RESEARCH ARTICLE Kor. J. Aesthet. Cosmetol., Vol. 12 No. 5, , October 2014 행인정유의멜라닌생합성저해효과 안정현, 민유홍 * 대구한의대학교한방피부미용학과 Inhibitory Effects of Apr

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시향 임
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1 RESEARCH ARTICLE 안정현, 민유홍 * 대구한의대학교한방피부미용학과 Inhibitory Effects of Apricot Seed Essential Oil on Melanogenesis Jeong-Hyun Ahn, Yu-Hong Min* Department of Herbal Skin Care, Daegu Haany University Abstract Although a number of depigmenting agents have already been developed, the majority of them produce adverse side-effects. There is, therefore, a constant need for melanogenesis inhibitors. In this study, the hydrodistilled essential oil from the apricot seeds (Armeniacae Semen) was investigated for the activity against tyrosinase and melanogenesis. The apricot seed essential oil inhibited mushroom tyrosinase with an IC 5 value of 1.11 μg/ml, which is more potent than the activities of kojic acid (IC μg/ml), ascorbic acid (IC μg/ml) and lemon essential oil (IC μg/ml). Benzaldehyde, the major component of the apricot seed essential oil, also showed similar level of inhibition (IC 5.94 μg/ml). These results suggest that the activity of the apricot seed essential oil is due to benzaldehyde. The apricot seed essential oil decreased tyrosinase activity and melanin content of murine B16F1 melanoma cells in concentrationdepentent manners. No cytotoxic effect was seen in B16F1 and human CCD-164sk skin fibroblast cells treated with up to 1 μg/ml of the apricot seed essential oil. These results indicate that the apricot seed essential oil may have potential for the application in aromatherapy and the development of depigmenting agents. Keywords: Apricot seed, Essential oil, Tyrosinase, Melanogenesis, Inhibition 인간의피부와모발에존재하는색소인멜라닌은멜라닌형 성세포 (melanocyte) 내에서생합성된다. 뇌하수체에서분비 된멜라닌형성세포자극호르몬 (α-melanocyte-stimulating hormone; α-msh) 은멜라닌형성세포의세포막에존재하는 melanocortin receptor 1 (MC1R) 수용체에결합하고, 이는 세포내 camp 의양을증가시켜 microphthalmia-associated transcription factor (MITF) 를활성화시킨다 (Park et al., 29). MITF 는멜라닌합성효소인티로시나제 (tyrosinase), tyrosinase-related protein 1 (TRP1) 및 tyrosinase-related *Corresponding author: Yu-Hong Min, Department of Herbal Skin Care, Daegu Haany University, 1 Haanydaero, Gyeongsan, , Republic of Korea Tel.: , Fax: yhmin@dhu.ac.kr Received August 25, 214; Revised August 25, 214; Accepted October 14, 214; Published October 3, 214 protein 2 (TRP2) 의발현을증가시킨다 (Park et al., 29). 이중에서특히티로시나제는멜라닌생합성의속도결정단계를촉매하는것으로알려져있다. 티로시나제는두가지화학반응들을촉매한다. 우선기질인 L-티로신 (L-tyrosine) 을 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) 으로수산화 (hydroxylation) 시키고, L-DOPA를 dopaquinone으로산화 (oxidation) 시킨다 (Korner & Pawelek, 1982). 이후 dopaquinone은효소의촉매작용없이세포내의 ph조건에서자발적으로멜라닌으로전환된다. 멜라닌은자외선으로부터인체를보호하는작용을하지만, 피부에과도하게침착되면미용상의문제를야기할수있다. 따라서이러한멜라닌색소침착을억제하기위하여티로시나제저해제들이연구되고있다. 현재미백용화장품또는의약품으로사용되는티로시나제저해제들은하이드로퀴논 (hydroquinone), 코직산 (kojic acid), 알부틴 (arbutin), 아스코르빈산 (ascorbic acid; vitamin C), azelaic acid, retinoid 등이있다 (Rendon & Gaviria, 25). 하지만효능이강한하이드로퀴논은세포독성, 신장독성, 발암가능성및조직흑변증 (ochonosis) 과같은피부손상으 677

2 로인해의약품으로만사용된다 (Curto et al., 1999; Kooyers & Westerhof, 24). 코직산도미백효과가우수하지만접촉성피부염또는암을일으킬수있는것으로알려져있다 (Nakagawa et al., 1995; Wei et al., 1991). 알부틴은유전독성이있으며, azelaic acid는홍반및피부자극을일으킬수있는것으로보고되었다 (Balina & Graupe, 1991; Cheng et al., 27). 일반적으로미백용제품은장기간사용하므로부작용이발생할가능성이높다. 그러므로미백효과는크고부작용이적은미백소재에대한탐색이여전히필요하며, 특히부작용이적은천연물을대상으로활발한연구가이루어지고있다 ( 김가람등, 214; 모정희과오수정, 213; 최연선과최태부, 214). 정유 (essential oil) 는식물이만들어낸향이나는식물재료로서물리적인방법으로얻어낸휘발성물질이다 (Arctander, 1994). 정유를이용하여신체적및심리적건강을향상, 유지하는것을아로마테라피 (aromatherapy) 라고한다. 아로마테라피에서는정유들이가지고있는다양한효과를이용하는데, 여러종류의정유들이색소침착, 여드름, 민감성, 건성, 노화피부관리및체형관리등의미용적목적으로도사용되고있다. 피부반점과같은색소침착에사용되는정유로는레몬 (lemon), 라임 (lime), 만다린 (mandarin), 버가못 (bergamot) 등의시트러스 (citrus) 계열과라벤더 (lavender), 라반딘 (lavandin), 케이드 (cade), 리시쿠베바 (litseacubeba) 등이있다 (Lawless, 1995). 미백효과가과학적연구를통해보고된정유는레몬등의시트러스 (citrus), 아니스 (anise), 황해쑥 (Artemisia argyi), 정향 (clove), 계피 (Cinnamomum cassia), 라벤더, 페퍼민트 (peppermint), 삼나무, 편백나무등이있다 ( 김선홍등, 211; Arung et al., 211; Chou et al., 213; Fiocco et al., 211; Huang et al., 212; Kubo & Kinst-Hori, 1998; Matsuura et al., 26). 장미과식물인살구나무 (Prunus armeniaca L.) 의종자인행인 ( 杏仁, Armeniacae Semen) 은지질, 단백질및섬유질등을함유한다 (Femenia et al., 1995). 특히불포화지방산이함유된지질함량이높아피부관리용기초오일 (base oil) 의추출을위해많이사용된다. 한방에서행인은고온 ( 苦溫 ) 한성미로해수기천 ( 咳嗽氣喘 ) 및장조변비 ( 腸燥便秘 ), 즉기침, 천식, 변비등의치료에사용된다. 또한피부미용적인효능이뛰어나기미등의색소침착, 여드름, 비듬, 손발트임, 가려움, 민감성피부, 노화피부의치료및관리에사용되고있다 ( 주영승등, 24). 행인의약리효능으로천식개선, 항염증, 항돌연변이, 항종양, 항균작용등이보고되어있다 ( 황대룡등, 23; Chang et al., 25; Yamamoto et al., 1992; Yiğit et al., 29). 또한행인의에탄올추출물은티로시나제억제, 자외선차단효과, 항산화, 수렴활성, 그리고열수추출물은항산화, 수렴활성등의화장품약리효능을갖는것으로밝혀져있다 ( 김영훈등, 27; 허상선과김일출, 211). 행인은특유의향을갖는정유성분이함유되어있다. Gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS) 를이용한성분분석결과에따르면행인정유는대부분 benzaldehyde (9.6%) 로구성되어있고, 그외에 mandelonitrile 및 benzoic acid가각각 5.2% 및 4.1% 함유되어있다 (Lee et al., 214). 행인정유의효능으로는항균및낮은항산화활성만이밝혀져있을뿐미용적효능에대해서는아직보고된바없다 ( 안정현등, 211; Lee et al., 214). 따라서본연구에서는행인정유의피부미백효과를티로시나제억제및멜라닌생합성억제실험을통해측정하고자하였다. 또한피부세포에대한독성여부도분석하여, 아로마테라피또는미백화장품소재로서의가능성을평가하고자하였다. 1. 정유추출행인정유는물증류법 (hydrodistillation) 을이용하여추출하였다 (Lee et al., 214). 분쇄된행인 ( 경주산 ) 3 g을탈이온수 1.5 L와함께클레벤저형추출기 (Clevenger type apparatus) 에넣고 3 h 동안가열하였다. 얻어진정유에황산나트륨.1 g 을가한후교반하여완전히탈수하였다. 이를기공크기가.2 μm인 syringe filter (Millipore, USA) 로여과하여최종적으로.8 g의정유를획득하였다 ( 수율.27% w/w). 2. 세포배양 B16F1 및 CCD-164sk 세포는미국 ATCC에서구입하여사용하였다. 1% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, USA) 을첨가한 Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM; Gibco BRL, USA) 을사용하여 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 3. Mushroom tyrosinase 저해활성측정버섯티로시나제활성억제측정을 L-DOPA를기질로이용하여다음과같이실시하였다 (Nerya et al., 24). 96-well plate의각 well에 dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma, USA) 로희석한시료액 1 μl 및.1 M potassium phosphate buffer (ph6.8) 6 μl을넣었다. 여기에 333 units/ml의티로시나제 (Sigma, USA) 용액 3 μl를가하고섞은후상온에서 5 min 간방치하였다. 12 mm의 L-DOPA (Sigma, USA) 용액을 1 μl 씩넣어섞고 microplate reader (Tecan, Switzerland) 를이용해 492 nm에서 2 min 간흡광도를측정하였다. 5% 의티로시나제활성을저해하는농도 (5% inhibitory concentration; IC 5 ) 를계산하였다. 비교를위해코직산 (Sigma, USA), 아스 678

3 코르빈산 (Sigma, USA), 레몬정유 (Florihana, France) 및 benzaldehyde (Sigma, USA) 를사용하였다. 4. Cell-free tyrosinase 저해활성측정마우스멜라닌형성세포의 tyrosinase 저해능측정을다음과같이실시하였다 (Dinget al., 211). 아무런처리없이 1 mm dish에서배양한 B16F1 세포를 phosphate buffered saline (PBS) 로 2번 washing한후, 1% Triton X-1 (Sigma, USA) 및 1 mm phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF; Sigma, USA) 가포함된 4 의.1 M potassium phosphate buffer (ph6.8) 를넣고 Dounce homogenizer로 3번 stroke하여 homogenization하였다. 이를 4 에서 15 rpm으로 15 min 간원심분리하여상등액을취하고 Bradford solution (Bio- Rad, USA) 을이용하여단백질농도를측정하였다. 상등액 ( 단백질 5 μg), 2.5 mm L-DOPA,.1 M potassium phosphate buffer (ph6.8) 그리고시료를넣어최종부피가 1 ml가되도록하였다. 이때시료의용해를위하여최종농도가.1% 가되도록 DMSO를첨가하였다. 이반응액을 37 에서 15 min 간방치한후 475 nm에서흡광도를측정하였다. 시료가포함되지않은무처리군의흡광도와비교하여시료첨가군의흡광도를백분율로나타내었다. 대조군으로코직산을사용하였다. 5. 멜라닌생성저해활성측정멜라닌생성량을 Choi et al. (21) 의방법을수정하여측정하였다. B16F1 세포를 6-well plate에 cells/well의농도로분주하여 24 h 배양한후,.1% DMSO 및각농도별시료가포함된새로운배지로교환하였다. 이때배지에멜라닌생성을촉진하기위하여 α-msh (Sigma, USA) 를 1 nm이되도록함께넣었다. 48 h 배양한후, 세포를 PBS로 2번 washing 하였다. 각 well에 lysis buffer (2 mm Tris (ph7.6),.1% Triton X-1) 를.5 ml씩넣고 4 에서 1 h 방치한후, 이를 4 에서 12 g로 5 min 간원심분리하였다. 생성된 pellet 에 1 N NaOH를 2 μl 넣고 6 에서 1 h 방치하여용해시킨후, microplate reader를이용하여 45 nm에서흡광도를측정하였다. 멜라닌생성량은 α-msh 무처리군의흡광도와비교하여백분율로나타내었다. 대조군으로코직산을사용하였다. 6. 세포독성측정마우스멜라닌형성세포인 B16F1 세포와인간피부유래섬유아세포 (fibroblast) 인 CCD-164sk 세포에대한독성을 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay를이용하여측정하였다. 96-well plate 에 B16F1 세포를 cells/well의농도로, CCD-164sk 세포는 cells/well의농도로분주하고 24 h 배양한후,.1% DMSO 및각농도별시료가포함된새로운배지 (1% FBS 함유 ) 로교환하였다. 48 h 배양한후, 5 mg/ml MTT 용 액을각 well 에 2 μl 씩넣고 3 h 더배양하였다. 배지를제 거하고각 well 에 DMSO 를 1 μl 씩넣어생성된 formazan crystal 을녹인후, microplate reader 를이용하여 57 nm 에 서흡광도를측정하였다. 무처리군의흡광도를기준으로세포 생존율을산출하였다. 비교를위해코직산을사용하였다. 1. 행인정유의버섯티로시나제저해 티로시나제저해제의 1 차스크리닝용으로주로사용되는버 섯티로시나제에대한실험결과, 행인정유는 IC 5 값이 1.11 μ g/ml 로측정되었다 (Table 1). 티로시나제저해제로알려진미 백물질들인코직산 (IC μg/ml), 아스코르빈산 (IC μg/ml), 레몬정유 (IC μg/ml) 에비하여높은저해활 성을나타내었다. 한편행인정유의주성분인 benzaldehyde 는티로시나제저해효과가알려진물질이다 (Jiménez et al., 21). Benzaldehyde 의저해능도함께측정하여본결과 IC 5 값이.94 μg/ml 로행인정유의 IC 5 값과비슷한것으로나 타났다. 따라서행인정유의티로시나제저해효과는주로 benzaldehyde 에기인하는것으로판단된다. 2. Cell-free tyrosinase 저해 버섯티로시나제는인간의티로시나제와아미노산서열동 일성 (identity) 이 23% 밖에안되는반면마우스티로시나제 와인간티로시나제는아미노산서열동일성이 82% 에이른다 (Sugimoto et al., 23). 따라서인체용미백제개발을위해서 는버섯보다마우스티로시나제를대상으로저해활성을평가 하는것이적합하다. 행인정유의마우스티로시나제저해효과 를측정하기위하여마우스멜라닌형성세포인 B16F1 세포의 crude extract 를사용하였다. 실험결과행인정유는마우스티 로시나제활성을농도의존적으로저해하였으며, 1 μg/ml Table 1. In vitro inhibition of mushroom tyrosinase by apricot seed essential oil and other depigmenting materials IC 5 ( g/ml) 1) Apricot seed essential oil 1.11 Kojic acid 5.7 Ascorbic acid 54. Lemon essential oil Benzaldehyde.94 1) IC 5 : 5% inhibitory concentration. 679

4 A Figure 1. Inhibitory effect of apricot seed essential oil on cellfree tyrosinase activity of B16F1 cells. Results were expressed as means±sd. B 처리시활성이 42.8% 로감소하였다 (Figure 1). 양성대조군인 코직산은 1 μg/ml 처리시활성을 21.1% 로감소시켰다. 행 인정유는버섯티로시나제실험결과와는달리코직산보다낮 은저해활성을나타내었지만, 마우스티로시나제저해활성역 시상당하다고판단된다. 3. 멜라닌생성저해 1 Figure 2. Inhibitory effect of apricot seed essential oil on the melanin content of B16F1 cells. Results were expressed as means±sd. 마우스멜라닌형성세포인 B16F1 세포에서의멜라닌생성 에행인정유가미치는영향을측정한결과, 농도의존적으로 멜라닌양을감소시켰다 (Figure 2). α-msh 를단독으로처리 한경우무처리군에비해멜라닌양이 156.2% 증가하였으며, α -MSH 와 1 μg/ml 의행인정유를함께처리한경우멜라닌 양은 156.2% 에서 123.7% 로감소하였다. 행인정유는양성대 조군인코직산과매우비슷한수준의멜라닌생성저해효과를 나타내었다. 이는 cell-free tyrosinase 저해결과와는다른것 으로, 아마도행인정유의높은세포막투과율에기인한것으 로사료된다. 즉행인정유는지용성이강하므로수용성인코직 Figure 3. Viability of B16F1 (A) and CCD-164sk (B) cells treated with apricot seed essential oil. Results were expressed as means±sd. 산보다세포막투과율이높을것이다. 따라서행인정유는티 로시나제저해율이코직산에비해낮지만세포흡수는보다잘 되므로, 결과적으로멜라닌생성에미치는영향은행인정유 와코직산이비슷한것으로판단된다. 정유또는정유성분들 은피부에상당히흡수또는투과되는것으로이미밝혀져있다 (Fuchs et al., 1997; Heuberger et al., 24; Reichling et al., 26; Wang & Tso, 22). 또한행인정유의주성분인 benzaldehyde 는피부에서잘흡수되어신체장기에분포되는 것으로알려져있다 (Andersen, 26). 따라서행인정유역시 피부흡수율이높을것으로예상된다. 4. 세포독성 행인정유의마우스멜라닌형성세포 (B16F1) 및인간피부 유래섬유아세포 (CCD-164sk) 에대한독성을측정한결과, 모두 1 μg/ml 까지의농도에서 1% 이상의생존율을보 여독성이관찰되지않았다 (Figure 3). 비교를위해사용한코 직산역시같은농도범위에서독성이나타나지않았다. 이결 과를통해행인정유의멜라닌생성저해작용은멜라닌형성 68

5 세포에대한독성작용에의한것은아님을알수있었다. 한 편행인은독성물질인청산배당체즉아미그달린 (amygdalin) 이함유되어있어복용시위험한것으로유명하지만, 증류법 을이용한정유추출방식으로는비휘발성인아미그달린은전 혀추출되지않는다 (Lee et al., 214). 또한행인정유의주성 분인 benzaldehyde 는독성이적은안전한물질로알려져있다 (Andersen, 26). 따라서실험결과와종합하여볼때행인정 유는피부세포에독성이없는미백화장품의소재로서개발가 능성이있다고사료된다. 본연구에서는멜라닌생성에대한행인정유의영향을분석 하였고그결과는다음과같다. 첫째, 버섯티로시나제에대한실험결과, 행인정유 (IC μg/ml) 는코직산 (IC μg/ml), 아스코르빈산 (IC μg/ml) 및레몬정유 (IC μg/ml) 에비하여높은 저해활성을나타내었다. 행인정유의주성분인 benzaldehyde (IC 5.94 μg/ml) 는행인정유와비슷한저해활성을나타내 었으므로행인정유의저해효과는주로 benzaldehyde 에기인 하는것으로판단된다. 둘째, 마우스멜라닌형성세포인 B16F1 을이용한 cell-free tyrosinase 저해실험결과, 행인정유는마우스티로시나제활 성을농도의존적으로저해하였다. 셋째, B16F1 세포를이용한멜라닌생성저해실험결과, 행인정유는농도의존적으로멜라닌양을감소시켰다. 넷째, 세포독성측정결과, 행인정유는 1 μg/ml 까지의 농도범위에서마우스멜라닌형성세포 (B16F1) 및인간피부 섬유아세포 (CCD-164sk) 에대한독성을나타내지않았다. 이상의결과들로부터행인정유가멜라닌생성저해활성을 가지고있음을확인하였다. 특히아로마테라피에서미백목적 을위해사용하는대표적정유인레몬보다도월등한저해활성 을나타내었다. 따라서새로운아로마테라피용아로마오일로서 사용가치가있다고사료된다. 또한행인정유가가진독특한향 을이용한방향성미백소재로화장품에사용할가능성이있다 고사료된다. 앞으로인체적용실험을통한추가적인효능및 독성평가가필요할것으로판단된다. 김가람, 차훈, 송희경, 이유나, 안규중, 안인숙, 안성관. 당유자 미숙과동결건조추출물이멜라닌생성에미치는영향. 대 한피부미용학회지, 12: 43-48, 214. 김선홍, 이수연, 홍창영, 곽기섭, 여환명, 이전제, 최인규. 삼나무와편백나무정유의미백및항산화효능평가. 목재공학, 39: , 211. 김영훈, 조우아, 천순주, 장민정, 성지연, 정연숙, 김영선, 강보연, 손애량, 이창언등. 행인 ( 杏仁 ) 의약용화장품활성및미백효과에관한연구. 한약응용학회지, 7: 35-39, 27. 모정희, 오수정. 황칠나무잎메탄올추출물및분획물의 Tyrosinase 저해및 Melanin생성억제활성. 대한피부미용학회지, 11: , 213. 안정현, 민유홍, 이은숙. 5가지한방정유 ( 목향, 당귀, 행인, 백자인, 야국화 ) 의라디칼소거작용에관한연구. 한약응용학회지, 11: 1-5, 211. 주영승, 김기연, 장성환. 미용동의보감, 성보사, 서울, 24. 최연선, 최태부. B16F1 mouse melanoma 세포에서삼채 (Allium hookeri) 추출물의멜라닌형성억제효과에관한연구. 대한피부미용학회지, 12: , 214. 허상선, 김일출. 모과, 행인및백자인의항산화성및미백효과에관한연구. 대한미용학회지, 7: , 211. 황대룡, 강영성, 김성수, 김대한, 신민교, 송호준. 행인의알레르기천식효과에대한연구. 대한본초학회지, 18: 21-28, 23. Andersen A. Final report on the safety assessment of benzaldehyde. Int. J. Toxicol., 25: 11-27, 25. Arctander S. Perfume and flavor materials of natural origin. Allured Publishing, USA, Arung ET, Matsubara E, Kusuma IW, Sukaton E, Shimizu K, Kondo R. Inhibitory components from the buds of clove (Syzygiumaromaticum) on melanin formation in B16 melanoma cells. Fitoterapia, 82: , 211. Balina LM, Graupe K. The treatment of melasma. 2% azelaic acid versus 4% hydroquinone cream. Int. J. Dermatol., 3, , Chang HK, Yang HY, Lee TH, Shin MC, LeeMH, Shin MS, Kim CJ, Kim OJ, Hong SP, Cho S. Armeniacae semen extract suppresses lipopolysaccharide-induced expressions of cycloosygenase-2 and inducible nitric oxide synthase in mouse BV2 microglial cells. Biol. Pharm. Bull., 28: , 25. Cheng SL, Liu RH, Sheu JN, Chen ST, Sinchaikul S, Tsay GJ. Toxicogenomics of A375 human malignant melanoma cells treated with arbutin. J. Biomed. Sci., 14: 87 15,

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,