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1 Journal of the Korean Ceramic Society Vol. 45, No. 10, pp. 618~624, Effects of Macrophage on Biodegradation of β-tricalcium Phosphate Bone Graft Substitute Young-Hee Kim, Anirban Jyoti, In-Sun Byun, Ik-Hyun Oh***, Young-Ki Min**, Hun-Mo Yang**, Byong-Taek Lee*, and Ho-Yeon Song Department of Microbiology, School of Medicine, Soonchunhyang University, Cheonan , Korea *Department of Biomedical Engineering & Materials, School of Medicine, Soonchunhyang University, Cheonan , Korea **Department of Physiology, School of Medicine, Soonchunhyang University, Cheonan , Korea ***Korea Institute of Industrial Technology (KITECH), Gwangju Research Center, Gwangju , Korea (Received September 26, 2008; Accepted October 14, 2008) sƒ β-tricalcium Phosphate w e w ½ ÁAnirban JyotiÁ Á x***á»**á z **Á k*á y w w w w * w w w œw ** w w w w ***w» Ÿ l ( ; ) ABSTRACT Various calcium phosphate bioceramics are distinguished by their excellent biocompatibility and osteoconductivity. Especially, the exceptional biodegradability of β-tcp makes it a bone graft substitute of choice in many clinical applications. The activation of osteoclasts, differentiated from macrophage precursor cells, trigger a cell-mediated resorption mechanism that renders β-tcp biodegradable. Based on this evidence, we studied the biodegradation process of granular-type β-tcp bone graft substitute through in vitro and in vivo studies. Raw cells treated with RANKL and M-CSF differentiated into osteoclasts with macrophage-like properties, as observed with TRAP stain. These osteoclasts were cultured with β-tcp nano powders synthesized by microwaveassisted process. We confirmed the phagocytosis of osteoclasts by observing β-tcp particles in their phagosomes via electron microscopy. No damage to the osteoclasts during phagocytosis was observed, nor did the β-tcp powders show any sign of cytotoxicity. We also observed the histological changes in subcutaneous tissues of rats implanted with granule-type β-tcp synthesized by fibrous monolithic process. The β-tcp bone graft substitute was well surrounded with fibrous tissue, and 4 months after implantation, 60% of its mass had been biodegraded. Also, histological findings via H&E stain showed a higher level of infiltration of lymphocytes as well as macrophages around the granule-type β-tcp. From the results, we have concluded that macrophages play an important role in the biodegradation process of β-tcp bone graft substitutes. Key words: Bone graft substitute, β-tcp, Biodegradation, Macrophage 1. w» w x,, x, z e w xk š. ƒ» w ù ƒ j w w ƒ,» w ƒ y šm ƒw. ƒ j w, Ÿ Corresponding author : Ho-Yeon Song songmic@sch.ac.kr Tel : Fax : q x ü w ú. w w» w, w ey œ w š. 1,2)» g 3 ƒ» w wš w. w» 3) 70% y qk p (hydroxyapatite, HAp) β-tcp (β-tricalcium phophate) Ca/P e 4)» yw w» 3,5) s š,, ww t y. t e 6,7) 618

2 HAp β-tcp š. w β-tcp w w ù8-13) HAp w» ƒ w ƒ š. β-tcp» š x ƒ j» w œ x β-tcp w., microwave assisted process 14) w sƒ β-tricalcium Phosphate w e w nm w x β-tcp w. w β-tcp w, œ mw œ x β-tcp w.» j ƒ, e š ü e w w w w w, w w w. s(osteoblast)ù s(osteocyte) w x q s(osteoclast) w ³ x w w w w. 15,16) w w w q s monocyte/ macrophage s l M-CSF (macrophage colony stimulating factor), RANKL w y s w mw s p s w w s(multinucleated giant osteoclast) x w. 17,18) β-tcp ù w q s s œ 19) w œ x β-tcp ü w w sƒ β-tcp w w e š w x x β-tcp 14) j q (microwave assisted process) w w œ w. w, Ca(OH) 3 H 3 PO 4 w j q w ph w w w β-tcp yw w w š, j»ƒ 100 nm w x β- TCP w. w w β-tcp w, œ œ x β-tcp w s q s Raw s 10% k x (fetal bovine serum; Hyclone) 1% w³ (100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, Gibco)ƒ sw Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM; Gibco) w. 100 nm w β-tcp š» ³ 121 C 15 ³ w» o (dryoven) 24 k z, 0.1 mg/ml 10% k x ƒ DMEM w xk k z β-tcp xk ƒƒ 10 w s w. 24 well» ƒ well s w 37 o C, 5% CO 2» w. x PBS (phosphate buffer saline) 2z w. sw q s w w Tartrate-resistant acid phosphate (TRAP) Raw s RANKL (50 ng/ml) M- CSF (30 ng/ml) w q s y TRAP mw y w. w, 24-well cells/well s wš y w 7 w. y ƒ sw 2 w. PBS (ph 7.4) w s 2% glutaraldehyde 15 š w. TRAP acid phosphatase, leukocyte kit (Sigma-Aldrich) w w w Scanning electron microscopy (SEM) Scanning electron microscopy (SEM) w q s y xkw y w» w β-tcp wì d Raw s 2% glutaraldehyde 2 š w z, 0.1 M PBS 1% OsO zš w. s 0.1 M PBS (ph 7.4) 10 3z w z 50 ~ 100% k k g. hexamethyldislazene (sigma) w š, r rl w gqw z SEM (JSM-541-LV, JEOL) w Transmission electron microscopy (TEM) TEM w q s s w» w β-tcp wì w s 2.5% glutaraldehyde š 2ml ƒw z 4C 2 o š w š 1% OsO z š w. s 0.1 M PBS (ph 7.4) 10 3 z w z 50 ~100% k k g. s w microtube ¼ z g propylene oxide 1:1 yww prophylene oxide ƒw 20 w. Prophylene oxide 45«10y(2008)

3 김영희 Anirban Jyoti 변인선 오익현 민영기 양훈모 이병택 송호연 620 Fig. 1. Microstructure of β-tcp particles and granule: (a) β-tcp nano powder fabricated by microwave assisted process. (b) β-tcp granule fabricated by fibrous monolitic process. araldite mixture (araldite epoxy resine ml+ddsa 48 ml+dmp %)의 1:1 혼합액에서 2시간 동안 정 치시킨 뒤 새로운 혼합액으로 교환하여 12시간 동안 실 온에서 정치시켰다. 세포들을 다시 캡슐로 옮긴 후 araldite 혼합액을 채워 60 C에서 2~3일 동안 중합시킨 후 전자 현미경용 절편을 만들었다. LKB-V ultratome으로 1 µm 두 께의 절편을 만들어 toluidine blue로 염색하여 광학현미 경으로 세포 부위를 확인한 후 60~70 nm 두께로 초박절 편을 만들었다. 각각의 절편들은 전자현미경(JEM 100 CXII)으로 관찰하였다. o 실험동물 및 피하 내 이식 실험동물은 7주령의 수컷 Sprague-Dawley (SD) 랫트 18 마리를 사용하여, 랫트의 등 피하조직에 다중압출공정에 의해 제조된 β-tcp 과립을 이식하였다. β-tcp 과립의 이 식 수술은 ether로 전신 마취를 시킨 후, 70% 에탄올과 베타딘으로 등을 소독하여 2 cm 정도를 절개한 후 피하 조직에 멸균된 시편을 삽입하고 봉합하였다. 삽입 후 1, 4, 8, 16주에 랫트를 살 처분하여 시간에 따른 피하조직 내 이물 반응과 β-tcp 과립의 생분해 과정을 해부현미경 과 H&E 염색법을 통해 관찰하였다. 또한, 이들 뼈이식제 의 생분해 과정이 대식세포와 어떤 관련성이 있는지를 관 찰하였다. 3. 결과 및 고찰 생체적합성이 우수하고 생분해 특성이 있어 인공 뼈 이 식제로 많이 사용되고 있는 β-tcp의 기계적 강도 및 골 유도 특성을 증가시키기 위해 β-tcp 나노분말을 이용하 여 과립형의 다공성 뼈이식제를 제작하였다. β-tcp 원료 분말의 합성은 기존에 사용하는 합성법과 는 다른 새로운 방법인 마이크로파(microwave assisted process)를 이용하여 초기 출발물질인 Ca(OH) 와 H PO 로 부터 ph를 조절함으로서 입자 크기가 100 nm 이하의 구 3 한국세라믹학회지 3 4 형 β-tcp 분말 원료를 제조하였다(Fig. 1(a)). 일반적인 wet-reaction 법을 사용하면 침상형의 HAp가 합성되는데 비해 마이크로파를 이용하여 합성하면 ph 조건을 조절함 에 따라 HAp와 β-tcp의 상 비를 조절할 수 있으며, submicron이 아닌 나노 크기의 구형 분말을 합성할 수 있었 다. 이렇게 합성한 나노 β-tcp 분말을 이용하여, 다중압 출공정을 거쳐 다공성의 β-tcp 과립을 제작함으로써 βtcp의 단점인 기계적 강도를 높일 수 있었다. 또한, 다공 성 β-tcp 과립을 SEM으로 관찰한 결과 200 µm의 균일 한 기공을 가지고 있어 뼈모세포의 성장을 위한 최적의 기공 크기인 200~300 µm를 구현하였다(Fig. 1(b)). 파골세포는 골 조직에서 뼈의 흡수에 관여하는 존재하 는 유일한 다핵세포이다. TRAP 염색은 기질인 naphtol AS-MX phosphate와의 반응 산물을 Fast red LB로 염색하 여 확인하는 방법으로 다핵의 파골세포를 관찰함으로써 Raw 세포가 포식기능을 갖는 파골세포로 분화됨을 확인 할 수 있다. Raw 세포의 배양액에 RANKL (50 ng/ml)과 M-CSF (30 ng/ml)를 처리하여 7일간 배양 후, TRAP 양성인 세포를 관찰하였다. 그 결과, 아무것도 처 리하지 않은 대조군에서는 TRAP 양성인 세포가 관찰되 지 않는 반면(Fig. 2(a)), RANKL과 M-CSF를 처리한 군 에서는 TRAP 양성인 세포들이 많이 관찰되었다(Fig. 2(b)). 또한, β-tcp 분말과 같이 배양한 군에서도 TRAP 양성인 세포들이 관찰되었다(Fig. 2(c)). 이렇게 분화된 Raw 세포의 파골세포로의 분화 및 형태학적 변화를 자세하게 관찰하기 위해 SEM으로 관찰하였다. 그 결과, 대조군에 서는 작고 동글한 조약돌 형태로 여러층으로 자라는 전 형적인 Raw 세포를 관찰할 수 있었다(Fig. 3(a)). 반 면, RANKL과 M-CSF를 처리한 군에서는 대식세포 특유 의 납작하고 여러세포들이 융합된 거대세포(multinucleated giant cell)들이 관찰되어(Fig. 3(b), 3(c)) Raw 세포 들이 포식기능을 갖는 파골세포로 잘 분화되었음을 확인 하였다. 분화를 유도시킨 파골세포에서의 포식작용을 관 찰하기 위해 세포들을 β-tcp 분말과 함께 배양한 후, 20,21)

4 대식세포가 β-tricalcium Phosphate 뼈이식제의 생분해에 미치는 영향 Fig. 2. Fig Inverted microscopic images of differentiated Raw cells; (a) control Raw cells, (b) TRAP positive osteoclast-like cells (arrows) treated with RANKL and M-CSF, (c) TRAP positive osteoclast-like cells cultured with nano powders of β-tcp. d) Number of TRAP positive osteoclast-like cells. Scanning electron microscopic images of differentiated Raw cells; (a) control Raw cells, (b) TRAP positive osteoclast-like cells treated with RANKL and M-CSF, (c) TRAP positive osteoclast-like cells cultured with nano powder of βtcp. TEM으로 관찰하였다. 대조군과 실험군 세포 모두에서 정 상형태의 미토콘드리아 및 기타 세포 소기관들이 관찰되 는 것으로 보아 파골세포는 정상적으로 분화 성장된 것 으로 판단된다. 대조군의 파골세포에서는 정상적인 대식 세포 내 구조물과 함께 내부가 비어있는 phagosome을 관 찰 할 수 있었다(Fig. 4(a)). 반면 β-tcp 분말과 함께 배 양된 세포군에서는 많은 β-tcp 분말 및 분해산물들이 phagosome 내에서 관찰되었는데(Fig. 4(b)) 이는 파골세포 의 포식작용에 의한 것으로 사료된다. 이는 파골세포가 뼈모세포와는 달리 대식세포의 일종으로 근본적으로 이 물질을 쉽게 포식하여 제거하는 특성을 가지고 있어 β-tcp의 생분해 과정에서 생기는 적은 수의 뼈 이식제 입자는 세포막의 손상 없이 세포내로 포식할 수 있고 포 식된 입자에 의한 세포내 소기관들의 손상도 유도되지 않 은 것으로 사료된다. 랫트의 피하에 이식된 과립형 β-tcp 뼈이식제의 조직 내 이물 반응과 시간경과에 따른 생분해 정도를 관찰하 였다(Fig. 5). 이식된 β-tcp 뼈 이식제는 섬유조직으로 잘 둘러싸여져 있었고, 시간이 지남에 따라 생분해되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5(b), 5(c)). 특히, 이식 4개월 후의 22,23) 제 45 권 제 10호(2008)

5 김영희 Anirban Jyoti 변인선 오익현 민영기 양훈모 이병택 송호연 622 Fig. 4. Fig. 5. Transmission electron microscopic images of osteoclast-like Raw cells cultured with the suspension of β-tcp nano powder: (a) control Raw cells: (b) Raw cells cultured with nano powder of β-tcp. P: phagosome; N: nucleus; M: mitochondria; β-tcp; β-tcp debries. Photographs of implanted porous β-tcp granules into subcutaneous tissue of rat. (b) After 4 weeks, the porous bodies were fully covered with fibrous tissue (c) After 16 weeks, implanted porous β-tcp granules were markedly degraded. 뼈 이식제의 경우 60% 이상의 질량 감소가 있었고 특히 바깥쪽의 기공을 확인할 수 없을 정도로 가장자리부터 중 앙으로 생분해 되어 들어감을 확인하였는데, 이는 가장자 리 부분이 이물 반응에 관여하는 세포들에 노출될 기회가 많았기 때문으로 생각된다(Fig. 5(c)). 또한 이식된 뼈 이식 제 주위의 조직을 H&E 염색을 하여 관찰하였다. 대조군 에서는 아무런 염증 반응이 관찰되지 않은 반면(Fig. 6(a)) 이식 1주째에는 이물 반응(foreign body reaction)에 관여 하는 다핵거대세포(multinucleated giant cells) 및 대식세포 의 부분적 침윤이 관찰되었다(data not shown). 이식 4주 째의 조직학적 소견상, 이물반응에 관여하는 다핵거대세 한국세라믹학회지 포, 대식세포 및 림파구의 침윤이 가장 많이 관찰되었다. 또한 이식 4개월 후에는 뼈이식제 분해산물로 보이는 이 물들이 많이 관찰되었고 이들 주위로 많은 수의 다핵거 대세포들이 관찰되었으나 만성 염증세포들은 감소하는 양 상을 보였다(Fig. 6(c)). 4. 결 론 본 연구에서는 생체적합성이 우수하며 인체 뼈를 구성 하는 무기 성분 중 하나인 β-tcp 나노분말을 합성한 뒤 다중압출공정을 통해 β-tcp 뼈 이식제의 단점인 낮은 기

6 대식세포가 β-tricalcium Phosphate 뼈이식제의 생분해에 미치는 영향 Fig Histological findings (H&E stain) of subcutaneous tissue implanted with porous β-tcp granule. (a) Control, no inflammatory reaction was observed. (b) 4 weeks after implantation, the cells in regard to foreign body reaction were markedly infiltrated around the porous body. (c) 4 months after implantation, debris of β-tcp granules were observed around β-tc granule. (d) Infiltration of many macrophages and lymphocytes were observed at 4 weeks post-operation. M: marcrophage; D: debries of β-tcp granule. 계적 강도를 개선하였고, 뼈세포 및 모세혈관의 형성유도 에 적합한 200~250 µm 크기의 3차원 기공으로 이루어져 뼈의 우수한 재생을 유도하는 다공성의 과립형 β-tcp을 제조하였다. β-tcp 뼈이식제의 생분해 과정에서 발생할 수 있는 βtcp 미세입자 및 분해 산물들이 어떻게 처리되며 세포독 성이 없는지를 관찰하기 위해 마이크로파 합성법으로 제 조한 β-tcp 분말을 대식세포로 분화된 파골세포와 함께 배양하여 관찰하였다. 파골세포로 분화된 세포들은 대식 세포 특유의 납작하고 여러 세포들이 융합된 거대세포 (multinucleated giant cell)들로 관찰되었고 파골세포의 phagosome 내에 포식된 β-tcp 입자들이 많이 관찰되었 다. 그러나 파골세포의 미토콘드리아 및 기타 세포 내 소 기관들이 정상 형태를 유지하고 있는 것으로 보아 β-tcp 분말 자체의 세포독성이나 포식과정에서 올 수 있는 세 포 손상은 발견되지 않았다. 또한 다공성의 β-tcp 과립 을 쥐의 피하조직에 이식한 후 시간 경과에 따른 생분해 변화를 관찰한 결과, β-tcp 뼈이식제는 섬유조직으로 잘 둘러싸여져 있었고, 이식 4개월 후에는 다공질체의 바깥 쪽 기공을 확인 할 수 없을 정도로 분해되어 질량대비 60% 이상의 생분해가 진행되었다. 또한, 이식체 주위의 피하조 직을 H&E 염색을 통해 조직학적으로 관찰한 결과, 과립 형 β-tcp 주변에 이물 반응 및 포식작용에 관여하는 대 식세포 및 림프구의 침윤이 증가되어 있었다. 이상의 파골세포 및 동물 실험의 결과로 미루어 보아, β-tcp 뼈이식제의 생분해 과정에 포식기능을 갖는 대식 세포가 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. Acknowledgment 본 연구는 산업자원부 지역혁신센터 사업비의 지원을 받아 수행되었음(MOCIE-RIC 60605). REFERENCES 1. P. Ducheyne, Q. Qiu, Bioactive Ceramics: the Effect of Surface Reactivity on Bone Formation and Bone Cell Function, Biomaterials, (1999). 2. J.E. Lee, J.C. Park, Y.H. Kim, and H. Suh, In vitro Evaluation of PEG Modified Polyurethanes in Cellular Toxicity, Biomet. Res., [2] 65-8 (1998). 3. H. S. Kang, Histology First Edition, pp , Komoonsa, Korea, S. A. Park, J. W. Shin, et al In Vitro Study of Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells on Heattreated Porcine Trabecular Bone Blocks., Biomaterials, 제 45 권 제 10호(2008)

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