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1 비소세포폐암환자의혈장 DNA 를이용한 Microsatellite 분석 화순전남대학교병원폐식도종양클리닉 1, 전남대학교의과대학호흡기내과학교실 2, 법의학교실 3 김규식 1,2, 김은정 2, 김수옥 2, 오인재 2, 박창민 2, 정주연 1,2, 김유일 2, 임성철 2, 박종태 3, 김영철 1,2 Microsatellite Alterations of Plasma DNA in Non Small Cell Lung Cancer Kyu-Sik Kim, M.D. 1,2, Eun-Jung Kim, M.D. 2, Soo-Ock Kim, M.D. 2, In-Jae Oh, M.D. 2, Chang-Min Park, M.D. 2, Ju-Yeon Jeong, M.D. 1,2, Yu-Il Kim, M.D. 2, Sung-Chul Lim, M.D. 2, Jong-Tae Park 3, Young-Chul Kim, M.D. 1,2 Lung and Esophageal Cancer Clinic, Chonnam National University Hwasun Hospital 1 Department of Pulmonology and Critical Care Medicine 2 Department of Forensic Medicine 3, Chonnam National University Medical School, South Korea Microsatellites are short tandem repeated nucleotide sequences that are present throughout the human genome. Variations in the repeat number or a loss of heterozygosity around the microsatellites have been termed a microsatellite alteration (MA). A MA reflects the genetic instability caused by an impairment in the DNA mismatch repair system and is suggested to be a novel tumorigenic mechanism. A number of studies have reported that MA in the DNA extracted from the plasma occurs at varying frequencies among patients with a non-small cell lung carcinoma (NSCLC). The genomic DNA from 9 subjects with a non-small cell lung cancer (squamous cell cancer 6, adenocarcinoma 2, non-small cell lung cancer1) and 9 age matched non-cancer control subjects (AMC: tuberculosis 3, other inflammatory lung disease 6) and 12 normal control subjects (NC) were extracted from the peripheral blood leukocytes and plasma. Three microsatellite loci were amplified with the primers targeting the Gene Bank sequence D21S1245, D3S1300, and D3S1234. MA in the form of an allelic loss or a band shift was examined with 6% polyacrylamide gel electrophoresis and silver staining. None (0/12) of the NC subjects less than 40 years of age showed a MA in any of the three markers, while 88.9%(8/9) of the AMC above 40 showed a MA in at least one of the three markers (p<0.05). Sixty percent(6/10) of the control subjects with a smoking history showed a MA in one of the three markers, while 9.1%(1/11) of the control subjects without smoking history showed a MA (p<0.05). However, not only did 66.7%(6/9) of lung cancer patients show a MA in at least one of the three markers but so did 88.9%(8/21) of the AMC patients (p>0.05). In conclusion, a MA in the D21S1245, D3S1300, and D3S1234 loci using DNA extracted from the plasma was detected in 66.7% of lung cancer while no MA was found in the young non-smoking control subjects. However, many of the non-cancer control subjects (aged smokers) also showed a MA, which compromised the specificity of the MA analysis as a screening test. Therefore, a further study with a larger sample size will be needed. (Tuberc Respir Dis 2005; 58: ) Key words : Non-Small Cell Lung cancer, Microsatellite Alteration, Plasma DNA 서 암은결국다양한유전자이상들이축적되어발생 본연구는전남대학교임상연구소연구비 CUHRI-U 에의하여이루어졌음. Address for correspondence : Young-Chul Kim, M.D. Lung and Esophageal Cancer Clinic Department of Pulmonology and Critical Care Medicine Chonnam Natioinal University Hwasun Hospital Jeollanamdo, Hwasun, Ilsim-ri 160, Phone : Fax : Kyc0923@jnu.ac.kr Received : Dec Accepted : Jan 론 된다고이해되고있는데악성종양은최소한 10-20단계이상의유전자이상들이중첩되어발생된다고알려져있다. 암세포에서발견되는변화들로는전암유전자들의활성화, 종양억제유전자들의기능소실, 잘못복사되거나손상을입은 DNA를복구하는유전자들의기능소실, 정상적으로세포사멸에관여하는인자들의변화들이복합되어관찰된다. Microsatellite는매우작은염기의반복되는단순한배열로서전체유전체 (genome) 에흩어져서존재한다. Microsatellite의크기는개체간에다형성을보이면서도유전자의진화과정에서안정적으로다음세대에유전되며 PCR을통해서쉽게분석할수있어 352

2 Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 58. No. 4, Apr 서유전적안정성을측정하는표식자로서활용될수있다. Microsatellite alteration(ma) 는이러한단순반복단위에결손또는삽입이나타나는경우인데이것은 DNA의복제과정에서간헐적으로발생되는염기구조의결손을불일치복구체계 (mismatch repair system) 가적절하게교정하지못하여발생된다. 즉 loss of heterozygosity(loh) 또는 band shift(bs) 형태로표현되는 MA가관찰된다면 DNA 의복제이상 (replication error) 이호발하여다양한유전자들의변이가발생될개연성이매우높은데실제로폐암을포함한다양한암종에서 MA는높은빈도로발견된다 1-4. 최근암사망률의가장흔한원인질환으로급격한증가추세를보이고있는폐암은방사선학적으로진단이어려울뿐만아니라조직진단이쉽지않으므로조기진단을위한검진이어려운문제가있다. 그런데최근에혈장 DNA의농도가폐암에서높으며 5, MA가조기폐암에서도비교적높은빈도로발견되므로 6, 혈장유전자를이용한폐암의진단, 추적관찰, 예후예측방법으로의응용가능성이제시되고있다. 저자들은폐암환자들과비폐암대조군의말초혈액백혈구로부터추출된 DNA와혈장 DNA을이용하여 MA를비교조사하여혈장 DNA를이용한 MA의진단적의의를알아보고자하였다. 연구대상및방법 1. 대상 2000년 1월부터전남대학교병원에서진단된폐암 환자들과비폐암대조군으로부터환자의동의하에얻어진혈액을이용하였다. 폐암군 9례 (squamous cell carcinoma 6례, adenocarcinoma 2례, non-small cell lung cancer 1례 ) 의연령은평균 63.4세 ± 10.6( 표준편차 ) 를보였고, 이들과연령이비슷한비폐암대조군 9 례 (Age Matched Control, AMC, 결핵 : 3례, 비특이적염증성폐질환 : 6례 ) 는평균 61.8±8.4 세로써폐암군과유의한연령의차이는없었다. 또한 40세이하의정상대조군 12례 (Normal Control, NC, 26.9±4.0세 ) 를함께조사하였다 (Table 1). 2. DNA 추출혈액 5cc를 EDTA가처리된용기에채취하여 1,500 rpm (HA , Hanil Science, Incheon) 에서 20분간원심분리하여상층 ( 혈장 ) 과혈구세포를분리하였다. 1) 말초혈액백혈구에서 DNA 추출혈장을취하고남은혈구세포를 15 ml polypropylene tube에옮겨 1x RBC lysis buffer (150mM NH 4 Cl, 20 mm Tris ph 8.0) 를넣고 37 항온수조에서 20-25분간흔들어주고 1,500 rpm(ha , Hanil Science, Incheon) 에서 10분간원심분리하여침전물만취하는과정을 2회반복하였다. 이렇게얻은침전물에 TEN buffer 375 μl, 10% SDS 25 μl, proteinase-k 10 mg/ml 10 μl를넣고 37 항온수조에넣어 16시간이상부치시킨다음 eppendorf tube에반응물을옮기고 5 M NaCl 160 μl를첨가하여잘혼합한다음 13,000 rpm (5415C, Eppendorf, Hamburg, Germany) 으로 20분간 Table 1. Characteristics of the Lung Cancer patients, Age Matched Control(AMC) and Normal Control Aged below 40 years(nc). Lung cancer AMC (age>40 years) NC (age<40 years) Number Sex (M/F) 6 / 3 7 / 2 * 10 / 2 Age (years, Mean±SD) 63.4 ± ± 8.4* 26.9 ± 4.0 Smoker / Never Smoker 5 / 4 8 / 1* 2 / 10 Diseases Squamous cell carcinoma. : 6 Adenocarcinoma : 2 Non-small cell cancer: 1 * : No statistically significant difference between the lung cancer and AMC group. Tuberculosis : 3 Other inflammation : 6 No known disease 353

3 KS Kim, et al.: Microsatellite alterations of Plasma DNA in NSCLC 원심분리하여단백질을침전시켰다. 상층액만을취하여새 eppendorf tube에옮기고 2배부피의 100% alcohol 880 μl를넣고잘흔들고원심분리하여 DNA 침전물을얻었다. 70% ethanol 400 μl로염기를제거하고 37 heat block에서 5분간건조한다음 TE buffer 600 μl 로녹였다. 분광광도계 (spectrophotometer, Gene Quant II; Pharmacia Biotech) 로 DNA 농도를측정하고 PCR 용 DNA 용액 5 ng/μl 의농도로희석하여중합효소연쇄반응법에의한유전자좌증폭에사용하였다. 2) 혈장에서 DNA 추출혈액에서분리해 -70 에보관된혈장 1 ml에 10% SDS 25 μl, proteinase-k 10 mg/ml 10 μl를첨가하고 37 항온수조에넣고 16시간이상부치시킨후, 폐놀용액 (phenol: chloroform: isoamylalcohol 25:24:1) 으로 DNA층을얻었다. 여기에 100% 에탄올 800 μl + 7.5M Ammonium acetate 100 μl, 20 mg/ml glycogen 1 μl을첨가해잘흔든후 -20 에부치시키고원심분리하여 DNA 침전물을얻었고 70% ethanol 400 μl 로염기를제거하였다 DNA 침전물을건조한다음 TE buffer 100 μl를넣고녹여서분광광도계 (spe ctrophotometer, Gene Quant II; Pharmacia Biotech) 로 DNA 농도를측정하였다. 5 ng/μl 농도로희석하여중합효소연쇄반응법에의한유전자좌증폭에사용하였다. 3. PCR과 MA 분석폐암에서 MA가흔히발생하는것으로알려진세유전자좌 D3S1300 (3p14.2, FHIT locus), D3S1234 (3p13-14) 그리고 D21S1245 (21q11-21) 를대상으로검색하였다. 세개의 microsatellite 유전자좌증폭을위한각각의 primer는 GeneBank ( nlm.nih.gov/) 로부터염기서열을얻어서 Whitehead Institute for Biomedical Research 의 web에기반을둔 primer 설계프로그램 ( mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) 을이용하여설계하였으며그염기서열은 D3S1300: forward; 5 - gcc ctc aga gag ctc aca tt 3', reverse: 5'- atg cca att ccc cag atg ta -3', D3S1234는 forward: 5'- cag gaa aat ccc ttg aac ca -3', reverse: 5'- gtt gtt gga gtg gga cca ag -3', 그리고 D21S1245는 forward: 5'- tga aaa aca gag aag gag gga at 3', reverse: 5'- tgg tga att cag ttt gct ggt -3' 를주문제작하여사용하였다. 1) 중합효소연쇄반응에의한유전자좌증폭 (PCR) 1U의 Taq DNA polymerase (Super BIO, Suwon) 와함께 40 ng의 sample DNA, 800 μm의 dntp, 1 μ M 의각각의 primer, 1.5 mm MgCl 2, 50 mm KCl으로하여총반응액을 20 μl 로하였다. 세쌍의 primer 모두각각 94 에서 30초간 denaturation, 57 에서 30초간 annealing 그리고 72 에서 30초동안 extension하는온도순환을 Perkin Elmer 2400 thermal cycler로 40회반복하였다. 2) 증폭된 DNA fragment 관찰증폭산물은 2% agarose gel에전기영동시켜확인한후 6% polyacrylamide gel에서다시전기영동 (40 Watt, 2시간, TBE buffer 0.5 x) 하여 silver staining으로 MA 여부를관찰하였다. Silver staining은전기영동을시킨 6% polyacrylamide gel의 DNA를 fix/stop (solution 500 ml당 50 ml; glacial acetic acid), staining (solution 500 ml당 ; 0.5g AgNO 3, 750 μl 37% formamide), developer solution 500 ml당 ; 15g Na 2 CO 3, 100 μl Na 2 S 2 O 3-5H 2 O, 750 μl 37% formamide) 의세단계염색방법이다. fix/stop solution에 6% polyacrylamide gel을 20분동안반응시킨후증류수로 2분씩세번깨끗하게씻어낸다음 staining sol ution 을이용하여 30분동안반응시키고위와같이증류수로 10초정도씻어내었다. 마지막으로 developer solution으로증폭산물의띠가보일때까지반응시키고띠가진하게보이면처음사용했던 fix/stop solution 으로고정과정을한번더시행하였다. MA 여부는 loss of heterozygosity (LOH) 또는 band shift (BS) 로관찰되었는데, 띠가없어져백혈구 DNA 에서는보이지만혈장 DNA 에서는관찰되지않 354

Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 58. No. 4, Apr. 2005 는다거나 (LOH), 띠의길이가달라서백혈구에서증폭산물의띠위치보다아래또는위에서관찰되는양상 (BS) 으로관찰되었다. 4. 통계분석연속변수는평균 ± 표준편차로표현하였다. 통계분석은 SPSS for Windows version 12.

4 Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 58. No. 4, Apr 는다거나 (LOH), 띠의길이가달라서백혈구에서증폭산물의띠위치보다아래또는위에서관찰되는양상 (BS) 으로관찰되었다. 4. 통계분석연속변수는평균 ± 표준편차로표현하였다. 통계분석은 SPSS for Windows version 12.0(SPSS Inc, Chicago, IL) 을사용하였다. 결과 이들에서 MA 여부를비교하였다. NC에서는위의세가지유전자좌중한가지에서도 MA가관찰되지않았으나 AMC 에서는 88.9%(8/9) 에서최소한한가지이상의유전자좌에서 MA가관찰되었다 (Table 2). 비폐암대조군 (AMC) 9례와 40세이하의정상대조군 (NC) 12 례를대상으로흡연력에따라흡연군 (10 례 ) 과비흡연군 (11례 ) 으로나누어 MA 빈도를비교하였다. 위의세가지유전자좌중한가지에서라도 MA 가관찰된경우는흡연자들이 70%(7/10) 를보인반면비흡연자는 9.7%(1/11) 에서만관찰되어흡연군에서유의하게높은빈도를보였다 (p<0.05, Table 3). MA는 LOH 또는 BS 양상으로관찰되었으며, 세가지유전자좌중 D21S1245는모두 LOH 양상이었고, D3S1300과 D3S1234는 LOH 또는 BS와 LOH 두가지형태의조합으로 MA가관찰되었다 (Figure 1). 폐암을갖고있지않은정상인에서연령의증가에따라 MA의빈도가높아지는지를보고자비폐암대조군 (AMC) 9례와정상인 (NC) 12례에서연령에따른 MA의빈도를비교하였다. D3S1300는 20례에서, D3S1234는 19례에서, 그리고 D21S1245는 15례에서대립유전자 (informative cases) 를관찰할수있었고 Figure 1. Microsatellite analyses of the paired leucocytes(l) and plasma(p) DNA from the non-small cell lung cancer patients. Note the allele loss (2, 5) and combination of band shift and allele loss(1, 3, 4) in the representative images of D3S1300, D3S1234 and D21S1245. (6% polyacrylamide gel, Silver stain) Table 2. Comparison of the MAs between the Age Matched Control(AMC) and Normal Control(NC) Aged below 40 years. Primer Informative cases No of MA AMC (age>40years) N=9 NC (age<40years) N=12 D3S /8 (37.5%) 0/12 (0%) D3S /9 (55.6%) 0/10 (0%) D21S /4 ( 75%) 0/11 (0%) Sum /9 (88.9%) 0/12 (0%) : p<0.05 Table 3. Comparison of the MAs in the Age Matched Control(AMC) and Normal Control(NC) Aged below 40 years according to their Smoking History. Primer Informative cases No of MA Smokers (N=10) Never smokers (N=11) D3S /9 (33.3%) 0/11 (0 %) D3S /10 (40 %) 1/9 (11.1%) D21S /6 (50 %) 0/10 (0 %) Sum /10 (70 %) 1/11 (9.7 %)* *: p<0.05 between smokers and never smokers 355

5 KS Kim, et al.: Microsatellite alterations of Plasma DNA in NSCLC Table 4. Comparison of MAs between the lung cancer and non-cancer Age Matched Control(AMC) group aged over 40. Primer Informative cases No of MA Lung cancer No (%) N=9 AMC No (%) N=9 D3S /9 (55.5%) 3/8 (37.5%) D3S /6 (66.7%) 5/9 (55.6%) D21S /5 (60%) 3/4 (75%) Sum /9 (66.7%) 8/9 (88.9%) : no statistically significant difference between the lung cancer and control group. 다음으로폐암군 (9례) 과이들과연령과흡연력이비슷한비폐암대조군 (9례) 간에 MA 빈도를비교하였다. D3S 례, D3S1234는 15례, 그리고 D21S1245 는 9례에서대립유전자를관찰할수있어서이들에서 MA의빈도를비교하였다. 위의세가지유전자좌중한가지에서라도 MA가관찰된경우는폐암군 66.7% (6/9), 비폐암군에서 88.9%(8/9) 로서양군간에 MA의빈도에는차이가없었다 (p>0.05, Table 4). 폐암군에서흡연여부에따라 MA의빈도를비교하였을때, 흡연자폐암에서 80%(4/5), 비흡연자폐암에서 50%(2/4) 로유의한차이는관찰되지않았다 (p>0.05). 고찰폐암은흡연인구의증가와대기오염등의원인으로우리나라에서도급속히증가하고있으며암으로인한사망의원인질환들중가장큰비중을차지하고있다 12. 이러한폐암의발생빈도및폐암으로인한사망률의증가는현재의흡연실태로보아앞으로도상당기간지속될것으로예상되나대부분의폐암이진단당시에이미제 3 병기이상으로진행된상태로진단되므로완치가어려운경우들이대부분이라는문제가있다 13. 종양세포는쉽게고사 (apoptosis) 되거나괴사 (necrosis) 되므로파괴된종양세포로부터유출된종양세포의유전자가혈액을순환할수있다. 즉혈액중의백혈구에는개체가고유하게물려받은유전자를가지고있지만, 혈청이나혈장속에순환하는유전자는종양세포로부터유리된유전자일수있다. Sozzi 등 6 은 1 병기에서 3 병기까지의비소세포폐 암 87례와 14례의대조군을이용하여연구자의같은부위의 MA를관찰하였는데조직 (56%) 과혈장 (40%) 모두에서 MA를관찰할수있었고특히제 1병기 (43%) 와 2 cm 이하의종양을가지고있는경우 (45%) 에서도높은빈도로 MA가관찰되어조기진단의지표로써의가능성을시사하였다. 그러나본연구에서고령의흡연자대조군에서도폐암과같은높은빈도의 MA가관찰되므로혈장 DNA를이용한 MA 검사는위양성율이높아서폐암진단을위한검사로는적절하지않음을추정할수있다. 연구자의성적과달리 Sozzi 등의보고들 5,6 에서 MA가대조군에서는관찰되지않았는데, 이는대조군의흡연율과연령이폐암군보다낮았기때문에 MA 가상대적으로낮게관찰되어특이도가높은결과를얻었을가능성이있다. 다른연구들 14,15 에서도혈장 DNA의 MA는특이도가높은검사로보고하고있지만, Khan등 16 은 86례의폐암군과연령과흡연력이비슷한 120례의폐질환 ( 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 결핵등 ) 환자들의혈장 DNA의 MA를비교하여저자들의연구와같이특이도가높지않음을보고하고있다. 즉폐암에서 69% 의 MA가관찰되었으나비폐암대조군에서도 42% 에서관찰되어서혈장 DNA의 MA는특이도가높지않다는점이다. 이상과같이 MA가고령의흡연자에서흔히발견되는소견이라면흡연과연령의증가중어떠한인자가 MA를초래하는주요원인인지를알아볼필요가있겠다. 그러나본연구에서대조군 9례중 1 례를제외하고는모두고령의흡연자들이었고 40세이상의정상대조군 12례는 2례를제외하고는모두비흡연자들이 356

6 Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 58. No. 4, Apr 었기때문에양대조군의흡연과연령특성이서로상이하여이문제의답을얻을수는없다. 단지폐암이호발하는고령의대조군에서폐암과같이높은빈도로 MA가발견되어서연령증가나흡연에따른변화이거나전암또는초기암병변이있을가능성을추정할수있다. 즉, 비폐암대조군을다양한연령층과흡연력의건강인들을대상으로 MA의빈도를관찰해비교해보아야할것이며, MA를보이는대조군에서폐암의발생위험도가높은지를추적관찰할필요가있겠다. 본연구에서는비소세포폐암환자들만을대상으로하였으나혈행성전이가호발하는소세포폐암에서도높은빈도의 MA를보임이인용된대부분의논문들에서보고하고있다. 따라서향후에는다양한조직형들의폐암검체를이용한연구가필요하겠고, 종양조직으로부터추출한 DNA와혈장 DNA의 MA 양상이일치하는지를검증하는실험도필요하겠다. 혈장 DNA로 MA를관찰할수도있지만최근에는혈장또는혈청 DNA의양을정량적 PCR 법으로측정하여진단및예후예측인자로써이용가능성도제시되고있어서 17,18 혈장또는혈청 DNA의정량적분석도추구되어야할과제이다. 결론적으로혈장 DNA의 MA는 40세이하의정상인들에서는발견되지않았으며폐암환자들에서높은빈도로발견되었다. 그러나고령의흡연자인비폐암대조군에서도높은빈도로 MA가관찰되므로폐암조기진단의지표로써는적합하지않을것으로예측된다. 요약폐암의조기진단을위한방법으로써 MA의의의를알아보고자전남대학교병원내과에내원한폐암환자 9례 (squamous cell carcinoma 6례, adenocarcinoma 2례, non-small cell lung cancer: 1례 ), 연령이비슷한비폐암대조군 9례 (AMC, 결핵 : 3례, 비특이적염증성폐질환 : 6례 ) 와 40세이하정상인 12례 (NC) 를대상으로, 이들의말초혈액의백혈구와혈장으로부터 DNA 를추출하여 D21S1245, D3S1300, D3S1234 유전자좌의 MA를분석하였다. 세가지유전자좌중어느한유전자좌에서라도 MA 가관찰되면 MA가있는것으로인정하였다. MA는 NC에서는관찰되지않았으나 0%(0/12), AMC 에서는 88.9%(8/9) 에서관찰되었다. AMC와 NC 총 21례중흡연자에서 70%(7/10) 비흡연자에서 9.1%(1/11) MA 가관찰되었다 (p<0.05). 폐암군과 AMC 총 18례중 AMC에서 88.9%(8/9), 폐암군에서 66.7%(6/9) 를보여양군간에서로차이없이모두높은빈도로관찰되었다 (p>0.05). 결과적으로혈장 DNA의 MA는 40세이하의정상인들에서는발견되지않으며폐암환자들에서높은빈도로발견되었다. 그러나고령의흡연자들인비폐암대조군에서도높은빈도로 MA가관찰되므로폐암조기진단의지표로써는적합하지않을것으로예상된다. 그러나본연구는소수의한정된대상을이용한결과로써다양한연령층과흡연력그리고조직형에따라세분화된더큰대상군을이용한연구가추구되어야할것이다. 참고문헌 1. Chen XQ, Stroun M, Magnenat JL, Nicod LP, Kurt AM, Lyautey J, et al. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nature Med 1996;2: Shaw JA, Smith BM, Walsh T, Johnson S, Primrose L, Slade MJ, et al. Microsatellite alterations plasma DNA of primary breast cancer patients. Clin Cancer Res 2000;6: Moriyama H, Matsubara N, Kanbara T, Mori M, Matsuoka J, Yoshino T, et al. Allelic imbalance and microsatellite instability in plasma DNA released from polyclonal pancreatic adenocarcinoma. Int J Oncol 2002;21: Goessl C, Heicappell R, Munker R, Anker P, Stroun M, Krause H, et al. Microsatellite analysis of plasma DNA from patients with clear cell renal carcinoma. Cancer Res 1998;58: Sozzi G, Conte D, Mariani L, Lo Vullo S, Roz L, Lombardo C, et al. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients. Cancer Res 2001;61: Sozzi G, Musso K, Ratcliffe C, Goldstraw P, Pierotti MA, Pastorino U. Detection of microsatellite alterations in plasma DNA of non-small cell lung cancer patients: 357

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