horse reddish peroxidase, HRP) 를상온에서 1시간반응시키고 100 μl PBS로세척하였다. TMB substrate solution (Pierce, USA) 을이용하여반응후 490 nm파장에서흡광도를측정하여발색정도를확인함으로써 procollagen type I 과 MMP1의생성량을확인하였다. 5. mrna 추출과 cdna 제조 Alliin이처리된 NHDF를수확한후 phenol 성분이첨가된 Trizol reagent (Invitrogen, USA) 을이용하여 mrna를 추출하였다. 수확한 NHDF가들어있는 tube 에 1 ml Trizol reagent를넣고현탁한후상온에 5분간방치하여세포를용해하였다. 여기에 0.2 ml chloroform (Biopure, Canada) 을첨가하고강하게 15초간흔들어준뒤 3분간상온에방치하고, 12,000g, 4 의조건에서 20분간원심분리를실시하여단백질이포함된하단부의 phenol층과 mrna가포함된상단부의수용성층으로분리하였다. 상단부의수용성층만을새로운 1.5 ml tube 로옮기고 0.5 ml isopropanol (Biopure) 을첨가하여상온에 10분간방치후, 12,000g, 4 의조건에서 15분간원심분리를실시하여 mrna를침전시켰다. 침전된 mrna는 75% ethanol로세척한후 ethanol 성분을제거하고상온에서건조하였다. 건조된 mrna는 diethylpyrocarbonate (DEPC) water로녹여실험에사용하였고추출된 mrna는 Nanodrop (Nanodrop, USA) 을이용하여순도를확인하였다. 260 nm, 280 nm의파장에서흡광도를측정후 260 nm / 280 nm의 ratio를확인하여 ratio가 1.8 이상의 mrna만을실험에사용하였다. ratio 1.8 이상이면 protein이함유되지않은순수한 RNA로판단하였다. cdna는 1 μg의 RNA를대상으로 M-MLV reverse transcriptase (Enzynomics, Korea) 를사용하여제조하였다. PCR tube에 1 μg RNA와 0.5 ng oligodt 18 과 DEPC water를첨가하여 total 10 μl의용액을제조후, 70 에서 10분간처리하여 RNA를 denaturation 유도한뒤 ice에방치하였다. 여기에 buffer 2 μl, 10 mm dntp, 200 unit/μl reverse transcriptase를첨가하고 37 에서 1시간반응시켜 cdna를제조하였다. 6. Quantitative real time PCR 유전자발현변화는 polymerase chain reaction (PCR) 과정중에증폭되는 DNA 산물에형광물질을붙이고형광물질을지속적으로검출하는방식인 quantitative real time PCR (qrt-pcr) 로측정하였다 (Higuchi et al., 1992). Alliin에따른 COL1A1과 MMP1 유전자발현변화를정량적으로확인하기위하여 PCR 산물이발산하는형광값을통하여결과값을확인하는방식으로 SYBR green Ι (Invitrogen) 을사용하였다. PCR tube에 0.2 μm primers, 50 mm KCl, 20 mm Tris/HCl ph8.4, 0.8 mm dntp, 0.5U Extaq DNA polymerase, 3 mm MgCl 2, 1 SYBR green을혼합하여반응액을제조하였다. 반응액을제조후 Linegene K (BioER, China) 를이용하여 94 에서 3분동안 primary denaturation 한후 denaturation, annealing, polymerization을각각 94 에서 30초, 58 에서 30초, 72 에서 30초로총 40 cycle을수행하였고, 매 cycle 이끝난후형광강도를측정하였다. PCR 결과는각결과별 melting curve로검증하였다. 각유전자의 threshold cycle (Ct) 값을 β-actin의 Ct값으로표준화한후, Ct값의변화량을 251

4 Kor. J. Aesthet. Cosmetol., Relative cell viability (% of control) Alliin (μm) Relative cell viability (% of control) H 2 (μm) Figure 1. Cytotoxicity of alliin in NHDF. NHDF ( cells) were seeded in 96 well plates and treated with indicated concentration of alliin for 24h. Cell viability was measured by MTT assay. The results are presented as the mean±se of the percentage of control optical density (OD) in triplicate. Figure 2. Cytotoxicity of H 2 in NHDF. NHDF ( cells) were seeded in 96 well plates and treated with indicated concentration of H 2 for 24h. Cell viability was measured by MTT assay. The results are presented as the mean±se of the percentage of control optical density (OD) in triplicate. 비교하여분석하였다. Ct값은 PCR 산물에의해발생하는형광의양 ( 증폭된 PCR 산물의수 ) 이기본값이상의일정한기준값에도달했을때의 cycle 수로서 Ct값을통하여유전자발현량을확인할수있다. 실험에사용한각유전자의 primer는 Table 1 과같다. 1. Alliin의세포독성분석 Alliin이노화현상인주름에어떠한영향을미치는지알아보기위하여먼저 NHDF에서 alliin의세포독성을확인하기위해 MTT assay를실시하였다. Figure 1 실험결과를보면, NHDF 에 0.1, 1, 10, 100, 1000 μm의각농도별로 alliin을처리하여세포독성을확인한결과, alliin 0.1 μm일때 96.63%, 1 μ M 일때 96.40%, 10 μm일때 94.08%, 100 μm일때 93.53%, 1000 μm일때 93.85% 로독성이거의나타나지않음을확인할수있었다. 따라서본연구의노화분석에는 alliin을 1, 10, 100 μm의농도로사용하기로하였다. 2. H 2 의세포독성분석활성산소가체내에들어가면조직의세포막을비롯한지질 성분을공격하여강력한세포독성으로작용하는과산화지질 (lipid peroxide: LPO) 을생성하여조직및세포막을파괴한다. 또한조직의단백질성분을공격하여 carbonyl group을생성하면서단백질산화를촉진하게되어조직세포를파괴하게된다. UV의외적인자로인한광노화에따른노화현상에대한연구소재로많은천연추출물, 한방, 발효물질들이연구되어보고되어왔다. 그러나김영주 (2011) 는 Centalla asiatica 추출물의인간진피섬유아세포에서 H 2 로유도된세포노화에대한조절작용을보고함으로서자연노화의활성산소로서 H 2 가사용된연구도보고하였다. 한상미등 (2011) 는산화적스트레스에대한국내산로얄제리의신경세포보호효과에서 H 2 의해유도된산화적스트레스로부터손상된뇌신경세포에대한보호효과에대해보고하였다. 본연구에서는자외선이아닌활성산소로 H 2 를산화적스트레스로적용하여 NHDF에처리하여 MTT assay를통하여 H 2 세포독성을확인하였다. Figure 2와같이 H 2 적정처리농도를설정하기위하여각 100, 200, 400, 600, 800 μm의농도별로독성을확인한결과, H μm일때 88.83%, 200 μ M일때 79.46%, 400 μm 일때 65.35%, 600 μm 일때 46.03%, 800 μm일때 34.57% 의세포생존율을확인하였다. H 2 400, 600, 800 μm 농도처리시, 세포생존율이점차감소하는결과를보였다. 따라서향후실험에서 H 2 의적용농도는세포가죽 Table 1. The list of primers used in this study Gene Forward primer Reverse primer -actin 5 -GGATTCCTATGTGGGCGACGA-3 5 -CGCTCGGTGAGGATCTTCATG-3 COL1A1 5 -AGGGCCAAGACGAAGACATC-3 5 -AGATCACGTCATCGCACAACA-3 MMP1 5 -TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG-3 5 -CAGGGTGACACCAGTGACTGCAC

5 알리인의인간진피섬유아세포보호효과및 Collagen 발현증가, MMP1 발현억제효과 Relative cell viability (% of control) EGCG (μm) Relative cell viability (% of control) H 2 (200 μm) EGCG (μm) p <.05 p <.01 : p-value is measured by paired t-test Figure 3. Cytotoxicity of EGCG in NHDF. NHDF ( cells) were seeded in 96 well plates and treated with indicated concentration of EGCG for 24h. Cell viability was measured by MTT assay. The results are presented as the mean±se of the percentage of control optical density (OD) in triplicate. 지않고안정적이면서도최대의효과를주기위한최적농도로 200 μm 를사용하기로하였다. 즉, NHDF 에산화적스트레스로 H μm 의농도를적용하여 alliin 이노화현상인주름의생 성에어떠한영향을미치는지를확인하고자하였다. 3. EGCG 의세포독성분석 EGCG 를비롯한폴리페놀화합물들은전자의공여를통하여 직접적으로라디칼을소거하거나산화촉진제로작용하는 metal 에대해 chelator 로작용하기도하며, 생체내에서 superoxide dismutase, catalase, hemooxgenase-1, glutathion, S-transferase 등과같은항산화효소들의발현을유도하여항 산화활성을나타낸다 (Chow et al., 2007). 김남이등 (2006) 은 녹차추출물의산화적스트레스에대한억제효과를보고하였 다. 김지은 (2003) 은인체피부섬유아세포에서열자극에의해 유도되는 procollagen type I, MMP1 과 TIMP-1 발현에대한 녹차추출물연구에서열에의해유도된노화된피부에대해유 발되는주증상인주름을호전시킬수있음을제시하였다. NHDF 에서 EGCG 의세포독성확인을위해 EGCG 10, 25, 50, 75, 100 μm 각농도별로 NHDF 를처리하였다. Figure 3 에서보는바와마찬가지로 EGCG 10 μm 일때 98.75%, 25 μ M 일때, 97.87%, 50 μm 일때, 95.43% 75 μm 일때, 93.37% Figure 4. Protective effects of EGCG to H 2 in NHDF. NHDF ( cells) were seeded in 96 well plates, and indicated concentration of EGCG pretreated for 4h. After pretreatment, EGCG-pretreated NHDF were exposed by 200 μm H 2 and incubated for 24h. Cell viability was measured by MTT assay. he results are presented as the mean±se of the percentage of control optical density (OD) in triplicate. 100 μm 일때 91.62% 의세포생존율을보였으므로, EGCG 의 세포독성은거의나타나지않음을확인하였다. 따라서본시험 에서는이와같은농도범위에서 EGCG 를양성대조군으로사 용하여 alliin 의노화억제에대한연구를비교실험하였다. 4. H 2 에대한 EGCG 의보호효과 Figure 4 와 Table 2 에 NHDF 에 H μm 과 EGCG 를 각 10, 25, 50, 75, 100 μm 농도별로처리한결과, H μμ 농도처리시, 세포생존율은 79.74% 의결과를보였으며, EGCG 10 μm 일때 82.29%, 25 μm 일때 88.62% 50 μm 일 때, 96.90%, 75 μm 일때 97.09%, 100 μm 일때 98.13% 의 농도의존적으로세포생존율을보였다. EGCG 의적정처리농 도를확인한결과최적농도를 50 μm 로설정하여향후실험에 서 alliin 의양성대조군으로사용하기로하였다. 지금까지알려진항산화제로는비타민 C 와비타민 E, β- 카로 틴, 글루타치온, 멜라토닌과녹차와은행추출물등이알려져 있고, 최근에녹차의주성분인 EGCG 가강력한항산화기능을 나타내고동시에항암효과도보고되어다양한기능을갖고있 는물질로인체에있어서그유용성및기전에많은연구가활 Table 2. Protective effects of EGCG to H 2 in NHDF EGCG ( ) Control H 2 (200 ) Viability (%) Error (%) p value

6 Kor. J. Aesthet. Cosmetol., Relative cell viability (% of control) H 2 (200 μm) p <.05 p <.01 : p-value is measured by paired t-test 발히진행중에있다. 따라서이미많은연구에서항산화성분 으로밝혀진 EGCG 를양성대조군으로하여 alliin 의노화개선 효능을밝히고자하였다. 5. H 2 에대한 alliin 의보호효과 Alliin (μm) EGCG (50 μm) Figure 5. Protective effects of alliin to H 2 in NHDF. NHDF ( cells) were seeded in 96 well plates, and indicated concentration of alliin pretreated for 4h. After pretreatment, alliinpretreated NHDF were exposed by 200 μm H 2 and incubated for 24h. Cell viability was measured by MTT assay. The results are presented as the mean±se of the percentage of control optical density (OD) in triplicate. 본시험에서는 H 2 에의한 alliin 의 NHDF 의세포보호효 과를보기위해 H 2 를사용하여산화적스트레스를유도하고 무처리군과 EGCG 양성대조군과비교하여 MTT assay 를이 용하여세포생존율을확인하였다 (Figure 5 와 Table 3). H μm 농도로만처리한군은 79.64% 로 alliin 1, 10, 100 μ M 농도처리시보다적은결과값을보였고, 양성대조군으로사 용된 EGCG 50 μm 일때 96.58% 로, alliin 100 μm 농도처리 Procollagen type I expression (% of control) H 2 (200 μm) Alliin (μm) EGCG (50 μm) p <.05 p <.01 : p-value is measured by paired t-test Figure 6. Effects of alliin on collagen synthesis in NHDF. NHDF ( cells) were seeded in 60 mm culture dish, treated with alliin for 4h, and then exposed with 200 μm H 2. After treatment of alliin and H 2, the cells incubated for 24h. And medium of the cell were collected and analyzed for collagen ELISA. The results are presented as the mean±se of the percentage of control optical density (OD) in triplicate. 시 97.13% 보다적은결과값을보였다. 이로서 alliin 이 EGCG 보다 H 2 를사용하여산화적스트레스를유도한 NHDF 생존 율이더좋은결과를나타냈다. 6. Alliin 에의한 procollagen type Ⅰ 생성촉진효과 콜라겐은신체곳곳에존재하는대표적인섬유상단백질로 서 14 개의 type 이존재하며이중피부에는 type I collagen 이 주로존재한다 (Uitto et al., 1989). 진피섬유아세포의기능이 상은콜라겐의생성저해와콜라겐분해효소인 MMP 의활성 증가로이어지게된다. 이민호등 (2013) 은진피섬유모세포에서 대복피추출물의세포외기질합성촉진효과에서 COL1A1 의 Table 3. Protective effects of alliin to H 2 in NHDF Control H 2 (200 M) Alliin ( M) EGCG ( M) Viability (%) Error (%) p value Table 4. Effects of alliin on collagen synthesis in NHDF Control H 2 (200 M) Alliin ( M) EGCG ( M) Expression (%) Error (%) p value

7 알리인의인간진피섬유아세포보호효과및 Collagen 발현증가, MMP1 발현억제효과 생성촉진에대한결과를보고하였고, 전지민등 (2011) 은유산균발효에의한인삼열매추출물의항산화및항노화효과에서 COL1A1의생성이항노화효과가있는것을보고하였다. 또한김선희 (2009) 은단일물질은아니지만흑마늘의다양한추출물로주름과미백에대한연구도보고하였다. 따라서 alliin에의한 procollagen typeⅠ의생성촉진을알아보기위하여 ELISA assay를수행하였다 (Figure 6과 Table 4). 본연구에서 H μm 농도처리시, 75.50% 로감소된 procollagen type Ⅰ의양이 alliin 1 μm 농도처리시, 86.17%, 10 μm 농도처리시 92.13%, 100 μm 농도처리시, 98.50% 로농도의존적으로 procollagen type Ⅰ을증가시키는결과를보였다. alliin이 100 μm일때 98.50% 로무처리군과거의유사한결과값을보였고, EGCG 50 μm일때 96.27% 로 alliin이 procollagen tpye Ⅰ 단백질의양을증가시킴을확인하였다. procollagen type Ⅰ 은일반적으로자연노화또는광노화피부에서큰폭의감소를보인다 (Yokoyama et al., 2014). 때문에콜라겐의발현을조절하는물질을통해서노화피부에콜라겐을보충하려는연구가계속적으로진행되고있다. 특히피부주름을개선시키려는목적으로콜라겐유도물질을향장제품에사용하고있다. 따라서노화피부에서 alliin의처리를통해서피부노화또는피부주름을억제할수있을것으로예상할수있다. 7. Alliin에의한 COL1A1 유전자발현변화 NHDF 에 alliin을각각 1, 10, 100 μm의농도로 24h 처리후세포를수확하여추출한 RNA를대상으로제작된 cdna를이용하여 COL1A1 유전자발현변화를확인하였다. Collagen 발현변화는 COL1A1 유전자를대상으로 qrt-pcr을사용하여확인하였다. Alliin은 H 2 로인해발현이감소된 COL1A1 유전자의발현을 alliin 1, 10, 100 μm 농도로증가됨에따라농도의존적으로증가시킴을확인할수있었으며, alliin 100 μm 농도처리시 0.99배로무처리군 1.00배와유사한결과값을보였고, EGCG 50 μm 농도처리시 COL1A1 유전자의발현량이 0.94 배로 alliin이 COL1A1 유전자의발현을더욱촉진하는결과를나타내었다. 앞선결과에서 alliin의 procollagen type Ⅰ 의생성을촉진함을확인하였고 (Figure 6과 Table 4), 또한 COL1A1 Relative levels of COL1A1 유전자발현량을증가시킴을확인하였다 (Figure 7 과 Table 5). 피부의노화는나이의증가와자외선등의외부요인이주요 원인이된다. 나이가증가되면섬유아세포의작용과세포수가 감소하여섬유성분의합성이줄어들고구조가느슨해져서탄력 이감소하며수분이손실되고각질층의구조가변화가된다. 피 부의기질단백질은피부에강도와장력을주는콜라겐이 90% 이상함유되어있는데 procollagen type Ⅰ 이대부분이고 type Ⅲ collagen 이소량포함되어있으며탄력섬유가 3 4% 정도 함유되어있다. 따라서주름을예방하기위해서는세포의기 질단백질의결핍을막아콜라겐합성을증가시킬필요가있다. Alliin 은콜라겐생성촉진효과가좋은결과를나타냄으로, 노 화의가장큰현상인주름생성을억제시킬수있는성분으로 보여진다. mrna (fold) H 2 (200 μm) Alliin (μm) EGCG (50 μm) p <.05 p <.01 : p-value is measured by paired t-test Figure 7. Effects of alliin on COL1A1 mrna expression in NHDF. NHDF ( cells) were seeded in 60 mm culture dish, treated with alliin for 4h, and then exposed with 200 μm H 2. After treatment of alliin and H 2, the cells incubated for 24h. And medium of the cell were collected and analyzed for qrt-pcr of COL1A1 mrna. The results are presented as the mean±se of ratio of expression level of control in triplicate. 8. Alliin 에의한 MMP1 생성억제효과 이번실험에서는 alliin 이 H 2 처리된 NHDF 에서 MMP1 생 성억제에미치는영향에대하여 ELISA assay 를통해확인하 였다. H μm 농도처리시, % 로증가된 MMP1 의양이 alliin 을 1, 10, 100 μm 농도처리시, 농도의존적으 로감소시키는결과를나타내었다. alliin 100 μm 농도처리시, Table 5. Effects of alliin on COL1A1 in NHDF Control H 2 (200 M) Alliin ( M) EGCG ( M) Expression (fold) Error (fold) p value

8 Kor. J. Aesthet. Cosmetol., MMP1 expression (%) H 2 (200 μm) Alliin (μm) EGCG (50 μm) p <.05 p <.01 : p-value is measured by paired t-test Figure 8. Effects of alliin on MMP1 synthesis in NHDF. NHDF ( cells) were seeded in 60 mm culture dish, treated with alliin for 4h, and then exposed with 200 μm H 2. After treatment of alliin and H 2, the cells incubated for 24h. And medium of the cell were collected and analyzed for MMP1 ELISA. The results are presented as the mean±se of the percentage of control optical density (OD) in triplicate % 로무처리군 10% 와유사한결과를보였고, EGCG 50μM 농도처리시, % 로 alliin 이 EGCG 보다 MMP1 생 성을억제하는결과를나타내었다 (Figure 8 과 Table 6). 9. Alliin 에의한 MMP1 유전자발현변화 Alliin 의 MMP1 유전자발현변화를알아보기위하여 qrt- PCR 을수행하였다. H μm 농도처리시, 1.69 배로 MMP1 유전자의발현을증가시켰으나, alliin 1, 10, 100 μm 농 도처리시농도의존적으로 MMP1 유전자발현을감소시키는 결과를나타내었다. Alliin 100 μm 농도처리시 1.10 배로무처 리군 1.01 배와유사한결과값을보였고, EGCG 50 μm 농도처 리시 1.26 배의 MMP1 유전자의발현량을확인하였다. 따라서 Relative levels of MMP1 mrna (fold) H 2 (200 μm) Alliin (μm) EGCG (50 μm) p <.05 p <.01 : p-value is measured by paired t-test Figure 9. Effects of alliin on MMP1 mrna expression in NHDF. NHDF ( cells) were seeded in 60 mm culture dish, treated with alliin for 4h, and then exposed with 200 μm H 2. After treatment of alliin and H 2, the cells incubated for 24h. And medium of the cell were collected and analyzed for qrt-pcr of MMP1 mrna The results are presented as the mean±se of ratio of expression level of control in triplicate. alliin 이 EGCG 보다 MMP1 유전자발현량을감소시킴을확인 하였다 (Figure 9 와 Table 7). 결론적으로피부노화는콜라겐의합성량과이를분해하는 MMPs 발현량의비율이불균형을이루면서노화가촉진된다고 볼수있다. 앞선실험에서 alliin 이 procollagen type Ⅰ 의합 성을증가시킴을확인했고, 콜라겐의분해효소인 MMP1 을감 소시킴으로써주름생성억제에효능이있다는것을알수있었 다. 결과적으로 alliin 이 H 2 에대한보호작용을나타낸결과 라고볼수있다. 따라서내인성노화가진행됨에따라 MMP1 의단백질과유전자발현량이감소하면 procollagen type Ⅰ 생성촉진에영향을미칠것으로생각된다. Table 6. Effects of alliin on MMP1 synthesis in NHDF Control H 2 (200 M) Alliin ( M) EGCG ( M) Expression (%) Error (%) p value Table 7. Effects of alliin on MMP1 mrna expression in NHDF Control H 2 (200 M) Alliin ( M) EGCG ( M) Expression (fold) Error (fold) p value

9 알리인의인간진피섬유아세포보호효과및 Collagen 발현증가, MMP1 발현억제효과 본연구에서는인간진피섬유아세포주실험모델을활용한세포효능시험을통해 alliin이피부의노화개선에효능이있음을 in vitro에서알아보고, 화장품소재로서 alliin의유용성을검토하고자하였다. 첫째, H 2 처리된인간진피섬유아세포에서 alliin이세포의생존율을증가시킨다는것을확인하였다. 둘째, alliin이 procollagen type Ⅰ 생성촉진을유도하는지분석한결과, H 2 처리에의해감소된 procollagen type Ⅰ의양을증가시키고 COL1A1 유전자의발현량을증가시킨다는것을확인하였다. 셋째, alliin이 MMP1의생성억제에어떠한영향을미치는지분석한결과, alliin이 H 2 로인해증가된 MMP1의생성을감소시키고 MMP1 유전자의발현량을감소시킨다는것을확인하였다. 현재 in vivo 인체적용시험을통해 alliin을함유한화장료조성물이노화피부및주름을개선할수있는지를확인하는시험을진행중에있다. 위의내용을종합하여주름개선용기능성화장품소재로서 alliin의활용가능성을제시하는바이다. 김나영, 문지선, 최태부. 자외선을조사한인간섬유아세포에서황금추출물과황금주요플라보노이드성분이 MMP-1 발현에미치는영향. 대한피부미용학회지, 11: , 김선희, 전승철, 홍양희. 흑마늘화장품의주름개선및미백에대한피부미용효과. 한국미용학회지, 15: , 김영주. Centella asiatica 추출물의인간진피섬유아세포에서 H 2 로유도된세포노화에대한조절작용. 건국대학교박사학위논문, 배인순. 황백열수추출물의피부노화억제효과및화장품소재활용에관한연구. 계명대학교박사학위논문, 강원식, 이윤희, 정현희, 강민경, 김택중, 홍진태, 윤여표. 녹차카테킨이지질과산화및 superoxide dismutase에미치는영향. 한국식품위생안전성학회지, 16: 41-47, 김나미, 구본석, 이성계, 황의일, 소승호, 도재호. 홍삼성분이섬유아세포의콜라겐합성과 MMP-1 활성에미치는영향. 고려인삼학회지, 31: 86-92, 김지은. 인체피부섬유아세포에서열자극에의해유도되는 type I procollagen, MMP-1과 TIMP-1 발현에대한녹차추출물 (epigallocatechin-3-gallate) 의효과. 고려대학 교석사학위논문, 박애영. 마늘추출물의항균성과두피건강에미치는영향. 성신여자대학교석사학위논문, 손명수, 송지혜, 김종식, 장해동, 김교남. 홍삼에서추출한오일의항산화및보습활성. 대한피부미용학회지, 11: , 이민호, 김형진, 정현아, 이영근. 진피섬유모세포에서대복피추출물의세포외기질합성촉진효과. 한국산학기술학회논문지, 14: , 윤혜영. 마늘추출물로제조한화장품의여드름억제효과에관한연구. 조선대학교석사학위논문, 전지민, 최성규, 김윤정, 장수진, 천종우, 이현상. 유산균발효에의한인삼열매추출물의항산화및항노화효과. 대한화장품학회지, 37: 75-81, 최현경. 인체피부세포를이용한라비지아추출물의항노화효능에관한연구. 동국대학교석사학위논문, 한상미, 이광길, 홍인표, 김원태, 조윤희. 산화적스트레스에대한국내산로얄제리의신경세포보호효과. 한국양봉학회지, 26: , Ariga T, Seki T. Antithrombotic and anticancer ettects of garlic-derived sulfur compounds: a review. Biofactors., 26: , Banerjee SK, Maulik Sk. Effect of garlic on cardiovascular disorders. Nutr. J., 19: 1-4, Castanet J, Ortonne JP. Pigmentary changes is aged and photoaged skin. Arch. Dermatol., 133: , Chow HH, Hakim IA, Vining DR, Crowell JA, Tome ME, Ranger-Moore J, Cordova CA, Mikhael DM, Briehl MM, Alberts DS. Modulation of human glutathione S-transferases by polyphenone intervention. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev., 16: , Chung JH. Photoaging in Asians. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., 19: , Fisher GJ, Datta SC, Talwar HS, Wang ZQ, Varani J, Kang S, Voorhees JJ, Molecular basis of sun-induced premature skin ageing and retinoid antagonism. Nature, 379: , Hachiya A, Sriwiriyanont P, Fujimura T, Ohuchi A, Kitahara T, Takema Y, Kitzmiller WJ, Visscher MO, Tsuboi R, Boissy RE. Mechanistic effects of longterm ultraviolet B irradiation induce epidermal and dermal changes in human skin xenografts. Am. J. Pathol., 174: ,

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