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지윤 진
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1 대한내분비학회지 : 제 21 권제 2 호 2006 원저 그레이브스병에서공동자극분자인 4-1BB 와 4-1BBL 의역할연구 울산대학교의과대학내과학교실, 울산대학교병원생의과학연구소 1 김은숙 정효원 1 남궁일성 우순주 최정일 1 김영일 Expression of 4-1BB and 4-1BBL in Graves Disease Eun Sook Kim, Hyo Won Jung 1, Il Sung Nam-Goong, Soon Joo Woo, Jung Il Choi 1, Young Il Kim Department of Internal Medicine, Ulsan University Hospital, College of Medicine; and Biomedical Research Center, Ulsan University Hospital 1 ABSTRACT Background: 4-1BB mediated costimulatory signal is a recently identified immunotherapeutic strategy for treating autoimmune diseases without depressing the immune response. In this study, we investigated the expression of 4-1BB and 4-1BBL on the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and we assessed whether the serum levels of soluble (s) 4-1BB and s4-1bbl in the patients with Graves' disease (GD) and compared them with normal subjects. Methods: Expression of 4-1BB and 4-1BBL on PBMC of GD patients was determined by flow cytometry. The concentrations of s4-1bb and s4-1bbl were assessed in the sera of GD patients by performing ELISA. Results: 4-1BB was constitutively expressed on naive CD4 + and CD8 + T cells of the GD patients and this was increased by stimulation. 4-1BBL was also expressed on the antigen-presenting cells such as CD19 + B cells, monocytes and dendritic cells in GD patients. The serum levels of s4-1bb and s4-1bbl were significantly higher in GD patients than those in controls, and these levels were significantly correlated with the serum levels of thyroid-binding inhibitory immunoglobulin and free T4. Conclusion: These results indicate that effector T cells of GD patients can be activated through the 4-1BB-mediated costimulatory signal. Elevated s4-1bb and s4-1bbl levels in the sera of GD patients may affect modulation of the clinical course in GD patients. (J Kor Soc Endocrinol 21:116~124, 2006) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: Costimulatory molecule, Graves' disease, 4-1BB, 4-1BBL 2) 서론정상적인면역반응의항상성은자가항원에반응하는자가반응성 T 세포를제거함으로써이루어지는데, 이러한조절기전이실패할경우자가면역질환이발병하게된다 [1]. 그레이브스병은갑상선여포세포막의갑상선자극호르몬접수일자 : 2005 년 7월 5일통과일자 : 2005 년 11월 7일책임저자 : 김영일, 울산대학교의과대학내과학교실 * 이논문은 2004년도울산대학교의연구비에의하여연구되었음. (thyroid stimulating hormone, TSH) 수용체에대한자가항체가생겨 TSH와같은양상으로수용체결합후갑상선을자극하여갑상선여포세포의증식과갑상선호르몬의과잉생산을일으키는, 자가항원에대한항상성조절기전실패에의한갑상선특이자가면역질환이라할수있다 [2~4]. 하지만아직어떠한기전으로자가항원이인지되어이에대한자가항체가생성되는지는분명하지않다. 사람의면역조절은면역반응과정에필요한여러단계의신

2 - 김은숙외 5인 : 그레이브스병에서공동자극분자인 4-1BB와 4-1BBL의역할연구 - 호전달을통해이루어지지만일단항원제시세포에의해항원이포획된후 T 세포수용체에제공되면서시작된다. 이후 T 세포표면에존재하는다양한공동자극분자들 (costimulatory molecules) 에의한이차적인신호전달이이루어짐으로써 T 세포활성화가이루어지게된다 [5]. 공동자극분자들에의한신호전달은세포분열, 세포생존및사이토카인분비와같은세포의실질적인기능을유발시키는데매우중요한역할을하며, 만약이경로가차단될경우 T 세포는무반응 (anergy) 상태에빠지거나제거과정에접어들어곧사멸됨으로써정상적인면역반응을유발하지못하게된다. 대표적인공동자극분자로는 CD28, inducible T-cell costimulator 및종양괴사인자 (tumor necrosis factor, TNF) 계열의여러분자들이있으며, 특히 OX40-OX40 리간드 (ligand, L), 4-1BB (CD137)/ 4-1BBL (CD137L), CD27, CD70, CD30-CD30L 및 herpervirus entry mediator 등이중요한 T 세포조절자로알려져있다 [6,7]. 4-1BB는종양괴사인자수용체계열의유도성 T 세포공동자극분자로서 B 세포, 대식세포및수지상세포와같은전문적인항원제시세포에서주로발현되는 4-1BBL와의상호작용을통해 T 세포활성화와기억을유도함으로써면역반응을조절한다 [8]. 4-1BB의경우 collagen-induced arthritis, experimental autoimmune encephalomyelitis와같은동물질병모델에서 anti-4-1bb 항체처리가자가반응성 T 세포의기능을억제시킴으로써자가면역질환치료에효과적인것으로보고되고있으며, 4-1BB를통한신호전달을효과적으로이용하는새로운면역치료방법이최근적극적으로개발되고있는추세이다 [9~12]. 본연구에서는그레이브스병환자를대상으로말초혈액에서 4-1BB와 4-1BBL의발현특성을조사하고그레이브스병의병태생리에서의역할을규명하고자하였다. 대상및방법 1. 대상 2004년 4월부터 12월까지울산대학교병원에내원하여처음그레이브스병으로진단받은환자 20명을대상으로하였고건강한정상인 20명을대조군으로하였다. 그레이브스병의진단은갑상선중독증의증상과갑상선호르몬검사, TSH 수용체항체 (TSH binding inhibitor immunoglobulin, TBII), 갑상선글로불린과갑상선과산화효소에대한자가항체검사그리고갑상선스캔검사등을통하여진단하였고, 내원당시항갑상선제를복용하고있거나재발된경우는제외하였다. 환자들의임상적특성은 Table 1에나타내었다. 그레이브스병환자와정상대조군의말초혈액은본원윤리위원회규정에따라환자동의후 heparinized vacutainer (BD PharMingen, Mountain View, CA, USA) 에 10 ml씩수집하였으며혈청은분리후즉시냉동 (-70 ) 보관하였다. 2. 세포분리와배양수집된각그룹의말초혈액으로부터 Ficoll-Hypaque 용액 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) 을이용한밀도구배원심분리법에의해단핵세포를분리하였다. 분리된단핵세포는 1 phosphate-buffered saline (PBS) 로 2번세척한다음 PBMC/mL씩 10% fetal bovine serum (FBS) 과항생제가첨가된 RPMI 1640 배지와함께 24-well 배양접시에분주하여 CO 2 세포배양기 (37, 5%) 에 24시간배양하였다. 세포의활성화를위해 anti-cd3 mab (OKT3; 1 μg/ml) 와 lipopolysaccharide (LPS; 5 μg/ml) 를함께처리하였다. 단핵구를분리하기위해단핵세포를 2시간배양한후배양접시바닥에붙어있는세포들을수거하였으며, 96.9% CD14 + 단핵구가분리되었다. 또한분리된단핵구의일부를 GM-CSF (100 U/mL) 와 IL-4 (1,000 U/mL) 를 2일간격으로 3번처리한후, TNF-α (500 U/mL) 를 1회처리하여수지상세포로분화시켰다. 완전히분화된수지상세포의순도는 98.9% CD11c + 로나타났다. 3. 유세포분석 (Flow cytometry) 그레이브스병환자와정상인의말초혈액으로부터분리한단핵세포에서 4-1BB, 4-1BBL의발현특성을조사하기위해유세포분석을실시하였다. 먼저단핵세포 ( cells/ml) 활성화를위해 OKT3 1 μg/ml와 LPS 5 μg/ml를처리하여 24시간배양한다음, 각세포를수거하고 BSA (2%) 와 NaN 3 (0.1%) 가첨가된 1 PBS (washing buffer) 를이용하여 2번세척하였다. 이를 FITC-labelled anti-4-1bb mab 또는 anti-4-1bbl mab와 PE-labelled CD4 mab, CD8 Age (years) Table 1. Clinical characteristics of each study group Gender TBII (%) free T4 (ng/dl) TSH (μu/ml) TPOAb (IU/mL) TgAb (IU/mL) Reference Value N F M Graves' Disease ± ± 17.3* 6.43 ± 2.39* 0.01 ± 0.00* 466 ± 358* 304 ± 683 Control ± ± ± ± ± ± 3.4 TBII, thyroid binding inhibitory immunoglobulin; TgAb, antibodies to thyroglobulin; TPOAb, antibodies to thyroid peroxidase. * P < 0.05 vs. control

3 - 대한내분비학회지 : 제 21 권제 2 호 mab (T cell markers) 또는 CD19 mab (B cell marker) 로 4 에서 30분간이중염색하였다. 염색된세포를 washing buffer로 3번세척하여염색되지않은항체를제거한다음, T 세포에서의 4-1BB와 4-1BBL의발현을 SSC/FSC gate의 lymphocytes population에서관찰하였으며, 결과는 Cell Quest software (BD Biosciences) 를이용하여분석하였다. 4. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 혈청으로부터 soluble (s) 4-1BB와 s4-1bbl를검출하기위해 ELISA를실시하였다. 먼저 ELISA microtiter plates (Nunc Maxisorb ELISA plate) 를 1 μg/ml anti-4-1bb mab (AB 4815, Immunomics, Co. Ulsan, Korea) 또는 anti-4-1bbl mab (AB 5G11; Immunomics) 가들어있는 0.05M NaHCO 3 용액으로 4 에서 overnight coating하였다. 이를 0.1% Tween 20이첨가된 washing buffer로 3회세척한후비특이반응을줄이기위해 4% BSA 용액으로실온에서 1시간동안 blocking 하였다. 혈청은 washing buffer를이용하여 2배로희석한다음 blocking이끝난 plate에 100 μl씩 3회반복하여넣은후 4 에서 overnight 하였다. 이를다시 3 회세척한후 detecting anti-4-1bb mab 또는 anti-4-1bbl mab가들어있는 1% BSA-1 PBS를넣어실온에서 2시간반응시켰다. Plate를 3회세척한다음, 1% BSA-1 PBS를이용하여 1/5000배로희석된 HRP-straptavidin 용액을넣고 3 7 에서 1시간반응시켰다. 이를다시 3회세척하고 TMB peroxidase substrate (Endogen, BD Bioscience) 을넣어 15 분간기질반응시킨다음, 0.1 N H 2SO 4 용액으로반응을정지시켰다. 반응결과는 OD 450 nm 흡광도에서발색농도를측정하였으며, 양성대조군으로 1 μg/ml의 purified human recombinant 4-1BB-Fc 또는 4-1BBL-Fc (PeproTech, Inc. Rocky Hill, NJ) 를이용하여농도값 (pg/ml) 을환산하였다. 제조된 ELISA kit의검출한계는 4-1BB와 4-1BBL 모두 20 pg/ml이었다. 5. 임상진단 TBII (%), free T4 (ng/dl) 및 TSH (μu/ml) 의혈청농도는시판되는 ADVIA Centaur kits (Bayer, USA) 를이용하였으며, TPOAb (antibody to thyroid peroxidase) (IU/mL) 와 TgAb (antibody to thyroglobulin) (IU/mL) 의역가는 IMMULITE 2000 kit (DPC, LA, US) 를이용하여 positive agglutination 정도를측정하였다. 6. 통계처리단핵세포에서의 4-1BB와 4-1BBL의발현율및혈청내 s4-1bb와 s4-1bbl의농도측정에대한모든실험은 3회이상반복실험하였으며, 통계적인방법은 SPSS 프로그램 (SPSS inc, Chicago, IL) 의 one-way ANOVA를통해유의성을검정하였고, P < 0.05시유의한차이가있는것으로인정하였다. 또한 s4-1bb와 s4-1bbl의상호연관성및갑상선기능검사와의연관성을 linear regression test를이용하여분석하였다. 결과 BB 와 4-1BBL의발현특성 4-1BB의발현은대조군의경우, anti-cd3 mab (OKT3) 에의해활성화된단핵세포에서만관찰된반면 (mean ± SD; ± 5.71%), 그레이브스병환자군은비활성단핵세포에서발현이관찰될뿐아니라 (3.61 ± 3.18%; P < 0.01), 활성화후발현율이대조군에비해더욱증가 (20.56 ± 8.26%) 하였다 (Fig. 1A; P < 0.01). 또 4-1BB는그레이브스병환자군과대조군모두 CD4 + T 세포및 CD8 + T 세포에서만제한적으로발현되었다 (Fig. 2). 4-1BBL의발현은대조군의경우는비활성단핵세포에서낮은비율로발현되었으며 (3.20 ± 1.91%) 활성화후증가되었다 (11.59 ± 6.19%). 그레이브스병환자군은대조군에비 A B Fig. 1. Expression levels of 4-1BB and 4-1BBL on PBMC of the patients with Graves' disease (GD). Naïve PBMC were activated with 1 μg/ml of anti-cd3 mab and 5 μg/ml of LPS for 24 hr. Expression levels of 4-1BB (A) and 4-1BBL (B) on PBMC of patients with GD were analyzed by flow cytometry compared with control group

- 김은숙외 5인 : 그레이브스병에서공동자극분자인 4-1BB와 4-1BBL의역할연구 - 해비활성단핵세포에서높은발현율 (11.66 ± 6.66%; P < 0.0001) 을나타내었으며활성화후발현율이증가하였다 (15.56 ± 8.64%)(Fig. 1B).

4 - 김은숙외 5인 : 그레이브스병에서공동자극분자인 4-1BB와 4-1BBL의역할연구 - 해비활성단핵세포에서높은발현율 (11.66 ± 6.66%; P < ) 을나타내었으며활성화후발현율이증가하였다 (15.56 ± 8.64%)(Fig. 1B). 4-1BBL의발현은 CD19 + B 세포, 단핵구및수지상세포와같은항원제시세포에서주로관찰되었으며, 대조군에비해 (Fig. 2A, 2B), 그레이브스병 환자군이높게발현되었다 (Fig. 2C, 2D). 2. 수용성 4-1BB 와 4-1BBL s4-1bb는대조군 ( ± 72.04%) 에비해그레이브스병환자군에서현저히높게 ( ± %; P < 0.05) A B C D Fig. 2. Expression patterns of 4-1BB and 4-1BBL on PBMC of the patients with Graves' disease. A and C, PE conjugated CD4 + /CD8 + T cells with FITC conjugated 4-1BB/4-1BBL fluorescence dot plots in the lymphocytes population of PBMC with healthy subject (A) and GD patient (C) by two-color cytometry. Square box presents double-positive cell population. B and D, 4-1BBL expression on primary monocytes (Mo) and monocyte-derived dendritic cells (DCs) of healthy subject (B) and GD patient (D) by single-color flow cytometric histogram. The thick lines represent 4-1BBL + cells and the thin lines represent isotype-matched mab as a control

5 - 대한내분비학회지 : 제 21 권제 2 호 검출되었으며, s4-1bbl 역시 s4-1bb와유사하게대조군 (37.61 ± 42.20%) 에비해그레이브스병환자군의혈청에서매우높게 ( ± %; P < 0.01) 검출되었다 (Fig. 3). 또한동일한그레이브스병환자의혈청내에존재하는 s4-1bb와 s4-1bbl의농도는서로양의상관관계를나타내었다 (Fig. 4). 3. 수용성 4-1BB 와갑상선기능검사와의상관관계그레이브스병환자의혈청 s4-1bb의농도는 TBII (P < 0.01; r 2 = 0.425) 및 free T4 농도 (P < 0.05; r 2 = 0.254) 와유의한양의상관관계를보였으며 TSH, TPOAb, TgAb 등의농도와는상관관계가없었다 (Fig. 5A, 5B). 혈청 s4-1bbl의농도역시 s4-1bb의경우와유사하게 TBII (P < 0.001; r 2 = 0.317) 및 free T4 농도 (P < 0.01; r 2 = 0.459) 와양의상관관계를보였다 (Fig. 5C, 5D). 고찰항원이인체외부로부터침입하면인체의면역계는이에즉시반응하여염증반응을일으키는비특이적인반응을유발하게되며, 이후적응면역반응으로이어져외부항원에대한특이적인반응이시작된다. 즉항원제시세포가항원을탐식하여이를다른면역세포인 T 세포에제시하게되는데, 항원을제시받은 T 세포중그항원에특이적인 T 세포수용체를가진 T 세포만이활성화된다. 이과정에서민감성과특이성을동시에갖추지않으면면역기능저하에의한감염이증가하거나, 비특이적인 T 세포반응에의해자가항원에대한면역반응을일으켜면역질환을유발하게된다 [1]. T 세포활성화에는 T 세포표면수용체를통한항원제시세포로부터의항원인식에의한 1차신호전달과더불어공동자극분자들의공동자극신호에의한 2차신호전달이필요하다 [4,6]. 그레이브스병을포함하여전신성홍반성낭창이나류마티스관절염과같은자가면역질환의경우자가반응성 T 세포에서의 cytotoxic T lymphocyte antigen-4 (CTLA-4) 과발현이질환의병태생리와밀접하게관련이있는것으로알려져있다 [13~15]. 그레이브스병은자가면역질환으로알려져있고갑상선기능항진증의가장흔한원인이다. 그레이브스병은 TSH 수용체항체가갑상선여포세포의수용체와결합하여 TSH와동일한기능을발휘함으로써증상을유발하는것으로알려져있으며, 항원특이성 T 세포기능에유전적결함 (HLA- DR3) 이생기는비정상적인체액성면역반응또한그레이브스병을유발하는병인으로알려져있다 [2~4]. 그레이브스병에서자가항원의제시는 B 세포또는수지상세포와같은전문적인항원제시세포및갑상선여포세포와같은비전문적인항원제시세포에의해이루어진다 [3]. 이런 A B Fig. 3. Serum levels of s4-1bb and s4-1bbl in the patients with Graves' disease. s4-1bb (A) and s4-1bbl (B) were assessed in sera of the patients with Graves' disease by ELISA and compared with normal subjects as a control. Fig. 4. Correlation between s4-1bb and s4-1bbl levels in sera of the patients with Graves' disease. The concentrations of s4-1bb and s4-1bbl were measured in sera of the same patients by ELISA

6 - 김은숙외 5인 : 그레이브스병에서공동자극분자인 4-1BB와 4-1BBL의역할연구 - A B C D Fig. 5. Correlation between s4-1bb/s4-1bbl and clinical parameters of the patients with Graves' disease (GD). A, Correlation between s4-1bb and TBII (%) levels in sera of the patients with GD. B, Correlation between s4-1bb and free T4 (ng/ml) levels in sera of GD patients. C, Correlation between s4-1bbl and TBII levels in sera of GD patients. D, Correlation between s4-1bbl and free T4 levels in sera of GD patients. 항원제시세포들은 major histocompatibility complex (MHC) class II, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), CTLA-4, CD40 등과같은분자들을과도하게발현하고있으며, ICAM-1 또는 CTLA-4의발현을차단할경우 T 세포의사멸또는무반응을야기함으로써자가면역반응을약화시킬수있다고한다 [3,4]. 그레이브스안구병증의경우안구후방조직내로의 effector T 세포침입이이루어지는데이는혈관성내피세포및결합조직세포에서의 ICAM-1, VCAM-1, CD44 등의발현과이를통한 TNF-α, IFN-γ의생성에의한것으로이런공동자극분자들의발현이 T 세포활성화에매우중요한역할을하여자가항원의인식을용이하게함으로써병이유발되는것으로알려져있다 [2]. 그레이브스병의경우에도활성화된독성 T 세포에서의 CD30의발현, IgG3 를분비하는세포또는 CD4 + T 세포에서의 CD154 및 CD40 등공동자극분자들의과발현이 T 세포와갑상선여포세포간의상호작용을용이하게함으로써질환유발에기여하는것으로보고있다 [16,17]. 즉자가반응성 T 세포에서의공동자극분자들의발현특성이그레이브스병과같이기관특이적자가면역질환의발병생태와더욱연관성이있다는것이다 [4]. 그레이브스병을대상으로 4-1BB와 4-1BBL 공동자극분자들의발현특성을조사한결과, 그레이브스병환자의말초혈액으로부터분리한단핵세포표면에서의 4-1BB와 4-1BBL 의발현은정상인에비해높게발현되었으며, naïve T 세포 에서도높은발현율을나타내었다. 4-1BB는주로 CD4 + T 세포및 CD8 + T 세포에만발현되는반면, 4-1BBL는 B 세포, 단핵구및수지상세포와같은항원제시세포에서주로발현되었다. 4-1BB와 4-1BBL의상호작용은 T 세포활성화및생존에중요한역할을하는것으로알려져있는데 [9,10], 최근전신성홍반성낭창이나류마티스관절염과같은자가면역질환의경우 4-1BB-매개신호전달을조절함으로써자가항체생성을억제하거나, 자가반응성 CD4 + T 세포의무반응및사멸을유도하여치료에도움이되는것으로보고되었다 [9,11]. 본연구에서는그레이브스병에서 4-1BB와 4-1BBL 가다량발현됨으로써자가반응성 T 세포가 4-1BB 매개신호전달에의해충분히활성화될수있음을알수있었으며, 이는 4-1BB 매개신호전달체계의조절이그레이브스병치료에이용될수있음을의미한다. 종양괴사인자수용체계열의공동자극분자들 (TNFRI, TNFRII, TNFRIII, CD27, CD30, CD40, CD95) 및리간드들은 mrna splicing이나 proteolytic cleavage 등의기전에의해수용성분자들로분비되며 autocrine/paracrine loop를통해순환되고, 특히종양세포성장을유도함으로써많은기관및질병진행에영향을준다 [18]. s4-1bb와 s4-1bbl의경우류마티스관절염, 베체씨병, 다발성경화증및골수이형성증후군등의환자혈청내다량존재하는것으로밝혀졌으며이들의농도가병의심화정도와연관성이있는것으로알려져있다 [19~24]. 본연구에서도그레이브스병환

7 - 대한내분비학회지 : 제 21 권제 2 호 자의혈청으로부터 s4-1bb 및 s4-1bbl의농도및임상증상과의연관성을조사한결과, 정상인에비해현저히높은농도의 s4-1bb와 s4-1bbl가그레이브스병환자의혈청에존재하는것을확인할수있었다. 또한동일환자의혈청내존재하는 s4-1bb와 s4-1bbl의농도는서로유의한연관성을보였다. 그러나세포표면에서발현되는 4-1BB 및 4-1BBL의발현양과는서로비례적인연관성을나타내지는않았다 (data not shown). 이는 s4-1bb와 s4-1bbl가반드시세포표면에서발현되는 4-1BB와 4-1BBL로부터 proteolytic cleavage 기전에의해서유래되는것은아니며, mrna splicing과같은유전자수준에서의서로다른조절이있다는것을암시한다. Michel 등에의하면 s4-1bb는 mrna splicing에의해만들어진다고하였으며 [20], Salih 등은 s4-1bbl의경우세포표면에발현된 4-1BBL로부터 matrix metalloproteinase (MMP) 에의해잘려질수있다고하였다 [21]. Yamada-Okabe 등에따르면, 갑상선호르몬수용체를발현하고있는 Hela 세포 (HeLaTR) 에서 T3 처리에의해 4-1BB 및 TRAF1, PSG7, fmfc 등의유전자발현이현저히증가하였다고하였으며, 특히 4-1BB 발현의증가는 T-세포매개의면역반응을유도할뿐아니라, 갑상선호르몬수용체발현과연관된 T3에의한신호전달경로를매개할수있는것으로보고하였다 [25]. 또한 Seko 등은 Takayasu's arteritis 환자의대동맥조직에서의 4-1BBL, Fas 및 MHC class I chain (MIC)-related A (MICA) 발현증가와 4-1BB, FasL 및 NKG2D receptor를발현하는 T 세포들의침착을확인하였으며, 이들각분자들의상호작용은세포사멸과염증성사이토카인분비에의한만성염증유발을통해혈관손상에기여한다고하였다 [26]. 한편 Salih 등 [22] 은세포표면에서의 4-1BBL 발현량의변화가세포- 세포간상호작용을조절하는데중요한역할을하며, 특히 s4-1bbl 분비는 PMA, anti-igm, anti-cd40 등의외부자극에의해현저히증가되어백혈병환자의 T 세포를통한공동자극신호에영향을미치게되어질병부위에존재하는 T 세포의급격한사멸을유도함으로써질병발달에기여한다고하였다. 또한류마티스관절염환자의경우혈청내고농도의 s4-1bb가존재하며 rheumatoid factor (RF) 농도와유의한연관성이있고 scd95 증가와함께관절조직내염증반응을가속화시킴으로써병의진행에기여하는것으로보고되었다 [23,24]. 본연구에서는그레이브스병환자의경우정상인에비해높은 4-1BB 및 4-1BBL의발현및혈청내다량의 s4-1bb 및 s4-1bbl가존재하며이는특히 TBII 및 free T4 농도와유의한상관관계가있는것으로나타났다. 따라서그레이브스병환자의경우 4-1BB 및 4-1BBL 발현의과도한증가가자가반응성 T 세포와같은항원특이적 T 세포의활성화에기여하게되며, 갑상선여포세포와같은질병연관세포들과의상호작용을용이하게함으로써자가면역질환과같은 비정상적인면역반응을유발시킬수있는것으로보인다. 또한혈청내다량존재하는 s4-1bb 및 s4-1bbl는염증성사이토카인분비를자극함으로써기관특이적자가면역질환의진행에기여하는것으로생각된다. 그러나과도한 4-1BB- 4-1BBL 매개의신호전달이어떻게그레이브스병의병태생리와연관되는지에대해서는앞으로지속적인연구가진행되어야할것이며, 이런 4-1BB 매개신호전달의조절을이용하여그레이브스병치료에유용한방법이개발될수있을것으로기대된다. 요약연구배경 : 4-1BB와 4-1BBL는 T 세포와항원제시세포에서발현되는종양괴사인자계열의공동자극분자로서 T 세포활성화와생존에중요한역할을한다. 본연구에서는그레이브스병에서 4-1BB와 4-1BBL의발현특성을조사하고그역할을알아보고자하였다. 방법 : 그레이브스병환자와정상인의말초혈액로부터단핵세포와혈청을분리한다음유세포분석법과 ELISA 방법을이용하여 4-1BB와 4-1BBL의발현특성및임상증상과의연관성을비교하였다. 결과 : 정상인의경우 4-1BB 발현은활성화된 T 세포에서만관찰되는반면그레이브스병환자는 naive T 세포및활성화된 T 세포모두에서발현이관찰되었으며활성화후발현율이더욱증가하였다. 4-1BBL는정상인과그레이브스병환자모두 B 세포, 단핵구및수지상세포와같은항원제시세포에서주로발현되었으며활성화후발현율이다소증가하였다. 4-1BBL 발현율역시그레이브스병에서높게나타났다. 혈청내 s4-1bb와 s4-1bbl 농도를조사한결과그레이브스병환자가정상인에비해현저히높게측정되었으며, 이들의농도는 TBII 및유리 T4 농도와서로유의한상관관계를보였다. 결론 : 그레이브스병환자의 effector T 세포는 4-1BB 매개신호전달을통해충분히활성화될수있으며, 혈청내존재하는고농도의 s4-1bb 및 4-1BBL는그레이브스병진행에기여할것으로추정된다. 참고문헌 1. Mathis D, Benoist C: Back to central tolerance. Immunity 20: , Heufelder AE: Pathogenesis of ophthalmopathy in autoimmune thyroid disease. Rev Endocr Metab Disord 1:87-95, Weetman AP: Autoimmune thyroid disease: propagation and progression. Eur J Endocrinol 148:1-9,

8 - 김은숙외 5인 : 그레이브스병에서공동자극분자인 4-1BB와 4-1BBL의역할연구 - 4. Salmaso C, Olive D, Pesce G, Bagnasco M: Costimulatory molecules and autoimmune thyroid diseases. Autoimmunity 35: , Croft M: Costimulation of T cells by OX40, 4-1BB, and CD27. Cytokine Growth Factor Rev 14: , Bodmer JL, Schneider P, Tschopp J: The molecular architecture of the TNF superfamily. Trends Biochem Sci 27:19-26, Kwon B, Yu KY, Ni J, Yu GL, Jang IK, Kim YJ, Xing L, Liu D, Wang SX, Kwon BS: Identification of a novel activation-inducible protein of the tumor necrosis factor receptor superfamily and its ligand. J Biol Chem 274: , Mittler RS, Bailey TS, Klussman K, Trailsmith MD, Hoffmann MK: Anti-4-1BB monoclonal antibodies abrogate T cell-dependent humoral immune responses in vivo through the induction of helper T cell anergy. J Exp Med 190: , Mittler RS, Foell J, McCausland M, Strahotin S, Niu L, Bapat L, Hewes LB: Anti-CD137 antibodies in the treatment of autoimmune disease and cancer. Immunol Res 29: , Foell J, Strahotin S, O'Neil SP, McCausland MM, Suwyn C, Haber M, Chander PN, Bapat AS, Yan XJ, Chiorazzi M, Hoffmann MK, Mittler RS: CD137 costimulatory T cell receptor engagement reverses acute disease in lupus-prone NZB x NZW F1 mice. J Clin Invest 111: , Sun Y, Lin X, Chen HM, Wu Q, Subudhi SK, Chen L, Fu XY: Administration of agonistic anti-4-1bb monoclonal antibody leads to the amelioration of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 168: , Seo SK, Choi JH, Kim YH, Kang WJ, Park HY, Suh JH, Choi BK, Vinay DS, Kwon BS: 4-1BB-mediated immunotherapy of rheumatoid arthritis. Nat Med 10: , Chistiakov DA, Turakulov RI: CTLA-4 and its role in autoimmune thyroid disease. J Mol Endocrinol 31:21-36, Anand A, Dean GS, Quereshi K, Isenberg DA, Lydyard PM: Characterization of CD3+CD4-CD8- (double negative) T cells in patients with systemic lupus erythematosus: activation markers. Lupus 11: , Brunner-Weinzierl MC, Hoff H, Burmester GR: Multiple functions for CD28 and cytotoxic T lymphocyte antigen-4 during different phases of T cell responses: implications for arthritis and autoimmune diseases. Arthritis Res Ther 6:45-54, Nakamoto Y, Niki M, Watanabe M, Iwatani Y: Increase in immunoglobulin G3-secreting cells in intractable Graves' disease. Thyroid 13: , Watanabe M, Yamamoto N, Matsuzuka F, Miyauchi A, Iwatani Y: Decrease of CD154 intensity on peripheral CD4+ T cells in autoimmune thyroid disease. Clin Exp Immunol 136: , Metkar SS, Naresh KN, Manna PP, Srinivas V, Advani SH, Nadkarni JJ: Circulating levels of TNF alpha and TNF receptor superfamily members in lymphoid neoplasia. Am J Hematol 65: , Setareh M, Schwarz H, Lotz M: A mrna variant encoding a soluble form of 4-1BB, a member of the murine NGF/TNF receptor family. Gene 164: , Michel J, Schwarz H: Expression of soluble CD137 correlates with activation-induced cell death of lymphocytes. Cytokine 12: , Salih HR, Schmetzer HM, Burke C, Starling GC, Dunn R, Pelka-Fleischer R, Nuessler V, Kiener PA: Soluble CD137 (4-1BB) ligand is released following leukocyte activation and is found in sera of patients with hematological malignancies. J Immunol 167: , Salih HR, Nuessler V, Denzlinger C, Starling GC, Kiener PA, Schmetzer HM: Serum levels of CD137 ligand and CD178 are prognostic factors for progression of myelodysplastic syndrome. Leuk Lymphoma 45: , Michel J, Langstein J, Hofstadter F, Schwarz H: A soluble form of CD137 (ILA/4-1BB), a member of the TNF receptor family, is released by activated lymphocytes and is detectable in sera of patients with rheumatoid arthritis. Eur J Immunol 28: , Jung HW, Choi SW, Choi JI, BS Kwon BS: Serum concentrations of soluble 4-1BB and 4-1BB ligand correlated with the disease severity in rheumatoid arthritis. Exp Mol Med 36:13-22, Yamada-Okabe T, Satoh Y, Yamada-Okabe H: Thyroid hormone induces the expression of 4-1BB and activation of caspases in a thyroid hormone receptor

9 - 대한내분비학회지 : 제 21 권제 2 호 dependent manner. Eur J Biochem 270: , Seko Y, Sugishita K, Sato O, Takagi A, Tada Y, Matsuo H, Yagita H, Okumura K, Nagai R: Expression of costimulatory molecules (4-1BBL and Fas) and major histocompatibility class I chain-related A (MICA) in aortic tissue with Takayasu's arteritis. J Vasc Res 41:84-90,

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee University College of Medicine & Hospital E mail : ycell2@yahoo.co.kr Abstract