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1 , pp 다양한 HPLC Column 에서의 IgY(Immunoglobulin Yolk) 분리특성 송성문 김인호 충남대학교화학공학과 대전시유성구궁동 220 (2012 년 1 월 25 일접수, 2012 년 3 월 22 일채택 ) Separation Characteristics of IgY (Immunoglobulin Yolk) in Various HPLC Columns Sung Moon Song and In Ho Kim Department of Chemical Engineering, Chungnam National University, 220 Gung-dong, Yuseong-gu, Daejeon , Korea (Received 25 January 2012; accepted 22 March 2012) 요 약 동물혈청중의 IgG (Immunoglobulin G) 에해당되는난황에포함된면역단백질 IgY (Immunoglobulin Yolk) 는식품단백질로장내면역물질로중요하다. IgY 를정제하기위해신선란의노른자에카리지난이나아라빅검을전처리물질로사용하였다. 전처리후 FPLC (Fast Protein Liquid chromatography) 의 DEAE (Diethylaminoethyl) Sepharose 칼럼에서이온교환법에의해불순물을제거하여 IgY 를얻고, GF HPLC (Gel Filtration High Performance Liquid Chromatography) 로 IgY 의분자량을측정하고표준 IgY 와비교하여 IgY 단백질을동정하였다. GF HPLC 에서 IgY 의다양성을발견하였고 IgY 단백질군의다양성을 IE HPLC (Ion Exchange High Performance Liquid Chromatography) 에서 AX, CX, SCX 칼럼을사용하여 ph, NaCl 농도를바꾸어조사하였다. AX 를사용하여 0.5 M NaCl, ph=8 조건에서 3 개의 IgY 피크를분리하였고, SCX 를이용했을때 0.5M NaCl, ph=5 조건에서도 3 개의 IgY 피크를분리할수있었다. Abstract IgY (Immunoglobulin Yolk) in egg yolk corresponds to IgG (Immunoglobulin G) in animal serum and plays an important role as immunological proteins in intestines. Carrageenan and Arabic gum were used as pretreatment agents to purify IgY from fresh egg yolk. DEAE (Diethylaminoethyl) Sepharose column in FPLC (Fast Protein Liquid chromatography) was an ion exchange tool to remove contaminants as well as to elute IgY from the column. GF HPLC (Gel Filtration High Performance Liquid Chromatography) enables to measure the molecular weights of IgY and to identify the purified IgY by comparing the molecular weight of standard IgY with the purified one. IgY is a heterogeneous group of different molecular weight and ionic properties, which was investigated with various IE HPLC (Ion Exchange High Performance Liquid Chromatography) columns such as AX, CX and SCX. Three peaks of IgY were separated in the AX column under the conditions of 0.5 M NaCl and ph=8. The SCX column also gave the three peaks of IgY at 0.5 M NaCl and ph=5. Key words: FPLC Chromatography, HPLC Chromatography, IgY (Immunoglobulin Y) 1. 서론 난황중의항체는포유류의 IgG 계통의항체에해당되고물리화학적인성질이약간다르며, 난황유래의항체이므로비교면역학분야에서는 IgY (Immunoglobulin Y) 라부른다 [1]. IgY 단백질의분자량은 180,000 Da이고, 등전점 (pi) 범위는 6.5~7.5이다 [2]. 계란의난황은 α-livetin, β-livetin, γ-livetin 이라는수용성단백질과인지질성분 (LDL, HDL) 으로구성되어있는데, 이중 γ-livetin은분자량 64 KDa 인 heavy chain과분자량 28 KDa의 light chain으로이루어져있고 To whom correspondence should be addressed. ihkim@cnu.ac.kr 이논문은 KAIST 홍원희교수님의정년을기념하여투고되었습니다. [3], IgG보다등전점이산성에가까우며닭의혈액에서분리한 IgG 와같은전기영동경향을보인다 [4]. 난황중의 IgY 함량은 ml 당 9~25 mg으로동량의혈청중의 IgG 함량과유사하며 [5], 난 1개당 15 ml의난황이분리되고, 닭마리당 IgY의년간생산량은 40 g 정도된다 [6]. 일반적으로토끼의혈액 1ml에서얻을수있는항체의양이 8~12 mg인데반하여달걀 1개에서얻을수있는항체의양은 60~200 mg이며이중에서특이항체는 10~20% 정도존재한다고알려져있다. 이에따라고면역성의항원들에대해한마리의닭은 1 년기간동안 120 마리의토끼에상응하는생산을한다 [7]. 항혈청생산에이용되는동물중에닭은소량의항원으로도양질의항체생산이가능하며어미닭에서생성된항체는난황에도전달이 659

2 660 송성문 김인호 된다 [8]. 산란계마리당난황으로부터생산되는항체 (Specific IgY) 의생산량은초유나혈청의경우보다상대적으로많고, 포유류의혈청에서얻은항체에비해생산비가저렴하게많은항체를생산할수있으며, 사육관리와계란생산이용이하기때문에난황을이용한항체생산은기술적및양적측면에서많은이점을갖고있다 [9]. 또한난황항체 IgY는포유동물과의계통학적차이로인해포유류의 IgG 와교차반응을하지않아 [10], 생화학적또는임상시약으로개발활용하는데좋은이점을갖추고있으며, 포유동물을면역시켜서피를채혈하거나도살하지않아도되므로사용된많은동물들을상당히줄일수있는등많은장점이있다 [11]. 이처럼난황은항체생산재원으로써편이성과경제성측면에서좋은점이인정되고있고, 특이항체의생성가능성과생산량및효율적인분리정제방법의개발에초점을두고연구개발을진행해왔으며, 특정항원에대해서는상당한연구성과를거두고있다 [12]. 효율적인분리방법으로는이온교환크로마토그래피와젤여과크로마토그래피, 고압액체크로마토그래피등의방법이이용되고있다 [13]. 본연구에서는 FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) 에서 IgY 시료를분취하여 HPLC (High Performance Liquid Chromatography) 로 IgY를분석하였다. FPLC에서 DEAE Sepharose gel 칼럼을사용하여 IgY 단백질을분리하였으며, 분리한분획물들을모아젤여과 HPLC (Gel filtration, GF) 로난황내 IgY의분자량을측정하였고, 이온교환 (Ion Exchange, IE) HPLC로음이온교환칼럼 (AX), 양이온교환칼럼 (CX), 양이온교환칼럼 (SCX) 으로분석하여난황내 IgY의이온분리특성을연구하였다. IgY는면역단백질로분자량이다양한단백질의집합이고이온가가복합적이므로 GF HPLC와 IE HPLC로분석하여단백질특징을조사할필요가있다. IgG에대한보고는 Pharmacia 회사의핸드북에잘설명되어있으나 [14], IgY 단백질특성에대한연구보고는적으며 IE HPLC로 IgY의이온특성을 IgG와비교하고자한다. 2. 실험재료와방법 2-1. 시료전처리 FPLC 주입시료로난황분말과신선란난황을전처리하여사용하였다. 난황분말 (Edentown F&B, Korea) 은증류수 1L에난황분말을각각 10 g, 15 g을넣어용해시켰다. 신선란난황으로시판계란으로부터난황을분리하였고, 증류수로 2.5배희석하여점도를감소시켰다. 시료의 ph를 5.0~5.3으로맞추기위해 1N HCl을첨가하였다. 난황속지질단백질을침전시키기위하여희석된난황부피 2배로첨가물 0.01% carrageenan (Sigma, USA) 을넣고혼합하여 24시간동안냉장보관하였다. 24시간자연침전후, 상등액만분리해서 rpm으로 3분간원심분리하여 FPLC 주입시료를만들었다. HPLC 만으로난황 IgY를분리할때의전처리방법으로 FPLC 전처리방법을사용하였고침전첨가물만 Arabic gum powder (Duksan, Korea) 로변경하였다 재료및시약이동상용매조제용으로무수제일인산나트륨 (98%, Samchun, Korea), 무수제이인산나트륨 (99%, Samchun, Korea), 구연산 (99.5%, Duksan, Korea), 구연산나트륨 (99%, Duksan, Korea) 을사용하여 20 mm 인산완충용액 (ph=7, 8) 과 20 mm 구연산완충용액 (ph=4, 5) 을제조하였다. 용출용액제조용으로염화나트륨 (99%, Duksan, Korea) 을사용하였다. 분자량측정용시약으로표준품 IgY, thyroglobulin, alcohol dehydrogenase, albumin, carbonic anhydrase를사용하였다 기기및장치 FPLC 실험장치로시료주입펌프 (P-50, Phamarcia, USA) 와용리, 완충용액을흘리기위한펌프 (P-500, Phamarcia, USA) 를사용하였고, 이펌프를 liquid chromatography controller (LCC-500, Phamarcia, USA) 로유량을조절하였다. 검출기는 UV 검출기 (Optical unit UV-1, Phamarcia, USA) 를사용하였으며, 용출단계에서 fraction collector (Model 2110 Fraction Collector, Bio-red, USA) 를이용해용액을모았다. 실험에사용한 ion exchange chromatography (IEC) 칼럼으로유리칼럼 (1.6 cm 5 cm, Spectrum, USA) 을사용하였고음이온교환수지로는 DEAE Sepharose CL-6B (Sigma, USA) 겔을사용하였다. HPLC 실험장치로는용매이송펌프 (222C HPLC pump, SSI) 와 UV 검출기 (Spectroflow 757, Kratos analytical, Germany) 를사용하였고, HPLC 칼럼으로 AX 칼럼 (2.1 mm 33 mm, Inertsil, GL Science, Japan), CX 칼럼 (2.1 mm 33 mm, Inertsil, GL Science, Japan), SCX 칼럼 (4.6 mm 250 mm, HP Genenchem), gel filtration 칼럼 (7.8 mm 300 mm, Bio-rad, USA) 을사용하였다. Auto data module (Younglin, Korea) 을통해서신호변환을거친뒤, 데이터수집프로그램인 Autochro-2000 (Younglin, Korea) 을이용해크로마토그램을얻었다 실험방법 FPLC에서의 ion exchange chromatography (IEC) 실험조건은 Table 1과같다. IEC 단계는평형, 샘플주입, 세척, 용리이며용리단계에서 IgY를얻는다. DEAE Sepharose 칼럼의이동상은 20 mm 인산나트륨완충용액으로 ph는 7이었고, 1.0 M NaCl을첨가하여용출용액으로사용하였다. 평형과세척유량은 5 ml/min로하였고, 시료주입과용출유량은 2 ml/min으로하였으며, 자외선검출기의파장은 280 nm로조정하였다. HPLC에서의 AX 칼럼의이동상은 20 mm 인산나트륨완충용액으로 ph는 7, 8이었고, 여기에 0.5, 1.0 M NaCl을첨가하여용출용액으로사용하였다. CX 칼럼의이동상은 20 mm 구연산 - 구연산나트륨완충용액으로 ph는 4, 5이었고, 용출용액으로 0.5, 1.0 M NaCl을사용하였다. 이용액이완전히섞이게하기위해초음파기 (Brason, USA) 로 15분간혼합시켜준후, 용액속의용존기체등을 제거하기위해다시한번초음파기로 10분동안탈기과정을거쳤다. 펌프의유량은컬럼길이에따라길이가짧은 AX, CX 칼럼은 0.2 Table 1. Experimental conditions of ion exchange chromatography Resin bed volume 10 ml Flow rate and time equilibration 5 ml/min for 10 min (50ml) sample loading 2 ml/min for 20min (40ml) washing 5 ml/min for 15min (75ml) elution 2 ml/min for 30min (60ml) Equilibration and 20 mm sodium phosphate buffer (ph 7) washing buffer Elution buffer 20 mm sodium phosphate buffer (ph 7) with 1.0 M Sodium chloride

3 다양한 HPLC Column 에서의 IgY(Immunoglobulin Yolk) 분리특성 661 ml/min, 길이가긴 SCX 칼럼은 1 ml/min으로하였으며, Sample loop 로 20 µl를사용하였다. Gel filtration 칼럼 (7.8 mm 300 mm, Biorad, USA) 의이동상은 20 mm 인산나트륨완충용액으로 ph는 7 이었고, 유량은 1 ml/min로하였으며주입량은 5µl로하였다. Table 2. Comparison of IgY contents in egg yolk Yolk sample Concentration Egg yolk powder (=10 g) 3.3 g/l Fresh egg yolk 36 g/l 3. 결과및고찰 Fig. 1의 FPLC 크로마토그램은평형, 시료주입, 세척, 용리단계를거쳐음이온교환수지에결합하는단백질을분리한결과이다. 먼저완충용액 20 mm 인산나트륨완충용액 (ph 7) 으로평형화시킨후, 시료를주입하였다. 주입된시료는용출용매인 1 M NaCl에의해이온교환겔에서떨어져 IgY 단백질의분리가이루어졌고음전하를띄는단백질피크가나왔다. Fig. 1(A) 크로마토그램은난황분말이 10 g 일때이고, Fig. 1(B) 크로마토그램은난황분말이 15 g일때를나타낸다. 각각의용리시간은 50.1, 50.4 분으로같은시간대에 IgY 피크가나왔으며, Fig. 1(A), (B) 를비교해봤을때난황분말이 10 g일때의 IgY 분획의흡광도값은약 80 mv이고, 난황분말이 15 g일때 IgY 분획의흡광도값은약 70 mv였다. 난황분말의양에따라난황분말이 15 g일때가난황분말이 10 g일때보다 IgY 분획의흡광도값이 1.5배정도증가되어야하나오히려흡광도값이감소하였다. 이는난황분말에포함된 IgY가이온교환겔에서의흡착력이작아흡광도가작은것으로생각된다. 난황에포함된 IgY가더많은신선난황으로실험하였으며, 난황분말과신선난황의농도는 Table 2에비교하였다. Fig. 2(A) 에서도 Fig. 1과같이 IgY 단백질의분리가이루어졌고음전하를띄는단백질의피크가나왔으며, IgY 분획의흡광도가약 400 mv로높게나온것을알수있었다. 이분획들의채취는 1 분마다이루어졌으며, IgY의분자량을측정하기위해단백질피크가나타난 50, 51, 52 분일때의샘플들을모아 GF HPLC를이용하여실 험한결과 Fig. 2(B) 에서보는바와같이 51 분일때의피크가가장높게나왔으며, 51 분분획의크로마토그램에서 8 분대의피크와어깨피크그리고 10 분대의피크로 3개의피크가있음을확인하였고, 3개의피크중앞에나오는 2개의피크를 IgY 분획으로가정하여 IgY 의분자량을측정하였다. Gel filtration 칼럼에분자량을알고있는단백질표준샘플과표준 IgY를주입하였다. 표준 IgY는구입한것과 FPLC에서분리한것을둘다사용하였다. 표준샘플로는 0.01 g/ml의 thyroglobulin, alcohol dehydrogenase, albumin, carbonic anhydrase이고이들각각의분자량은 669, 150, 69, 29 kda이다. 실험결과단백질샘플과표준 IgY의체류시간은 Fig. 3(A) 에서보는바와같이 thyroglobulin 6.14 분, alcohol dehydrogenase 7.57 분, albumin 7.71 분, carbonic anhydrase 9.85 분, 표준 IgY 6.94 분의체류시간을갖는것으로나타났다. 분자의크기에따라겔의기공속에들어갈수없는큰분자는그대로통과하고그보다작은분자는크기에따라서겔의내부에들어감에따라용출이늦게되는 GFC 원리에의해분자량이큰 thyroglobulin의체류시간이가장빨랐고그다음은표준 IgY, alcohol dehydrogenase, albumin, carbonic anhydrase 순이었다. Fig. 3(B) 에 GFC 실험결과에따른단백질샘플들과표준 IgY의체류시간과 log (M.W) (Molecular Weight) 에따른회귀곡선을나타내었다. 단백질샘플과표준 IgY의 log (M.W) 는 thyroglobulin 2.83, alcohol dehydrogenase 2.18, albumin 1.84, carbonic anhydrase 1.46, IgY 2.5이며 IgY의분자량은약 300 kda으로추정되었다. IgY의분자량은 24 kda, 74 kda, 109 kda로 3가지이었고, 모두합쳐 207 kda Fig. 1. Ion exchange chromatograms of DEAE Sepharose CL-6B FPLC column using egg yolk powder; (A) egg yolk power=10 g, (B) egg yolk powder=15 g, IEC steps : (a) equilibrium (b) loading (c) washing (d) elution.

4 662 송성문 김인호 Fig. 2. (A) Ion exchange chromatograms of fresh egg yolk using DEAE Sepharose CL-6B FPLC column; IEC steps: (a) equilibrium (b) loading (c) washing (d) elution. (B) gel filtration chromatography of collected fractions from FPLC column. Fig. 3. Gel filtration chromatograms of standard IgY and protein samples, and regression equation for determining IgY MW. 으로보고되었으며 [15], 본연구에서실험한 IgY의분자량이더크게나왔다. 이는 IgY 단백질이좀더모여응집된것으로생각된다. GF HPLC 실험결과 Fig. 4(B) 에서 2개의 IgY 피크와 1개의불순물이존재한다는걸알았고, 좀더분리도를증가시키기위해 IE HPLC 에서실험하였다. Fig. 4(A) 는 AX 칼럼을이용하여이동상이 ph 7일때의 NaCl 농도변화에따른결과이며, Fig. 4(B) 는 ph 8일때의 NaCl 농도에따 른결과이다. Fig. 4(A) 에서 0.5 M NaCl일때에불순물단백질의체류시간이 2 분대인것에비해 1 M NaCl에서는불순물단백질이 IgY 피크뒷부분에겹쳐서나온것으로생각되어진다. Fig. 4(B) 에서도같은결과이며, ph 8일때에불순물단백질의피크가 IgY 피크보다더높다. ph가클수록등전점이작은불순물단백질이 IgY 보다 IE gel에더많이흡착되었다고보여진다. 난황수용성단백질은 3개의 subgroup (α-livetin, β-livetin, γ-livetin ) 으로분리되는데 [16], 0.5 M

5 다양한 HPLC Column 에서의 IgY(Immunoglobulin Yolk) 분리특성 663 Fig. 4. Comparison of chromatograms according to NaCl concentration by using AX column; flow rate=0.2 ml/min, (A) ph=7, (B) ph=8. Fig. 5. Comparison of chromatograms according to NaCl concentration by using CX column; flow rate=0.2 ml/min, (A) ph=4, (B) ph=5. NaCl의크로마토그램에서피크가 3개로분리된것을볼수있고, 1 M NaCl일때보다 0.5 M NaCl일때피크분리와분리도증가에유리함을알수있었다. 불순물제거에유리하다고보고된연구에따라 [14], CX 칼럼을사용하여크로마토그램의마지막에나온불순물피크의크기를줄이도록실험했다. Fig. 5에서불순물제거에효과적임을확인하였으나분리도가높게분리되지는않았다. IgY의등전점 (pi) 값에가까운 ph 5에서 NaCl 농도변화에따른크로마토그램의흡광도차이가작으나, ph 4에서는 IgY 흡착력이 NaCl 농도변화에따라변하여흡광도의차이가크게나타났다. NaCl 농도가클수록 IgY가칼럼의고정상에잘흡착되는데, 이는 IgY가높은이온농도에서즉소수성이강한상태에서고정상에잘흡착되는것으로사료되며, IgG의분리 에서소수성크로마토그래피를이용하여혈청내의친수성불순물단백질을제거한보고가있다 [14]. 다른양이온 IE HPLC에서 IgY를분리실험하기위해길이가긴 SCX 칼럼을사용하였다. 칼럼의길이가길면분리도가증가하고체류시간이길어지기때문에유량을 1 ml/min으로증가시켰다. Fig. 6 의 SCX 크로마토그램은 AX 칼럼의크로마토그램과같이 IgY 피크가 3개로분리되었고, 길이가긴 SCX 칼럼의크로마토그램의분리도가 CX 보다좋음을알수있었으며, ph 5의크로마토그램이 ph 4의크로마토그램보다피크가명확히나타났다. CX 칼럼의크로마토그램에서나타난 NaCl의소수성효과가 SCX 칼럼 ph 5에서는나타나지않았고, ph 4에서 NaCl 농도가증가하면 IgY 흡착력이낮게나타났다. 이는 CX HPLC 칼럼의관능기는약한양이온교환기

6 664 송성문 김인호 Fig. 6. Comparison of chromatograms according to NaCl concentration by using SCX column; flow rate=1 ml/min, (A) ph=4, (B) ph=5. propyl benzenesulfone 기를갖고있고 SCX HPLC 칼럼은강한양이온교환기를가지고있으므로소수기의영향이이온기의영향보다작아져서 SCX 칼럼에서 NaCl의농도가높아질때 IgY의고정상흡착력이낮아진것으로보인다. 또한 Fig. 6(B) 와는달리 Fig. 6(A) 에서피크끼리서로붙어서나오는것을볼수가있는데, 이는 IgY의등전점인 7근처에서멀어질수록전하량이더커지므로 ph 4일때가 5일때보다전하량이더커서강하게흡착되어있다가탈착이되기때문에 IgY 분자들의분리도가떨어진것으로생각된다. 4. 결론난황에존재하는 IgY의분자량과이온특성을알아보기위하여 FPLC에서시료를분취하여 IEC, GFC로분자량을조사하였다. GF HPLC로 0.01 g/ml 표준샘플인 thyroglobulin, alcohol dehydrogenase, albumin, carbonic anhydrase의체류시간과분자량을표준 IgY와비교하였다. 실험결과 IgY의분자량은 300 kda이었다. HPLC 칼럼인 AX 칼럼, CX 칼럼그리고컬럼길이가긴 SCX 칼럼으로이동상의 ph와 NaCl의농도에따른이온특성을연구하였다. AX 칼럼에서 ph 7일때보다 ph 8일때에불순물단백질이 gel에더많이흡착되며, 0.5 M NaCl일때피크의분리도가우수하였다. CX 칼럼은불순물제거에효과적이었으나분리도가떨어졌다. AX 칼럼보다 SCX 칼럼에서피크의분리도가더좋았으며 ph 4일때보다 ph 5의크로마토그램이명확히나타났으며, CX 칼럼에서 NaCl의영향이 ph 5에서는작게나타났다. 감사이연구는연구재단기초연구과제에의해지원되었으며이에감사드립니다. 참고문헌 1. Lee, K., Ametani, A., Shimizu, M., Hatta, H., Yamamoto, T. and Kaminogawa, S., Production and Characterization of Anti- Human Insulin Antibodies in the Hen s Egg, Agric. Biol. Chem., 55, (1991). 2. Lim, S., Manusu, H. P., Gooley, A. A., Williams, K. L. and Rylatt, D. B., Purification of Monoclonal Antibodies from Ascitic Fluid using Preparative Electrophoresis, J. Chromatogr., 827, (1998). 3. Shim, W. B., Kim, H. J., Park, S. J., Kang, D. H., Kang, J. S. and Chung, D. H., Production and Specificity of Immunoglobulin Yolk (IgY) on Vibrio Parahaemolyticus, J. Food Hyg. Safety., 18(2), 61-66(2003). 4. Shimizu, M., Robert, C., Fitzsimmons and Nakai, S., Anti-E. Coli Immunoglobulin Y Isolated from Egg Yolk of Immunized Chickens as a Potential Food Ingredient, J. Food Sci., 53, (1988). 5. Wang, K., Hoppe, C. A., Datta, P. K., Fogelstrom, A. and Lee, Y. C., Identificaion of the Major Mannose-Binding Proteins from Chicken Egg Yolk and Chicken Serum as Immunoglobulins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, (1986). 6. Hatta, H., Kim, M. and Yamamoto, T., A Novel Isolation Method for Hen Egg Yolk Antibody, IgY, Agric. Biol. Chem., 54(10), (1990). 7. Hatta, H., Tsuda, K., Akachi, S., Kim, M. and Yamamoto, T., Productivity and Some Properties of Egg Yolk Antibody (IgY) Against Human Rotavirus Compared with Rabbit IgG, Biosci. Biotech. Biochem., 57(3), (1993). 8. Patterson, R., Youngner, J. S., Weigle, W. O. and Dixon, F. J., Anti body Production and Transfer to Egg Yolk in Chickens, J. Immunol., 89(1), (1962). 9. Kim, J. W., Production of Egg Yolk Antibodies against Flagella

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Microsoft PowerPoint - Chapter 3-2

Microsoft PowerPoint - Chapter 3-2 Chapter 3 단백질의탐구및단백체학 (3) 겔거르기 (Gel filtration) chromatography: 크기에의한분리 - Resin: 다공성구슬 = Sephadex, Sepharose, Biogel = Bead size: 100 mm - 원리 : 분배 (partition) chromatograph = 분배 : 용질이이동상 (mobile phase)