<C8AFB0E6BFC0BFB020BBFDC3BCC1F6C7A520B0B3B9DF20B9D720B5B6BCBABFACB1B820C7A5C1D8C8AD2D E687770>

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1 발간등록번호 NIER No 환경오염생체지표개발및독성연구표준화 환경보건안전부환경노출평가과 이철우, 류지성, 송상환, 김은경, 양창용, 이문순, 김현미, 정영희, 최경희 Development of biomarkers for environmental pollution and standardization of toxicity tests C.W.Lee, J.S.Ryu, S.H.Song, E.K.Kim, C,Y,Yang, M.S.Lee, H.M.Kim, Y.H.Chung, K.H.Choi Environmental Exposure Assessment Division Environmental Health and Safety Department National Institute of Environmental Research 2006 國立環境科學院

2 요약문 1. 제목 환경오염생체지표개발및독성연구표준화 2. 연구목적 - 표준화된독성시험과평가방법을바탕으로한독성자료생산 - 유해화학물질에대한생체지표연구및민감지표선정 - OECD 화학물질테스트가이드라인과의조화를바탕으로한국내화학물질유해성시험방법제 개정 3. 연구내용및방법 가. 어류, 무척추동물류를이용한독성시험수행및표준화 1) 어류독성시험 어류급성독성시험 시험종 : Medaka (Oryzias latipes) adult 및 larvae 시험물질 : hexavalent chromium (potassium dichromate) 노출농도 : 0 ~ 256mg /L 노출기간 : 96시간, semi-static ( 측정항목 : 치사율 ) -i-

3 어류초기생장단계독성시험 시험종 : Medaka (Oryzias latipes) fertilized eggs 시험물질 : hexavalent chromium (potassium dichromate) 노출농도 : 0 ~ 256mg /L 노출기간 : 14일 측정항목 : 치사율, 부화율, 기형증상, 기타 시험방법 : OECD 화학물질 testguidelines (TG 203, 210) 2) 물벼룩독성시험 물벼룩급성독성시험 시험종 : Waterflea (Daphnia magna) offspring( 부화후 24시간이내 ) 시험물질 : hexavalent chromium (potassium dichromate) 노출농도및기간 : 0 ~ 1.2mg /L (48시간, static method) 측정항목 : 유영저해 (Immobility) 시험방법 : OECD 화학물질 testguidelines (TG 202) 물벼룩배양액차이에따른급성독성비교 시험종 : Waterflea (Daphnia magna) offspring( 부화후 24시간이내 ) 시험물질및배양액 : potassium dichromate, [MHW medis, M4 media, M4 media(-edta)] 시험방법 : OECD 화학물질 testguidelines (TG 202) - i-

4 3) 선충, 지렁이를이용한독성시험 ( 예쁜꼬마 ) 선충급성독성시험 시험종 : Nematode (Caenorhabditis elegans) 시험물질 : hexavalent chromium (potassium dichromate) 노출농도 : 0 ~ 156.2mg /L 노출기간 : 24시간 ( 측정항목 : 치사율 ) 선충의경우현재 OECD에서표준화된시험법이없음 지렁이급성독성시험초기생장단계독성시험 시험종 : Earthworm (Eisenia fetida) 시험물질 : hexavalent chromium (potassium dichromate) 노출농도 : 0 ~ 800mg /L ( 노출기간 : 14일 ) 측정항목 : 치사율 시험방법 : OECD 화학물질 testguidelines (TG 207) 나. 독성물질에대한생체내반응조사및생체지표발굴 1) 마이크로어레이기법을이용한생체내반응조사 선충 (Nematode) DNA chip microarray 시험 시험종 : Nematode (Caenorhabditis elegans) 시험물질 : hexavalent chromium (potassium dichromate) 노출농도 : NOEC (6.9mg/L), LC 10 (78.3mg/L) - i-

5 2) 독성물질에대한생체지표발굴및시험법적용연구 6 가크롬에반응하는생체내유전자조사및검토 Glutathion-s-transferase 등의유전자조사및검토 다. 화학물질유해성시험방법제 개정 1) OECD 화학물질테스트가이드라인제 개정추진현황검토 OECD 화학물질 TG 제 개정프로그램의추진방향검토 제 개정가이드라인안 (draft) 검토 2) 화학물질유해성시험방법일부항목제 개정 국내 화학물질유해성시험방법 ( 국립환경과학원고시 ) 의일부항목의제 개정 (OECD TG와의 harmonization( 조화 )) 제정 ( 신규 ) : 물벼룩류생식능시험, 어류초기생장단계독성시험, 급성경구독성시험 ( 고정용량법, 독성등급법 ) 개정 : 어류급성독성시험, 물벼룩류급성독성시험, 지렁이급성독성시험, 조류성장저해시험 OECD TG와의조화또는독성시험표준화연구를토대로시험방법제 개정 -iv-

6 4. 연구결과 가. 어류, 무척추동물류를이용한독성시험수행및표준화 1) 어류독성시험 OECD 화학물질테스트가이드라인에따른시험방법상의문제점은도출되지않음 단, 수용성이낮은시험물질에대해서는시험법표준화를위한보완연구가지속적으로요구됨 표준화된방법에의거한 6가크롬의독성자료생산 : 치어 (larvae) 에서의크롬감수성이성어에비해낮음 Fish (Medaka), Acute Toxicity Test Adult LC50 (mg/l) 48 hrs 96 hrs * ( ) ( ) * 95% Confidence limit 96h-NOEC (mg/l) = 32mg/L Larvae LC50 (mg/l) 48 hrs 96 hrs > ( ) * 95% Confidence limit 96h-NOEC (mg/l) = 64mg/L Fish (Medaka), Early-life Stage Toxicity Test Normal Embryo Dead Embryo Normal Larvae Edema Hatch Success (10-day) Death rate 20 0 Adverse Effects Potassium dichromate conc. (mg/l) *Adverse effects of medaka embryos include cardiovascular defect, hemorrhage and growth inhibition. Adverse effects of medaka embryos were observed within 14 days after the chemical treatment. Mortality was measured from the dead embryos and larvae within 14 days after the chemical treatment. NOEC= 64mg/L -v-

7 2) 물벼룩독성시험 화학물질유해성시험방법제 개정을위한보완사항도출 OECD와 EPA 시험법에서의물벼룩배양액의차이점검토 중금속 ( 크롬 ) 의경우, 배양액조성차이 (EDTA의여부 ) 에따른독성차이확인 : 48h-EC 50 (M4 media) 48h-EC 50 (M4 media - EDTA) 중금속인크롬은 EDTA 와킬레이팅 (chelating) 하여독성이감소됨에따라중금속독성시험의경우, 배양액에서 EDTA 를제외하도록함 독성자료생산 어류와비교해 6가크롬에대해매우민감한것으로나타남 물벼룩급성독성시험결과 -vi-

8 3) 선충, 지렁이를이용한독성시험 6 가크롬 (potassium dichromate) 에대한선충독성시험 : 현재표준화된시험방법은없음. 향후시험법화추진예정 [ 선충독성시험방법 ( 안 ) 요약 ] 1 동일한생장단계의선충 (C. elegans) 을포집하여배지내에서생장시킨후성체가품고있는알 (egg) 들만모아먹이가없는상태에서하루동안배양한다. 2 배양후 16시간이경과한뒤부화된 L1 stage 단계의개체들을포집한다. 3 포집된 C. elegans를 24 well plate에 well당 20마리의개체를투입한다. 4 농도별로시험물질을처리한다. 5 시험기간 ( 예 : 24시간 ) 동안노출하여독성값 (LC 50 등 ) 을산출한다. Nematode (C. elegans) Chromium toxicity ( 농도와생존률에대한그래프 ) NOEC=23.4uM(6.88 mg /L), LC 10 =266uM(78.26 mg /L), LC 50 =531uM( mg /L) -vi-

9 선충 (C. elegans) 의생장비교 (K 2 Cr 2 O 7 24 시간노출후 ) 6 가크롬에대한지렁이독성시험 6 가크롬 (potassium dichromate) 에의한 지렁이 (Eisenia fetida) 급성독성결과 -v i-

10 나. 독성물질에대한생체내반응조사및생체지표발굴 1) 마이크로어레이기법을이용한생체내반응조사어류독성시험 선충 (Nematode) DNA chip microarray 시험 Microarray 시험및발현패턴분석 발현패턴분석을통해가능성있는생체지표 ( 민감지표 ) 조사 발현이유의하게증가된유전자 (Up-regulated genes) Serine proteinase inhibitor, UDP-Glucuronosyl transferase, P-granule associated novel protein, Glutathione-S-transferase, Phosphoserine aminotransferase, Hydroxy-acyl-coA dehydrogenase, Immunoglobin and related proteins, Acetylcholine receptor, Osmotic Stress Resistant protein, Peptidase M8 family 등 발현이유의하게감소된유전자 (Down-regulated genes) Proteasome regulatory particle, Casein kinase II(β subunit), Ubiquitin-like protein, Heat shock protein, Thioredoxin-like protein, Animal-type fatty acid synthase, DNA alkylation damage repair protein, Nuclear hormone receptor family, Ubiquinone oxidoreductase 등 -ix-

11 독성물질에대한생체지표발굴및시험법적용연구 6 가크롬에반응하는생체내유전자조사및검토 : Glutathion-s-transferase 등의유전자조사및검토 다. 화학물질유해성시험방법제 개정 1) OECD 테스트가이드라인제 개정추진현황검토 OECD에서의 2006년도주요제 개정내용 : 개구리밥성장저해시험및지렁이생식능시험제정, OECD TG 407 개정 ( 안 ) 검증화작업 OECD TG 실무그룹 (OECD EDTA 포함 ) 추진방향검토 2) 국내화학물질유해성시험방법일부항목제 개정 화학물질유해성시험방법 ( 국립환경과학원고시 ) 일부항목의 제 개정 (OECD TG 와의 harmonization( 조화 )) 시험항목 개정 / 제정 ( 신규 ) 개요 어류급성독성시험개정유해성심사항목, 일부내용보완 물벼룩류급성독성시험개정 유해성심사항목, 일부내용보완 ( 배양액등 ) 지렁이급성독성시험개정필터페이퍼방법추가 유해성심사항목, OECD TG 개정에따른조류성장저해시험개정조화어류초기생장단계독성시험신규제정수생생태독성시험의다양성확보 물벼룩류생식능시험 급성경구독성시험 ( 고정용량법 ) 급성경구독성시험 ( 독성등급법 ) 신규제정물벼룩만성독성시험의추가필요성 신규제정 신규제정 기존경구독성시험폐지 (OECD TG401) 및대체시험의신설필요성 (OECD TG 420과의조화 ) 기존경구독성시험폐지 (TG401) 및대체시험의신설필요성 (OECD TG 423과의조화 ) -x-

12 화학물질유해성시험방법 [ 별표 5] 이포함되어있는규정 [ 화학물질유해성시험연구기관의지정등에관한규정, 국립환경과학원고시 ] 화학물질유해성시험방법개정 ( 예 : 물벼룩류급성독성시험 ) -xi-

13 5. 기대효과 1) 표준화된독성시험법을바탕으로한유해화학물질의독성자료확보및본자료의 ( 위해성평가에 ) 활용 2) 민감생체지표발굴을바탕으로생체지표의시험법적용기대 3) 화학물질유해성시험방법 ( 국립환경과학원고시 ) 의유관기관전파및활용성 ( 제 개정에따른신규시험법확대 ) 증대 4) 표준화된시험법에이용할수있는적정시험종 ( 예 : 선충 ) 발굴 -xi-

14 Abstract New test methods or the existing testguidelines were applied to ecotoxicity tests and these experiments were standardized. Based on these results, the existing testguidelines were revised and new guidelines were prepared to test the environmental toxicity tests. Besides several biomarkers for environmental contaminants were investigated in this research. Issuing chemical contaminant, hexavalent chromium (as potassium dichromate), was selected for the toxicity tests such as fish acute toxicity test, waterflea acute toxicity test, fish early life stage test and earthworm acute toxicity test. These experiments following with OECD test guidelines for hazardous chemicals, indicated that waterflea (Daphnia magna) is more sensitive to hexavalent chromium than fish. The 48h-EC 50 value of potassium dichromate to D. magna was 0.32mg/L. With the above results, the test guidelines for hazardous chemicals in Korea were revised. Toxicity experiments with hexavalent chromium were carried out to investigate the applicable biomarker as end-point of toxicity test. DNA microarray experiments were performed with nematodes (C. elegans) exposed to hexavalent chromium and several biomarkers were identified for the chromium. -x i-

15 목차 요약문 i Abstract xiii 목차 xiv 그림목차 xvi 표목차 xvii I. 서론 1 II. 연구내용및방법 4 1. 어류, 무척추동물류를이용한독성시험수행및표준화 4 가. 어류독성시험 4 나. 물벼룩독성시험 8 다. 선충, 지렁이독성시험 12 라. 하천저질에서의크롬독성평가방법에관한연구 독성물질에대한생체내반응조사및생체지표발굴 19 가. 마이크로어레이기법을이용한생체내반응조사 19 나. 생체지표의발굴및시험법적용에대한검토 화학물질유해성시험방법제 개정 22 가. OECD 테스트가이드라인제 개정추진현황검토 22 나. 화학물질유해성시험방법일부제 개정 22 -xiv-

16 II. 연구결과및고찰 어류, 무척추동물류를이용한독성시험수행및표준화 23 가. 어류독성시험 24 1) 어류급성독성시험 24 2) 어류초기생장단계독성시험 25 나. 물벼룩독성시험 28 1) 물벼룩급성독성시험 28 2) 배양액차이에따른물벼룩에서의독성비교 30 다. 선충, 지렁이독성시험 31 1) 선충독성시험 31 2) 지렁이급성독성시험 34 라. 하천저질에서의크롬독성평가방법에관한연구 독성물질에대한생체내반응조사및생체지표발굴 41 가. 마이크로어레이기법을이용한생체내반응조사 41 나. 생체지표의발굴및시험법적용에대한검토 화학물질유해성시험방법제 개정결과 50 가. OECD 테스트가이드라인제 개정추진현황검토 50 나. 화학물질유해성시험방법일부제 개정결과 53 IV. 결론 114 V. 참고문헌 117 부록 122 -xv-

17 그림목차 그림 II-1. 어류초기생장단계독성시험흐름도 7 그림 II-2. 물벼룩급성독성시험흐름도 9 그림 II-3. 선충 (Caenorhabditis elegans) 독성시험의흐름도 15 그림 II-4. 지렁이 (Eisenia fetida) 독성시험의흐름도 15 그림 III-1. 6가크롬 (Potassium dichromate) 에대한초기생장단계독성시험에서의부화성공률 (hatch success), 사망률 (dead rate) 및기형발생률 (adverse effects) 26 그림 III-2. 6가크롬 (Potassium dichromate) 에노출된송사리 embryo와 larvae 26 그림 III-3. 6가크롬에의한물벼룩급성독성시험 28 그림 III-4. 배양액차이에따른 6가크롬 (potassium dichromate) 의물벼룩급성독성비교 30 그림 III-5. 6가크롬에의한선충독성시험 31 그림 III-6. 6가크롬노출선충의성장비교 33 그림 III-7. 6가크롬 (potassium dichromate) 에의한지렁이 (E. fetida) 급성독성결과 35 그림 III-8. 하천저질중중금속독성평가를위한프레임워크 ( 안 ) 40 그림 III-9. OECD 화학물질테스트가이드라인의제정과정 52 -xvi-

18 표목차 표 III-1. 송사리급성독성시험결과 24 표 III-2. 6가크롬 (potassium dichromate) 농도별송사리의치사율 (mortality), 부화율 (hatch success) 및주요증상 (adverse effects) 27 표 III-3. ICP-MS를이용한중금속함량측정값 ( μg / ml ) 38 표 III-4. 6가크롬에의해발현이활성화된선충내유전자 (Up-regulated genes) 45 표 III-5. 6가크롬에의해발현이억제된선충내유전자 (Down-regulated genes) 46 표 III-6. 화학물질유해성시험방법 [ 별표 5] 이수록되어있는고시규정 54 표 III-7. 화학물질유해성시험방법 ( 국립환경과학원고시 ) 의제 개정항목및사유 54 -xvi-

19 I. 서론 환경독성학 (environmental toxicology) 이란환경중에존재하는오염물질에의한유해한영향을연구하는학문인데이때환경오염물질은경우에따라단일물질일수도있고혼합물질로존재하기도한다. 중금속카드뮴과같이단일물질로존재하는경우, 일반적으로이를유해화학물질 (hazardous chemical) 이라고부르며, 반면석면과같이혼합물질로존재하는것들은유해성분 (hazardous material) 에해당된다. 환경독성분야에서유해성 (hazard) 평가란어떠한물질이인간이나환경에악영향을야기할수있는잠재적능력을판단하는일이다. 한편, 환경독성의상위단계인위해성 (risk) 평가는주어진노출 (exposure) 조건하에서유해한작용이나타날확률 (probability) 또는가능성 (likelihood) 을정량적으로평가하는것이다. 일반적으로화학물질의유해성을평가하기위해서는독성시험을필요로하는데독성이나타날수있는수용체로는인간또는환경중생물이지만실제적으로독성시험은특정실험동물을대상으로행해진다. 따라서독성물질에대한노출방법및실험동물을선정할때는평가하고자하는대상 ( 사람또는생태계생물 ) 에가장근접하도록하는것이가장이상적이다. 특히사람에대한안전성을확립하는차원에서는독성시험방법및실험동물의상태등이엄격히규제또는관리되어야하며, 시험결과의해석은가능한한정확하게이루어져야한다. 이처럼시험의진행과정과결과의해석을지침화하여시험자또는실험실간의오차를최소화하는작업을독성시험의표준화라고하며, 이는환경오염물질의유해성 / 위해성평가단계에서가장기본을이루는중요한과정이라고할수있다. 표준화된독성시험은해당시험항목에대한테스트가이드라인 (testguideline) 또는공정시험방법과같이구체적인지침또는법 ( 또는고시 ) 등으로표현될수있다. -i-

20 최근들어독성시험이나위해성평가에있어생체지표란용어의사용이급격히증가하고있다. 생체지표 (biomarker) 란 생체내의생화학적성분, 세포학적구조또는기능의변화를나타내며, 생물시스템에서측정이가능한감수성이있는성질 이라정의하고있다 (Bearer, 1998). 특히환경오염에대한생체지표라함은환경중유해물질에의해유발되고또한감지될수있는생체내에서의반응이라고할수있다. 또한생체지표가환경오염물질에의한노출과위해성정도를이해하는데유용한도구로활용될수있기때문에 (Travis, 1993), 이들지표는화학물질의노출및생물학적유효농도측정에있어정량적잣대로사용되고있다. 이처럼노출과 ( 악 ) 영향사이의관계를이어줄수있는생체지표의사용은독성시험에서지속적으로증가하고있는데그이유는비교적짧은시험기간이소요되는시간적경제성, 다른측정항목에비해저용량노출에서상대적고민감성등의장점을지니고있기때문이다. 예로, 해독과정에서작용하는효소의활성화, DNA adduct 등과같은유전적변이, 발암성유전자의활성화, 내분비계장애물질에의해유도되는에스트로젠조절유전자발현등이대표적인생체지표로사용되고있다. 그러나모든생체지표가독성평가에이용될수는없는데생체지표가독성시험에적용되기위해서는대상물질의노출에따른용량-반응양상을나타낼수있어야하며, 이들지표를측정하는시험방법및관찰항목등에대한검증화작업을거쳐야한다. 환경오염물질, 특히유해화학물질의독성자료생산을위해서는국제적으로검증된시험항목및측정방법이필수적으로요구되고있다. OECD는화학물질의유해성을평가하기위한시험법 (OECD 화학물질테스트가이드라인 ) 의제정또는개정작업을지속적으로진행하고있으며, 여기에는생태독성과건강영향 ( 인체독성등 ) 분야에해당되는시험들이핵심을이루고있다. 이러한제 개정작업은 OECD 회원국을중심으로각국에서생산된유해성평가와이와관련된다양한연구결과들을보완하여추진 - i-

21 되고있다. 따라서우리나라의경우도 OECD 화학물질테스트가이드라인의제 개정작업및해당시험법 ( 안 ) 을검증화하기위한국가간프로그램에적극적으로참여하기위해서는관련분야에대한시험기술기반을시급히마련해야할필요가있다. 또한국내에서현재운영되고있는 화학물질유해성시험방법 ( 국립환경과학원고시 ) 은아직까지양적 ( 시험항목수 ), 질적측면에서보완할점이많으며, 따라서 OECD 테스트가이드라인과의조화 (harmonization) 를바탕으로본시험방법을발전시키는데집중해야할것이다. 특히독성시험에서생체지표 (biomarker) 및분자생물학적인시험기술의중요성이날로증가하고있는실정이므로국내에서도이러한기술을바탕으로유해화학물질의영향을신속 정확하게판정할수있는분자생물학적기법을확립하여야한다. 이상서술한바와같이독성시험과생체지표는매우밀접하게연관되어있다. 따라서본연구사업은국내에서사용되고있는시험법 ( 특히생태독성분야 ) 의개선 보완및새로운시험방법의도입과표준화, 그와더불어독성시험법에적용가능성이있는생체지표를발굴하는데목적을두고있다. 따라서대표적인환경오염물질로서현재이슈화되고있는 6가크롬을시험대상물질로선정, 이물질을사용하여주요생태독성시험법을표준화하고, 이와동시에 6가크롬에대한독성자료를생산하였다. 또한 6가크롬에대해민감성있게발현되는생체지표의발굴을시도하여향후표준화된독성시험의종말점 (end points) 으로적용하기위한기초데이터를도출하였다. 결론적으로본연구사업에서시도하는환경오염물질독성시험표준화와생체지표개발에관한연구결과들은유해성평가에사용되는국내독성시험방법이지속적으로선진화되고발전하는데밑거름이될것으로기대한다. - i-

22 II. 연구내용및방법 1. 어류, 무척추동물류를이용한독성시험수행및표준화 어류와무척추동물류의대표적인시험종 (OECD 공시생물종 ) 인송사리 (Oryzias latipes) 와물벼룩 (Daphnia magna) 을사용하여독성시험을수행함으로써해당시험법을표준화하며, 동시에시험물질의독성자료를생산하고자하였다. 송사리의경우, 어류급성독성시험 과 어류초기생장 단계독성시험 을수행하였으며, 물벼룩의경우는 물벼룩류급성독성시 험 을실시하였다. 독성테스트는 OEDC 화학물질테스트가이드라인 과 화학물질유해성시험방법 ( 국립환경과학원고시 ) 에의거해시험하였다. 가. 어류독성시험 1) 어류급성독성시험 가 ) 시험어종어류급성독성시험에사용된송사리 (Orange-red type, Oryzias latipes) 는국립환경과학원환경노출평가과어류사육실에서수온 25± 1, ph 7.5±0.2, 용존산소 7~ 8 mg /L 및광주기 16시간 /8시간 ( 명 / 암 ) 의조건으로사육하였으며, 먹이로는알테미아를 1일 1회공급하였다. 급성독성시험은성어 (adult) 와치어 (larvae 단계 ) 두가지생장시기로나누어수행하였는데성어는부화후 5개월이상된 250±50mg의 -iv-

23 무게를가진개체들을대상으로하였으며, 치어의경우는부화후 2 일 경과된 larvae 수준의개체를사용하였다. 한편, 본시험어종은외관상 기형이없으며, 건강한개체만을사용하였다. 나 ) 시험물질및시험방법시험물질은 6가크롬인 potassium dichromate (K 2 Cr 2 O 7, Aldrich chemical Corp., USA) 를사육수 ( 탈염소된수돗물 ) 에용해시켜 stock solution을제조하였고, 이를재차사육수에일정비율로희석하여농도별로시험에적합한용액을만들었다. 예비시험을통해처리군의농도를설정하였으며, 대조군외에 5 개 의처리군을두었다. 처리군의농도는 16, 32, 64, 128, 256mg /L ( 공비 2) 로설정하였으며, 용매를사용하지않았기때문에추가로용매대조군을두지않았다. 대조군및각처리군에시험어 10마리씩을투입하였으며, 노출기간은 96시간동안실시하였다. 시험물질의노출은 24시간마다시험용액을교환해주는반지수식 (Semi-tatic) 방법을사용하였으며, 노출기간동안치사율과행동반응을관찰하였다. 시험도중치사어는발견즉시제거하였고, 아가미호흡이멈춘상태를사망으로간주하였다. 치사율에따른반수치사농도 (LC 50 ) 는 Probits 통계처리법을사용하여 산출하였다. 기타시험에관한사항은국립환경과학원고시 화학물질 유해성시험방법 ( 화학물질유해성시험기관의지정등에관한규정의 [ 별 표 5] 에해당 ) 및 OECD 화학물질테스트가이드라인 에제시된방법 에의거해진행하였다 (OECD, 1992a) -v-

24 2) 어류초기생장단계독성시험 가 ) 시험어종시험어종으로사용한송사리 (Orange-red type, Oryzias latipes) 는국립환경과학원환경노출평가과어류사육실에서수온 25±1, ph 7.5±0.2, 용존산소 7~ 8mg /L 및광주기 16시간 /8시간 ( 명 / 암 ) 의조건으로사육하였으며, 먹이로는알테미아를각각 1일 1회충분히공급하였다. 수정란확보를위해산란에사용된개체는부화후 5개월이상된외관상기형이없고건강한암 수개체를사용하였다. 나 ) 시험물질및시험방법시험물질은 6가크롬인 potassium dichromate (K 2 Cr 2 O 7, Aldrich chemical Corp., USA) 를사육수 ( 탈염소된수돗물 ) 에용해시켜 stock solution을제조하였고, 이를다시사육수에일정비율로희석하여농도별로시험에적합한용액을만들었다. 예비시험을통해처리군의농도를설정하였으며, 대조군외에 5 개 의처리군을두었다. 처리군의농도는 16, 32, 64, 128, 256mg /L ( 공비 2) 로설정하였으며, 용매를사용하지않았기때문에추가로용매대조군을두지않았다. 건강한송사리성어로부터산란된알가운데배반구가분할되기직전또는바로직후의수정란들을취하여각처리군별로 60개의수 정란을유리비이커에넣어 200 ml의시험용액을첨가하여일정하게 유지되도록하였다. 노출기간은대조군의부화가 100% 완료되는데충 분한시간인 14 일동안시행하였다. 시험용액의교환은반지수식방법 -vi-

25 을적용하여 2일에 1회갈아주었다. 초기배발생에서크롬 (potassium dichromate 로서 ) 의영향을알아보기위해대조군과처리군에서의성장과정을실체현미경 (Karl Zeiss co.) 을이용하여 24시간마다관찰하였으며, 시험과정에는대조군및처리군의사망률, 부화율, 배발생과정, 기형발생률및독성증상등을관찰하였다. 기타시험에관한사항 은국립환경과학원고시 화학물질유해성시험방법 ( 화학물질유해성시 험기관의지정등에관한규정의 [ 별표 5] 에해당 ) 및 OECD 화학물 질테스트가이드라인 에제시된방법에의거해진행하였다 (OECD, 1992b). 그림 I-1. 어류초기생장단계독성시험흐름도 -vi-

26 나. 물벼룩독성시험 1) 물벼룩급성독성시험 가 ) 시험종 물벼룩은 OECD 공시종인 Daphnia magna 를시험종으로선정하였 으며, 생후 24 시간미만의어린개체를독성시험에사용하였다. 물벼 룩사육을위한먹이는녹조류인 Selenastrum 을배양하여공급하였다. 물벼룩배양액은 OECD 에서추천하는 M4 media 를사용하였으며, 사용 전 24 시간동안폭기시켰다. 나 ) 시험물질및시험방법시험물질은 6가크롬인 potassium dichromate (K 2 Cr 2 O 7, Aldrich chemical Corp., USA) 를배양액인 M4 media에용해시켜 stock solution 을제조하였고, 이를희석수 (M4 meidia와동일 ) 에일정비율로재차희석하여농도별로시험에적합한용액을만들었다. 크롬의경우킬레이팅의우려가있어 M4 media에서 EDTA는제외하였다. 예비시험을 통해처리군의농도를설정하였으며, 대조군외에 5 개의처리군을두 었다. 처리군의농도는 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.2 mg /L ( 공비 2) 로설정 하였으며, 용매를사용하지않았기때문에추가로용매대조군을두지 않았다. 건강한물벼룩 (Daphnia magna) 성체로부터생산된 24 시간미만의 어린개체들을채취한후대조군및처리군당 30 ml의시험용액이첨 가된비이커에 5 개체씩투여하였다. 동일농도군에서 4 개씩의반복군 -v i-

27 (replicates) 을설정하였다. 노출기간은 48 시간동안실시하였으며, 시 험용액을교환하지않는지수식방법을사용하였다. 시험기간동안유영저해 ( 시험용기를조용히움직여준후, 약 15초후에관찰하여일부기관은움직이나유영하지않는경우 ) 가발견된개체는즉시제거하고기록하였다. 시험결과는유영저해율을바탕으로 24시간및 48시간 EC 10 또는 EC 50 으로산출하였다. 기타시험에관한사항은국립환경과 학원고시 화학물질유해성시험방법 ( 화학물질유해성시험기관의지정 등에관한규정의 [ 별표 5] 에해당 ) 및 OECD 화학물질테스트가이드 라인 에제시된방법에의거해진행하였다 (OECD, 2004). 그림 II-2. 물벼룩급성독성시험흐름도 -ix-

28 표 II-1. 물벼룩 (Daphnia magna) 배양액인 M4 media ( 또는 M7 media) 의조성 M4 또는 M7 배양액을각농축액농도조제하기위한각농축액의 ( 또는물질 ) 명 ( mg /L, 증류수 * 농축도 ( 배 ) ) 첨가량 ( ml /L, 멸균증류수 ) M4 media M7 media 1) 농축액 I ) CaCl 2 2H 2O 293,800 1, ) MgSO 4 7H 2O 246,600 2, ) KCl 58,000 10, ) NaHCO 3 64,800 1, ) Na2SiO 3 9H 2O 50,000 5, ) NaNO 3 2,740 10, ) KH 2PO 4 1,430 10, ) K 2HPO 4 1,840 10, ) Vitamin 농축액 - 10, Thiamine HCl ,000 3가지 vitamin을 하나의 증류수 Cyanocobalamine 10 10,000 에용해시켜 Vitamin 농축액 을 Biotin ,000 제조한다. 각농축액 ( 또는물질 ) 명 농도 ( mg /L, 증류수 * ) 농축도 ( 배 ) - M4 기준 - 농축액 I을조제하기위한각농축액의첨가량 ( ml /L, 멸균증류수 * ) M4 media M7 media H 3BO 3 57,190 20, MnCl 2 4H 2O 7,210 20, LiCl 6,120 20, RbCl 1,420 20, SrCl 2 6H 2O 3,040 20, NaBr , Na 2MoO 4 2H 2O 1,230 20, CuCl 2 2H 2O , ZnCl , CoCl 2 6H 2O , KI 65 20, Na 2SeO , NH 4VO , Fe-EDTA 용액 1, Na 2EDTA 2 H 2O FeSO 4 7H2O 5,000 1,991 2,000 2,000 M4 media 에서의농축액 I 조성 2 가지농축액을 1:1 의비율로혼합하여멸균하여 Fe-DETA 용액을제조한다 -x-

29 2) 배양액조성차이에따른물벼룩급성독성비교현재물벼룩 (daphnia magna) 을사육하고있는배양액은대표적으로 OECD 테스트가이드라인에서권장하는 M4 또는 M7 media와 EPA 배출수독성시험법에서사용하는 MHW(moderate hard water) 또는 HW(hard water) media가있다. 따라서본연구사업에서는각기다른배양액에서사육한물벼룩을대상으로배양액 ( 희석수포함 ) 조성차이에따른독성값을비교함으로써물벼룩독성시험의표준화를위한참고자료로사용하고자하였다. 가 ) 시험종물벼룩은 OECD 공시종인 Daphnia magna에서생산된생후 24시간미만의어린개체를시험에사용하였다. 시험용물벼룩은 MHW media 와 M4 media에서각기배양한물벼룩모체로부터얻은개체를사용하였다. 나 ) 시험물질및시험방법시험물질은 6가크롬인 potassium dichromate (K 2 Cr 2 O 7, Aldrich chemical Corp., USA) 을사용하였으며, 시험을위한배양액과희석수는 EPA MHW media와 M4 media에서 EDTA를포함한배양액을각각사 용하였다. 처리군의농도는 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.2 mg /L ( 공비 2) 로 설정하였으며, 모든시험과정은앞장의물벼룩급성독성에서수행한 M4 media에서와동일한방법을사용하였다. 시험종료후배양액차이 (M4 media(edta 포함 ), M4 media(edta 제외 ) 와 MHW media) 에따른독성값 (EC 50 ) 을상호비교하였다. -xi-

30 다. 선충, 지렁이독성시험 1) 선충독성시험 가 ) 시험종 시험생물은선충 (Nematode) 가운데학명이 Caenorhabditis elegans ( 이하 C. elegans) 이며, Strain 이 N2 인것을사용하였다. 나 ) 시험물질및시험방법 6가크롬화합물인 Potassium dichromate(k 2 Cr 2 O 7, Aldrich chemical Corp., USA) 를멸균증류수에의해용해시켰으며, 1M stock solution을만든후순차적으로희석을하였다. 급성독성을위한시험물질의농도는대조군 (control), 15.6, 31.2, 62.5, 125, 250, 500 및 1,000uM 을설정하였다. 선충 (C. elegans) 의크롬에대한독성을측정하기위해서우선적으로동일한생장단계의 C. elegans 를포집하였으며, 이를위한방법은다음과같다. 액체배지안에서 C. elegans 를성장하게한후성체가품고있는알 (egg) 들만모아먹이가없는상태에서하루동안배양하였다. 배양개시 16시간경과후, 부화된알들은 L1 stage 단계에서성장을멈추며, 따라서본시기에 C. elegans 를일괄적으로포집하였다. 포집된 C. elegans 는 24well plate에 well당 20마리를투입하고, 농도별로 potassium dichromate 를처리한후, 24시간동안배양하였다. 24시간노출후농도값으로무영향관찰농도 (NOEC), 10% 영향농도 (LC 10 ) 및반수영향농도 (LC 50 ) 를산출하였다. -xi-

31 2) 지렁이급성독성시험 가 ) 시험종 시험종은 OECD 공시종인지렁이 (Earthworm, Eisenia fetida) 를사 용하였으며, 시험은사육온도 20±2 와 Lux 의광조건에서 사육한건강한개체를대상으로실시하였다. 나 ) 인공토양및시험물질의조제인공토양은 Sphagnum peat : Kaolin clay : 산업용모래를 1:2:7의비율 ( 건조중 ) 로조제하여사용하였다. 인공토양의각성분가운데 Sphagnum peat는 ph 5.5~ 6.0으로분말상으로건조된것, kaolin clay 는 kaolinite 함량이 30% 이상인것, 산업용모래는입경 50~200 μm인 모래가 50% 이상을차지하는것을사용하였다. 인공토양의조성성분 들을비율에맞도록정확히측량한후 ph를 6.0±0.5가되도록 CaCO 3 를일정량가하여소형믹서기를사용하여혼합하여조제하였다. 지렁이급성독성시험을위한대상물질로서 6가크롬인 potassium dichromate(k 2 Cr 2 O 7 ) 를멸균증류수에용해시켜 stock solution을제조하였고, 이를사육수에일정비율로재차희석하여농도별로시험에적합한용액을만들었다. 노출농도는예비시험을거쳐반수치사농도를포함할수있는범위를예상하여설정하였으며, 따라서 50, 100, 200, 400 및 800mg /kg ( 공비 2) 의농도 (nominal concentration) 를설정하였다. -x i-

32 다 ) 시험물질의노출 각처리군별로유리수조 (15 14cm) 에미리떼어둔모래 100g 을 넣고농도별로조제된시험물질 5ml을모래위에고르게뿌린다음용매를휘발시킨후인공토양을추가로넣어모래와혼합하였다. 대조군의경우에는모래 100g이담긴유리수조에아세톤용매 5ml을고르게뿌리고휘발시킨후시험군과동일한방법으로인공토양을혼합하였다. 시험방법은국립환경과학원고시인 화학물질유해성시험방법 ( 화 학물질유해성시험기관의지정등에관한규정의 [ 별표 5] 에해당 및 OECD 테스트가이드라인 에제시된방법에의거해진행하였다 (OECD, 1984). 농도별로조제된시험군당 10마리의지렁이를처리하였으며, 각시험군은 4개의반복수를두었다. 노출은 14일동안실시하였으며, 치사율은 7일과 14일 2회관찰하였다. 인공토양의수분유지를위해플라스틱필름을사용해수조를밀봉하였으며, 필름에는공기구멍을내어통기가되도록하였다. ph와수분함량측정은시험개시전과시험종료후에 2회실시하였다. 반수치사농도 (LC 50 ) 는 100% 치사농도와 0% 치사농도사이에치사농도가 2개이상인경우에는 probit법을사 용하였으며, 2 개미만인경우에는 moving- average angle 법을사용하 여산출하였다. 반수치사농도외에무영향관찰농도 (NOEC, No Observed Effect Effect) 을산출하였다. -xiv-

33 그림 II-3. 선충 (Caenorhabditis elegans) 독성시험의흐름도 그림 II-4. 지렁이 (Eisenia fetida) 독성시험의흐름도 -xv-

34 라. 하천저질에서의크롬독성평가방법에관한연구 1) 시료채취독성평가방법연구를위한조사지역은중금속오염지역으로보고된지역이아닌일반하천을대상으로하였으며, 전라북도군산시농수로부근인 oo 소하천을조사지점으로선정하였다. 저질시료는삽을이용하여채취하였으며, 동시에같은지점에서하천수를채수하였다. 채취한저질과하천수는시료병에공기가들어가지않게담아, 4 로보관하여실험실로운반하였다. 2) 수분함량측정증발접시를사용하여저질의수분함량을측정하였다. 증발접시는 105~110 의드라이오븐에서 1시간동안건조시킨다음실리카겔건조용기안에서냉각시킨후사용하였다. 무게를측정한증발접시에저질시료를담고재차무게를측정한후, 105~110 의드라이오븐에서 4시간동안건조시킨다음실리카겔건조용기안에넣어냉각시킨후무게를측정하였다. 수분함량은다음의방법으로계산하였다. 수분 (W,%)=(W2-W3)/(W2-W1) 100 W1 : 건조된증발접시의무게 W2 : 건조된증발접시의무게 + 저질시료 ( 건조전 ) W3 : 건조된증발접시의무게 + 저지시료 ( 건조후 ) -xvi-

35 3) 저질의용출수용성인크롬의저질내농도와동시에독성여부를확인하기위하여건조된저질 20g을 80ml의사육수에서 180rpm으로교반하면서 8시간동안용출시켰다. 용출된시료는두가지로분리하였는데우선크롬등중금속측정을위해서산 (acid) 처리 ( 분석을위한전처리 ) 를하였고, 저질독성평가를위해서는전처리를실시하지않았다. 4) 크롬농도분석크롬등중금속측정을위한시료는저질, 하천수, 저질용출수, 용출에이용된사육수 ( 대조군 ) 모두 4개의시료였다. 전처리는하천수와사육수의경우, 질산처리후여과하였으며저질과저질용출수의경우에는질산 -과산화수소 -염산처리를거쳐저질내유기물질을모두녹인뒤여과하여액상의시료를준비하였다. 전처리는우선 2g( 고체시료, 액체시료는약 5ml) 의시료를유리용기내에서질산 ( 약 5ml) 과 1:1로섞어반응이멈출때까지기다린후, 시계접시를얹어가열판에서용액을서서히가열하였다. 그후질산 5ml을넣어준후재차가열 분해하여용액의총량이 5ml가되었을때 35% 과산화수소용액을추가로 3ml를첨가하고계속가열하였다. 시료액부피가다시 5ml정도로 감소하면가열을멈추고상온에서식힌후염산 10 ml를첨가하고, 갈 색연기가사라질때까지가열하였다. 시료를충분히분해시키고, 상온에서식힌후필터페이퍼 (watman 41, 42) 를이용해여과하였으며, 3차증류수를사용해총부피가 60ml가되도록하였다. 전처리가끝난후시료는 ICP-MS를사용해각각의농도를분석하였다. -xvi-

36 5) 독성시험및독성평가를위한프레임워크 ( 안 ) 도출저질의유해성을평가하기위해서는저질용출액와하천수를사용하여어류와물벼룩을사용하여독성시험을실시하였다. 독성시험에사용된저질용출액과하천수는별도로 ( 어류의경우사육수, 물벼룩의 경우 M4 배양액 ) 희석하지않았으며, 각각의시험방법은화학물질을 사용한독성시험에서와동일한방법을사용하였다. 어류독성시험의경우는송사리 (Oryzias latipes) 를대상으로하였으며, 급성독성의경우 96시간노출하였고, 초기단계독성시험의경우 14일간수정란을노출하였다. 물벼룩은 OECD 공시종인 Daphnia magna를사용하였으며, 48 시간동안노출하여유영저해 (immobility) 를관찰하였다. 독성결과의검토는앞장에서의 potassium dichromate 독성값과저질용출액등에서의크롬측정값의비교를통해실시하였다. 한편, 본크롬유해성시험을바탕으로하천저질중의중금속독성평가를위한프레임워크 ( 안 ) 을도출하였다. -xv i-

37 2. 독성물질에대한생체내반응조사및생체지표발굴 가. 마이크로어레이기법을이용한생체내반응조사 1) 시험물질및시험방법 시험생물은선충 (Nematode) 가운데학명이 Caenorhabditis elegans( 이하 C. elegans) 이며, Strain 이 N2 인것을사용하였다. 2) 시험물질및시험방법시험물질은 6가크롬화합물인 Potassium dichromate(k 2 Cr 2 O 7, Aldrich chemical Corp., USA) 를사용하였으며, 노출은선충독성시험을통해얻어진무영향관찰농도 (24h-NOEC, 6.9mg /L) 와 10% 치사농도 (24h-LC 10, 78.3mg /L) 로수행하였다. 노출방법은앞에서의 24시간선충독성시험과동일하게하였다. 3) RNA 추출 노출이종료된후액체질소하에서막자사발을이용하여 C. elegans 를분쇄하였고, 분쇄물로부터 RNA 추출킷트 (QIAGEN Co.) 를이용하여총 RNA 를정제하였다. 총 RNA 정제방법은킷트내의 메뉴얼에의거해수행하였으며, 최종 RNA 의농도는 nano-drop 을이 용하여산출하였다. 정제된 RNA 샘플은 -80 에보관하였다. -xix-

38 4) DNA 칩마이크로어레이시험및패턴분석 마이크로어레이에사용되는총 (Total) RNA 의양은약 20~50 μg가 량을필요로하기때문에소량의 RNA 를증폭시키는방법을사용하 였다. RNA 증폭은 Ambion사의 Amino Allyl MessageAmp RNA kit를사용하였으며, Cy3와 Cy5는 Amersham bioscience사에서구입하였다. RNA 2μg에 1μl의 oligo-(dt) primer를첨가하고, RNase free water로최종부피 (final volume) 가 12μl가되도록맞춘다음혼합한후에 spin-down 하였다. 이어서 70 에서 10분간가열한후에얼음에서 1분간방치하여변성 (denaturation) 시켰다. RNA와 primer 혼합 용액 (mixture solution) 에 10X First Strand Buffer 2 μl, Ribonuclease inhibitor 1 μl, dntp Mix 4 μl, Reverse Transcriptase 1 μl를넣고최 종부피가 20 μl가되도록한후, 42 에서 2 시간반응 (incubation) 시 켰다. 2 차합성 (Second Strand cdna synthesis) 를위해 10X second strand buffer가포함된 mixture 80μl를첨가하여최종부피가 100μl가되도록한후, 16 에서 2시간반응시켰다. 그후 cdna 정제 (purification) 를통해 arna가합성되도록 37 에서최소 6시간에서최대 14시간까지반응시키고, 즉시 arna purification을시행하였다. 상기과정에서얻어진대조군및처리군의 arna 샘플농도를 20μg으로동일하게조정한후, DMSO에용해시킨 Cy3를대조군샘플 (control sample arna) 에첨가하고, 반면 Cy5 는처리군샘플 (treated sample arna) 에첨가하여잘혼합한뒤혼합액을 30분동안실온에서암조건으로반응 (incubation) 시켰다. 상기반응이완료되면, 60 에서미리예열 (pre-warming) 한 3X pre-hybridization buffer를 labeled RNA에첨가하고칩 (chip) 위에로딩 (loading) 하였다. 이어서 -xx-

39 Hybridization 과정은 16 시간이상 42 배양기 (incubator) 에서수행 하였다. Hybridization 반응이완료된후, low stringency wash buffer 에서커버슬립을제거하고가볍게세척한뒤 high stringency wash buffer 에 chip 을넣고 30 초간세척하였다. 최종적으로슬라이드를 700rpm 에서 5 분동안원심분리하고건조시킨후가능한한빠른시 간내에슬라이드를스캐닝 (scan) 하였다. 나. 독성물질에대한생체지표발굴및시험법적용연구중금속인크롬의유해성확인및위해성평가를위해서는해당생물종에서의독성메카니즘을명확히규명하는것이매우중요하며, 이와더불어노출 -반응관계를해석하기위해서는독성영향에대한명확한종말점 (end-points) 을필요로한다. 따라서크롬에대해명확한용량 - 반응양상을보이며, 보다민감한독성값 ( 예, NOEC, LOEC 등 ) 을도출할수있는시험방법또는생체지표를선정하여독성시험에적용하는것이매우중요하다고판단된다. 각국에서수행된바있는크롬에대한생체지표및시험법연구를조사 검토하였으며, 이를통해크롬을포함한중금속류에적합한시험방법과생체지표를발굴하고자하였다. -xxi-

40 3. 화학물질유해성시험방법제 개정 가. OECD 테스트가이드라인제 개정추진현황검토현재 OECD에서는화학물질유해성시험을위한가이드라인의제 개정작업을지속적으로진행하고있다. 즉, 새로운독성시험방법의필요성이제기될경우이에대한초안을만들고, 검토및검증 (validation) 작업을통해신규로테스트가이드라인으로추가하며, 기존의시험방법에대한개선이필요한경우, 수정 보완하는작업을진행하고있다 (OECD chemicals testing-guidelines). 따라서본연구사업에서는 OECD 에서추진하는테스트가이드라인 의제 개정에대한최근의동향을검토 분석하였다. 나. 화학물질유해성시험방법일부항목제 개정국립환경과학원고시인 화학물질유해성시험연구기관의지정등에관한규정 의 [ 별표 5] 에해당하는 화학물질유해성시험방법 은각시험항목별로 ( 물리화학적시험분야, 생태영향시험분야, 미생물분해및생물농축성시험분야, 건강영향시험분야 ) 필요성에따라개정또는신규제정을통해시험항목을추가하고있다. 즉, 국내에서의적용성, OECD 테스트가이드라인 (TG) 개정에따른 TG와의조화 (harmonization) 등을바탕으로진행하고있다. 따라서본연구사업에서는이들시험법중생태독성분야를중심으로일부항목을개정하고제정 ( 신규추가 ) 하는작업을수행하였다. -xxi-

41 III. 연구결과및고찰 1. 어류, 무척추동물류를이용한독성시험수행및표준화 독성시험에는크게건강영향분야인인체독성에관한시험과생태계생물들을이용하는생태독성시험으로구분할수있다. 인체독성은주로렛드, 마우스등설치류를대상으로한시험으로평가하고있으며, 생태독성시험은수생생물, 육생생물, 저서생물등시험대상의종류가매우다양하다. 수생생물의경우주로어류, 갑각류, 조류가시험종으로사용되는데연체동물, 강장동물, 극피동물등다양한수생생물또한독성시험종으로이용된다. 어류의경우대개급성독성은 96시간을권고하고있으며, 만성의경우는수개월의노출을권고하고있다. 무척추동물은보통 24시간에서 96시간까지의노출시험을급성독성시험으로간주하며, 만성독성시험은물벼룩 (Daphnia) 의경우 21일정도를권고하고있다. 한편, 조류, 박테리아, 원생동물의경우는만성독성시험을위한노출기간이어류나무척추동물에비해짧은것이특징인데 3~ 4일간의노출했을때의관찰값 ( 예, NOEC) 도만성독성값으로평가하기도한다 (RIVM, 2001). 예를들어조류 (algae) 는며칠동안에도여러세대에걸쳐분열이일어나므로어류에서는급성노출기간인 4일노출시험이조류에서는만성독성시험으로간주된다. 본연구에서는생태독성가운데가장핵심을차지하고있는물벼룩과어류, 지렁이에대한독성시험을수행하고표준화된시험방법을도출하고자하였다. 또한 OECD 등에서현재표준화된가이드라인이존재하지않는선층을이용한독성시험의표준화가능성을제시하고자하였다. -xx i-

42 가. 어류독성시험 1) 어류급성독성시험 어류를이용한급성독성시험은독성시험가운데가장기본이되는시 험이다. 어류의경우 OECD, US EPA, 그리고 ASTM 에서급성독성영향의 노출기간을 96 시간으로권고하고있다. 6 가크롬 (hexavalent chromium) 은급성독성자료가비교적풍부하게존재하고있으며, 특히어류등수 생생물에서의독성데이터는다양한종 (species) 에서산출된바있다. 본연구에서송사리를이용한급성독성시험결과, 성어에서 6 가크롬 의반수치사농도 (96 시간 -LC 50 ) 는 mg /L (as K 2 Cr 2 O 7 ) 로산출됨에따라 기존어류시험결과에서와마찬가지로어류에서는독성이낮은것으로나 타났다. 한편, 어류급성독성시험에서는적용연령이아닌치어 (larvae) 의 급성독성을수행했을때 96 시간 LC 50 은 mg /L (as K 2 Cr 2 O 7 ) 로산출되 었다. 그결과성장시기별독성비교시성어가갓부화한개체보다 6 가크롬에대한민감성이높게나타났다 ( 표 III-1 참조 ). 상기시험은 OECD 화학물질테스트가이드라인 (TG No.203) 에의거해 수행하였으며, 시험상의유의한문제점은발견되지않았다. 그러나표준화 를위해서는수용성이낮거나없는시험물질에대해서노출방법의개선이 필요하며, 따라서이에대한연구와검토가추가로요구되었다. 표 III-1. 송사리급성독성시험결과 Potassium dichromate (mg/l) 시험물질노출시간성어 (Adult) 치어 (Larvae) LC 10 LC 50 LC 10 LC 시간 시간 xxiv-

43 2) 어류초기생장단계독성시험본시험은수서생물가운데어류의생장초기단계에서화학물질의영향을평가하는데목적이있으며중금속류, 내분비계장애물질등의생태독성에서주로사용되는시험이다. 송사리수정란에중크롬산칼륨 (K 2 Cr 2 O 7 ) 을농도별로처리한결과, 부화율은그림 III-1과표 III-2에나타낸바와같이본시험농도범위 (0~ 256μg /L) 에서대조군과처리군사이에유의성있는차이는나타나지않았다 ( 대부분의개체가부화됨 ). 그러나사망률의경우, 128μg /L 처리군에서부터증가하기시작했는데사망한개체는대개부화직후부터 4일이내에발견되었다. 특히 256μg /L K 2 Cr 2 O 7 농도에서는시험기간동안 80% 이상의치사율을보였다. 한편, 시험기간 14일동안생존한 embryo( 부화전 ) 또는 larvae( 부화후 ) 에서의이상증상 ( 기형을 포함한 adverse effects) 은시험물질의농도가증가함에따라영향이 증가하는용량 -반응양상은나타나지않았다. 즉, 생존개체는육안적으로유의한현상은관찰되지않았으며, 사망개체의대부분은부화후 2~ 3일동안에발견되었다. 대조군의소수 embryo에서도이상증상이관찰되었으나그증상은심하지않았으며, 추후회복됨으로써정상적인부화가이루어졌다. 대조군및처리군의일부에서혈액순환 (blood circulation) 저해와부종 (edema) 이관찰되었고, 이들개체는결국부화되지못하고사망하였다 ( 그림 III-2 참조 ). 시험결과, 치사율에대한무영향관찰농도 (NOEC) 는 64μg /L로산출되었다. 상기시험은 OECD 화학물질테스트가이드라인 (TG No.210) 에의거해수행하였으며, 시험상의유의한문제점은발견되지않았다. -xxv-

44 그림 III-1. 6가크롬 (Potassium dichromate) 에대한초기생장단계독성시험에서의부화성공률 (hatch success), 사망률 (dead rate) 및기형발생률 (adverse effects) 그림 III-2. 6가크롬 (Potassium dichromate) 에노출된송사리 embryo와 larvae 1: normal embryo, 2: dead embryo, 3: normal larvae, 4: Edema ( 부종 ) -xxvi-

45 표 III-2. 6 가크롬 (potassium dichromate) 농도별송사리의치사율 (mortality), 부화율 (hatch success) 및악영향 (adverse effects) 농도 Conc. ( μg /L) 치사율 Mortality (%) 부화율 Hatch Success (%) * 악영향 (Adverse effects) (%) 주요이상증상 (Major types of lesions and deformations) 0 10 ( 6/60) 93 (56/60) 8 ( 5/60) No severe effects (10/60) 93 (56/60) 10 ( 6/60) (11/60) 90 (54/60) 10 ( 6/60) (10/60) 88 (53/60) 13 ( 8/60) (19/60) 90 (54/60) 12 ( 7/60) (56/60) 87 (52/60) 17 (10/60) 치사율 (mortality) 은시험물질의노출후 14 일동안측정된값이다. * 악영향 (adverse effecrs) 은심장박동저해 (cardiovascular defect), 출혈 (hemorrhage), 혈액순환저해 (blood circulation inhibition), 부종 (edema) 및사망 (death) 을포함한것이다. 악영향은시험물질노출시작후 12 일 동안관찰 측정된값이다. Blood circulation inhibition Peritoneal/Visceral edema -xxvi-

46 가. 물벼룩독성시험 1) 물벼룩급성독성시험물벼룩 (Daphnia magana) 를 이용한 급성독성시험 결과, 6가크롬 (K 2 Cr 2 O 7 로서 ) 의 반수영향농도는 48시간및 96시간 -EC 50 이 각각 0.53 및 0.32mg /L로나타났다. 한편 10% 유영저해를보이는 EC 10 은 48시간 후 0.07mg /L을보였다. 한편 Daphnia magana에대한급성독성시험결 과의비교 검토를위해수서생물에대한크롬 (K 2 Cr 2 O 7 로서 ) 의급성독 성자료를조사하였는데어류에서는 20~ 120mg /L 범위의반수치사농도 (96h-LC 50 ) 를보였으며, Daphnia pulex 등다른종의물벼룩류에서는 48h-EC 50 가 0.02~0.2 mg /L 수준으로나타났다 (IPCS Inchem 1988). 이러한결과를토대로무척추동물인물벼룩이어류에비해 6 가크 롬에대해매우민감한것으로드러났다. 그림 III-3. 6 가크롬 (potassium dichromate) 에 의한물벼룩급성독성시험 -xxv i-

47 물벼룩은일반적으로수중에서부유생활을하거나수초에붙어사는작은갑각류 (crustaceans) 를일컫기도하나학술적으로는지각류 (cladocerans) 를의미한다. 일부크기가큰육식성의물벼룩을제외하고는대부분작은체장을가지고있다 (Dodson and Frey 2001). 물벼룩은우리나라뿐만아니라전세계적으로널리분포하는것으로알려져있는데근연종간의교배에의한잡종 (hybridization) 이출현함에따라형태적인분류에있어서많은어려움이있다고알려져있다. 물벼룩은수중에서식물플랑크톤에의한 1차생산이나부유성유기물 질을섭취하여상위먹이사슬단계로전달하는 1 차소비자의역할을 담당하고있고, 수서곤충또는작은물고기, 치어등의먹이로서도중요한역할을하고있다. 현재국내 외에서독성시험에가장널리사용되고있는물벼룩은 Daphnia magna 종이다. Daphnia magna는다른물벼룩류에비해크기가비교적크고, 사육이용이하고, 번식력이높다는장점을가지고있다. 또한유해화학물질에대한감수성도높아환경독성을연구하는시험생물로서좋은요건을지니고있다. 이처럼 D. magna가 OECD 공시종으로서국제적으로널리이용되고, 검증되어있기때문에우리나라에서도 D. magna를시험용물벼룩으로사용하고있는상황이다. 따라서 D. magna를이용한시험체계및독성시험에관한표준화는 OECD 등국가간의조화를이루어진행하는것이바람직하다고본다. 아울러국내에널리서식하는물벼룩종인 Daphnia galeata 또는 Daphnia simils 등을이용한독성시험표준화작업도국내실정에적합한환경위해성평가를시도하는측면에서필요한부분이라할수있다. -xxix-

48 2) 배양액조성차이에따른물벼룩급성독성비교 배양액조성차이에따른급성독성값의차이여부를조사하고자, M4 media 와 MHW media 를시험물질의희석수로사용하여비교하였 다. 또한중금속의경우 EDTA 와킬레이팅하기때문에그에따른독 성차이역시조사하였다. 조사결과, M4 media(edta 를 media 조성 에서제외한경우 ) 와 MHW media 에서의크롬 (K 2 Cr 2 O 7 로서 ) 독성차이 는거의나타나지않았다. 그러나 EDTA 를배양액조성에서제외하지 않는 M4 media 의경우는 EC 50 값이 0.59 mg /L 로상승하였으며 ( 독성이 감소 ), 따라서크롬과같은중금속독성시험의경우에는 M4 media 에서 EDTA 를제외하는것이필요하였다 ( 그림 III-4 참조 ). 그림 III-4. 배양액차이에따른 6 가크롬 (potassium dichromate) 의 물벼룩급성독성비교 -xxx-

49 다. 선충, 지렁이를이용한독성시험 1) 선충독성시험중크롬산칼륨 (K 2 Cr 2 O 7 ) 을 15.6~1,000uM 범위의농도로노출하였으며, 이를통해선충 C. elegans의치사율중 LC 10 (10% 치사농도 ) 과 LC 50 ( 반수치사농도 ) 을산출하였다. 시험물질 15.6uM 이하의농도에서는모두생존하였으나 31.2uM에서부터사망개체가나타났으며, 1,000uM에서는모든개체가 24시간이내에사망하였다. 시험물질처리 24시간후, 125uM, 250uM 및 500uM의농도에서각각 4.4%, 6.8% 및 46.8% 의치사율을나타내었으며, LC 10 은 23.4uM (6.88mg/L), LC 50 은 266uM (78.26mg/L) 로각각산출되었다. 한편대조군과처리군대해서성장정도를비교하였으며, 그결과처리군개체의성장억제역시 6가크롬의농도증가에따라강하게영향받은것으로드러났다. 그림 III-5. 6 가크롬에의한선충독성시험 -xxxi-

50 본독성시험에사용된선충의일반명은예쁜꼬마선충으로서학명 으로는 Caenorhabditis elegans 이다. 몸길이는 1 mm정도로서수명은 약 3 주이며, 자연계에서는흙속에서생활하고있다. 체세포수는 959 개인데그중 302 개가신경세포이나아직까지는신경세포의경로 ( 신경회로 ) 가완전히밝혀지지는않은상태이다. 1998년에게놈정보 (9700만염기쌍 ) 가다세포생물로서는처음으로해독되었으며, 약 1만 9000개의유전자를지니고있는것으로추정되었다 (Reichert et al. 2005; Horvitz 1999). 시험용생물종으로서의장점은사육이용이하고, 관찰이쉬우며다루기가비교적편리한것으로알려져있다. 특히의학분야에서는노화나수명에관련하는유전자가상당수밝혀져있어, 선충을사용한노화연구가진행되고있다 (Kenyon 1988). 이러한장점들로인해 C. elegans 는독성시험 ( 환경독성시험 ) 을위한모델생물로서의가능성을충분히지니고있다고판단된다. 특히짧은생활사로인해 1주일이내의노출을통해만성독성시험이가능하다. 본시험결과선충은 6가크롬과같은중금속류에충분히반응을나타낼것으로보이며, 따라서중금속, 내분비계장애물질등보다많은물질에대한독성데이터를확보한다면환경독성 ( 특히토양중오염물질에의한독성 ) 에대한시험생물종으로자리잡을수있을것으로기대된다. -xxxi-

51 그림 III-6. 6 가크롬노출선충의성장비교 -xxx i-

52 2) 지렁이급성독성시험지렁이 (earthworm) 급성독성시험결과, 6가크롬 (K 2 Cr 2 O 7 으로서 ) 의반수치사농도 (LC 50 ) 는 7일경과후에 239.5mg / kg이었고, 14일후에는 206.5mg / kg를나타내었다. 한편, 치사율에대한무영향관찰농도 (NOEC) 는 7일및 14일후에모두 50mg /kg이었으며, 7일까지 100% 치사가나타나는시험군은 800mg /kg 였으며, 14일후에 100% 의치사율을나타내는농도는 800mg /kg으로동일하였다 ( 표 III-3 참조 ). 인공토양의 ph 또는수분의지나친변화는시험물질이아닌환경요인에의한독성을야기할수있기때문에측정되어야할중요한항목이다. 따라서독성시험시작및종료후의 ph 변화를조사한결과, 인공토양의 ph는시험시작전과시험종료후 범위로서지렁이에독성을유발하지않는범위였다. 한편, 인공토양의수분변화역시독성을유발할수있는요인으로는작용하지않았다. 지렁이는토양에서유기물을분해하고, 그배설물이식물에영양분을공급함과동시에토양의구조를향상시킨다는측면에서매우중요성이높은생물이다. 또한이러한토양에서식하는대표적생물체인지렁이에대해서는각국에서환경오염물질이토양생물군에미치는영향을평가하는측면에서관심이점차증가하고있으며, 따라서국내에서도지렁이를이용한독성및위해성평가연구에보다많은관심과연구가필요한상황이다. 지렁이는토양에서화학물질의독성을평가하기위한매우유용한지표생물로서시험에사용하기에매우적절한생물학적특성을가지고있는것으로보고되고있다 (Neuhauser et al. 1985; Susana et al. 2005; Maria et al. 2005). 유럽연합 (EU) 과 OECD는지렁이를생태독성시험의주요공시생물로이미채택하였으 -xxxiv-

53 며, 그이유는환경오염평가를위해실험실조건에서독성시험을수 행하는데있어시험생물로적절하기때문이다. 지렁이가운데 OECD 에 서는 Eisenia foetida 종을공시생물로제시하고있는데본지렁이종 은화학물질에대한감수성이비교적높고생활사가짧아부화후 7~ 8주정도지나면성체가된다. 이외에도번식률이높고사육이용이하여독성시험생물로국제적으로널리사용되고있다 (OECD 1984). 2006년에 OECD에서도만성독성인지렁이생식영향시험 (Earthworm reproduction test) 이채택되어표준화된지렁이독성시험법이점차강화되고있다. 그러나수서생물에비해지렁이독성시험에대한인프라는아직까지취약한상태이며, OECD에서도아직까지시험법제 개정에대한관심은상대적으로미흡한실정이다. 본지렁이급성독성시험을바탕으로기존의국내화학물질유해성시험방법및 OECD 테스트가이드라인을검토한후, 표준화된시험법을제시하였다 (3장에제시 ). 표 III-7. 6 가크롬 (potassium dichromate) 에 의한지렁이 (Eisenia fetida) 급성독성결과 -xxxv-

54 라. 하천저질에서의크롬독성평가방법에관한연구 1) 크롬의일반적성질및분포중금속의일종인크롬 (chromium) 은원소기호 Cr ( 원자번호 24), 원자량 , 비중 7.19를갖는흰색의광택을지닌부서지기쉬운금속으로서높은융점 ( 약 2,000 ) 을지니고있다. 주로존재하는화합물로서는 3가 (trivalent) 와 6가 (hexavalent) 이며, 토양이나암석등에서는대부분 Cr 3+ 로서존재하며가장안정한형태를취하고있다 (Hartford et al. 1979). 2가크롬은강한환원제로불안정하여활동성이없는 3가크롬으로산화된다. 수용액에서안정한상태는 3가와 6가이며, 환경에서주로검출되는상태이다. 4가와 5가크롬화합물은불안정하여모든크롬화학종중가장적게존재하며, 대부분크롬이온들은 6가크롬에서 3가로환원되는과정에서일시적인중간산물로형성된다. 6가크롬은잠재적독성물질로서많은연구들이진행되고있는물질이다. 6가크롬은강력한산화제로서대부분의경우산화물이나할로겐산화물로서존재한다. 6가크롬의산화형태는 ph에따라영향을받게되는데 ph>6인경우 chromate 이온 (CrO 2-4 ) 이우세하며, 2<pH<6에서는 dichromate 이온 (Cr 2 O 7 2- ) 과 HCrO 4 - 이온으로, ph<1 인조건에서는 H 2 CrO 4 형태로주로 존재하며각기산화력에차이를나타내고있다. 크롬및그화합물의주요발생원인크롬철광은 Cr 3+ 상태이며, Cr 6+ 화합물은크롬산염및중크롬산염이주를이루고있고, 화학적활성이높으며생체내에서영향력 ( 독성 ) 도높은것으로알려져있다. 크롬 (Chromium) 은여러산화형태의화합물로존재하며주로합금, -xxxvi-

55 안료, 피혁및직물공업, 촉매, 목재방부제등에이용되고있다. 산업활동에따른크롬의환경방출로인해지표및지하수층으로크롬이오염될수있으며, 금속광산으로부터의용출또한환경중크롬오염의원인인것으로알려져있다. 크롬화합물가운데 6가는비록작용기전이명확히밝혀져있지는않지만돌연변이나발암성물질로알려져있다 (Kauppinen 2003). 또한 6가크롬은기화하기쉬워소화관과폐, 피부를통하여체내에쉽게흡수되므로폐암등의원인이된다 (Holmas 2006). 체내에서강한산화력에의해독성이나타난후에상대적으로독성이적은 3가크롬으로변하여체내에잔류하기도한다. 강한산화력에의한 6 가크롬의독성은위장염, 피부염, 궤양을일으 키는원인이되기도한다. 스테인레스용접, 크롬도금, 크롬염료및가죽제혁생산등크롬사용이확대되면서제조 사용자들에대한노출그리고, 환경중으로배출되면서수질, 토양은물론환경생태계에대한위해성도우려되고있다. -xxxvi-

56 2) 하천저질에서의크롬분석및독성평가 조사지점의저질, 하천수, 저질용출액, 용출에사용한사육수 ( 대조 군 ) 등총 4 개시료를대상으로총크롬을측정하였으며, 그결과는 표 III-4와같다. 분석결과, 크롬의대부분은저질중에존재하였으며, 하천수의경우는사육수에존재하는수준인 basal level로검출되었다. 참고로크롬외에측정된주요중금속의수준도표 III-4에나타내었다. 조사지점의저질을용출한결과, 용출액에서는총크롬이 83.6μg / ml으로검출되었다. 본용출액을대상으로어류와물벼룩을사용해독성시험을실시하였으며, 그결과용출액에서는대조군유의한차이가나타나지않음에따라어류 (Oryzias latipes) 와물벼룩에독성은발견되지않았다. 표 III-3. ICP-MS를이용한중금속함량측정값 ( μg / ml ) 중금속 저질 하천수 저질용출액 사육수 증류수 Cr Cd As Pb xxxv i-

57 본조사에서측정된저질내총크롬의함량은 13,730μg / ml이나실질적으로독성이강한 6가크롬의정도는파악할수는없었다. 따라서저질을용출시켜크롬을측정한결과, 저질용출수의총크롬함량은 83.6μg / ml로측정됨에따라저질중에수용성이높은 6가크롬농도는 83.6μg / ml이내로추정되었다. 그러나하천저질중의 6가크롬기준이설정되어있지않아기준치초과여부는판정할수없었다 ( 참고로 6가크롬에대한토양오염기준은 4mg/kg 수준 ). 한편, 저질시료를채취한동일지점하천수의총크롬의함량은 2.9μg / ml로검출농도는미약하였다. 일반적으로수중의 Cr 6+ 은 Cr 3+ 에비해불안정한상태로서환경중에존재하는다양한유기물질또는환원물질에의해 Cr 3+ 로환원될수있다 (Katz and Salem 1994). 본조사에서나타났듯이일반하천에존재하는크롬은상당부분저질에흡착되어있고, 하천수에존재하는크롬양은상대적으로적은것으로사료되었다. 그러나, 저질중에크롬이잔류할경우, 집중호우와같이자연적인영향으로인해저질중크롬이용출됨으로써 6가크롬의하천수오염가능성을유념할필요가있다. 최근하천저질에서의유해중금속 ( 납, 카드뮴, 크롬등 ) 의오염도를측정하고평가하기위한연구들이증가하고있는데아직까지하천수내저질에서의중금속함량측정과중금속의생태유해성 (hazard) 평가, 그리고이들간의원인관계규명을위한연구방법적가이드라인은제시되지못하고있다. 따라서본연구에서는크롬을대상물질로하여하천저질중의중금속독성평가를목적으로한실험방법적측면에서의프레임워크 (framework) ( 안 ) 을제시하였다. -xxxix-

58 그림 III-8. 하천저질중중금속독성평가를위한프레임워크 ( 안 ) - 프레임워크 ( 안 ) 에대한각주 (footnotes) 1 시료채취후저질 (sediment) 을 105 에서 4시간건조시킨후수분함량을측정 2 수용성인중금속 ( 예, 6가크롬 ) 의측정을위하여저질시료 : 용매 ( 사육수 ) = 1 : 2 또는 1 : 4의비율로저질을용출 3 ICP-MS 등을이용해각시료들의중금속농도를측정하고, 해당중금속의기존생태독성자료의검출농도를비교 4 수용성인중금속독성을측정하기위해수생생물독성실험 ( 송사리수정란, 물벼룩 ). 5 비수용성인중금속의독성평가를위해건조된저질로독성실험 (Hyalella azteca( 단각류 ) 및 Eisenia fetida( 지렁이 ) 등의저서생물독성실험 ) -xl-

59 2. 독성물질에대한생체내반응조사및생체지표발굴 가. 마이크로어레이기법을이용한생체내반응조사 중금속물질인 6 가크롬 (K 2 Cr 2 O 7 로서 ) 에의해선충 (C. elegans) 내에서발현이증가되거나억제되는유전자들을확인하고자 6.9mg /L (NOEC) 와 78.3mg /L (LC 10 ) 농도의 K 2 Cr 2 O 7 를 C. elegans에처리하였고, 그결과미규명유전자 (unknown genes) 를포함한총 22,000개의유전자중 20여개의유전자발현에서유의한변화가관찰되었다. 대조군에비해두드러지게발현이증가되거나억제된유전자들을표 III-5와 III-6에각각나타내었다. Serine proteinase inhibitor, UDP-glucuronosyl transferase, glutathione-s-transferase, phosphoserine aminotransferase, hydroxy-acyl- coa dehydrogenase (hacd), immunoglobin and related proteins, acetylcholine receptor, osmotic stress resistant protein, Peptidase M8 family 등의유전자가무영향관찰농도수준인 K 2 Cr 2 O 7 6.9mg /L에의해발현이증가되었다. 반면, 이와동일한크롬농도에서 proteasome regulatory particle, casein kinase II (β subunit), ubiquitin-like protein, heat shock protein, thioredoxin-like protein, animal-type fatty acid synthase, DNA alkylation damage repair protein, nuclear hormone receptor family과같은유전자의발현은억제된것으로나타났다. 한편, 어류및양서류등난생동물의 vitellogenin 등과같이에스트로젠 (17β-estradiol) 호르몬에의해활성이증가되는유전자발현의증가는본크롬농도에서거의관찰되지않았다 (Sumpter and Jobling -xli-

60 1995). 또한본실험에서뚜렷하게발현이유도된유전자들중에는 C. elegans에서그기능이아직까지명확히밝혀져있지않은유전자들이다수포함되어있었으며, 특히크롬과의관련성이밝혀지지않은유전자들이대부분이었다. 6가크롬 (K 2 Cr 2 O 7 로서 ) 에노출된 C. elegans에서의 DNA microarray 실험 결과, serine proteinase inhibitor, UDP-glucuronosyl transferase, glutathione-s-transferase 유전자의발현이두드러지게나타났다. Serine proteinase는생체내의다양한생리학적반응에관여하는데특히, 혈액응고, 섬유소분해 (fibrinolysis), 배아착상 (embryo implantation), 세포분화등에서의단백질가수분해에작용하는효소이다 (Osterwalder et al. 1998). 이때 serine proteinase의작용을조절하는저해제가 serine proteinase inhibitor로알려져있다. Serine proteinase inhibitor는대부분의식물과동물에서발견되고있으며, serpin 이라고불리우기도한다 (Coughlin et al. 1993). Serpin은앞서언급한바와같이 serine proteinase와함께혈액응고, 섬유소분해등의 regulation에매우중요한인자이다. Serpin 유전자서열또는구조에대한연구가다양한생물종에서진행되었으나, 기능에대한정확한메카니즘에대해서는지속적인연구가필요하다. 특히 6가크롬노출에의한선충 (C. elegans) microarray 시험에서 serpin이가장높은발현증가율을보였으나, 증가원인에대해서는명확히알수는없었다. 따라서 serpin과산화적스트레스또는활성산소의증가와의관계, 6가크롬과활성산소의증가등의상관관계등을고려하여발현증가에대한기작을연구할필요성이있다. 한편, 일반적으로환경오염물질은생체내에흡수되었을때대사과정을거쳐비독성화과정을통해해독 배설되는데이때 -xli-

61 -xliglutathion-s-transferase (GST) 는 phase II 단계에작용하며, phase I에서시토크롬계효소들에의해활성화된중간산물을비활성화, 즉비독성화 (detoxicification) 시키는역할을한다. GST는친전자성화학물질을비활성화시키는데특히발암성물질에대한보호체계를형성하는역할을하고있으며, 또한체내에서생성되는자유라디칼을제거함으로써산화스트레스 (oxidative stress) 로부터보호하는역할도하고있다. 이러한기능으로인하여 GST 유전자의활성화를환경오염물질 ( 유해화학물질 ) 의영향에대한생체지표로사용하는경우가많다. 본시험에서도 6가크롬에의해 GST 발현이높게활성화되었는데이때크롬에의한 C. elegans 내에서의산화적스트레스증가가 GST를활성화시키는데기여를한것으로사료되었다. 선충을비롯해다양한생물에서환경오염에대한생체지표로서의 GST 연구는꾸준히진행되고있다 (Coles and Ketterer 1990; Liao et al. 2006). 중크롬산칼륨 (K 2 Cr 2 O 7 ) 의무영향관찰농도 (NOEC) 수준에서발현이억 제된유전자들가운데 myc transcription factor, proteasome regulatory particle, protein kinase, ubiquitin-like proteins, heat shock proteins, thioredoxin-like protein, intracellular lectin의경우, 30배이상의감소를나타내었다. Myc transcription factor는세포분열에관여하는인자로알려져있는데 (Lee et al. 2005) 본시험결과, 6가크롬노출시발현에있어강한억제반응을보였다. Proteasome regulatory protein의경우는 C. elegans가스트레스또는화학물질에노출되었을때증가됨으로써생체를보호하기위한작용을하는것으로알려져있으나, 본농도에서는오히려억제됨으로써보호하는기능이상실되어가는것으로추정되었다. 이밖에 DNA alkylation damage repair protein은생체 DNA 손상을

62 복구하는역할을하는데치사농도이하의저농도에서는 C. elegans 가 스스로 DNA 손상을억제하는기능을보유하고있는것으로보인다. 본실험에서 C. elegans를사용한이유는비록선충이해부학적으로나유전적인측면으로볼때단순한생물체이기는하나, 동물로서지녀야하는기본적인체계는모두갖추고있으며, 소기관을둘러싸고있는표피가투명하여성체로발달하기까지의과정을관찰하기가용이하다는점이다. 또한 1998년에전체게놈의분석이완료됨에따라유전자들의변화를동시에파악하기위한 microarray 시험이가능하게되었다. 향후본기법이현재보다보완되고개선될경우중금속류를포함한환경유해물질들을직접선충에노출하여생체내유전자의변화되는양상과인과관계를밝히는데기여할수있을것이다. 결론적으로선충을실험동물모델로이용한 microarray profiling은환경오염물질의독성을평가하는데있어보다구체적이고정확한방법이될것으로예상되며, 특히발암성등의성질을지닌유해화학물질에의한영향을독성유전체방법을이용해추적함으로써현재의유해화학물질위해성평가에서나타나는불확실성을최소화하는데기여할것으로기대한다. -xliv-

63 표 III-4. 6 가크롬에의해발현이활성화된선충내유전자 (Up-regulated genes) 유전자번호 Gene No. C34F6.1 F01E11.1 M88.6a Y53F4B.30 Y45G12C.2 유전자명 (Gene Name) Serine proteinase inhibitor (KU family) ugt-57 - (UDP-Glucuronosyl transferase) pan-1 - (P-granule Associated Novel protein) gst-27 - (Glutathione S-Transferase) gst-10 - (Glutathione S-Transferase) NOEC (6.9mg/L) 증가비율 LC 10 (78.3mg/L) F26H9.5 Phosphoserine aminotransferase R09B5.6 M02D8.1 hacd-1 - (Hydroxy-Acyl-CoA Dehydrogenase) Immunoglobin and related proteins Y74E4A.1a Acetylcholine receptor C32E12.3 osr-1 - (Osmotic Stress Resistant) Y43F4A.1 C44H4.2 Leishmanolysin-like peptidase (Peptidase M8 family) sym-5 - (SYnthetic lethal with Mec) xlv-

64 표 III-5. 6 가크롬에의해발현이억제된선충내유전자 (Down-regulated genes) 유전자번호 (Gene No.) T20B12.6a ZK20.5 T01G9.6b F25B5.4c Y47H9C.5 B 유전자명 (Gene Name) mml-1 - (Myc and Mondo-Like). Mlx interactors and related transcription factors rpn-12 - (proteasome Regulatory Particle, Non-ATPase-like) kin-10 - (protein kinase). Casein kinase II, beta subunit ubq-1 - (Ubiquitin) Ubiquitin and ubiquitin-like proteins. dnj-27 - (DNaJ domain (prokaryotic heat shock protein)) trx-2 - (Thioredoxin) Thioredoxin-like protein NOEC (6.9mg/L) 감소비율 LC 10 (78.3mg/L) T04G9.3 ile-2 - (Intracellular Lectin) T10G3.6 C52E4.4 F32H2.5 gut-2 - (GUT differentiation defective) rpt-1 - (proteasome regulatory Particle, ATPase-like) asn-1 - (Fatty Acid SyNthase). Animal-type fatty acid synthase and related proteins H24K24.3a Alcohol dehydrogenase Y51H7C.4 DNA alkylation damage repair protein Y53G8AL.2 NADH: ubiquinone oxidoreductase C27C7.4 nhr-73 - (Nuclear Hormone Receptor family) F11C7.2 Zinc metalloprotein M02D8.4a Asparagine synthase (glutaminehydrolyzing) Y37D8A.23c unc-25 (Uncoordinated) xlvi-

65 나. 독성물질에대한생체지표발굴및시험법적용연구 생체지표 (biomarker) 란 생체내의생화학적성분, 세포학적구조또는기능의변화를나타내며, 생물시스템에서측정이가능한감수성이있는성질 이라정의하고있다 (Bearer 1998). 특히환경오염에대한생체지표라함은환경중유해물질에의해유발되고또한감지될수있는생체내에서의반응이라고할수있다. 또한생체지표가환경오염물질에의한노출과위해성정도를이해하는데유용한도구로활용될수있기때문에 (Travis 1993), 이들지표는화학물질의노출및생물학적유효농도측정에있어정량적잣대로사용되고있다. 생체지표연구는독성시험및환경오염모니터링에있어기장초기단계의과정이라할수있다. 따라서사망에이르거나그직전단계에이르지않더라도생체내초기이상증상의감지가가능하게할수있는것이생체지표이다. 본연구사업에서시험물질로사용된 6가크롬에대해서도각국에서는다양한측면에서생체지표연구가진행되어왔으며, 현재도진행중에있다. 본장에서는 6가크롬의주요독성및그와관련된가능성 ( 시험법에적용가능한 ) 있는주요생체지표에대해정리하고검토하였다 간독성 (hepatotoxicity) : 6가크롬은간내의다양한효소의발현에 이상을가져올수있는것으로알려져있다. 따라서이와관련된유전자및효소등을시험법에적용하고자하는연구들이각국에서진행중에있다 (Krumschnabel and Nawaz 2004). 가장대표적인것이 glutathione-s-transferase(gst) 이며, 본효소는일부어류에서유전자서열이규명되었고이에관한연구는각국에서활발하게추진되고있 -xlvi-

66 다. 또한 P450(CYP)-mediated phase I 대사시스템, 중금속과밀접한 관련이있는 metallothionein 등이 6 가크롬에대한생체지표로서연구 가되고있다 (Kostaropoulos et al. 2005). 산화적스트레스 (Oxidative stress) : 6가크롬은생체내에흡수된후 Cr 6+ 에서 Cr 3+ 로대개환원된다. 이러한환원과정에서반응성이높은 활성산소인 ROS(Reactive Oxygen Species) 가생성된다. ROS 의존재는 체내산화적스트레스와지질 (lipid) 의과산화 (peroxidation) 을증가시키는요인이된다 (Valko et al 2005). 한편, 생체내에활성산소가증가하면이를제거하기위해 SOD(superoxide dismutase) 가작용하게된다. 따라서 6가크롬의영향을측정하는생체지표로서 ROS, SOD, lipid peroxidation ( 일반적으로 Malondialdhyde 의생산을측정 ) 등이사용 가능하며, 측정방법에대한표준화가이루어지면크롬등중금속의독 성을평가하는시험법에적용가능하다고보인다. 급성독성및조직병리학적영향 (Acute toxicity and Hisopathological alteration) : 일반적으로 6가크롬의급성독성은인체에서는비교적높으나, 반면에어류등에서는상대적으로독성이높지않은것으로알려져있다. 인체의경우, 크롬독성은통상 6가크롬화합물에의한경우가많다 (Kalahasthi et al. 2006). 피부접촉시화상, 진무름, 괴사등의국부증상을일으키며, 흡입된경우는기침, 녹황색담, 호흡곤란, 폐울혈증상을일으킨다. 삼키면녹황색점액의구토, 복통등을가져오며, 이어서전신증상으로서, 오심, 구토등이계속되고간장해, 위장해를일으킨다. 특히혈뇨, 결핍뇨, 뇨독증에서중증의경우는죽음에이 -xlv i-

67 른다. 신장의병변은뇨세관의괴사, 출혈이주요변화이다. 수생생태의경우아가미등의조직학적인변화를가져올수있다. 6가크롬에노출될경우, 아가미조직의비대 (hypertrophy) 와증생 (hyperplasia) 등을유발할수있으며, 따라서세포조직학적 (histopathological) 관찰역시생체지표로적용가능하다고본다 (Svecevicius 2006). 발암영향 (Cancer risk) : 발암성에관한연구는주로설치류를포함한건강영향분야에서많이알려져있다. 크롬은주로위장관과호흡기도를통해흡수되며, 체내흡수되는양은크롬의형태에따라다르다. 크롬산제조업과안료제조업에종사하는경우에암발생빈도가높다 (Costa and Klein 2006). 폐이외도크롬에의해부비강, 인두등상부기도에암이발생할수있다고알려져있다 (Kuo et al. 2006). 소화기계통의암도크롬에의해유발된다는보고가있으나대조군에비해대부분 1 2 배정도의증가로추측되고있다. 이러한암발생요인이크롬에의한영향인지아닌지는결정하기어려운상황이므로따라서 6가크롬에대한암유도연구는지속적으로필요하다고본다. 갑상선호르몬영향 (Thyroid hormones) : 갑상선호르몬영향은간독성과더불어 6가크롬등중금속류에우려되는독성이다. 따라서지속적으로갑상선장애에대해서는중점적인연구가필요하다고본다. 갑상선호르몬가운데 T 3 (triiodothyronin) 과 T 4 (thyroxin) 을표적호르몬으로선정하였다 (Hook et al. 2006). 갑상선호르몬장애는현재내분비계장애에해당되는항목으로서내분비계장애물질여부를판정하는중요한시험가운데하나이다. 시험대상물질에대한 in vitro 노출또는갑상선호르몬장애시험등이수행됨에따라용량-반응양상이확인될경우, 6가크롬의위해성평가를위한독성값에적용가능하리라예상된다. -xlix-

68 다. 화학물질유해성시험방법제 개정결과 1) OECD 화학물질테스트가이드라인의제 개정추진현황검토 OECD에서는화학물질의유해성을시험하고자테스트가이드라인을작성 운영중에있으며, 본가이드라인에대한개정또는제정작업이지속적으로진행중에있다. 즉, 새로운표준화된독성시험방법의필요성이제기될경우이에대한초안을만들고, 검토및검증작업을거쳐예비항목을신규테스트가이드라인으로추가한다 ( 제정이라고표현함, 그림 III-8 참조 ). 이때제정사유로는공시시험종의만성독성시험이필요한경우등여러가지사유로인해새로운시험법이필요한경우가해당된다. 또한기존의시험방법에대한개선이요구될때수정 보완하는작업을진행하고있으며 ( 개정이라고표현함 ), 개정작업에는시험과정에서도출되는문제점의보완부터시험기간, 시험군수, 관찰항목등의조항을변경하는작업까지포함하고있다. OECD 화학물질테스트가이드라인 (OECD testguidelines for chemicals) 은국가기관, 산업계및학계의관련실험실에서사용되는국제적으로조화로운 (harmonized) 표준화된시험방법이라고할수있다. OECD 화학물질테스트가이드라인 (TG) 은현재 108개시험항목으로구성되어 있는데 (2006 년 3 월현재 ) 물리화학적성질분야 (section 1), 생태유해 성분야 (section 2), 생분해및농축성분야 (section 3), 건강영향분야 (section 4) 등 4개의섹션으로구성되어있다. 본지침에새로운시험항목을제정하기위해서는그필요성에대해회원국간의합의가요구되며, 이는회원국을비롯해각국의전문가, 실무자그룹들의미팅 (OECD 화학물질 TG 실무그룹 ) 을통해이루 -l-

69 어진다. 시험항목의제정에대한필요성으로는각국에서개발된시험 기술을활용해보다개선된시험방법이도출된경우, 기존의 OECD TG 항목을폐지하고대체시험이필요한경우, 새로운이슈등에따라기존의독성시험으로는유해성을평가할수없는경우등이다. 대표적인예로서내분비계장애물질과같이기존의생식독성등으로는명확한유해성을파악하기어려운경우, 새로운기법과종말점 (end-points) 이요구된다. 따라서 OECD에서는 EDTA(Endocrine disruptors testing and assessment) 라는별도의전문가그룹을통해새로운항목을지침에신규로추가하는작업을진행중에있다. 내분비계장애물질독성시험과관련해 28 일설치류반복투여독성 시험 (Repeated dose 28-day oral toxicity study in rodents)", 자궁증식시험 (Uterotrophic assay), 정소비대시험 (Hershberger assay) 이대표적으로개정되거나신규제정하려는시험항목들이다. 건강영향분야에해당하는 28일설치류반복투여독성시험 (OECD TG 407) 의경우는사료선택, 노출기간, 종말점 (end-points) 등을내분비계장애물질에적 합하도록개정하는작업을추진중에있으며, 2006 년 9 월현재개정 ( 안 ) 의검증화 (validation), 그리고 peer review 작업을진행하였다. 한 편, 랫드에서의정소비대시험 (Hershberger assay in rats) 역시 OECD TG로채택하기위한지침 ( 안 ) 을만들어현재검증화작업을진행중에있다 (Owens et al. 2006). 내분비계장애물질외에도 OECD TG 실무그룹에서는기존의시험항목을보완하는개정또는제정프로그램을 2006년에도진행하였다. 2006년상반기에건강영향분야에서 "TG423, Acute oral toxicity(up-and-down)" 시험의개정을마쳤으며, 생태유해성분야에서 -li-

70 는 개구리밥성장저해시험 (TG 221, Lemna sp. Growth inhibition test)" 과 지렁이생식능시험 (Earthworm reproduction test) 이새로이제정되었다. 개구리밥은새로운공시시험종으로채택된경우이며, 지렁이의경우는급성독성시험 (TG 207) 외에보다노출기간이장시간인새로운시험항목을추가한경우이다. 그림 III-9. OECD 화학물질테스트가이드라인의제정과정 -li-

71 2) 화학물질유해성시험방법일부항목제 개정결과현재국립환경과학원에서는 화학물질유해성시험연구기관의지정등에관한규정 을고시화하고있으며, 본규정의 [ 별표 5] 화학물질유해성시험방법 에는생태영향및건강영향등과관련된표준화된다양한독성시험법을수록하고있다 ( 표 III-7 참조 ). 각시험항목은필요성 ( 국내에서의적용성, OECD 화학물질테스트가이드라인 (TG) 개정에따른 TG와의조화 (harmonization) 등 ) 에따라개정또는신규로제정하고있다. 본연구사업에서는이들시험방법중생태독성시험을중심으로독성시험의표준화와그에따른결과를 화학물질유해성시험방법 제 개정을통해제시하였다. 이와관련하여 2006년도에는생태독성분야에서 2항목을제정하고 ( 어류초기생장독성시험, 물벼룩류생식능시험 ), 조류성장저해시험, 물벼룩류급성독성시험, 어류급성독성시험, 지렁이급성독성시험등 4항목을개정하였다. 이가운데어류와물벼룩, 지렁이에 대해서는앞장에서제시한바와같이 6 가크롬을대상으로직접시 험을수행하며, 독성값산출은물론표준화와관련된사항을조사 검 토하였다. 한편, 생태독성분야는아니지만현재화학물질 OECD 테스트가이 드라인의건강영향시험분야에서는설치류의기존급성경구독성시험 (TG401) 을폐지하고대체시험법을제정 운영함에따라국내시험법역시 OECD TG와의조화필요성이제기되었다. 따라서 2항목의대체시험법 ( 급성경구독성시험의고정용량법과독성등급법 ) 을신설하였다. 독성연구의표준화와더불어국내시험법고시의제개정은지속적으로진행할예정이다. 금번제 개정된시험항목명과개요는표 III-8과같으며, 자세한내용은가 )~ 바 ) 와부록에나타내었다. -li-

72 표 III-6. 화학물질유해성시험방법 [ 별표 5] 이수록되어있는고시규정 [ 화학물질유해성시험연구기관의지정등에관한규정, 국립환경과학원고시 ] 표 III-7. 화학물질유해성시험방법 ( 국립환경과학원고시 ) 의제 개정 항목및사유 시험항목 개정 / 제정 ( 신규 ) 개요 조류성장저해시험 개정 유해성심사항목, OECD TG 개정에따른조화 어류급성독성시험 개정 유해성심사항목, 일부내용보완 물벼룩류급성독성시험 개정 유해성심사항목, 일부내용보완 ( 배양액등 ) 지렁이급성독성시험 개정 필터페이퍼방법추가 어류초기생장단계독성시험 물벼룩류생식능시험 급성경구독성시험 ( 고정용량법 ) 급성경구독성시험 ( 독성등급법 ) 신규제정수생생태독성시험의다양성확보 신규제정물벼룩만성독성시험의추가필요성 신규제정 신규제정 기존경구독성시험폐지 (OECD TG401) 및대체시험의신설필요성 (OECD TG 420과의조화 ) 기존경구독성시험폐지 (TG401) 및대체시험의신설필요성 (OECD TG 423과의조화 ) -liv-

73 가 ) 조류성장저해시험 (1) 목적이시험은단세포담수녹조류의성장에미치는화학물질의영향을측정하기위한것으로서, 공장폐수, 유출수, 지하수등의영향을측정하는데도적용할수있다. 이시험방법은물에잘녹는화학물질을기준으로하였기때문에용해도가매우낮은물질의경우반수영향농도 (EC 50 ) 값을구할수없는경우도있다. (2) 정의 2.1 영향농도 (EC x, Effective Concentration) 시험조류의성장또는성장률이대조군에비하여 X% 가감소 될때의시험물질농도이며, 일반적으로노출시간을앞에나타낸다 ( 예 : 72hr-EC 50 ). 2.2 대조물질 (Reference substance) 독성시험이정상적인조건에서수행되었는가를확인하기위하여사용하는물질이며, 대조물질로병행시험을한경우에는그결과를보고한다. 대조물질로는중크롬산칼륨 (K 2 Cr 2 O 7 ) 을주로사용한다. 2.3 생물량 (Biomass) 일반적으로주어진부피내에서살아있는생물체의건조중량을말 한다. 본시험에서는일정부피당조류의세포수를생물량에포함한다. -lv-

74 2.4 성장률 (Growth rate) 시험기간중생물량의대수학적증가를말한다. 즉, 단위시간당 세포농도의증가를말한다. 2.5 수율 (Yield) 시험종료시조류의생물량에서시험개시기조류의생물량을 뺀값의백분율을나타낸다. 2.6 무영향관찰농도 (NOEC, No Observed Effect Concentration) 무영향농도를지칭하는것으로여기서는대조군의값과처리군의값을비교하여통계적으로유의한차이가없는처리군농도중가장높은농도를나타낸다. 2.7 최소영향관찰농도 (LOEC, Lowest Observed Effect Concentration) 최소영향농도를지칭하는것으로여기서는대조군의값과처리군의값을비교하여통계적으로유의한차이가있는 ( 성장에저해를받은 ) 처리군농도중가장낮은농도를나타낸다. 2.8 단위 농도는중량 / 용량 ( mg /L) 으로표기한다. -lvi-

75 (3) 시험의준비 3.1 장치및기구 시험용플라스크 : 적당한용량 (250~500 ml ) 의삼각플라스크 배양장치 : 21~ 24 의온도범위에서온도편차가 ±2 로 유지되고, 약 4,000~ 9,000 룩스 (lux) 범위의광도를유지할수 있는장치를보유하며, 아울러시험용플라스크를기계적으로진탕또는교반을할수있어야한다 ph 측정기 : ph를측정할수있는기기 세포농도를계수하는장치 : 전자입자계수장치 (Coulter counter), 혈구판 (Hemacytometer), 현미경, 형광광도계, 분광광도계, 비색계등 기타일반적인실험실의장치및기구 고압멸균기 (Autoclave) 3.2 배지조류의 배양은 OECD 테스트가이드라인에서 추천하는 배양액 또는 EPA 의 AAP 배양액중선택해서사용하는것을권장한다 ( 주 1, 주 2). 이들배양액의조성을변경해서사용할경우에는명확한 사유 ( 예, 중금속시험물질의배양액성분과의킬레이팅방지 ) 와그 내용을보고서에포함시켜야한다. 3.3 시험조류 아래의조류중한종을선택하여시험하며, 다른종을사용하 는경우에는사용 strain 과출처를보고해야한다. -lvi-

76 1 Selenastrum capricornutum ( 다른이름으로 Pseudokirchneriella subcapitata) ATCC 22662, CCAP 278/4 2 Navicula pelliculosa UTEX Scenedesmus subspicatus ( 다른이름으로 Desmodesmus subspicatus) SAG 4 Anabaena flos-aquae UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A 5 Synechococcus leopoliensis UTEX 625, CCAP 1405/1 3.4 조류의계대배양시험에사용하는조류는활성을유지시키기위하여, 적어도 2 개월에 1회는보존용고체배지에이식하여단세포를만들고, 이단세포를이용하여액체배양을시작하며, 액체배양은약 1~ 2주간격으로계대배양한다. 3.5 전배양시험에사용할조류를얻기위해배양하는것을말한다. 전배양은시험조건과동일한조건에서배양하며, 지수성장기에이른조류를시험에사용한다. 대개시험시작 2일 ~ 5일전에전배양을시작하는데조류의성장속도에따라전배양기간은적절하게조정한다. 시험용조류를관찰하여비정상적인모양이관찰될때는시험에사용하지않도록한다. -lv i-

77 (4) 시험방법 4.1 원리지수성장기에 있는 조류를 여러 농도의 시험물질에 노출시킨 후일정조건하에서배양을하면서조류의성장또는성장률에미치 는시험물질의영향을보는것으로노출시간은일반적으로 72 시간 이며결과는 EC x 값으로나타낸다. 이때시험물질의적절한농도범 위를알기위해농도설정시험을실시하고그결과에기초하여본시 험을실시한다. 4.2 농도설정시험 무균조건에서전배양을한다 시험용플라스크에단계적으로시험물질의농도를설정한후시험용조류를접종한후농도설정시험을실시한다. 조류의생물량 (biomass) 은시험군간에동일하게접종되도록주의하며, 생물량이배지당 0.5mg /L( 건조중량으로 ) 를넘지않도록한다. 배지당초기접종량은조류의종류마다다른데시험기간동안조류가대수기 (exponential growth) 로증식할수있도록생물량을조절하여접종한다. 시험조류의초기접종량은다음의사항을참조한다. (1) Selenastrum capricornutum ~10 4 cells/ ml (2) Navicula pelliculosa 10 4 cells/ ml (3) Scenedesmus subspicatus 2~ cells/ ml (4) Anabaena flos-aquae 10 4 cells/ ml (5) Synechococcus leopoliensis ~10 5 cells/ ml 농도설정시험은 100mg /L 이내의시험물질농도에서진행하 -lix-

78 며, 100 mg /L 농도에서독성이나타나지않을것으로예측되는 경우 100 mg /L 에서한계시험 (limit test) 을수행한다. 한계시험에서 는대조군과 100mg /L 처리군은각각 6개이상의반복구 (replicates) 를두는것을권장한다 시험물질의수용성이매우낮은경우시험물질을기계적으로분산시키거나또는시험조류에대해서독성이낮은유기용매와계면활성제및분산제등과같은보조제를사용하여조제할 수있는데, 이경우보조제의양이 100 μl /L 를초과하지않도록 한다. 또시험물질이휘발성인경우에는상부가넓고마개가달린플라스크를사용해야하는데이때시험결과의해석에유의해야한다 ~ 24 의온도범위에서배양하며온도편차는설정온도의 ±2 를유지한다 백색의연속조명하에서배양하며광도조명은일반적으로 60~ 120μE/m 2 s 범위로한다 ( 이와같은광량은조도계로측정하면약 4,440~8,880 룩스가량이된다 ) 시험기간은 72시간으로하며, 생장이느린조류의경우필요시시험기간을보다증가시킬수있다. 최소한 24, 48, 72시간후에세포수를계수한다. 4.3 본시험 농도설정시험결과에기초하여시험물질의노출농도를결정 하는데, 적어도 5 개농도이상으로하며대수등간격으로설정한 다. 이때공비는 3.2 를초과하지않도록한다. -lx-

79 4.3.2 농도설정시에는최저농도에서조류의성장에대한영향이관찰되지않도록하고, 최고농도에서는대조군과비교하여 50% 이상의성장저해가관찰되도록한다 시험물질조제시유기용매나분산제를사용한경우, 이들물질이포함된대조군 ( 최고농도로들어간농도기준 ) 을추가로두어야한다 처리군및대조군에대해각각 3개이상의반복구를두도록한다 각플라스크의생물량은 24시간마다측정하며, 생물량은일반적으로세포수로측정한다. 전자입자계수장치와비색계를사용하여세포수를측정하는경우, 공시료 (blank) 는배양액을여과한용액을사용한다 ph는시험시작전과시험종료후에측정하며, 원칙적으로는시험기간동안 ph가 1.5 이상변화해서는안된다 형태학적변화등처리군에서나타나는조류의상태를관찰한다 다른모든시험환경은농도설정시험과동일하게한다. 4.4 시험상의유의사항 대조군의세포농도가시험기간내에 16배이상증가하여야한다 육안적으로관찰하여조류이외의미생물증식이확인되지않아야한다 시험물질이불안정하다고판단되는경우, 시험용액내의농 -lxi-

80 도를일정간격을두고측정한다. 이때시험기간동안시험물질 의농도는초기농도의 80% 이상을유지하도록하며, 이때영향 농도 (EC x ) 는시험물질의투여농도 (nominal concentration) 또는초 기측정농도를바탕으로산정한다. 그러나 80% 이상유지되지 않을경우시험기간동안측정된농도의평균값을바탕으로영향농도를산정한다 시험실시기관은시험의신뢰성을확인하기위해서정기적으로대조물질을가지고시험을실시한다 시험용액중의시험물질이조류체내로이행하여소실된경우, 그결과는유효한것으로인정한다. (5) 시험결과및보고 5.1 결과의처리 각처리군과대조군의생물량 ( 세포농도등 ) 을측정시간과시험물질의농도별로표로정리한다 농도별처리군과대조군의평균세포농도 (Y축 ) 를측정시간 (X축 ) 별로그림표에표시하여성장곡선을그린다 반수영향농도 (EC 50 ) 를구하기위해서는아래의방법을사용할수있다. -lxi-

81 5.1.4 평균성장률 시험기간동안일정기간의평균특이성장률 (average specific groweth rate) 은다음식에의하여구할수있다. ln X j - ln X i u i-j = (day -1 ) t j - t i u i-j : 평균특이성장률 (i 에서 j 까지의시간 ) X i : i 시간에서의생물량 (biomass) X j : j 시간에서의생물량 (biomass) 성장률에대한저해율 (%) 은다음의식에의하여구할수있다. u c - u T %I r = u c %I r : 평균특이성장률 (average specific groweth rate) 에 대한저해율 u c : 대조군에서의평균특이성장률 (u) 의평균값 u T : 처리군에서의평균특이성장률 각농도별처리군에서의성장률을구한후, 대조군의성장 률과비교하여각처리농도별상대적성장저해율로써영향농 도 (ECx) 를계산한다 수율 (yield) 에대한저해율 (%) 은다음의식에의하여구할 수있다. 수율은시험종료시의생물량에서시험개시기의생물 량을뺀값을나타낸다. -lx i-

82 (Y c - Y T ) %I y = Y c %I y : 수율 (yield) 에대한저해율 Y c : 대조군에서의평균수율 Y T : 처리군에서의수율 5.2 시험결과의보고 시험결과를보고할때는아래의내용이포함되어야한다 시험실시기관의명칭및소재지 시험책임자및담당자성명, 소속 시험물질 : 화학물질의명칭 ( 일반명, 상품명등명기 ) 입수처, 입수일순도또는불순물 시험조류 : 종명 (species) 및균주 (strain) 번호입수처배양방법 ( 규정방법이외의방법일경우 ) 시험조건 : 시험개시일및종료일, 시험기간시험온도배지조성 ( 규정조성과다를경우 ) 배양장치 ( 제조회사명및형식 ) 시험물질의처리농도 ( 설정치또는실측치 ) -lxiv-

83 시험물질조제방법시험시작전과종료의시험용액의 ph 광원의종류및광도 시험결과 : 24시간마다측정한각시험농도별생물량 : ( 부피당세포수 ), 계수방법생물량의평균값성장곡선영향농도 (EC x ) 와계산방법 ( 예, EC 10, EC 20, EC 50 ) 무영향관찰농도최소영향관찰농도조류의형태학적변화 -lxv-

84 주 1) 조류배양용배지 (OECD 배지 ) 농축액 No. 시약농도 NH 4Cl MgCl 2 6H 2 O CaCl 2 2H 2O MgSO 4 7H 2O KH 2 PO 4 FeCl 3 6H 2O Na 2 EDTA 2H 2 O H 3BO 3 MnCl 2 4H 2 O ZnCl 2 CoCl 2 6H 2O CuCl 2 2H 2 O Na 2MoO 4 2H 2O NaHCO 3 (Na 2SiO 3 9H 2O) 1.5 g/l 1.2 g/l 1.8 g/l 1.5 g/l 0.16 g/l 64 mg/l 100 mg/l 185 mg/l 415 mg/l 3 mg/l 1.5 mg/l 0.01 mg/l 7 mg/l 50 g/l 1) 각각의농축액은멸균증류수또는이온화수에녹인다. 2) 농축액 2와 4는막필터 (0.2μm평균 pore size) 를사용하여여과하고, 농축액 1과 3은막필터로여과하거나 121 에서 15분간습식멸균한다. 각농축액의보관은저온 (4 ) 의암조건에서보관한다. 3) 멸균증류수 500ml에각각의농축액을다음의양으로첨가한다. - 농축액 1: 10ml - 농축액 2: 1ml - 농축액 3: 1ml - 농축액 4: 1ml상기용액에멸균증류수를첨가하여최종 1000ml를맞추어배지를조제한다. 4) 조제된배지의 ph는일반적으로 8.1을나타낸다. 5) 시험용조류로 Navicular pelliculosa를사용할경우, 농축액 4에 Na 2 SiO 3 9H 2O를첨가한다 ( 최종배지에서의농도가 1.4mg Si/L 가되도록함 ) 6) 보존배양용고체배지는상기배지에 0.8% 의한천또는 agar를첨가한다. 주 2) 조류배양용배지 (EPA AAP배지 ) -lxvi-

85 농축액 No. 시약 농도 1 NaNO g 2 MgCl 3 6H 2O g 3 CaCl 2 2H 2O g 4 MgSO 4 7H 2 O g 5 K 2HPO g 6 NaHCO g 1) H 3BO mg 1) - 9) 의시약을멸균증류 2) MnCl 2 4H2O mg 수다음의양으로녹여 500ml 3) ZnCl mg 로맞춘다. 5) FeCl 3 6H 2O mg 7 6) CoCl 2 6H 2 O mg * 시약 10) 의경우는규조류 7) Na 2MoO4 2H 2O mg (diatom) 를배양하는경우에만 8) CuCl 2 2H 2O mg 추가로넣는다. 9) Na 2 EDTA 2H 2 O mg 10) Na 2SeO 4 5H 2O mg 1) 1~ 7의농축액각각 1ml씩을 900ml의멸균증류수또는이온화수에첨가하고최종적으로 1L 로맞춘다. * 규조류를배양할경우에는 Na 2SiO 3 9H 2O 202.4mg을최종조제된 1L 배지에첨가한다. 2) 0.1N 또는 1.0N의 NaOH 또는 HCl을사용하여 ph 7.5±0.1로맞춘다. 3) 여과막 (membrane filter, 0.22μm또는 0.45μm ) 을사용하여멸균한다. 4) 배지의보관은저온 (4 ) 의암조건에서보관한다. -lxvi-

86 나 ) 물벼룩류급성독성시험 (1) 목적본시험은화학물질의수서무척추동물군에대한영향을평가하는데필요한자료를얻기위하여, 수서무척추동물중에서물벼룩류를선정하여유영능력에대한영향을측정하는데목적이있다. (2) 정의 2.1 반수영향농도 (EC 50, median effective concentration) 일정시험기간동안시험생물의 50% 가유영저해를일으키는농도이다. 만일다른기준을적용할경우에는근거와함께보고해야한다. 2.2 지수식시험 (Static test) 시험기간중시험용액을교환하지않는시험을말한다. 2.3 반지수식시험 (Semistatic test) 한다. 시험기간중시험용액을일정기간마다전량을교환하는시험을말 2.4 유수식시험 (Flow-through test) 시험기간중시험용액을연속적으로교환하는시험을말한다. 2.5 유영저해 (immobilization) 시험용기를조용히움직여준후, 약 15 초후에관찰하여일부 -lxv i-

87 기관 ( 촉각, 후복부등 ) 은움직이나유영하지않는것을말한다. 만일다른기준을적용할경우는보고서에명시하여야한다. 2.6 단위 농도는중량 / 용량 (mg/l) 으로표시한다. (3) 시험의준비 3.1 장치및기구 시험용기 : 100ml유리제용기 항온장치 : 18~ 22 의온도범위에서유지될것 ph 측정기 용존산소측정기 경도를측정할수있는장치및기구 자동점멸장치 총유기탄소 (TOC) 또는화학적산소요구량 (COD) 을측정할수있는장치및기구 조도측정장치 기타일반실험실장치및기구 3.2 희석수및배양액 독성시험에사용하는희석수는배양액과동일한것을사용한다 물벼룩배양액은탈염소수도수, 천연수또는조제수를사용할수있으나, 반드시검증된것을사용한다. 일반적으로 OECD -lxix-

88 테스트가이드라인에서사용이권장되고있는 M4 또는 M7 배양액 ( 주 1) 을사용하거나, ISO 시험수 ( 주 2) 를배양액으로사용한다 시험물질이중금속인경우, 희석수를조제할때 EDTA와같은킬레이팅물질은독성에영향을줄수있으므로제외할수있다 ( 예, M4 또는 M7 배양액 ) 배양액의총유기탄소값 ( 먹이인조류를첨가하기전상태 ) 은 2mg/L, 비이온성암모니아는 1μg /L, 잔류염소는 10μg /L이넘지않는것을권장한다 배양액또는희석수의 ph는 6.0~9.0, 경도는 80mg /L(CaCO 3 로서 ) 이상, 용존산소는 3.0mg /L를유지하도록하며, 사용하기전에 24 시간정도폭기시킨다. 3.3 시험종및먹이 Daphnia magna를사용하나, 다른종을사용하는경우는근거를제시하여야한다 출처가명확하고건강한개체를사용한다 독성시험에는생후 24시간미만의어린개체를사용한다 먹이는 Chlorella, Selenastrum 등과같은녹조류를배양하여공급한다. M4 또는 M7 이외의물벼룩배양액을사용하는경우 ( 예, ISO 시험수 ), 조류외에효모등의보조먹이 (Yeast 등 ) 를공급할수있다. -lxx-

89 (4) 시험방법 4.1 원리물벼룩에시험물질을처리한후, 48시간동안관찰하여처리한물벼룩의 50% 가유영저해를받는농도 (48시간 EC 50 ) 를산출한다. 이때시험물질의적절한농도범위를알기위해농도설정시험을실시하고, 그결과에기초하여본시험을실시한다. 4.2 한계시험 시험물질의농도를 100mg /L로하여한계시험을실시한다. 한계시험에는 20개체의물벼룩을사용하는데 ( 가능한한 5마리씩 4반복구사용 ) 동일한개체수의대조군을동시에둔다 한계시험에서유영저해율이 10% 이내일경우, EC 50 은 100 mg /L 이상으로하며, 10% 를넘는경우본시험을진행한다 시험기간, 보조제사용등기타조건은농도설정시험또는본시험과동일하게한다. 4.3 농도설정시험 본시험에들어가기전농도설정시험을실시하여본시험에서의농도범위를결정한다. 농도설정시험에서의농도범위는시험자가적절하게선정한다 농도설정시험에서는각농도당 5개체의물벼룩을사용하 며, 반복구는두지않아도된다. 시험시간은 48 시간또는그이 내로한다 시험물질이난용성인경우에는물벼룩에대하여독성이낮은 -lxxi-

90 유기용매, 계면활성제, 분산제등의보조제를사용하여조제할수 있다. 이경우보조제의농도가 100 mg /L 를초과하지않도록한다 시험물질이휘발성인경우에는밀폐된용기에서시험해야 하는데, 이경우용존산소가 3.0 mg /L 이하가되지않도록주의한 다 ph 는조정하지않는다. 단, 시험용액의 ph 가 6~ 9 를벗어 나는경우, 시험물질농축액의 ph 를시험물질의농도가변하지 않는조건하에서조정할수있다. 4.4 본시험 농도설정시험의결과에기초하여농도범위를설정하며, 적어도 5개이상의농도 ( 대조군제외 ) 를대수등간격으로정하는데, 공비가 2.2를초과하지않도록한다 만일시험물질조제시보조제 ( 유기용매나분산제등 ) 를사용한경우는이들물질이포함된대조군 ( 최고농도로들어간농도기준 ) 을추가로두어야한다. 보조제사용은농도설정시험에서와동일한방법으로한다 한농도당 20개체이상의물벼룩을사용하며, 이때가능한한 4개이상의반복구를둔다 ( 예, 20개체의경우 5마리씩 4개의반복구를사용 ). 시험용액의양은 1개체당 2ml이상으로한다 독성시험전과후에대조군과처리군에서의수온, ph, 용존산소를측정한다. 처리군의경우, 최소한최저농도군과최고농도군에서는상기항목을측정하도록한다 시험기간은 48시간이며, 24시간마다물벼룩의유영저해, -lxxi-

91 기타의상태를관찰하여기록한다. 유영저해의기준은앞의정의에서명시된방법에따른다 시간후의반수영향농도 (EC 50 ) 을산출한다 시험기간동안조명은명 : 암 =16:8시간을유지하도록한다 ~22 온도범위내에서시험을실시하며, 온도의변화는최저온도와최고온도사이가 2 이내를유지하도록한다 ( 예, 18~20, 19~ 21, 20~ 22 ) 시험기간동안에는먹이를주지않고, 원칙적으로통기하지않는다 시험은일반적으로지수식방법을사용하나, 시험물질의안정도가낮은경우, 반지수식또는유수식시험방법을사용할수있다. 4.5 시험상의유의사항 대조군에서물벼룩의사망률은시험종료시까지 10% 를초과하지않아야한다 시험물질이불안정하다고판단되는경우, 시험용액내의농도를일정간격을두고측정한다. 만일측정값이 ±20% 범위를벗어나는경우, 시험농도는측정값에준하여적용한다 시험기간을통하여대조군및처리군에서용존산소가 3mg /L 이하가되지않도록한다 대조군에서시험물벼룩이표면에뜨지않도록한다. -lxx i-

92 (5) 시험결과및보고 5.1 결과의처리본시험종료후적당한통계적방법을사용하여, EC 50 값과 95% 에서의신뢰구간을구하며, 보고서에는통계적방법이명시되어야한다. 5.2 시험결과의보고 시험결과를보고할때는아래의내용이포함되어야한다 시험기관의명칭및소재지 시험책임자및담당자성명, 소속 시험물질 : 화학물질의명칭 ( 일반명, 상품명명기 ) 입수처, 입수일순도또는불순물 시험종 : 학명, 입수처, 사육방법 시험조건 : 시험과정 ( 노출방법, 개체수, 반복수, 시험용액의양등 ) 희석수의수질특성시험기간동안의수질측정치시험농도및시험물질조제방법시험용액에서시험물질의상태 시험결과 : 시험기간동안최대무영향농도와 100% 영향이나타난가장낮은농도각노출농도별누적유영저해개체수 24시간마다반수영향농도 (EC 50 ) 와 95% 신뢰구간 -lxxiv-

93 통계적과정농도-반응그림표대조군에서의치사율기타시험과정에서관찰된이상현상분석된시험물질의농도 -lxxv-

94 주 1) 물벼룩배양액 (M4 및 M7) 의조성 각농축액 ( 또는물질 ) 명 농도 ( mg /L, 증류수 * ) 농축도 ( 배 ) M4 또는 M7 배양액조제 M4 또는 M7 배양액 ** 을조제하기위한각농축액의첨가량 ( ml /L, 증류수 * ) M4 배지경우 M7 배지경우 1) 농축액 I ) CaCl 2 2H 2O 293,800 1, ) MgSO 4 7H 2O 246,600 2, ) KCl 58,000 10, ) NaHCO 3 64,800 1, ) Na2SiO 3 9H 2O 50,000 5, ) NaNO 3 2,740 10, ) KH 2PO 4 1,430 10, ) K 2HPO 4 1,840 10, ) Vitamin 농축액 - 10, Thiamine HCl ,000 3가지 vitamin을하나의증류 Cyanocobalamine (B 12) 10 10,000 수에용해시켜 Vitamin 농축 Biotin ,000 액 을제조한다. * 증류수는멸균증류수를사용한다. ** 각농축액을일정비율로섞은후 M4 또는 M7 배양액을제조한다. 농축액 I 조제 농축액 I을조제하기위한각각농축액농도농축도 ( 배 ) ( 또는물질 ) 명 ( mg /L, 증류수 * 농축액의첨가량 ( ml /L, 멸균증류수 * ) ) - M4 기준 - M4 배지경우 M7 배지경우 H 3BO 3 57,190 20, MnCl 2 4H 2O 7,210 20, LiCl 6,120 20, RbCl 1,420 20, SrCl 2 6H 2O 3,040 20, NaBr , Na 2MoO 4 2H 2O 1,230 20, CuCl 2 2H 2O , ZnCl , CoCl 2 6H 2O , KI 65 20, Na 2SeO , NH 4VO , Fe-EDTA 용액 1, Na 2EDTA 2 H 2O 5,000 2,000 2가지농축액을 1:1의비율로혼합하여 FeSO 4 7H2O 1,991 2,000 멸균하여 Fe-DETA 용액을제조한다 -lxxvi-

95 주 2) 물벼룩배양액 (ISO 시험용액 ) 의조성 물질명 배양액조제를위한농축액농도 (g/l, 증류수 * 농축액의첨가량 ) ( ml /L, 증류수 * ) 1) CaCl 2 2H 2 O ) MgSO 4 7H 2 O ) NaHCO ) KCl * 증류수는멸균증류수를사용한다. -lxxvi-

96 다 ) 어류급성독성시험 (1) 목적 이시험방법은화학물질의수서생물에대한영향을평가하기위 해수서생물중어류에대한화학물질의급성적영향을측정하는데 목적이있다. 시험물질에어류를 96 시간동안노출시킨다. 시험물질 에노출후 24, 48, 72, 96 시간경과시의치사율을기록하여어류의 50% 를치사시키는농도를결정한다. (2) 정의 2.1 반수치사농도 (LC 50, median lethal concentration) 시험생물의 50% 를치사시키는수용액상의시험물질농도이며, 이때시험기간을명기한다 ( 예, 96h-LC 50 ). 2.2 지수식시험 (Static test) 시험기간중시험용액을교환하지않는시험을말한다. 2.3 반지수식시험 (Semistatic test) 시험기간중일정기간마다시험용액을새로교환하는시험을 말한다. 2.4 유수식시험 (Flow-through test) 시험기간중시험용액을연속적으로흘려주면서새로교환하 는시험을말한다. -lxxv i-

97 2.5 단위 농도는중량 / 용량 ( mg /L) 으로표시한다. (3) 시험의준비 3.1 장치및기구 시험용수조 : 화학적으로불활성인재질로만들어진용기 를사용하는데, 일반적으로유리로된것을사용한다 온도제어장치 : 21~ 25 의온도범위에서온도편차를 ± 2 로유지한다 ph측정기 용존산소측정기 기타일반적인실험실의장치및기구 3.2 희석수 양질의천연수나조제수를사용하는것이좋으나, 탈염소처 리한수도수도사용할수있다. 수질의경도는 10mg에서 250mg CaCO 3 /L, ph는 6.5 에서 8.5 사이가적합하다 조제수는다음과같이만든다. 1 Calcium chloride 용액 CaCl 2 2H 2 O 11.76g을탈이온수에녹이고 1리터로맞춘다. 2 Magnesium sulphate 용액 MgSO 4 7H 2 O 4.93g을탈이온수에녹이고 1리터로맞춘다. 3 Sodium bicarbonate 용액 NaHCO g을탈이온수에녹이고 1리터에맞춘다. -lxxix-

98 4 Potassium chloride 용액 KCl 0.23g 을탈이온수에녹이고 1 리터에맞춘다. 모든시약은특급시약을사용하며증류수또는탈이온수의전도도는 10μScm -1 이하여야한다. 1~4까지의용액을 25ml씩취하여섞고, 탈이온수로 1L에맞춘다. 조제후통기하여산소를포화되게한후보관한다. 3.3 시험어류독성시험에사용하는어류는담수에서식하는온수어종중에서쉽게구할수있으며, 그외에경제적, 생태적요인을고려하여결정한다. 시험어종은다음에추천된종가운데 1종또는그이상을선정하여시험에사용한다. 사용어류는건강상태가양호하며외견상기형이없는것을사용한다 사용어종및크기 1 잉어 (Cyprinus carpio, common carp) : 3.0±1.0cm 2 송사리 (Oryzias latipes, ricefish) : 2.0±1.0cm 3 구피 (Poecilia reticulata, guppy) : 2.0±1.0cm 4 제브라피시 (Danio rerio, zebrafish) : 2.0±1.0cm 5 북미산잉어과 (Pimephales promelas, Fathead Minnow) : 2.0±1.0cm 6 블루길 (Lepomis macrochirus, Bluegill) : 2.0±1.0cm 7 무지개송어 (Oncorhynchus mykiss, Rainbow trout) : 5.0±1.0cm -lxxx-

99 3.3.2 어류의순화시험에사용하는어류는시험전에 12일이상실험실의환경에서순화시켜야하며, 시험개시 7일전에는아래의조건에서독성시험에사용할희석수와같은수질의물에서순화시켜야한다. 1 조명 : 하루 12~ 16시간조명 2 온도 : 사용어종의적정생육온도 3 용존산소 : 포화산소농도의 80% 이상 4 먹이 : 시험개시 24시간전까지주 3회또는 1일 1회 5 시험어류 : 사용어류는순화를시작한지 48시간후부터치사어를관찰하여다음의기준에따라처리한다. - 7일안에치사율이 10% 이상이면사용군전부를폐기한다. - 치사율이 5~ 10% 이면다시 7일간더사육한후판정한다. - 치사율이 5% 이하이면시험에사용한다. (4) 시험방법 4.1 원리어류를일정조건하에서시험물질에처리한후, 96시간동안관찰하여처리한어류의 50% 가치사하는농도 (96h-LC 50 ) 를구하는것이다. 96시간동안먹이는주지않는다. 이때시험물질의적절한농도범위를알기위하여예비시험을실시하고, 그결과에기초하여본시험을실시한다. 4.2 한계시험 한계시험은 100 mg /L 의농도에서실시하는데이때대조군을 -lxxxi-

100 두도록한다 시간동안관찰한다 대조군과처리군각 10마리를원칙으로처리하되최소 7마리이상을사용한다 mg /L에서 96시간동안치사어가한마리도관찰되지않을경우시험물질의 LC 50 은 100mg /L 이상으로한다. 단, 한마리이상이라도치사어가관찰될경우본시험을실시한다. 4.3 본시험 본시험에서는적어도 5 개이상의농도 ( 대조군제외 ) 를대 수등간격으로정하는데공비는 2 를초과하지않도록한다. 본시 험에서의농도가무영향농도와 100% 영향농도사이에서설정될수있도록예비시험을수행할수있다. 이때예비시험은시험자가시험물질의농도와방법을적절하게판단하여수행한다 만일시험물질조제시유기용매나분산제를사용하는경우는이들물질이포함된대조군 ( 최고농도로들어간농도기준 ) 을추가로두어야한다 한농도당 7마리이상을처리한다 독성시험기간동안 24시간마다대조군, 최저농도, 최고농도에서수온, ph, 용존산소를측정한다 시간동안매일관찰하여치사어와독성증상을기록하고, 치사어는기록후곧제거한다. -lxxxi-

101 4.4 시험환경 공시어무게와시험수의비율은최대투입량이 1.0g/L를넘지않도록한다 시험용액은농축용액 (stock solution) 희석을통하여조제한다. 수용해도가낮은농축용액의경우초주파분쇄나다른적절한물리적방법에의하여조제한다. 필요시시험용액을용해하기위하여어류에독성이낮은유기용매, 유화제, 분산제가사용가능하나그농도는 100mg /L 를초과하지않도록한다 용존산소농도가포화농도의 60% 이하가되지않도록한다. 통기는시험물질의손실이없는조건으로제공할수있다. 특히시험물질이휘발성인경우밀폐된용기를사용하며통기에주의를한다 시험은 ph를조절하지않고수행하되만일시험물질의농축용액을가한후희석수의 ph가현저히변화할시반복시험한다. 이때농축용액의 ph를농축용액을가하기전의희석수의 ph 와같도록 HCl이나 NaOH를사용하여조절한다 광주기는 12~16 시간 ( 명 ) : 8~ 12시간 ( 암 ) 으로한다 시험기간동안먹이는공급하지않는다 시험어종의적정온도에서 ±2 로온도를유지한다 치사의판정은공시어를건드려도움직이지않거나아가미호흡이중단된경우사망으로판정한다 시험종료후대조군의개체는무게와길이를측정한다. -lxxx i-

102 4.5 시험상의유의사항 대조군에서공시어사망률은시험종료시 10% 를넘지않아야한다 시험기간중시험물질농도는원칙적으로설정농도의 80% 이상으로유지되도록한다 시험실시기관은시험의신뢰성을확인하기위해서정기적으로대조물질을가지고시험을실시하도록한다. (5) 시험결과및보고 5.1 결과의처리 본시험이종료되면적당한통계적방법을사용하여, 급성독성값 (LC 50 ) 과 95% 에서의신뢰구간을구하며, 보고서에는통계적방법을 명시하여야한다. 5.2 시험결과의보고시험결과를보고할때는아래의내용이포함되어야한다 시험기관의명칭및소재지 시험책임자및담당자성명, 소속 시험물질 : 화학물질의명칭 (CAS 번호, 일반명, 상품명 ) 입수처, 입수일순도또는불순물 시험종 : 학명, 입수처순화방법, 순화기간의관찰결과, 사육방법 ( 먹이종류, 먹이량, 먹이공급빈도등 ) -lxxxiv-

103 길이, 무게 시험조건 : 시험과정 ( 노출방법, 사용마리수, 반복수, 시험용액량등 ) 희석수의수질특성시험기간동안의수질측정치시험농도및농축시험물질조제방법시험용액에서시험물질의상태및측정치 시험결과 : NOEC와 100% 영향이나타난가장낮은농도각노출농도별누적치사개체수및누적치사율 LC 50 값과 95% 신뢰구간 LC 50 값을구하는통계적과정농도-반응그림표대조군에서의치사율시험과정에서나타난독성증상시험결과에영향을줄수있는요인의발생 -lxxxv-

104 라 ) 지렁이급성독성시험 (1) 목적이시험은토양을수송매체로하는육생생물에의한기초단계시험으로서토양을이용한지렁이의단기간노출을통하여화학물질의유해성을스크리닝하는데목적이있다. 1 시험용지렁이를사용한다. 2 난용성물질도가능하나수용성인물질에가장용이하게적용된다. 3 본시험법의적용대상은주로화학물질이며공장폐수, 표면수및지하수등에도확대적용될수있다. 4 본시험법에는 필터페이퍼를이용한독성시험 과 인공토양을이용한독성시험 을수록함에따라선택하여시험할수있으나전자는화학물질의스크리닝을위한시험이며, 화학물질의유해성심사, 위해성평가등평가를목적으로하는경우는후자의시험에서얻어진독성값을사용하여야한다. (2) 정의 2.1 반수치사농도 (LC 50 ) 시험생물의 50% 를사망하게할것으로추정되는시험물질의치사농도 (Lethal Concentration) 를말하며, 시험기간을명기한다 ( 예 : 14d-LC 50 ) 2.2 대조물질 시험에사용하는생물의화학물질에대한반응이일정한가를 -lxxxvi-

105 확인할목적으로사용하는화학물질이다. 염화아세트아미드 (CH 2 ClCONH 2 ) 를주로사용한다. 2.3 농도단위 농도는토양건조중량에대한시험물질의무게 ( 예, mg / kg ) 로표 기한다. (3) 시험의준비 3.1 장치및기구 시험용기 : 화학적으로불활성인재질로수용량에따라적절한크기의용기 (1L 비이커등 ) 온도제어가능한배양장치 : 20±2 의온도범위에서설정한 온도를 ±2 로유지하고조도 400~ 800 룩스 (Lux) 로조정가능한 배양기또는실험실 ph측정기 수분측정기 소형믹서 필터페이퍼 : 80~85g/m 2, 두께약 0.2mm의중급이상의재질 소형바이알 : 바닥이납작한원형으로서높이 8cm, 지름 3cm가량되는것 3.2 인공토양의준비 지렁이생육에적당한토양을사용하며다음과같은인공토양 을사용할수있다. -lxxxvi-

106 % Sphagum으로만든진흙 (ph 5.5~ 6.0에가까울것. 식물이남아있어서는안되며, 분말상이고건조시킨것 ) % 카올린점토 ( 카올린함량은가능한 30% 이상일것 ) % 공업사 ( 잔모래인경우 50~ 200μm의입자경인것이 50% 이상점유할것 ) ph는탄산칼슘을가하여 6.0±0.5로조정한다. 위의건조성분을정확한비율로혼화하여대형실험용믹서 또는소형 전기시멘트믹서로완전히혼합한다. 소량의시료를 105 에서건조하여재칭량하고수분함량을측정한다. 전체의수분함량이건조중량의약 35% 가되도록이온교환수를가해완전히혼합한다. 제조한인공토양에압력을가해도물이나와서는안된다. 실제시험에사용하는인공토양은상기조건을만족하는토양으로적절하게제조하여사용하면된다. 3.3 필터페이퍼의준비인공토양대신에필터페이퍼를사용하여독성시험을할수있다 필터페이퍼를이용한시험은수용성이높은물질, 유기용매등을시험물질로할때적당하다 필터페이퍼를바이알의바닥크기로잘라바이알안바닥에깔아준다. 3.4 시험용지렁이 장려하는시험종은 Eisenia foetida (Michaelsen) 이다. 이종은 유기물이풍부한토양에살며, 화학물질에대한감수성은실제토 -lxxxv i-

107 양에살고있는종과비슷하다. 3~ 4 주안에부화하고 20 에서 7~ 8주지나면성숙한다. 다산하며성숙한지렁이는 1주일에 2~ 5 개의난포 (cocoon) 를낳고각난포에서몇마리씩의지렁이가태어난다. 이지렁이는시판되며각종유기폐기물로쉽게번식시킬수있다. 동일계통의지렁이를사육장으로부터보급받아야한다. Eisenia foetida 에는두아종있으며 E. foetida foetida 는환절부위 에특징적인선 (stripping) 모양이있으나, E. foetida andrei 는선모 양이없고붉은색을띤얼룩무늬가있다. 시험에는가능한한 E. foetida foetida 를사용하는것이좋다. 시험에사용하는지렁이는다음조건을만족해야한다. 1 지렁이는생후 2개월이상된성숙한것으로체중이 300~ 600mg이되어야한다. 2 시험개시전 1일이상인공토양에서사육하되먹이는주지않는다. 필터페이퍼로시험을할경우, 시험전 3시간동안증류수로적신필터페이퍼에지렁이를두어장안의내용물이스며나오게하고, 지렁이를물로씻은후물기를말려시험에사용한다. (4) 시험방법 4.1 원리지렁이를 시험조건 하에서 여러 농도의 시험물질에 일정기간 노출하여그사망수를시험기간동안측정하여반수치사농도를산 출하며, 그외의독성영향도관찰한다. 인공토양을이용한시험이 주로사용되며필터페이퍼를이용한시험은화학물질의독성을스 -lxxxix-

108 크리닝하는데적용할수있다. 시험물질의적당한농도범위를설정 하기위해농도설정시험을실시하고그결과에기초하여농도단계 를설정하여본시험을한다. 4.2 농도설정시험 인공토양을이용한독성시험 농도설정시험을위한시험물질의농도는 1000, 100, 10, 1, 0.1, 0.01mg / kg을기본으로하여단계적으로정한다 시험용지렁이는 1개의시험용기에 10마리를사용한다 각농도당처리군및대조군마다 1개의시험용기를사용한다 시험물질이수용성인경우, 증류수에녹이고인공토양과잘혼화한다 시험물질이난수용성인경우, 시험용액은시험용지렁이에대해독성이낮은유기용매, 계면활성제, 분산제등의보조제를사용하여조제해도무방하다. 이경우각처리군은일정농도의보조제를포함하도록하며동일한농도의보조제대조 군을설정한다. 또한보조제의농도가 100 mg / kg을넘지않도 록한다 ph는조정하지않고시험을한다 시험용기마다습중량 750g의시험토양 ( 시험물질 + 인공토양 ) 을유리용기에넣고, 인공토양에 1일이상순화시킨지렁이를빠른속도로증류수에씻은후시험농도당 10마리이상을토양표면에놓는다. 용기는통풍구멍이뚫린플라스틱필 -xc-

109 름으로덮어건조를막는다 ±2 범위로온도를설정하고, 각처리군및대조군의온도를설정온도의 ±2 이내로유지한다 조명은시험기간중점등한다 그밖에노출기간및관찰방법은본시험에서의방법과동일하게한다 필터페이퍼를이용한독성시험 필터페이퍼가깔려있는각각의바이알에농도별로 1ml의시험용액을첨가한다. 시험용액의 ph는사전에측정해기록해둔다 대조군의경우 1ml의증류수를첨가하거나보조제를일정량첨가한다 ( 처리군의최고농도에첨가된유기용매, 분산제등의양과동일량 ) 바이알을수평으로천천히회전시키면서시험용액이첨가된필터페이퍼를건조시킨다 바이알내의필터페이퍼가건조된후, 1ml의증류수를첨가하여적신다 ~ 1.0mg / cm 2 의범위에서농도를선택하여지렁이를투입 (1개체 /1바이알 ) 하여농도설정시험을한다. 반복구의유무또는그수는적절히판단하여정한다 각각의바이알은캡또는플라스틱필름을이용하여밀봉한다 그밖에노출기간및관찰방법은본시험과동일하게한다. -xci-

110 4.3 본시험 인공토양을이용한독성시험 농도설정시험결과, 즉 14일간대부분의지렁이가생존한최고농도및 14일간대부분의지렁이가사망한최저농도를고려하여 5단계이상의농도를대수등간격으로설정한다 각시험농도군및대조군마다시험용기 4개, 즉 4개이상의반복구를둔다. 시험기간은 14일로한다 시험지렁이의생사및그상태 ( 토양속으로들어가는상태, 건드렸을때의반응, 채색등 ) 를시험개시후 7일째및 14일째에관찰하여기록한다. 시험지렁이의머리부분에기계적자극을주어도반응이없을때를사망으로간주한다. 사망한지렁이는즉시제거한다 시험개시전과시험종료후에시험농도군및대조군의토양의 ph와수분을측정한다 시험개시및시험종료시생존한지렁이의체중을측정한다 기타사항은농도설정시험과동일한방법으로한다 필터페이퍼를이용한독성시험 농도설정시험결과를바탕으로 5개이상의농도를대수등간격으로정한다 농도당 10 반복구이상을두며, 20 반복구까지둘수있다 한바이알에 1개체이상을넘지않도록한다 시험기간은 48시간이며, 필요한경우 72시간까지연장할수있다. -xci-

111 시험기간동안 20±2 범위로온도를설정하고, 각처리군및대조군의온도를설정온도의 ±2 이내로유지한다 시험은조명을두지않고어둠속에서진행한다 시험지렁이의머리부분에기계적자극을주어도반응이없을때를사망으로간주한다 기타사항은농도설정시험과동일한방법으로한다. 4.4 시험상의유의사항 대조군의사망률은시험종료시 10% 를넘지않아야한다. (5) 시험결과및보고 5.1 결과의처리본시험종료후사용한지렁이의사망률 ( 시험물질농도당 ) 을계산하여얻은값을적당한통계적방법 (pribit법등 ) 을이용하여반수치사농도 (LC 50 ) 와이의 95% 신뢰한계를산출한다. 5.2 시험결과의보고시험결과를보고할때는아래의내용이포함되어야한다 시험실시기관의명칭및소재지 시험책임자및담당자성명, 소속 시험물질 : 화학물질의명칭 ( 일반명, 상품명등명기 ) 구조식 ( 시성식, 분자식명기 ) 입수경위, 제조년월일순도또는불순물 -xci-

112 물에대한용해도휘발성또는증기압기타물성에관한자료 시험지렁이 : 시험용지렁이의종명, 계통및입수경위적응결과, 사육방법 ( 먹이, 섭식량, 급식빈도등 ) 평균길이, 평균체중 시험조건 : 시험개시일, 시험종료일및시험기간시험온도, 조도및광원의종류바이알의규격및재질필터페이퍼의규격, 재질인공토양의성상 ( 공급원또는강열감량, 유기탄소, 총질소, 등 ) 시험토양의상태, 보관방법, 인공토양에대한시험물질첨가방법시험용기당시험토양의양, 시험지렁이수시험농도군설정근거및각시험농도군시험물질의농도 ( 설정치및실측치 ) 시험용액의 ph 시험결과 : 각시험농도군및대조군의각관찰기간에있어서의사망개체수와누적사망률 시험기간중의각시험농도군및대조군의 ph, 수분측정치 ( 인공토양의경우 ) 시험개시및종료시생존한지렁이의체중 시험종료시농도 - 사망곡선그래프 -xciv-

113 각관측시의 LC 50 치와그산출방법및 95% 신뢰구간 사망률 0% 의최고농도및사망률 100% 의최저농도 기타관찰된영향및그영향이인정된농도 -xcv-

114 마 ) 어류초기생장단계독성시험 (1) 목적이시험방법은화학물질에대한수서생물의생장단계에따른독성영향을평가하기위해어류의생장초기단계에미치는화학물질의영향을측정하는데목적이있다. (2) 정의 2.1 최소영향관찰농도 (LOEC, lowest observed effect concentration) 시험기간중대조군과비교하여시험물질이유의한정도 (p<0.05) 의영향을나타내는것으로관찰되는농도중가장낮은시험물질의농도를나타낸다. 2.2 무영향관찰농도 (NOEC, no observed effect concentration) 시험기간중영향을나타내지않는시험물질의농도로서 LOEC 의바로아래값을나타낸다. 2.3 유수식시험 (Flow-through test) 시험기간중시험용액을연속적으로흘려주면서새로교환하는 시험을말한다. 2.4 반지수식시험 (Semistatic test) 시험기간중일정기간마다시험용액을새로교환하는시험을 말한다. -xcvi-

115 2.5 단위 농도는중량 / 용량 ( mg /L) 로표시한다. (3) 시험의준비 3.1 시험에대한정보시험물질에대한어류급성독성값은생육초기독성시험을위한유용한정보가될수있다. 특히급성독성값이본시험에서와동일어종인경우는시험물질의농도설정에도움이된다. 이밖에물질의구조식, 순도, 물에대한용해도, 안정성, pk a, P ow 등도시험에유용한정보이다. 3.2 장치및기구 시험용수조 : 화학적으로불활성인재질로만들어진용기를사용하는데일반적으로유리로된것을사용한다 온도제어장치 : 시험에서의설정온도범위에서온도편차를 ±2 이내로유지한다 ph측정기 용존산소측정기 기타일반적인실험실의장치및기구 3.3 희석수 양질의천연수나탈염소처리한수도수를사용할수있다 희석수의수질은다음의기준을넘지않은것을사용한다. 총 유기탄소 (total organic carbon) 2 mg /L 이하, 비이온성 -xcvi-

116 암모니아 (unionized ammonia) 1 μg /L 이하, 잔류염소 10 μg /L 이하 3.4 시험어류독성시험에사용하는어류는담수및염수에서식하는어종중에서쉽게구할수있고경제적, 생태적요인을고려하여결정한다. 시험어종은다음에추천된종중에서선택한다 사용어종및시험 ( 사육 ) 온도 1 송사리 (Oryzias latipes, ricefish) : 담수, 24±1 ( 수정란 ), 23±1 ( 부화후 ) 2 무지개송어 (Oncorhynchus mykiss, rainbow trout) : 담수, 10±2 ( 수정란 ), 12±2 ( 부화후 ) 3 미노우 (Pimephales promelas, fathead minnow) : 담수, 25±2 4 제브라피쉬 (Danio rerio, zebra fish) : 담수, 25±2 5 미노우 (Cyprinodon varieqatus, sheepshead minnow) : 염수, 25±2 6 잉어 (Cyprinus carpio, common carp) : 담수, 연어류 (Oncorhynchus kisutch, coho salmon) : 담수, 10 ( 수정란 ), 12 ( 부화후 ) 8 연어류 (Oncorhynchus tschawytscha, chinook salmon) : 담수, 10 ( 수정란 ), 12 ( 부화후 ) 9 연어류 (Salmo salar, atlantic salmon) : 담수, 송어류 (Salmo trutta, brown trout) : 담수 송어류 (Salvelinus fontinalis, brook trout) : 담수, 송어류 (Salvelinus namaycush, lake trout) : 담수, xcv i-

117 13 블루길 (Lepomis macrochirus, bluegill) : 담수, 얼룩메기 (Ictalurus punctatus, channel catfish) : 담수, 대서양실버사이드 (Menidia menidia, atlantic silverside): 염수 조수실버사이드 (Menidia peninsulae, tidewater silverside): 염수 수정란채취 시험어류로부터채란한수정란은비이커나유리페트리디쉬 에옮기고, 미수정란을제거한후수조로옮겨시험에사용한다. (4) 시험방법 4.1 원리어류의초기단계 ( 수정란단계 ) 에서일정농도의시험물질에노출시킨후, 일정시간동안의치사영향, 발생장애, 기형등을관찰하고대조군과비교하여시험물질에대한최소영향관찰농도, 무영향관찰농도등을평가한다. 4.2 시험 적어도 5개이상의농도 ( 대조군제외 ) 를대수등간격으로정하는데공비는 3.2를초과하지않도록한다. 필요한경우예비시험단계를거쳐농도범위를보다좁게설정하여시험할수있다. 농도범위는급성독성시험등의자료를토대로처리군의최고농도가 LC 50 값을넘지않도록한다 만일시험물질조제시유기용매나분산제를사용하는경우 -xcix-

118 는원래의대조군외에이들물질이포함된유기용매대조군 ( 최고농도로들어간농도기준 ) 을추가로두어야하며유기용매농도는 0.1ml /L 이하가되도록한다 한농도당처리한수정란의수는통계적으로유의성을나타낼수있도록충분해야하며, 처리군당수정란의수는동일하게한다. 처리군당수정란의수는최소한 60개이상으로하며, 동일농도에서 2개이상의반복수를두도록한다 시험의방법은유수식또는일정시간에용액을갈아주는반지수식방법을사용한다 시험의시작은수정된직후부터실시한다. 수정란의배반구가분할되기직전또는바로직후의것들을시험용액에노출시킨다 독성시험기간은수정란이부화하고대조군의치어가먹이를공급하지않아도생존할수있는정도의기간을최소기간으로한다. 따라서시험기간은시험어종에따라다를수있다. 노출기간을연장할경우먹이를공급한다 시험기간동안용존산소와수온은매일측정하며, 경도와 ph는시험시작과종료시측정한다. 수온은대조군의한수조에서연속적으로측정하는것이필요하다. 한편수정란및부화어의상태는매일관찰하고기록하며, 만일치사개체가발견되면즉시제거한다 수정란의경우알의색깔이불투명해지거나배아단계에서심장박동이정지하였을경우사망한것으로간주한다. 부화한개체의경우호흡이정지하거나외부자극에대해전혀반응이없 -c-

119 는것을사망개체로판정한다. 4.3 시험환경 수정란의무게와시험수의비율은 0.5g/L 를넘지않도록한다. 용존산소농도는포화농도의 60% 이하가되지않도록유지한다 시험물질을처리한후, 시험용액의 ph가현저하게변화할 시시험목적에따라시험물질용액의 ph 를염산또는수산화나 트륨으로조절할수도있다. 이때대조군에도동일한량을첨가하여야하며, ph를조정할때시험물질의농도가변화한다거나화학반응이일어나서는안된다 광주기는 12-16시간 ( 명 ) : 8-12시간 ( 암 ) 으로한다 시험기간동안필요한경우먹이는공급하되시험어종의발육단계에서가장적절한먹이 ( 예 : 송사리의경우알테미아 ) 와횟수로공급한다 시험온도는시험어종의적정온도를유지하도록한다 조사항목 수정란발생단계시험시작시노출시킨수정란의배 (embryo) 발생단계를가능한한정확하게파악하도록한다 부화와생존율 24시간마다생존개체와부화여부를관찰하여정확히기록하도록한다. 사망한수정란및치어는즉시제거함으로써다른개체에영향을주지않도록한다. -ci-

120 각단계별사망기준은다음과같다. - 수정란 : 탁해지고, 색깔의변화가있는것 - 배 : 배안에서심장박동과같은움직임이없는것 - 치어 : 호흡및심장박동이없거나자극에대해반응이없는것 비정상적외형외부형태가기형적인개체를기록하며사망한경우에만수조에서제거한다 비정상적행동시험기간동안비정상적행동을보이는개체는기록한다 무게시험이종료되면모든생존개체는무게를측정하는데개체별로측정하는것이바람직하나무게측정이어려운경우는군별 ( 시험용기별 ) 로측정할수있다. 무게는건중량으로표시한다 길이시험이종료되면각각의생존개체에대해전길이 ( 머리부터꼬리지느러미까지 ) 를측정하는데, 만일꼬리지느러미의부식또는손상에따른이상이발생할경우표준길이 ( 머리부터꼬리지느러미를제외한몸체길이 ) 를측정한다. 4.5 시험상의유의사항 시험기간중시험물질농도는주기적으로측정하여야하는 데적어도주 1 회의분석치가있어야하고, 시험기간동안시험 농도가설정농도의 ±20% 이내로유지되도록한다 ( 측정시의수 치가설정수치와다를경우시험농도는측정수치를적용한다 ). -ci-

121 4.5.2 시험기간중대조군의부화율은최소 66% 이상이되도록하고, 부화개체의경우시험종료시까지생존율이가능한한 70% 를넘도록한다 유기용매대조군에서의영향이대조군과비교하여유의한차이가있어서는안된다. (5) 시험결과및보고 5.1 결과의처리시험이종료되면적절한통계적방법을사용하여결과를산출하도록하며, 보고서에는통계적방법을명시하여야한다. 5.2 시험결과의보고시험결과를보고할때는아래의내용이포함되어야한다 시험기관의명칭및소재지 시험책임자및담당자성명, 소속 시험물질 : 화학물질의명칭 (CAS 번호, 일반명, 상품명 ) 입수처, 입수일순도또는불순물 시험종 : 학명입수처먹이종류, 공급량, 공급빈도등시험어류의무게, 길이수정란발달단계, 수집및수정란취급방법 시험조건 : 노출방법, 수정란수, 반복수, 시험용액의양등 -ci-

122 희석수의수질특성시험기간동안의수질측정치시험농도및시험물질조제방법시험용액의상태 (ph, 온도, 용존산소, 경도등 ) 먹이종류, 공급량, 공급방법및횟수 시험결과 : 시험과정에서나타난증상및관찰사항 ( 기형상태, 유영상태, 최초부화시작시기, 부화종료시기 ) 대조군에서의부화율및부화개체의생존율각노출농도별누적치사개체수및누적치사율각노출농도별부화율및부화후치어의생존율시험종료후생존개체의체중및체장데이터의통계분석처리방법농도 -반응자료및그래프 NOEC와 LOEC 시험결과에영향을줄수있는요인의발생여부 -civ-

123 바 ) 물벼룩류생식능시험 (1) 목적 본시험의목적은물벼룩의생식능력에미치는시험물질의영향 을 파악하는데있다. 노출기간동안시험군모체에서태어난자손 의개체수를조사함으로써해당물질의생식능에대한영향여부를 파악할수있다. 이외에도치사율, 최초부화시기, 기타독성증상들 을대조군과비교한다. (2) 정의 2.1 최소영향관찰농도 (LOEC, Lowest observed effect concentration) 시험기간동안물벼룩모체 (parent) 의사망또는생식능에영향을나타낼수있는최소농도를의미한다. 즉, 최소영향관찰농도는대조군과비교해통계적으로유의한차이를나타내는처리군의농도중최소값을말한다. 2.2 무영향관찰농도 (NOEC, No observed effect concentration) 최소영향관찰농도바로아래의농도로서물벼룩의생식능에영 향을주지않는최대값을의미한다. 2.3 영향농도 (ECX) 용량반응관계에서시험물질을처리한물벼룩의생식능이대조 군에비해 X% 의감소를일으킬수있는시험물질의농도를말한 다 ( 예, EC 50 : 반수 (50%) 영향농도 ). -cv-

124 2.4 검출한계 (Limit of determination) 화학적분석을통해검출은가능하나정량되지않는최저농도 수준을나타낸다. 2.5 치사 (Mortality) 시험기간동안관찰한물벼룩이유영능력이없거나움직임이없는상태를말하며물벼룩이들어있는시험용기를가볍게움직인후 15초이내에움직임이없을경우치사로간주한다. (3) 시험의준비 3.1 장치및기구 시험용기 : 유리제용기 항온장치 : 18~ 22 의온도범위에서유지될것 ph 측정기 용존산소측정기 경도를측정할수있는장치및기구 자동점멸장치 총유기탄소 (TOC) 또는화학적산소요구량 (COD) 를측정할수있는장치및기구 조도측정장치 기타일반실험실장치및기구 -cvi-

125 3.2 희석수및배양액 생식능시험에사용하는희석수는배양액과동일한것을사용한다 물벼룩배양액은조성을반드시기재해야하며, 반드시검증 된것을사용한다. 일반적으로 OECD 테스트가이드라인에서사용 이권장되고있는 M4 또는 M7 배양액을사용한다 ( 주 1). 한편배양액의총유기탄소 (TOC) 값은 2mg /L를넘지않게 ( 먹이인조류를첨가하기전상태 ) 하는것을권장한다 배양액또는희석수의 ph는 6.0~9.0, 경도는 80mg /L(CaCO 3 로서 ) 이상, 용존산소는 3.0mg /L를유지하도록하며, 사용하기전에 24시간정도폭기시킨다. 3.3 시험종및먹이 물벼룩가운데 Daphnia magna 종을사용한다 출처가명확하고건강한개체를사용한다 생후 24시간미만의어린개체를사용한다 먹이는 Selenastrum, Chlorella 등과같은대수기의녹조류 를배양하여공급한다. M4 또는 M7 이외의배양액을사용하는 경우, 조류외에효모 (Yeast) 등의보조먹이를공급할수있다. 3.4 시험용액의조제 시험물질은배양액에용해또는분산시켜사용한다 시험물질이비수용성이거나수용해도가낮은경우는농축액 (stock solution) 제조시유기용매또는분산제를사용할수있다. -cvi-

126 유기용매의경우 acetone, ethanol, methanol, triethylene glycol, dimethylformamide, DMSO 등을사용할수있으며, 분산제의경우는 cremophor RH40, methylcellulose 0.01% 또는 HCO-40 등을사용할수있다. 용매나분산제는가능한한시험용액의 0.01%(v/v) 를넘지않도록한다. (4) 시험방법 4.1 원리 시험물질에물벼룩을 21 일동안노출하여물벼룩의생식능에영 향을나타내는농도 ( 예 EC 10, EC 50 등 ) 를산출하며, 아울러생식능 에영향을나타내지않는무영향관찰농도 (NOEC) 또는영향을나타 내는농도가운데최소영향관찰농도 (LOEC) 를구한다. 4.2 시험 총시험기간은 21일로하며, 시험물질의노출은반지수식또는유수식방법을사용한다 반지수식시험의경우, 대조군또는처리군당 10마리의물벼룩을사용하는데시험용액이담긴각수조당 1개체씩투여한 다 ( 대조군및시험물질농도당 10 개의반복구 ). 유수식시험의 경우는대조군또는처리군당 20~ 40마리를사용하며, 4개의반복구를둔다 ( 예, 40마리의경우 10마리씩 4개의반복구, 20마리의경우 5마리씩 4개의반복구를설정 ) 수조내시험용액의양은일반적으로 30~ 100ml범위를두도록하며, 시험용액의화학적분석등을고려하여용액의양을 -cv i-

127 보다증가시킬수있다 시험농도의범위는물벼룩급성독성시험결과등사전독성정보를참조하여설정한다. 농도는최소한 5개이상의농도 ( 대조군제외 ) 를대수등간격으로설정하며, 이때공비가 3.2를초과하지않도록한다 시험용액조제시용매또는분산제를사용한경우, 대조군외에용매또는분산제대조군을추가로두도록한다. 이때첨가되는용매또는분산제의양은시험군중최고농도군에첨가되는용매또는분산제의양과동일하게처리한다 무영향관찰농도 (NOEC) 또는최소영향관찰농도 (LOEC) 를도출하기위해서는최저농도에서의산란능이대조군보다유의하게낮지않도록최저농도를설정하며, 반면최고농도는산란능이대조군보다유의하게낮은수준으로관찰될수있는농도가되도록설정한다 생식능에대한영향농도 (ECx) 값을산출하기위해서최고농도는예측되는영향농도보다충분히높도록설정한다 반지수식시험의경우, 시험용액의교환은시험물질의안정도 (stability) 에따라교환주기를달리할수있으나, 일주일에최소한 3회이상을교환하도록한다. 한편시험물질의안정도가낮다고판단되는경우, 시험용액은매일갈아주도록하며, 가능한경우반지수식보다는유수식시험을실시하는것이바람직하다 시험용액의교환시에는새로교환할시험용액을미리준비한후유리피펫을사용하여갈아주려는새로운시험용액이담긴수조로물벼룩을조심스럽게옮겨준다. 이때피펫을통해물벼룩 -cix-

128 과함께옮겨지는시험용액의양은최소화한다 관찰은매일실시하는데모체로부터태어난자손개체수를반드시측정하고, 그후시험용액으로부터제거한다. 측정되는자손개체수는살아있는것을기준으로하며, 부화되지않은알또는죽은개체의숫자도별도로기록해둔다. 관찰결과는빠짐없이기록한다 최초로생산된자손수와출생시기를기록한다 사망한모체물벼룩의수도매일관찰하고기록한다 생식능외에필요한경우기타항목들을측정할수있다. 예를들어시험종료후에모체의체장 (anal spine을제외한몸통길이 ) 을측정하여기록한다. 그밖에포낭속알의존재, 수컷혹은내구란 (ephippia) 을출현여부및이들숫자를파악하여기록한다 시험물질이불안정하다고판단되는경우, 시험용액내의농도를일정간격을두고측정한다. 이때시험기간동안시험물질의농도는초기농도의 80% 이상을유지하도록한다. 4.3 시험환경 시험용액의 ph, 용존산소, 수온, 경도등을주기적으로측정하며, 최소한 1주일에 1회정도실시한다 시험기간동안조명은명 : 암 =16:8시간을유지하도록하며, 광도는 15~ 20uE m -2 s -1 범위를유지하도록한다 시험용액의노출은 18~ 22 온도범위내에서실시하며, 온도의변화는 2 이내를유지하도록한다 ( 예, 18~ 20, 19~ 21, -cx-

129 20~ 22 ) 시험도중에는폭기하지않는다 먹이는매일공급하는것을원칙으로하되, 일주일에최소 한 3 회이상공급한다. 먹이는대수기의녹조류 (Selenastrum 또 는 Chlorella) 를충분히공급한다. 4.4 시험상의유의사항 대조군에서물벼룩모체의사망율은시험종료시까지 20% 를초과하지않아야한다 대조군에서시험종료시까지물벼룩각모체에서생산되는자손의평균개체수는 60마리이상을유지하여야한다 시험물질을흡착할가능성이있으므로물벼룩의먹이를지나치게과량으로공급하지않아야한다. (5) 시험결과및보고 5.1 결과의처리 본시험종료후적당한통계적방법을사용하여, 무영향관찰 농도또는최소영향관찰농도및영향농도를 95% 에서의신뢰구간 에서구하며, 보고서에는통계적방법이명시되어야한다. 5.2 시험결과의보고 시험결과를보고할때는아래의내용이포함되어야한다 시험기관의명칭및소재지 -cxi-

130 5.2.2 시험책임자및담당자성명, 소속 시험물질 : 명칭 ( 일반명, 상품명명기 ) 입수처, 입수일화학물질의특성자료 시험종 : 학명, 입수처사육방법 ( 먹이의종류, 공급횟수등 ) 시험조건 : 시험과정 ( 노출방법, 사용마리수, 반복수, 시험용액의양등 ) 첨가물의사용여부와농도배양액및희석수의수질특성시험온도광도, 광의종류및광주기수온, ph 및용존산소농도 ( 가능하면표로만들것 ) 시험용액에서시험물질의농도와측정날짜먹이의종류, 공급량및공급빈도 시험결과 : 시험물질의영향을받은물벼룩의수와퍼센트적용한통계적과정의설명및근거기타시험과정에서관찰된이상현상 유영저해와생식능감소에대한각각의 ECx( 최소 7일에 1회및시험종료시기 ), 95% 신뢰구간, 통계적과정각각의농도에서첫번째자손생산이이루어진시간 24시간마다생산된살아있는자손개체수부화하지못한알의수, 출생하였으나사망한 -cxi-

131 자손개체의수 ( 매일측정 ) 시험기간동안사망한모체물벼룩의수시험기간동안나타난생식능에대한무영향관찰농도또는최소영향관찰농도농도 -반응그림표 ( 주 1) 의배양액조성은 ( 나 ) 물벼룩류급성독성시험 에서의 M4 또는 M7 배양액 의조성과동일함 -cx i-

132 IV. 결론 국내에서사용되고있는독성시험법 ( 특히생태독성분야 ) 을개선 보완하거나새로운시험방법을도입하여이를표준화하며, 그와더불어독성시험에적용성이있는생체지표를발굴하기위한목적으로본연구사업을시작하였다. 따라서대표적인환경오염물질로서현 재이슈화되고있는 6 가크롬을시험대상물질로선정하고이물질에 대한주요생태독성시험을수행함으로써시험방법을표준화하고아울러 6가크롬에대한독성자료를생산하였다. 이러한결과는 화학물질유해성시험방법 ( 국립환경과학원고시 ) 에반영하였으며, 이를본시험방법의제 개정을통해제시하였다. 또한 6가크롬에대해민감성있게발현되는생체지표를발굴함으로써향후표준화된독성시험의종말점 (end-points) 으로적용가능한지에대한검토를실시하였다. 결론적으로본연구사업에서시도하는환경오염물질에대한독성시험표준화와생체지표개발에관한연구결과들은국내생태독성관련시험방법들이지속적으로선진화되고발전하기위한밑거름이될것으로기대한다. 1. 6가크롬인 potassium dichromate(k 2 Cr 2 O 7 ) 을시험물질로선정하여생태독성시험가운데주요항목인 어류급성독성시험, 물벼룩류급성독성시험, 어류초기생장단계독성시험 및 지렁이급성독성시험 을수행하였다. 시험은국립환경과학원고시인 화학물질유해성시험방법 및 OECD 테스트가이드라인 에의거해실시하였다. 시험결과, -cxiv-

133 6 가크롬 (K 2 Cr 2 O 7 ) 에대한민감도는물벼룩이가장높은것으로나타 났다 (48h-EC 50 = 0.3mg/L). 한편, 현재 OECD 등국내 외적으로공 인된시험법이없는선충 (C. elegans) 을대상으로 6가크롬에대한독성시험을실시함으로써향후본생물종의독성시험법적용가능성을검토하였다. 상기시험들을통해주요항목에대한표준화연구를실시하였고, 본결과는 화학물질유해성시험방법 제 개정을통해제시하였다 가크롬을시험물질로하여생체지표 (biomarker) 연구를실시하였 으며, 아울러기존의생체지표연구결과를토대로독성시험의종말 점으로적용가능성이있는생체지표를조사 검토하였다. 특히, 6 가 크롬을노출시킨선충을대상으로 DNA 마이크로어레이 (microarray) 시험을수행함으로써독성유전체기법을활용하여가능성있는생체 지표를도출하였다. 3. 현재국립환경과학원에서는 화학물질유해성시험연구기관의지정등에관한규정 을고시화하고있으며, 본규정의 [ 별표 5] 화학물질유해성시험방법에는생태영향및건강영향등과관련된표준화된다양한독성시험방법을수록하고있다. 본연구에서는주요시험에관한표준화연구를토대로상기시험방법고시의일부항목을제 개정하였다. 생태독성시험을중심으로시험법을제 개정하였는데생태독성분야에 서 2 항목을제정 ( 어류초기생장독성시험, 물벼룩생식능시험 ), 조류 성장저해시험, 물벼룩류급성독성시험, 어류급성독성시험, 지렁이급 -cxv-

134 성독성시험등 4항목을개정하였다. 한편, 건강영향분야의경우, OECD 화학물질테스트가이드라인에서기존설치류급성경구독성시험을폐지하고대체시험법을제정 운영함에따라 OECD 테스트가이드라인과의조화 (harmonization) 를위해 2개의대체시험법 ( 급성경구독성시험의고정용량법과독성등급법 ) 을신설하였다. -cxvi-

135 V. 참고문헌 Bearer, C. F. (1998) Biomarkers in Pediatric Environmental Health; A Cross-Cutting Issue. Envrionmental Health Perspectives. 103(3): Costa, M. and Klein, C.B. (2006) Toxicity and carcinogenicity of chromium compounds in humans. Crit Rev Toxicol. 36(2): Coughlin, P., Sun, J., Cerruti, L., Salem, H.H. and Bird, P.(1993) Cloning and Molecular Characterization of a Human Intracellular Serine Proteinase Inhibitor. Proc Natl Acad Sci. 90: Dodson, S.I. and Frey, D.G. (2001) "The Cladocera and other Branchiopoda" in Ecology and Systematics of North American Freshwater Invertebrates. 2nd Edition. Academic Press Hartford, W.H. (1979) Chromium compounds. In: Grayson M, ed. Kirk-Othmer encyclopedia of chemical technology. 3rd ed. Volume 6. New York, NY: John Wiley and Sons, Holmas, A.L., Wise, S.S., Sandwick, S.J., Lingle, W.L., Negron, V.C., Thomson, W.D. and Wise, J.P. (2006) Chronic exposure to lead chromate causes centrosome abnormalities and aneuploidy in human lung cells. Cancer Res. 66(8): -cxvi-

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140 부록 1. 환경독성관련용어 2. 급성경구독성대체시험법 - 급성경구독성시험 ( 고정용량법 ) - 급성경구독성시험 ( 독성등급법 ) -cxxi-

141 환경독성관련용어 Acute ( 급성 ) : 생명체의생활주기중짧은노출기간을말함. 일반적 으로어류의경우는 96 시간, 미생물의경우는몇분에해당되는시간 Additivity ( 상가영향 ) : 덧셈론에근거를둔혼합물의독성으로서혼합 물내의개개성분이나타내는독성의합 Adverse effect ( 악영향 ) : 특정물질 ( 예, 유해화학물질 ) 에노출됨에따 라생물체 ( 동물, 식물 ) 내의정상적인기능에장애를유발할수있는 영향 Assessment end-point(s) ( 평가종말점 ) : 보호되어야할환경적가치에대한명확한표현. 구체적으로언급하자면특정한환경적스트레스에의해영향을받는 ( 보호되어야할 ) 개체군, 생물종 ( 種 ) 등에서유발되는특징을말하며, 이때특징은수치적으로측정이가능한것을사용하도록한다 ( 예, 번식률 ) Complete exposure pathway ( 완전노출경로 ) : 화학물질이환경중오염원으로부터매체를통해수용체 ( 화학물질에의해영향을받을수있는생물체 ) 로전달되는모든경로. 예를들어오염물질이저질로부터표층수를거쳐물고기의아가미로전달될경우, 완전노출경로는저질- 표층수 -물고기의아가미이다. -cxx i-

142 Battery of Tests ( 시험셋트 ) : 최대한모든독성의작용기작을기록하고자하는목적으로수행하는독성시험의셋트. 예로폐수와같은환경중시료에대한생태독성시험을실시할경우생산자 - 1차소비자 - 2차소비자측면에서조류독성시험 - 물벼룩독성시험 - 어류독성시험을하나의 battery로하여실시하기도한다. Bioassay ( 바이오어세이 ) : 미지의물질또는시험물질 ( 의약품, 호르몬, 화학물질등 ) 의생물학적영향을결정하기위한실험실적테스트. 이테스트는살아있는세포나시험동물을사용하여실험을실시하며, 영향이밝혀져있는기지의물질을대조물질로사용하여이를비교함으로써역가를산출한다. Biological Assessment ( 생물학적평가 ) : ( 개발, 계획따위를위한 ) 생물학적영향평가. 특정서식처의물리화학적환경요소와함께그지역에서식하는특정분류군의종목록을작성하여해당종의풍부도및다양성조사를통해생물학적영향상태를파악한다. Biomarker ( 생체지표 ) : 생체내의생화학적성분, 세포학적구조또는기능의변화를나타내며, 생물시스템에서측정이가능한감수성이있는성질. 특히환경오염에대한생체지표라함은환경중유해물질에의해유발되고또한감지될수있는생체내에서의생리학적, 생화학적, 조직학적반응을말한다. -cxxiv-

143 Biomass ( 바이오매스, 생물량 ) : 특정지역에서현존하는식물또는동물의중량또는총량. 일반적으로단일종 ( 種 ) 또는특정식물또는동물그룹에대한중량또는총량으로표현한다. 하나의지역에서개체의분포량을파악하기위해개체수측정대신에사용되는측정방법이다. 현존하는생물체가일정지역에서일정한시간에생산하는유기물의총량은생산력이라고하며, 에너지의단위는 gcal / m2 / 년을사용한다. Biomonitor ( 바이오모니터 ) : 환경에서의일어나는변화 ( 예, 오염수준 의변화 ) 에민감하고, 그영향을측정가능할수있는정도로반응하 는생물종 BPEO ( 실행가능한최상의환경적선택 ) : Best Practicable Environmental Option, 폐기물을비롯한환경적위해를최적으로관리 하고자하는목적으로영국에서만들어진환경친화적인개념 Chronic ( 만성 ) : 급성에비해상대적으로긴노출기간을말하며, 통생물체의생활사에서상당기간을차지하는오랜기간. 이러한 보 장기 간을시험물질에노출하는독성테스트를만성독성시험이라고한다. Complex Effluent ( 복합배출물 ) : 조성이일정하지않고가변적인혼합물로된폐수. 주로액상으로서배출수라고도하며, 독성이있는경우라도그원인을정확히규명, 제한또는통제하지못하는경우가대부분이다. -cxxv-

144 Conceptual site model ( 개념적사이트모델 ) : 다음의주제에대한표 현을종합한것. 1) 환경중에존재하는각각의화학물질들이생태학적 요소들에어떤방식으로영향을나타내는가 2) 잠재적위기상태에있는 생태시스템또는생태시스템의요소들 3) 측정또는평가종말점들 (endpoints) 간의관계 4) 생물체들이유해물질에어떻게노출되는가? Contaminant ( 오염물질 ) : 공기, 물, 토양또는생물체로부터발견되 는물리적, 화학적및생물학적물질. 다시말해환경을통해생물체 에악영향을유발할수있는물질을의미한다. COPEC ( 잠재적생태학적우려물질 ) : Contaminant of Potential Ecological Concern 의약자로서어느한지역에서생태적으로위해성또는악영향을유발할가능성이있는잠재적오염물질. 실질적으로위해성을유발할수도또는유발하지않을수도있다. COPC (Contaminant of Potential Concern) 라고도한다. Discharger ( 배출자 ) : 배출물 (Effluent) 을방출하는개인, 운용자또는법인 Ecotoxicity ( 생태독성 ) : 환경생태학적인종말점 (End-points) 을이용하여 측정된시료의독성. 수생생물독성, 육생생물독성, 저질생물독성등이포 함된다. -cxxvi-

145 Ecotoxicological benchmarks ( 생태독성기준 ) : 비생물적인환경매체 ( 저질, 수질, 토양 ) 또는생물체의조직 (tissue) 에존재하면서유해한 영향을나타내는수준이상의오염물질농도를표현하는산술적가치 EC 50 ( 반수영향농도 ) : 50% Median effective concentration 로서일정시 험기간동안시험생물의 50% 가유영저해를일으키는농도 ( 물벼룩류 급성독성에서주로사용됨 ) EDTA ( 내분비계장애물질시험및평가 ) : Endocrine Disruptor Testing and Assessment, OECD 에서추진중인내분비계장애물질시험 지침개발을위한프로그램 Effects Range-Low ( 영향범위 - 낮음 ) : 유해한영향이나타날수있을 것이라예측되는수준이상의오염물질농도 Effects Range-Median ( 영향범위 - 중간 ) : 유해한영향이항상또는거 의항상나타날수있는수준이상의 오염물질농도 Effluent ( 배출물 ) : 처리과정으로부터나오는액상배출물 ( 산업용또는가 정용 ). 일반적으로액상이므로배출수라고도하며, 배출물은환경중으로 직접배출되거나사전에처리프로세스에연속적으로처리된후배출된다. -cxxvi-

146 Endocrine disruptor ( 내분비계장애물질 ) : 생물체내의정상적인내분비계기능을방해하는화학물질. 환경중에배출되거나잔류해있다가체내로유입되어마치호르몬처럼작용한다고해서환경호르몬으로불리기도한다. 일본에서는내분비계교란물질이라고부른다. End-point ( 종말점 ) : 시험의종료를나타내는변수 ( 예 : 시간또는시험생물체 의반응 ) 또는시험결과의특징으로부터유추한측정 ( 예 : EC, NOEC) Environmental estrogens ( 외인성에스트로젠 ) : 내분비계장애물질가운 데여성호르몬인에스트로젠성질을가지고있는물질. Xenoestrogen 이 라고도하며, DES, 노닐페놀, 비스페놀 A 가대표적이다. Environmental quality standard ( 환경질기준 ) : 보통농도로표기되는환 경부분 ( 예 : 담수, 대기, 토양 ) 에대한목표한계 Exposure ( 노출 ) : 생태계또는생물개체들이화학물질에접촉하는정도 Flow-through test ( 유수식시험 ) : 시험기간중시험용액을연속적으 로교환하는시험 Hazard ( 유해성 ) : 인체나환경에유해한작용을야기할수있는화학 물질의잠재적능력 -cxxv i-

147 Hazard Quotient ( 유해지수 ) : 오염물질의노출수준 ( 예, 노출최고수준 ) 에대한 ( 특정물질의 ) 위해성평가를위해선택된독성값 ( 예, LOAEL 또는 NOAEL) 의비 ( 比 ). 만일노출수준이독성값보다높을경우에는수용체에대한잠재적위해성이존재한다고할수있다. Immobilization ( 유영저해 ) : 시험용기를조용히움직여준후, 약 15 초후에관찰하여물벼룩의일부기관 ( 촉각, 후복부등 ) 은움직이나유 영하지않는상태. 물벼룩류급성독성시험에서사용되는용어이다. In-situ tests ( 현장독성시험 ) : 생물種 ( 식물또는동물 ) 을특정지역 ( 시험지역또는대조지역 ) 에거주케함으로써해당지점의오염영향을측정하는독성시험. 실험실적노출시험보다환경중의영향을보다현실적으로볼수있는장점이있다. 그러나다양한환경의변화 ( 날씨등 ) 를조절할수없기때문에예상할수없는어려움을겪을수있다. In-situ test는환경중에서식하지않는생물을사용하지않는데그이유는환경중에노출되었을때적응하지못하고죽을수있기때문이다. LC 50 ( 반수치사농도 ) : 50% median lethal concentration 로서시험생 물의 50% 를치사시키는수용액상의시험물질농도. 시험기간을명기 한다 ( 예, 96h-LC 50 ) -cxxix-

148 LOEC ( 최소영향관찰농도 ) : Lowest observed effect concentration의약자로서시험기간중대조군과비교하여시험물질이유의한정도 (p<0.05) 의영향을나타내는것으로관찰되는농도중가장낮은시험물질의농도 Media ( 메디아 ) : 생태계의한부분을지칭하는용어 ( 예 : 토양, 대기, 저질등 ) NOEC ( 무영향관찰농도 ) : No observed effect concentration 의약자로 서시험기간중영향을나타내지않는시험물질의농도. LOEC 의바 로아래값을나타낸다. PCBs (Polychlorinated Biphenyls) ( 폴리염화비페닐 ) : 염소와비페닐을반응시켜만드는매우안정한유기화합물. 염소가치환된비페닐의이성질체인공업용혼합물은비교적물에녹지않고무색의점성도가있는액체의형태로시판되며, 고온에서도품질이떨어지지않는좋은절연체이다. PCB는 1930, 1940년대를거치며공업용으로널리사용되었으나 1970년대중반이후이들화학약품이생명체에해롭다는사실이밝혀지면서생산과이용이제한되었다. Performance testing ( 운영시험 ) : 독성시험결과의다양성원인을결 정하고이를제어하기위한방법 -cxxx-

149 PEC ( 예측환경농도 ) : Predicted Environmental Concentration의약자로서평가하고자하는물질의특정지점에서예측되는농도. 폐수등이배출되는지점의경우방출에따른배출물의초기부피와수용체의희석 / 확산능력을감안하여 PEC을도출한다. PNEC ( 예측무영향농도 ) : 수용불가능한효과, 즉유해한영향이발생할 수있는가능성보다낮은수준으로예측되는환경농도. 보통 NOEC( 무영 향관찰농도 ) 에안전계수 (safety factor) 를적용해산출한다. Quality assurance ( 질적보증 ) : 독성시험결과를보증하기위해고안된관리 및운용시스템 Probit analysis ( 프로비트분석 ) : 화학물질의노출정도와노출영향가능성의연관관계를실험식을이용하여분석하는통계방법. 일반적으로독성시험에서반수치사농도 (LC 50 ), 반수영향농도 (EC 50 ) 등이이러한통계법을이용해산출된다. Receptor ( 수용체 ) : 오염물질에노출되는개체, 개체군, 집단, 서식지 Reference areas ( 대조지역 ) : 환경중모니터링을실시할때조사지역 ( 오염예상지역 ) 과비교하기위한비오염지역. 조사지역과인접한곳에위치하며오염물질에대한영향을받지않거나최소한으로받은지역가운데서선정한다. -cxxxi-

150 Risk ( 위해성 ) : 유해물질의특정농도나용량에노출된개인혹은집 단에게유해한결과가발생할확률 (probability) 또는가능성 (likelihood) Risk calculation ( 위해도계산 ) : 생태독성학적기준을이용하여환경 에대한위해가능성을산술적으로평가하는과정 Screening numbers ( 스크리닝넘버 ) : 특정매체 ( 수질, 저질, 토양 ) 에잔류하며환경중악영향을유발하는오염물질의수준. 특정지역에서이미알고있는오염물질의최고농도와스크리닝넘버를비교함으로써생태적위해가능성을예측할수있다. Semi-static test ( 반지수식시험 ) : 시험기간중시험용액을일정기간 마다전량을교환하는시험 Spot-Sampling ( 지점샘플링 ) : 일정시간에한지역에서시료를채취 하는행위 Static test ( 지수식시험 ) : 시험기간중시험용액을교환하지않는시험 Sub-chronic( 아만성 ) : 급성과만성기간사이의노출기간 Sub-lethal ( 아치사 ) : 사망을유발하는수준이하에서의독성물질에 대한생물학적반응 -cxxxi-

151 Substance-specific control ( 물질특이적조절 ) : 개개물질이나물질 군에대한화학적분석을근거로하여배출물 (effluent) 과환경시료를 분석하거나통제하는행위 Synergism ( 상승영향 ) : 혼합물의독성이혼합물에존재하는각각의 성분의독성합보다더크게나타나는영향 Toxicant( 독성물질 ) : 생명체에대해악영향을나타내는능력또는잠 재력을지닌물질 Toxicity ( 독성 ) : 생명체에대해악영향을나타내는물질의능력또는 잠재력 Toxicity limit ( 독성한계 ) : 초과되지말아야할독성학적최고치. 폐수 배출시배출허가의요구조건이될수있다. Toxicity Reduction Plan ( 독성저감 계획 ) : 배출물 ( 또는배출수 ) 내 독성물질의원인을확인하고아울러이들독성을감소시키기위한 이후의치료활동. Toxicity screening ( 독성스크리닝 ) : 포괄적인독성시험에선행하여 평가대상물질또는시료의독성여부를알기위한사전검색과정 -cxxx i-

152 Toxicity tests ( 독성시험 ) : 특정화학물질, 화학물질의혼합물, 배출물 또는환경시료를대상으로시험생물에대한효과 ( 영향 ) 정도를측정하 기위한일련의테스트과정 Toxic mode of action ( 독성작용기작 ) : 독성을가지는물질이생명 체에게악영향을유발하는생체내작용메카니즘 Trophic Level Testing ( 영양단계시험 ) : 생태계를구성하는여러단 계의영양단계 (trophic level, 생산자 - 1 차소비자 - 2 차소비자등 ) 로부 터얻은생명체를하나의 battery 로하여수행하는독성시험 Whole effluent toxicity ( 총배출물독성 ) : 생태독성시험을바탕으로직접적으로배출물의독성정도를측정함으로써배출물의총독성효과를설명하는미국 EPA의개념. 국내에도도입예정이며통합독성이라고부르기도한다. -cxxxiv-

153 급성경구독성시험대체시험법 급성경구독성시험 ( 고정용량법 ) 1. 목적이시험은시험동물의보호를위해치사량이상의화학물질사용을가급적피하고, 치사량이하의용량에서경구투여하여독성증상을관찰하는데목적을둔다. 2. 정의 1) 급성경구독성 시험물질을 24 시간이내에 1 회또는수회경구투여한후 단시간 내에나타나는악영향 (adverse effects) 2) 투여량 (Dose) 투여하는시험물질의양. 일반적으로단위는시험동물의체중당 시험물질의무게 ( 예, mg / kg ) 로표시한다. 3) 빈사상태 (Moribund state) 시험물질의독성에의하여시험동물이죽어가는상태또는생존 할가망이없는상태 -cxxxv-

154 4) 지연사망 (Delayed death) 시험물질투여후 48 시간이내에사망또는빈사상태에도달하지는 않으나그후 14 일간의관찰기간동안사망하는경우 5) GHS Globally Harmonized Classification System for Chemical Substances and Mixtures 의약자. 국제적으로조화된화학물질의분류시스템 3. 시험의준비 1) 시험동물 연령이 8~12 주령된시험용랫드 ( 다른설치류도가능 ) 를사용하며 개체간체중차이는평균체중의 ±20% 를넘지않도록한다. 시험은 한쪽성을사용하는데암컷을사용하는것을원칙으로하며, 수컷을사 용할경우타당한사유를제시한다. 암컷은과거에새끼를낳은적이 없고현재임신중이지않은것을사용한다. 시험에사용할개체는시 험시작전최소 5 일이상실험실에서순화시킨건강한동물중에서 무작위로선정한다. 2) 사육조건사육실은온도가 22 ±3, 습도가 30~ 70% 가유지되도록한 다. 사육은암 수를구별하여실시하며각개체의상태관찰이용 이하도록밀도가높지않도록한다. 조명은명 / 암이 12/12시간이되 도록조절하며, 시료와물을적절히 공급한다. -cxxxvi-

155 3) 시험물질 시험물질은적당한용매에용해또는현탁시킨다. 시험물질은 수 용성액이우선적으로권장되나, 비수용성인물질의경우오일 ( 예, corn oil) 또는기타다른용매를사용한다. 이때사용하는용매는 사전에독성여부와특성이잘알려진것을사용한다. 4. 시험방법 1) 원리예비시험에서한쪽성 ( 암컷을원칙으로함 ) 에대해여러시험용량의독성효과를조사하고그결과로부터최소치사량및용량 -반응관계를확보한다. 본시험에서는한쪽성 ( 암컷을원칙으로함 ) 의동물을사용하여고정용량 (5, 50, 300, 2,000mg / kg ) 에대해단계적으로시험한다. 시작용량은예비시험결과에근거하여선정하는데사망과같은심각한독성을유발하지않으나그외의독성증상이관찰될수있을것으로예측되는용량으로한다. 시작용량의경과에따라다음용량을결정한후단계적으로투여한다. 2) 시험물질의투여 1 경구투여하는시험물질의양은시험동물의크기에따라다르나, 일반적으로최대 1ml /100g을넘지않도록한다. 다만수용액의경우는 2ml /100g까지허용한다. 2 투여는 1회투여를원칙으로하되불가능할경우소량씩나누어실시한다. 이때투여간격은 24시간이넘지않도록한다. 3 시험물질투여전날저녁부터먹이공급을중단하고체중을측 -cxxxvi-

156 정한다. 경구투여후 3~4 시간후 ( 마우스의경우는 1~2 시간후 ) 부 터먹이를공급하되소량씩여러번물과사료를적절히제공한다. 3) 예비시험 1 시험물질투여후적어도 14일동안관찰한다. 2 예비시험의시작용량은독성증상을관찰할수있을것으로예측되는용량으로써고정용량 (5, 50, 300, 2,000mg / kg ) 가운데하나를선택하여한마리씩투여하고, 이때나타난결과를통해다른농도에서예비시험을실시하거나본시험의농도를설정한다. 예비시험의농도선정은시험물질또는시험물질과관련이있는물질의독성자료를바탕으로한다. 3 시작용량을선정하기위해서해당물질또는유사물질의독성정보가없는경우처음에 300mg / kg용량으로시작한다. 4 만일 2,000mg / kg이상의농도에서실험동물이사망하지않는경우예비시험을중단하고본시험을 2,000mg / kg에서실시한다. 5 만일, 최소고정용량인 5mg / kg에서처음투여한 1 마리의동물이사망하면시험을중단하고 GHS 카테고리 1로분류한다. 이때이를확실히검증하려면보완적인시험도실시하는데이는시험자가선택적으로실시한다. 보완시험의경우두번째동물에 5mg / kg을투여하며, 이때동물이사망하면 GHS 카테고리 1 분류를확정한다. 만약생존할경우추가로 1마리씩시간간격을두고총 3마리를 5mg / kg용량으로투여한다. 이때 2마리이상사망할경우 GHS 카테고리 1로분류하며, 1마리이하사망시카테고리 2로분류한다 ( 그림 1 참조 ). 6 동물복지를위하여 5,000mg / kg고정용량시험은권장되고있지않 -cxxxv i-

157 으나필요하다고판단될때는특별히 5,000 mg / kg고정용량시험을 수행할수있는데이때에는적정사유를언급하여야한다. 4) 본시험 1 각시험용량에대해한쪽성 ( 암컷을원칙으로함 ) 5마리를시험동물로사용한다. 이때예비시험에사용된동물 1마리를 5마리에포함시켜결과를산출하도록한다. 2 예비시험의결과를토대로설정한용량을시험동물에투여하며이때나타난독성반응에따라카테고리를분류한다. 3 관찰기간은보통 14일정도실시하는데관찰기간은고정적이지는않으며독성반응, 속도, 회복기간등에따라변경될수있다. 4 관찰은투여후 30분이내에적어도한번관찰하고, 24시간마 다주기적으로관찰을실시한다. 특히투여후처음 4 시간은특 별한주의를기울여관찰하도록한다. 5 관찰기간동안시험물질의용량별투여주기는독성증상에따 라 시험자가선택할수있으나보통 3~ 4 일주기의투여를권장 한다. 6 한계시험은시험물질이무독성일가능성이있을때수행될수있다. 2,000mg / kg ( 특별한경우 5,000mg / kg ) 으로시작되는예비시험을거친후동일용량으로추가 4마리에대해서본시험의절차에따라수행한다 ( 그림 2 참조 ). 7 독성증상이나타나기시작한시간과소멸되기시작한시간은매우중요하므로모든관찰은체계적으로기록되어야하며, 개체별로기록이되도록해야한다. -cxxxix-

158 8 관찰은피부및털, 눈및점막, 호흡계, 순환계, 자율및중추신경계, 행동유형을포함한다. 특히경련, 설사, 유연, 혼수상태등의증상은유의하여관찰한다. 9 체중은시험물질투여직전과종료후부검직전측정하며, 시 험기간중에는주 1 회측정을원칙으로하는데이때체중변화 를계산하여반드시기록하도록한다. 시험중사망및빈사동물 을포함하여모든시험동물은부검후소견을기록한다. 5) 시험상의유의사항 1 부식성이나자극성이큰물질의경우시험동물에고통을주므 로되도록시험을피하도록한다. 2 예비시험에서가능한 5 마리이상의시험동물은사용하지않도 록한다. 3 시험동물이참기힘들정도로고통스러워할경우안락사시키 며시험중사망한동물로처리한다. 5. 시험결과및보고 1) 결과의처리시험용량, 시험동물수, 독성증상을보이는시험동물수, 시험기간중치사동물수, 독성발현및시간, 용량-독성반응관계, 부검결과등기록한다. 2) 시험결과의보고 시험보고서는다음의항목을포함한다. -cxl-

159 1 시험기관의명칭및소재지 2 시험책임자및담당자성명 3 시험동물종, 시험동물의수, 연령, 공급원, 사육조건, 각개체의사육조건 4 시험물질물질명과 CAS 번호, 물리적특성및순도, 시험과관련된물리화학적특성, 시험물질의안정성 5 시험용매명및선정사유 6 시험조건시험기간, 투여용량수준및횟수, 먹이공급시기 7 시험결과 - 성별 - 용량별독성반응결과 - 사용동물수, 체중변화, 사망및도살동물수, 독성증상을보이는동물수, 피부및털, 눈및점막, 소화계, 호흡계, 순환계, 중추신경계, 행동유형, 독성증상정도 - 용량별독성반응결과사용동물수, 체중변화, 사망및도살동물수, 독성증상을보이는동물수, 피부, 털, 눈, 점막, 소화계, 호흡계, 순환계, 중추신경계에나타나는독성증상 ( 행동유형, 경련, 설사, 유연, 혼수상태등 ) - 독성증상을보이는시간및회복시간 - 도살기준및근거 - 부검결과 - 결과의해석 -cxli-

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162 급성경구독성시험 ( 독성등급법 ) 1. 목적이시험은시험동물의보호를위해시험물질에의한사망또는고통을가급적줄이고자최소한의동물에시험물질을경구투여하여급성독성증상을관찰하는데목적을둔다. 2. 정의 1) 사망임박 (Impending death) 다음관찰시기전사망또는빈사상태가예견되는상태로서경련을일으키거나옆으로누워있는상태가관찰되는상황 2) 예측사망 (Predictable death) 시험이종료되기전사망을예측가능하도록임상학적인징후를보이는상태 ( 예, 물이나먹이에접근하지못하거나, 물이나먹이를먹지못하는상태 ) 3. 시험의준비 1) 시험동물 시험이시작되는시점에연령이 8~ 12 주령된시험용랫드 ( 다른 설치류도가능 ) 를사용하며개체간체중차이는평균체중의 ±20% 를넘지않도록한다. 시험은한쪽성을사용하는데암컷을사용하는것을원칙으로하며, 수컷을사용할경우타당한사유를제시한다. 암컷은과거에새끼를낳은적이없고현재임신중이지않은것을사용한다. -cxliv-

163 시험에사용할개체는시험시작전최소 5 일이상실험실에서순화시 킨건강한동물중에서무작위로선정한다. 각동물의식별을용이하게 하기위해개개의동물에표시를한다. 2) 사육조건사육실은온도가 22 ±3, 습도가 30~70% 가유지되도록한다. 사육은암 수를구별하여실시하며각개체의상태관찰이용이하도록밀도가높지않도록한다. 조명은명 / 암이 12/12시간이되도록조절하며, 먹이와물을적절히공급한다. 3) 시험물질시험물질은적당한용매에용해또는현탁시킨다. 시험물질은수용성액이우선적으로권장되나, 비수용성인물질의경우오일 ( 예, corn oil) 또는기타다른용매를사용한다. 이때사용하는용매는사전에독성여부와특성이잘알려진것을사용한다. 4. 시험방법 1) 원리한계시험또는본시험에서는단일성 ( 가능한암컷을우선으로함 ) 의동물을사용하여제시된용량에대해단계적으로시험한다. 시작용량은기존의독성자료에근거하여선정하는데사망과같은심각한독성을유발하지않으나그외의독성증상이관찰될수있을것으로예측되는용량으로한다. 시작용량의경과에따라다음용량을결정한후단계적으로투여한다. -cxlv-

164 2) 시험물질의투여 1 경구투여하는시험물질의양은시험동물의크기에따라다르나, 일반적으로최대 1 ml /100g( 체중 ) 을넘지않도록한다. 다만수용액 의경우는 2ml /100g까지허용한다. 2 투여는 1회투여를원칙으로하되불가능할경우소량씩나누어실시한다. 이때투여간격은 24시간이넘지않도록한다. 3 시험물질을투여하기전날저녁부터물을제외한먹이공급을중 단하고체중을측정한다 ( 마우스의경우는투여전 3~ 4 시간전부터 먹이공급을중단한다 ). 시험물질의경구투여후 3~ 4시간후 ( 마우스의경우는 1~ 2시간후 ) 부터먹이를공급한다. 시험물질을소량씩나누어투여할경우, 투여간격을고려하여소량씩여러번물과먹이를적절히제공한다. 3) 한계시험 (limit test) 1 한계시험은해당시험물질또는시험물질과유사한특성을지닌물 질의독성이비교적낮거나무독성으로예상되는경우에만수행한다. 2 한계시험은한가지농도인 2,000 mg / kg ( 체중 ) 을투여한다. 시험 물질의투여는 6마리를대상으로하는데 3마리씩 2단계로수행한다. 1단계에서투여한 3마리에서관찰되는사망 ( 또는빈사상태 ) 정도에따라다음단계로넘어간다. 사망 ( 또는빈사상태 ) 개체수가 0~ 1마리의경우는 2단계에서 3마리에대해동일농도 (2,000mg / kg ) 를재차투여하며, 이때 0~ 1마리가사망 ( 또는빈사상태 ) 하는경우, 시험물질을 GHS 카테고리 (Category) 5로등급을분류한다. 한편 1단계또는 2단계에서사망 ( 또는빈사상태 ) 개체수가 2~ 3마 -cxlvi-

165 리로발생하는경우, 이보다저농도 (300mg / kg ) 에서시험을수행한다 ( 그림 1 참조 ). 3 시험물질의독성이없다고예상되거나관련정보및적정사유가있는경우, 한계시험을 5,000mg / kg에서수행할수도있다. 이때 1마리에먼저투여했을때바로사망하면 2,000mg / kg부터다시시 험을수행한다. 반면, 사망하지않는경우순차적으로 2 마리에계 속투여했을때모두사망하지않는경우 (3마리모두사망하지않는경우 ) 는미분류 (unclassified) 등급으로구분하며, 1마리이상사망할경우 2,000mg / kg농도에서시험을수행한다 ( 그림 1 참조 ). 4 한계시험의관찰기간및방법은본시험에서와동일하게한다. 4) 본시험 1 각시험용량에대해단일성 ( 암컷을우선으로함 ) 인 3마리를시험동물로사용한다. 2 시험시작은제시된용량 (5, 50, 300, 2,000 mg / kg ) 가운데서독성증상 ( 사망또는빈사상태 ) 이나타날것으로예측되는용량하나를선택하 여 3 마리씩투여하고, 이때나타난결과를통해다른농도에서시험을 계속진행한다 ( 그림 1~4 참조 ). 상기 4가지고정된용량가운데 2,000 mg / kg에서시험을시작하는경우는이를한계시험이라할수있다. 3 시험물질또는이와유사한물질의독성정보가없는경우, 300mg / kg용량으로시험을시작한다. 4 관찰기간은일반적으로 14 일실시하는데관찰기간은고정적이 지는않으며독성반응, 속도, 회복기간등에따라변경될수있다. 5 관찰은투여후 30 분이내에적어도한번관찰하고, 특히투여 -cxlvi-

166 후처음 4시간은특별한주의를기울여관찰하도록한다. 이후 14 일까지적어도 1회이상관찰한다. 6 시험물질의투여후시험동물의증상 ( 사망또는빈사상태 ) 이명확히관찰된경우, 다음시험단계로진행한다. 빈사상태의동물은안락사시킨다. 7 독성증상이나타나기시작한시간과소멸되기시작한시간은매우중요하므로모든관찰은체계적으로기록되어야하며, 개체별로기록하여야한다. 8 관찰은피부및털, 눈및점막, 호흡계, 순환계, 자율및중추신경계, 행동유형을포함한다. 특히경련, 설사, 유연, 혼수상태등의증상은유의하여관찰한다. 9 체중은시험물질투여직전과종료후부검직전측정하며, 시험기간중에는주 1회측정을원칙으로하는데이때체중변화를계산하여반드시기록하도록한다. 시험중사망및빈사동물을포함하여모든시험동물은부검후소견을기록한다. 필요시부검후조직병리학적관찰을통한소견을기록한다. 5) 시험상의유의사항 1 부식성이나자극성이큰물질의경우시험동물에고통을주므로되도록시험을피하도록한다. 2 시작농도선택에신중을기함으로써시험동물의수를가능한최소화하여야한다. 3 시험동물이참기힘들정도로고통스러워할경우안락사시키며시험중사망한동물로처리한다. -cxlv i-

167 5. 시험결과및보고 1) 결과의처리시험용량, 시험동물수, 독성증상을보이는시험동물수, 시험기간중치사동물수, 독성발현및시간, 용량-독성반응관계, 부검결과등을기록한다. 2) 시험결과의보고 시험보고서는다음의항목을포함한다 시험기관의명칭및소재지 시험책임자및담당자성명 시험동물 종, 시험동물의수, 성별, 연령, 공급원, 먹이종류, 각개체의 사육조건 4 시험물질 물질명과 CAS 번호, 물리적특성및순도, 시험과관련된물리 화학적특성, 시험물질의안정성, 기타정보 5 6 시험용매명및선정사유 시험조건 시험기간, 투여용량수준및횟수, 먹이공급시기 7 시험결과 - 성별 - 용량별독성반응결과 - 사용동물수, 체중변화, 사망및빈사동물수, 독성증상을보이 -cxlix-

168 는동물수, 피부및털, 눈및점막, 소화계, 호흡계, 순환계, 중추신경계, 행동유형, 독성증상정도 - 용량별독성반응결과사용동물수, 체중변화, 사망및도살동물수, 독성증상을보이는동물수, 피부, 털, 눈, 점막, 소화계, 호흡계, 순환계, 중추신경계에나타나는독성증상 ( 행동유형, 경련, 설사, 유연, 혼수상태등 ) - 독성증상을보이는시간및회복시간 - 빈사판정기준및근거 - 부검결과 ( 조직관찰시조직병리학적소견 ) - 결과의해석 -cl-

169 -cli-