51(6)-21(유태경130).fm

Size: px

Start display at page:

Download "51(6)-21(유태경130).fm"

소영 장
5 years ago
Views:

1 Korean Chem. Eng. Res., 51(6), (2013) 역오팔구조지지체를이용한인간지방유래줄기세포의연골분화촉진 방석호 * 유태경 **, * 세인트루이스워싱턴대학교생물의공학과 MO 미국세인트루이스 ** 경희대학교화학공학과 경기도용인시기흥구서천동 1 (2013 년 10 월 10 일접수, 2013 년 11 월 1 일수정본접수, 2013 년 11 월 7 일채택 ) Enhanced Chondrogenic Differentiation of Human Adipose-derived Stem Cells with Inverse Opal Scaffolds Suk Ho Bhang* and Taekyung Yu**, *Department of Biomedical Engineering Washington University, Saint Louis, MO 63130, USA **Department of Chemical Engineering, College of Engineering, Kyung Hee University, 1 Seocheon-dong, Kiheung-gu, Yongin, Gyeonggi , Korea (Received 10 October 2013; Received in revised form 1 November 2013; accepted 7 November 2013) 요 약 본연구는역오팔지지체를이용하여인간지방유래줄기세포의연골분화를촉진하는내용을담고있다. 비다공성구조를가진지지체에서세포를분화시도하였을경우분화가잘촉진되지않는것에비해 200 nm 정도의균일한구멍을가지는 poly(d,l-lactide-co-glycolide) 로구성된역오팔지지체는그다공성구조로인하여지지체의내부까지산소와유기물의수송을가능하게하여지지체내에서어떤유전적, 약물적처리없이인간지방유래줄기세포가분화가잘되게하는것을확인하였다. Abstract In this report, we present an inverse opal scaffold that can enhance the chondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells (hadscs) without drug, gene, or cytokine supplement. Inverse opal scaffolds based on poly(d,l-lactide-co-glycolide) were formed with uniform 200 µm pores. Due to uniform pore sizes and well-controlled interconnectivity of inverse opal scaffold, hadscs were allowed to distribute homogeneously throughout the scaffolds. As a result, high cell density culture with scaffold was possible. Since the hadscs cultured in inverse opal scaffolds were subjected to limited supplies of oxygen and nutrients, these cells were naturally preconditioned to a hypoxic environment that stimulated the up-regulation of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α). As a result, apoptotic activity of hadscs until 3 weeks after initial cell seeding was significantly reduced and chondrogenic differentiation related molecular signal cascades were up regulated (transforming growth factor-beta, phosphorylated AKT, and phosphorylated p38 expression). In contrast, hadscs cultured with small and non-uniform porous scaffolds showed significantly increased apoptotic activity with decreased chondrogenic differentiation. Taken together, inverse opal scaffold could potentially be used as an effective tool for improving chondrogenesis using stem cells. Key words: Chondrogenesis, Human Adipose Derived Stem Cells, Hypoxia Preconditioning, Inverse Opal Scaffolds 1. 서론 연골조직은특성상주변조직에존재하는혈관의양이적어한번손상되면치료나재생이어렵다. 실험을통해천공술등을이용한자가연골이식법이새로운치료법으로써제시되었으나, 자가연골을추출하기위한추가적인수술과정으로인해, 이차연골손상을야기할수있다는단점이있다 [1]. 이를극복하기위한대체방식 To whom correspondence should be addressed. tkyu@khu.ac.kr 으로인간지방유래줄기세포이식법이주목받고있다 [2]. 인간지방유래줄기세포는자가연골세포나여타의줄기세포에비해간단한효소처리방식으로많은양의세포를추출하고배양할수있다는장점이있다 [3,4]. 이러한장점을이용하여시험관내에서인간지방유래줄기세포의연골분화를유도한뒤연골치료에활용할수있다 [5]. 그러나일반적인세포배양법과같이인간지방유래줄기세포를단층으로배양할경우연골분화관련유전자의발현은증가할가능성이있어도, 치료및재생에필요한완전한형태의연골분화는그비율이낮은편이다 [6]. 이를극복하기위해일반적으로 727

2 728 방석호 유태경 줄기세포의연골분화는고밀도세포배양법을사용하여수주동안배양시키면서연골세포외기질단백질의발현을증가시킨다. 하지만이러한고밀도세포배양법도오랜시간동안세포를배양함에따라세포덩어리의크기에따른산소투과율감소, 분화유도첨가물질의전달효율감소등문제점이발생한다. 이에따라세포덩어리의중심부분에서세포사멸이발생하며, 결과적으로전체적인연골분화효율이떨어지게된다 [5]. 또한고밀도세포배양법은임상치료적용에서요구되는만큼의세포를대량으로배양하기에는부적합한방식이다. 따라서이를해결할수있는새로운연골분화세포배양법이필요하다. 생분해성다공성지지체는지지체내부로세포가쉽게이동하여부착될수있도록수많은기공구조를포함하고있으며, 이를통해부착된세포가산소, 영양분, 및특정첨가물의공급을원활히받을수있다는장점이있다. 생분해성을갖는재료는이식된세포가조직으로완전히분화되는시점에서분해되고사라져이차적인외과적제거수술이필요없다는장점이있다 [7,8]. 이러한장점을바탕으로다양한방법을이용해생분해성다공성지지체를성형하였으나, 기존의연구들에사용된지지체들은지지체내의기공크기와기공간의연결도를균일하게유지할수없었다 [9]. 이에따라다공성을가지는지지체라고하더라도, 세포의이동, 산소, 및특정첨가물의공급이원활하지않거나고밀도세포배양법의단점과같이시간이지남에따른세포증식억제, 세포사멸증가가나타나원하는방향으로의세포분화비율을떨어뜨리는결과가나타났다. 본연구는고밀도세포배양법과기존방식으로성형된생분해성다공성지지체의단점을극복하고, 줄기세포의연골분화효율을증진시키기위해, 일정한크기의기공과각기공들간의높은연결도를가지는역오팔구조지지체를인간유래지방줄기세포의연골분화배양에적용해보았다. 역오팔구조지지체를통해고밀도세포배양시그리고불균일한기공을가지는다공성지지체에서발생하는내부세포사멸을방지하여지지체에이식된세포의생존율을높이고, 이에따라줄기세포의연골분화효율을증진시킬수있을것이라고가정하였다 [10]. 3주간의세포배양기간을거치면서역오팔구조지지체에서배양된인간유래지방줄기세포의연골분화비율을불균일다공성지지체에서배양된세포의연골분화비율과비교하였으며, 정성, 정량적인비교를위해연골분화유전자및관련단백질의발현을 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), real time PCR, western blot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 로확인하였다. 추가적으로역오팔지지체에서만발견되는특이적유전자발현을통해여타의세포분화방식에비해역오팔지지체가연골분화를더욱촉진되는이유를밝혔다. 2. 재료및방법 2-1. 생분해성다공성지지체제작 Poly(D,L-lact ide-co-glycolide) (PLGA, lactide 75: glycolide 25, Mw 66, ,000, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 를이용하여생분해성다공성지지체를제작하였으며기존의방식을참고하였다 [11]. 간략히설명하면, 200 µm의지름을가지는젤라틴마이크로스피어 (Sigma-Aldrich) 를메탄올에분산시킨뒤, 50 ml 원심분리용튜브에넣고 tapping하여 cubic-close packed (ccp) 격자구조로균일하게배열시켰다. 이후 ccp 격자구조로배열된상태에서 75 o C, 1시간오븐 열처리한다. 상온에서온도를떨어뜨린후, ccp 격자구조덩어리를모으고, 1,4-dioxane (Sigma-Aldrich) 에녹인 PLGA (20 wt%, lactide: glycolide=75:25, M w =66, ,000, Sigma-Aldrich) 용액을격자구조에부어침투시킨다. 여과지로과량의 PLGA 용액을제거하고 -20 o C에서 5시간처리후 12~18시간가량동결건조한다. 잔존하는공기방울을제거하기위해동결건조된 PLGA 덩어리를에탄올과함께처리하고, 45 o C, 900 ml 증류수로옮겨 3시간동안처리하여젤라틴을최종적으로제거하였다. 불균일다공성지지체는상기의 PLGA 용액을실리콘주형에넣고 12~18시간동안동결건조시켰다. 이를통해기공연결성이떨어지고, 5 µm 이하의기공을가지는다공성지지체를제작하였다 세포배양및부착인간지방유래줄기세포는 Lonza (Basel, Switzerland) 에서구입하였으며, α-minimum essential medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 에 10% (v/v) fetal bovine serum (Gibco BRL), 100 U/mL penicillin, 그리고 100 mg/ml streptomycin을혼합하여배양하였다. 실험에사용된인간지방유래줄기세포는모두 6회계대배양횟수내에서사용되었다. 연골분화를유도시인간지방유래줄기세포는 Dulbecco s modified Eagle s medium high glucose (Gibco BRL) 배지에 50 mg/ml ascorbic acid과 100 nm dexamethasone 그리고 10 ng/ml of transforming growth factor-beta3 (R&D systems, Minneapolis, MN) 를혼합하여 3 주간배양하였으며, 배지교환은 3일마다실시하였다. 인간지방유래줄기세포는분화유도전지지체에부착하였으며, 세포를하나의지지체에부착시킨뒤 3 주간분화를유도하였다. 세포가부착된지지체들은 agarose가코팅되어세포가부착되지않는세포배양접시에서배양함으로써지지체로부터세포가빠져나가는것을방지하였다 지지체관찰각지지체의구조와인간지방유래줄기세포부착후지지체의모습을주사전자현미경을사용하여관측하였으며, 세포가부착된지지체의경우 glutaraldehyde (1% v/v PBS, Sigma-Aldrich) 에서 1시간동안고정하고, 농도별에탄올을이용해탈수시킨뒤건조하였다. 이미징은 60초간금을코팅을한뒤 5~10 kv 전압으로 Nova NanoSEM 2300 (FEI, Hillsboro, OR) 주사전자현미경을이용해촬영하였다 세포생존도및연골분화정도조사지지체에세포를부착시키고, 3주간배양한뒤, 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich) assay와 3-amino-7-dimethylamino-2-methylphenazine hydrochloride (Neutral Red) assay, RT-PCR, real-time quantitative PCR, western blot, enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) 를실시하여세포의생존도와연골분화정도를조사하였다. RT-PCR는샘플을 Trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) 에처리한뒤, chloroform (Sigma-Aldrich) 과 isopropanol (80% v/v water, Sigma-Aldrich) 을이용하여 RNA를추출하고, 75% 에탄올처리, 건조과정을거쳐 0.1 vol.% diethyl pyrocarbonate-treated water (Sigma-Aldrich) 와반응시켰다. Spectrophotometer를사용하여 RNA 농도를 260 nm에서측정한뒤, Reverse transcription는 5 µg의 RNA와 SuperScript TM II reverse transcriptase

3 역오팔 구조 지지체를 이용한 인간 지방 유래 줄기 세포의 연골 분화 촉진 729 (Invitrogen)를 사용하였으며 이후 PCR 증폭을 실시하였다. 35 cycles의 denaturing (94 oc, 30초), annealing (58 oc, 45초), extension (72 oc, 45 초) 그리고 final extension (72 oc, 10분)의 구성으로 실시하였으 며 2 wt% agarose gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다. Real-time quantitative PCR은 1 ml Trizol reagent와 200 µl chloroform을 사 용하여 샘플을 녹이고, 12,000 rpm에서 10분간 4 oc를 유지하여 원 심 분리하였다. RNA pellet은 75 vol.% 에탄올로 워싱하였고 건조되 었다. 건조가 끝난 샘플은 RNase-free water에 녹였다. iq SYBR Green Supermix kit (Bio-Rad, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)와 MyiQ single color Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)를 사용하였다. 단백질 분석은 Western blot을 통해 실시되었으며, icecold lysis buffer (15 mm Tris-HCl (ph 8.0), 0.25 M sucrose, 15 mm NaCl, 1.5 mm MgCl2, 2.5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 1 mm dithiothreitol (DTT), 2 mm sodium pyrophosphate (NaPPi), 1 µg/ml pepstatin A, 2.5 µg/ml aprotinin, 5 µg/ml leupeptin, 0.5 mm phenymethylsulfonyl fluoride, mm Na3VO4, 25 mm sodium fluoride (NaF), 10 µm lactacystin)에 샘플을 녹였다. BCA protein assay kit을 사용하여 단 백질 정량을 한 뒤 각 샘플에서 동량의 단백질을 sample buffer과 섞고 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 에 로딩하였다. SDS-PAGE에서 분리된 단백질은 Immobilon-P membrane (Millipore, Billerica, MA)에 apply하여 분석 대상 항체와 상온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 이후 한 시간 동안 상온에서 horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)와 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence detection system (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)을 이용해 결과를 확인하였다. 연골 분화 시 방출되는 transforming growth factor-beta의 양을 세포 분화 배지를 수거하여 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용해 측정하였다. 배지에 첨 가된 transforming growth factor-beta의 양은 측정된 총량에서 제외 하여 계산하였다 통계처리 통계처리는 analysis of variance (ANOVA, Bonferroni test)를 사 용하였으며, 유의 수준이 0.05 미만일 때 통계학적으로 유의함을 표 시하였다(p value < 0.05). 3. 결과 및 고찰 기존 연구에서 사용되는 삼차원 구조 지지체들은 기공이 존재하 지 않거나 불균일한 기공을 가지는 경우가 많아 함께 이식되는 세포 가 지지체 내부까지 부착되지 않거나 물질 교환의 한계로 인해 세포 사멸로 진행되는 경우가 많았다. 이를 극복하기 위해 본 역오팔 구 조 지지체를 활용하여, 균일한 크기의 기공을 제작하였으며 균일한 배열을 통해 기공 연결도를 크게 증진시켰다. Fig. 1A와 B는 불균일 다공성 지지체와 역오팔 구조 지지체의 차이점을 보여준다. 주사 전 자 현미경을 통해 확인해본 결과, 역오팔 구조 지지체는 200 µm의 균일한 기공이 각 층에 조성되어 있고, 이를 통해 각 층이 연결되는 부분이 발생함에 따라 기공 연결도가 불균일 다공성 지지체에 비해 크게 높아졌다. 이러한 결과는 역오팔 구조 지지체의 단면에서도 확 인할 수 있었으며 불균일 다공성 지지체의 경우 내부에서 기공이 서 로 연결되지 않고 막히는 결과가 관찰되어 두 구조체의 외부와 내부 Fig. 1. SEM images of the non-uniform porous scaffolds (NUPS) and inverse opal scaffolds (IOS). (A) Top view of a non-uniform porous scaffold. (B) Top view of an inverse opal scaffold. (C) Cross-sectional view of a non-uniform porous scaffold after culture with hadscs for 3 weeks. hadscs were hardly found in inner part of NUPS. (D) Cross-sectional view of an inverse opal scaffold after culture with hadscs for 3 weeks. Scale bars: 100 µm. White arrows indicate hadscs attached in inner part of IOS. 가 세포의 초기 이동 및 부착에 차이를 나타낼 수 있음을 보여준다. 역오팔 구조 지지체는 하나의 기공 아래 다시 균일한 크기의 세 기 공이 다시 연결되고 있었으며, 이를 통해 산소, 영양분, 세포 대사물 등의 교환이 원활히 이루어질 수 있음을 확인했다. 3주간 인간 지방 유래 줄기 세포를 배양한 후 각 지지체를 다시 주사 전자 현미경으 로 확인해본 결과, 역오팔 구조 지지체는 지지체 중심부까지 세포가 잘 분포하고 있었지만, 불균일 다공성 지지체의 경우 내부까지 도달 한 세포의 수가 극히 적어 존재를 확인하기 어려웠다(Fig. 1C와 D). 인간 지방 유래 줄기 세포가 각 지지체에서 3주간 연골 분화 과정을 거친 뒤 생존율에 변화가 있는지를 DNA 정량(RT-PCR 중 계산), neutral red assay, MTT assay를 통해 확인한 결과, 초기에 불균일 다 공성 지지체와 역오팔 구조 지지체에 이식된 세포의 수가 차이가 없었음에도 불구하고(Fig. 2A, 왼쪽), 3주 후 불균일 지지체에 존재 하는 줄기 세포의 양이 역오팔 구조 지지체에 비해 현저히 감소함을 확인할 수 있었다(Fig. 2A, 오른쪽). 역오팔 구조 지지체의 경우, 인 간 지방 유래 줄기 세포가 지지체의 연결된 기공을 통해 내부까지 이 동할 수 있었으며, 이를 통해 세포가 부착, 증식할 수 있는 표면이 증 가함에 따라 많은 양의 세포가 3주 후까지 존재할 수 있었던 반면 불 균일 다공성 지지체의 경우 세포의 이동 자체가 어려워 상반되는 결 과를 나타낸 것으로 보인다. 본 연구는 200 µm 크기의 균일한 기공 이 존재하는 역오팔 구조 지지체와 불균일 다공성 지지체를 비교하 였는데, 이는 역오팔 구조 지지체의 세포 부착 및 성장 능력이 표면 적의 증가와 함께 극대화되는 지점이 200 µm의 기공을 포함하고 있 었을 때라는 기존 연구를 참고하였다. 같은 역오팔 구조를 가진다고 하더라도, 세포의 부착 및 이동은 기공의 크기 증감에 따라 차이를 보이기 때문에, 역오팔 구조 자체의 장점을 나타내기에 위해서는 최

(B) Cell viability (neutral red assay) and (C) mitochondrial metabolic activity (MTT assay) at 3 weeks of culture in the scaffolds. *p<0.01.

4 730 방석호 유태경 Fig. 2. Viability of hadscs cultured on the non-uniform porous (NUPS) and in the inverse opal scaffolds (IOS). (A) The amount of total DNA of hadscs in the scaffolds at day 1 and 3 weeks of culture. (B) Cell viability (neutral red assay) and (C) mitochondrial metabolic activity (MTT assay) at 3 weeks of culture in the scaffolds. *p<0.01. (D) RT-PCR analysis results for Bcl-2 (anti-apoptotic) and p53 (pro-apoptotic) expressions in the two types of scaffolds. 적화된형태의구조를제작하고, 기존의지지체와비교해야했었다 [12]. 연골분화유도배양 3주후불균일다공성지지체에배양된세포의생존율이역오팔구조지지체에비해떨어짐을확인하였으며 (Fig. 2B와 C) 세포사멸억제유전자 (Bcl-2) 의발현량이감소하고세포사멸유도유전자 (p53) 의발현이역오팔구조지지체에비해증가되는것을확인할수있었다 (Fig. 2D). 이러한결과는기공연결도가높은역오팔구조지지체에서세포의생존에필요한물질의대사가원활히이루어질수있음을의미하며, 세포가지지체중심부로이동한이후에도이러한현상이잘유지되고있음을나타낸다 [13]. 불균일다공성지지체의경우기공연결도가매우낮아세포의생존에결정적인역할을하는세포부착표면적이적고, 세포가이동하기에부적합한크기의기공들이존재함에따라세포의이동이저해되어장기간배양시공간적제약으로인해세포사멸이진행되는것으로보인다. 줄기세포의연골분화는줄기세포자체의유전적발현에의해진행되며, 이에더해분화가진행되는동안줄기세포가분비하는물 질이다시인접한줄기세포에게들어가상호연골분화 (paracrine effect) 를촉진시키는과정이연골분화효율에큰영향을미친다. 특히줄기세포의연골분화에있어서는 paracrine effect를통한 transforming growth factor-beta의분비량이연골분화효율을높이는데결정적으로작용한다. 이러한 paracrine effect는세포의분화를위해외부에서인위적으로첨가하는요인 ( 유전자, 단백질, 등 ) 에의해서촉진되기도하지만, transforming growth factor-beta의경우 HIF-1α의발현증가로인해분비량이증가된다 [14]. 역오팔구조지지체가많은양의세포를포함하면서시간이지남에따라산소교환비율이상대적으로떨어지게되면서, 세포의생존율은유지가되지만세포자체는저산소환경 (mild hypoxia) 에노출되게된다. 이러한환경은세포가저산소환경에적응할수있도록 HIF-1α 유전자의발현을증가시켰다 (Fig. 3). 이를통해역오팔지지체에존재하는세포들은불균일다공성지지체에존재하는세포들에비해세포생존도가높게유지될수있었으며, 추가적으로연골분화에영향을미치는 transforming growth factor-beta의분비매커니즘을작동시켜연골분화효율이높아지는효과를나타낼수있었다. Fig. 3에서확인된바와같이역오팔지지체에서배양된인간지방유래줄기세포는 HIF-1α의유전자발현증가와더불어 transforming growth factor-beta의유전자발현량이증가하였으며, 그결과세포배양배지내에존재하는 transforming growth factor-beta의양이불균일다공성지지체에비해현저히증가함을확인할수있었다. 불균일다공성지지체의경우, transforming growth factor-beta의발현량이비약적으로증대되지못하였는데, 이는역오팔구조지지체와는달리 HIF-1α 유전자의발현이증대되지않았기때문으로생각할수있다. 불균일다공성지지체에서관찰된상대적으로소량의 transforming growth factor-beta 양분비량증가는외부에서인간유래줄기세포의연골분화를위해넣어준성장인자의영향에의한것으로보인다. 역오팔구조지지체를사용함으로써추가적인외부요인의개입없이구조체자체적인특성에기인하여인간지방유래줄기세포의연골분화를촉진시킬수있었으며이는 HIF-1α 유전자발현이주요인이었던것으로보인다. HIF-1α 유전자의발현은연골분화 transcription factor인 SOX-9의증가를유도함으로써인간지방유래줄기세포의연골분화를촉진시킨다 [15]. 비록연골분화의핵심요인인 2형콜라겐과 aggrecan의증가가 HIF-1α 유전자의발현과비례하지는않지만, SOX-9의발현과는직접적인연계성을가지고있다 [16]. 연골분화매커니즘을확인해본결과, p-p38, pakt의발현 Fig. 3. Enhanced expression of hypoxia-induced survival factor (HIF-1α) and transforming growth factor-beta in hadscs cultured in the inverse opal scaffolds for 3 weeks. (A) Western blot analysis and (B) real time quantitative PCR results for HIF-1á and transforming growth factor-beta expressions in the two types of scaffolds. (C) The amount of transforming growth factor-beta secreted from had- SCs cultured in the non-uniform porous (NUPS) and inverse opal scaffolds (IOS). *p<0.01.

5 역오팔구조지지체를이용한인간지방유래줄기세포의연골분화촉진 731 Fig. 5. The expression of adipogenic (PPRγ) and osteogenic (OP and OC) differentiation markers in the hadscs cultured with different scaffolds as evaluated by (A) western blot analysis and (B) real time quantitative PCR (ND: not detected). Fig. 4. Enhanced chondrogenesis of hadscs by transplanting the cells cultured in the inverse opal scaffolds. (A) Western blot analysis, (B) RT-PCR analysis, and (C) real time quantitative PCR results showing the representative chondrogenic gene (collagen type II and aggrecan) expression levels. *p<0.01. 기세포가지방또는뼈로분화할가능성을확인하기위해추가적인 western blot 을실시하였으며이를통해역오팔구조지지체에서배양된세포가연골로분화하는과정에서다른계열의세포로분화되는현상이없음을확인하였다 (Fig. 5). 지방분화가능성을조사하기위해 PPRγ의발현양을, 뼈분화가능성을조사하기위해 osteocalcin (OC) 과 osteopontin (OP) 의발현양을확인해보았으나 NUPS, IOS에서배양된세포에서관련단백질의증가를관찰할수없었다. 4. 결론 이역오팔구조지지체에서배양된인간지방유래줄기세포에서증가되었다. p38과 pakt는줄기세포의연골분화에관여하는인자로보고되어있으며 transforming growth factor-beta의발현량을제어하는것으로알려져있다 [16]. p38과 pakt의발현은 transforming growth factor-beta의발현량증가와도연계성을가지지만저산소환경조건에의해서도영향을받으며이러한요인이줄기세포의연골분화를촉진시키는것으로보고된바있다 [18]. Fig. 4에서보여진바와같이역오팔지지체를사용한경우에서불균일다공성지지체를사용한경우보다 pakt의발현이증가하였으며, p38의발현도함께증가되는것을확인하였다. 상기의내용과결과를토대로, 불균일다공성지지체가 200 µm 크기의기공을가질경우세포배양결과를예측할수있다. 역오팔구조의경우 Fig. 1과같이내부연결도가높으나불균일다공성지지체는연결도가낮아세포가내부로이동할수없었으며, 3주후세포생존율이감소함을확인할수있었다. 역오팔구조지지체의경우내부연결도가증가함에따라세포부착표면적이함께증가하는반면, 불균일다공성지지체의경우내부연결도가낮아세포부착표면적이크게증가되지않을확률이높다. 세포의부착, 이동, 그리고이후연골분화에필수적인유전자의발현에는지지체에이식된세포가지지체내부까지부착되고증식되야한다는조건이필요하다. 따라서불균일다공성지지체가 200 µm 크기의기공을가진다고하더라도, 역오팔구조와같이기공간의연결도가낮다면세포생존율의증가, 연골분화효과는기대하기어려울것으로보인다. 유전자발현에서 SOX-9의발현이역오팔구조지지체의경우가불균일다공성지지체의경우보다현저히증가되었으며, 연골분화의대표적인표지인 aggrecan의발현역시 SOX-9의결과와같은경향성을보였다. 이는또다른연골분화의대표표지인 2형콜라겐의발현량에서도같은현상을보였다. 연골분화유도과정에서일부줄 본연구는연골재생을위해줄기세포와함께사용될수있는지지체의구조가줄기세포의연골분화효율을증진시킬수있음을고찰하였다. 200 µm 크기의균일한기공과높은기공연결도를가진역오팔구조지지체는세포의이동및부착이불균일다공성지지체에비해지지체의중심부까지용이하게진행되었으며, 세포의생존과분화에필요한물질교환이용이하여장기간배양이후에도높은연골분화율을나타내었다. 뿐만아니라고밀도세포배양을통해 hypoxia preconditioning 효과를추가적인유전자, 단백질등의사용없이나타냄으로써연골분화를촉진시킬수있는유전자의발현을자체적으로증진시키는효과를나타내었다. 결과적으로인간지방유래줄기세포가역오팔구조지지체에배양됨으로써, 연골분화촉진메커니즘이작동할수있었으며, 나아가 paracrine 효과가증진되어 transforming growth factor-beta3의분비량이증가함을확인할수있었다. 이상의연구결과를통해, 역오팔구조지지체의구조적특징이줄기세포의이동, 부착, 및치료효과증진에활용될수있음을확인하였으며, 연골재생연구뿐만아니라다양한분야의조직재생에활용될가능성이있음을확인하였다. References 1. Lee, C. R., Grodzinsky, A. J., Hsu, H. P., Martin, S. D. and Spector, M., Effects of Harvest and Selected Cartilage Repair Procedures on the Physical and Biochemical Properties of Articular Cartilage in the Canine Knee, J. Orthop. Res., 18, 790(2000). 2. Rodriguez, A. M., Elabd, C., Amri, E. Z., Ailhaud, G. and Dani, C., The Human Adipose Tissue is a Source of Multipotent Stem Cells, Biochimie., 87, 125(2005). 3. Casteilla, L., Planat-Benard, V., Cousin, B., Silvestre, J. S., Laharrague, P., Charrie`re, G. and Penicaud, L., Plasticity of Adipose Tissue: A

6 732 방석호 유태경 Promising Therapeutic Avenue in the Treatment of Cardiovascular and Blood Diseases, Arch. Mal. Coeur. Vaiss., 98, 922(2005). 4. Oedayrajsingh-Varma, M., Ham, S. V., Knippenberg, M., Helder, M. N., Klein-Nulend, J., Schouten, T. E., Ritt, M. J. and Milligen, F. J. V., Adipose Tissue-derived Mesenchymal Stem Cell Yield and Growth Characteristics Are Affected by the Tissue-harvesting Procedure, Cytotherapy, 8, 166(2006). 5. Yoon, H. H., Bhang, S. H., Shin, J. Y., Shin, J. and Kim B. S., Enhanced Cartilage Formation via Three-dimensional Cell Engineering of Human Adipose-derived Stem Cells, Tissue Eng., 18, 1949(2012). 6. Afizah, H., Yang, Z., Hui, J. H., Ouyang, H. W. and Lee, E. H., A Comparison Between the Chondrogenic Potential of Human Bone Marrow Stem Cells (BMSCs) and Adipose-derived Stem Cells (ADSCs) Taken From the Same Donor, Tissue Eng., 13, 659(2007). 7. Park, S. J., Kim, S. H. and Hong, S. K., Preparation of Microcapsules and Release Behaviors of Biodegradable Poly(L-lactide)/ Poly(ethylene glycol) Copolymers, Korean Chem. Eng. Res.(HWA- HAK KONGHAK), 41, 497(2003). 8. Lee, M. J., Seo, D. Y., Lee, H. E. and Choi, G. J., Therapeutic Effect of Chitosan Modification on Salmon-calcitonin-loaded PLGA Nanoparticles, Korean J. Chem. Eng., 28, 1406(2011). 9. Yoo, D. J, Computer-aided Design and Fabrication of Bio-mimetic Scaffold for Tissue Engineering Using the Triply Periodic Minimal Surface, J. Kor. Soc. Prec. Eng., 28, 834(2011). 10. Shin, Y. M. and Shin, H. S., Current Status of Tissue Engineering Scaffolds Using Biodegradable Polymers, Polym. Sci. Tech., 18, 458(2007). 11. Choi, S. W., Zhang, Y. and Xia, Y., Three-dimensional Scaffolds for Tissue Engineering: the Importance of Uniformity in Pore Size and Structure, Langmuir, 26, 19001(2010). 12. Oh, M. J., Moon, S. K., Kim, S. E. and Choi, S. W., Preparation of Inverse Opal Scaffolds with Uniform Pore Sizes and Their Effect on Cell Proliferation, Biomaterials Research, 17, 126(2013). 13. Zhang, Y., Choi, S. W. and Xia, Y., Modifying the Pores of An Inverse Opal Scaffold with Chitosan Microstructures for Truly Three-dimensional Cell Culture, Macromol. Rapid Commun., 33, 296(2012). 14. Amarilio, R., Viukov, S. V., Sharir, A., Eshkar-Oren, I., Johnson, R. S. and Zelzer, E., HIF1alpha Regulation of Sox9 is Necessary to Maintain Differentiation of Hypoxic Prechondrogenic Cells During Early Skeletogenesis, Development, 134, 3917(2007). 15. Murphy, C. L. and Polak, J. M., Control of Human Articular Chondrocyte Differentiation by Reduced Oxygen Tension, J. Cell Physiol., 199, 451(2004). 16. Sekiya, I., Tsuji, K., Koopman, P., Watanabe, H., Yamada, Y., Shinomiya, K., Nifuji, A. and Noda, M., SOX9 Enhances Aggrecan Gene Promoter/Enhancer Activity and is Upregulated by Retinoic Acid in a Cartilage-derived Cell Line TC6, J. Biol. Chem., 275, 10738(2000). 17. Oh, C. D., Chang, S. H., Yoon, Y. M., Lee, S. J., Lee, Y. S., Kang, S. S. and Chun, J. S., Opposing Role of Mitogen-activated Protein Kinase Subtypes, erk-1/2 and p38, in the Regulation of Chondrogenesis of Mesenchymes, J. Biol. Chem., 275, 5613(2000). 18. Kanichai, M., Ferguson, D., Prendergast, P. J. and Campbell, V. A., Hypoxia Promotes Chondrogenesis in Rat Mesenchymal Stem Cells: a Role for AKT and Hypoxia-inducible Factor (HIF)- 1alpha, J. Cell Physiol., 216, 708(2008).

α α α α α

α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를