06-01안훈철

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민정 구
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1 대한응급의학회지제 18 권제 2 호 Volume 18, Number 2, April, 2007 원 저 흰쥐해마에서일과성전뇌허혈 - 재순환손상후세포고사에대한 α-lipoic Acid 의효과 원광대학교의과대학응급의학교실, 생리학교실 1 안훈철 송진호 1 김광석 1 유수진 Effects of α-lipoic Acid on Apoptotic Cell Death in Rat Hippocampus Following Transient Forebrain Ischemia-reperfusion Injury Hun Cheol Ahn, M.D., Jin Ho Song, M.D. 1, Kwang Seok Kim, M.D. 1, Su Jin Yoo, M.D. Conclusion: The results of this study suggest that LA has the potential to prevent neuronal cell death in the hippocampus by inhibiting intracellular signaling pathways responsible for apoptosis following transient I/R injury. Key Words: Forebrain ischemia-reperfusion injury, Apoptosis, α-lipoic acid, Hippocampus Purpose: The purpose of this study was to evaluate effect of α-lipoic acid on apoptotic cell death in rat hippocampal neuron following transient forebrain ischemia-reperfusion (I/R) injury. Methods: The four-vessel occlusion method was used to induce transient I/R injury in the forebrain of Sprague- Dawley rats. In the treatment group, α-lipoic acid (LA) was administered subcutaneously at 50 mg/kg/day for 7 days before induction of I/R injury. Results: Pretreatment with LA significantly reduced the number of TUNEL-positive neurons in the pyramidal cells layer of the hipocampal CA1 region 5 days after the ischemia, suggesting a marked reduction of apoptotic cell death. Pretreatment with LA also resulted in marked suppression at the transcript level of mrna for caspase-3 at 24 hours, and decreased concentration of the active form of caspase-3 protein in the hippocampus at 1, 3, and 5 days after I/R injury. Furthermore, as indicated by western blot analysis, the concentration of apoptosis-inducing factor (AIF) in the hippocampus was reduced at 1 and 3 days after a transient I/R injury by pretreatment with LA. 책임저자 : 유수진전라북도익산시신용동 원광대학교의과대학응급의학교실 Tel: 063) , Fax: 063) ysoojin@wmc.wonkwang.ac.kr 접수일 : 2006년 9월 11일, 1차교정일 : 2006년 10월 2일게재승인일 : 2007년 1월 31일 * 본연구는 2005 년도원광대학교교비지원에의해수행됨. 134 Department of Emergency Medicine, Department of Physiology, Wonkwang University School of Medicine 1 서 우리나라사망원인중뇌혈관질환은암, 심혈관계질환다음으로많은것으로밝혀져있다. 심장마비에의해심폐소생술을실시하다가희생된환자가일년에약 7만여명이며이중최소 60% 환자가심한뇌손상때문에결국병원에서사망하게되고단지 3% 의심폐소생환자만이건강한생활을갖는다고한다 1,2). 뇌허혈손상의병태생리를연구하기위하여흰쥐에서양측경추동맥을영구적으로폐쇄시킨후양측경동맥을 10~20분간일시적으로폐쇄시켜뇌에혈액공급을완전히차단후다시재순환시키는전뇌허혈-재순환손상을야기하는 4-vessels occlusion 법이많이이용되고있다 3). 전뇌허혈-재순환손상은해마, 기저핵, 신피질등의특정부위에서손상수일후신경세포가소실되는지연성신경세포죽음 (delayed neuronal death) 또는세포고사 (apoptosis) 현상이관찰되는것으로알려져있다 2,4). 세포고사는세포내에본래부터존재하던자살기작이여러가지세포내부, 외부의자극에의하여활성화되어세포내단백질분해효소인 caspase 효소계의활성화를통하여세포가계획된대로죽는현상으로이때 DNA 의분절현상이해부학적특징이며 TUNEL 염색기법을통하여관찰할수있다 4,5). 뇌에서허혈-재순환손상에의하여여러가지화학적반응에의하여반응성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 이발생하며뇌손상을유도한다. ROS 는세포막의지방을산화시키고, 단백질을변성시켜, DNA을분절시킴으 론

2 안훈철외 : 흰쥐해마에서일과성전뇌허혈 - 재순환손상후세포고사에대한 α-lipoic Acid 의효과 / 135 로서세포고사를유도하는중요한인자중의하나로인식되고있다 1,6). 그리고뇌조직은특히높은지방량, 높은산소소모율, 다양한신경전달물질의생성을위한복합적인화학적반응때문에다른조직보다는 ROS 의합성이쉽게되는장기이다 6). α-lipoic acid (LA) 는 Reed 등 7) 에의해분리되었으며 thioctic acid, 1,2-dithiolane-3 pentanoic acid, 1,2- dithiolane-3 valeric acid, 6,8-thioctic acid 등다양한이름으로알려져있다. LA는강력한항산화작용을가지고있어여러가지 ROS 로부터세포를보호하며지질, 단백질및 DNA 의손상을억제한다. 또한세포내 ph 정상화, 미토콘드리아 ATP 합성증가, 및가수부해감소등의작용을가지고있다 8). LA는임상적으로당뇨병, 다발성신경병증등과같은질환의치료및예방적목적으로사용되고있다 9). LA 는심장, 근육, 신장, 망막및말초신경등의여러장기에서허혈-재순환손상을억제하는것으로알려져있다 10,11). 또한실험적연구에서허혈-재순환손상및영구적허혈손상시신경세포및신경교세포의손상을억제하는하는것으로알려져있다 12-14). 그러나LA에의한뇌의허혈- 재순환손상후신경세포의손상억제하는분자생물학적기전에대한연구들이많이이루어지지않았으며특히신경세포세포사멸에관여하는세포고사기전에대한 LA 의효과에대한연구는미미한실정이다. 따라서본연구는흰쥐해마에서대상으로일과성전뇌허혈-재순환손상후세포고사에관여하는 caspase-3 단백및 mrna 유전자의발현과 apoptosis-inducing factor (AIF) 단백발현에대한 α-lipoic acid의전처치효과를관찰하고자하였다. 대상과방법 1. 실험동물및약제실험동물은체중 200~300 g의성숙한 Sprague- Dawley계수컷흰쥐를사용하였으며, 실험동물은허혈-재순환손상군 (n=36) 과모든수술적조치들은다하였으나허혈-재순환손상을가하지않은 Sham 수술군 (n=12) 으로나누었다. 이때 sham 수술군은 TUNEL 검사에 6마리를 sham 수술 5일후에동물을희생하였다. 그리고 Western 검사, RT-PCR 검사에각각 3마리씩사용되었으며 sham 수술 24 시간후동물을희생하였다. 허혈-재순환손상군은다시생리식염수를투여한실험군 (n=18) 과 α-lipoic acid (LA) (n=18) 를투여한실험군으로구분하였다. 각실험군은 TUNEL 검사에 6마리, Western 검사에 9마리 ( 각관찰시간대별 3마리 ), RT-PCR 검사에 3마리씩각각사용되었다. LA (thioctic acid, Sigma, USA) 는허혈-재순환손상유발 7일전부터 50 mg/kg 용량으로피하로 1일 1회주사하였다. 또한허혈-재순환손상당일손상 2시간전에피하로 50 mg/kg로주사하였다. 한편생리식염수투여군은같은양의생리염수만을주입하였다. 2. 일과성전뇌허혈 - 재순환손상 일과성허혈-재순환손상은 Pulsinelli와 Buchan (1988) 이제시한양측추골동맥과경동맥의 4개혈관폐쇄법에의하여유발시켰다. 실험동물은 10% Chloral hydrate (100 mg/kg) 를복강내주사하여마취시킨후추골동맥폐쇄는복와위위치에서후경부의정중앙피부를절개하여제 1 경추의 alar foraminae를노출시킨다음제 1 경추와제 2 경추사이로지나가는양측추골동맥을전기인두로영구폐색시켰다. 추골동맥폐쇄을유발한지 24 시간후, 경동맥폐색을위하여흰쥐를앙와위자세로위치시킨후전경부의정중앙피부를절개하여양측경동맥을분리하였다. 분리된경동맥을 micro aneurysm clips (George Tiemann and Co, USA) 으로폐쇄하고봉합사로경부근육내에존재하는측지분지의흐름을차단하였다. 대뇌로흐르는혈류를 20 분간차단하는동안에는전기담요 (FST- 100 inc., Canada) 를이용하여체온을 36~37 C 로유지하였다. 경동맥혈관폐색동안동공산대와동공반사의소실을통하여전뇌허혈여부를확인하였다. 허혈유발 20 분후결찰을풀어줌으로써혈류를재개시켰으며, 회복시발작을보이는흰쥐는이연구에서제외하였다. 3. Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated biotin-dutp nick-end labeling (TUNEL) 염색 TUNEL 염색은 In situ Apoptosis Detection Kit (TaKaRa Shuzo Co., Ltd. Japan) 을사용하였다. 4% paraformaldehyde로고정한뇌절편 (40 μm) 을슬라이드글라스에부착시키고 1주일간실온에서건조시켰다. 뇌절편을세척액 (0.1 M PBS, ph 7.4) 으로세척하고실온에서 20분간 proteinase K (20 μg/ml) 처리후다시 PBS 으로세척후 peroxidase의활성을억제하기위하여실온에서 5 분간 3% H 2O 2 로내인성 peroxidase 활성을차단하였다. 세척후얼음위에서 2~5 분간세포막투과완충액 (permeabilisation buffer) 을처리한후 Fluorescein-dUTP (TdT+ Labeling safe buffer) 로 37 C 배양기에서 90 분간 labeling하였다. 세척후 Anti-FITC HRP conjugate를 37 C 배양기에서 30 분간항체반응후 DAB (5 mg/ml, in Tris buffer, ph 7.0) 로실온에서 10~15분간발색하여광학현미경으로관찰하였다. 배측해마의 CA1 피라미드세포들중가장지연성세포

3 136 / 대한응급의학회지 : 제 18 권제 2 호 2007 사가잘일어나는중앙부 (middle zone) 의 1,000 μm 길이에서신경세포수를관찰하였다. 광학현미경고배율 (200x) 에서 TUNEL 양성뉴론이보이는 CA1 피라미드세포층을디지털카메라 (Olympus, Japan) 를이용하여디지털영상으로전환한후컴퓨터에저장하였다. 화상자동분석시스템 (Image-Pro Plus, USA) 을이용하여 TUNEL 양성뉴론을계측하였으며이때실험동물당 3개의조직에서양측뇌해마를관찰하였으며이들을평균한수치를실험값으로하였다. 4. Western blot analysis 동안반응시킨후 0.05% Tween20-TBS (TBST) 로 3회세척하였다. 이후이차항체인 goat rabbit IgG conjugated AP (Santa Cruz, USA) 를 1:2,000 으로희석하여 1시간동안반응시켰다. TBST로 2회세척후 alkaline phosphates 용액 (0.1 M Tris, 0.1 M NaCl, 0.01 M MgCl 2) 에세척하고여기에 NBT 와 BCIP를넣어발색시켰다. 또한동일조건에서 AIF 와 caspase-3 의대조실험으로 β-actin의발현을관찰하였다. 5. 역전사반응 (RT-PCR, Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction) 실험동물에서 apoptosis-inducing factor (AIF) 와 caspase-3 단백발현변화를관찰하기위하여전뇌허혈- 재순환손상유발 1(n=3), 3(n=3), 5일 (n=3) 후실험동물을희생시켜수술현미경하에서해마를채취하였다. 각실험동물의해마로부터단백을추출하기위해조직분쇄기에해마조직과완충용액 (20 mm Tris-HCl ph 8.0, 1% NP-40, 150 mm EDTA, 10% glycerol, 0.1% betamercaptoethanol, 0.5 mm DTT) 을넣고분쇄하였다. 4 C 에서 15 분간 12,000 g로원심분리하여상층액의단백을채취하였다. 이후 Bradford 법을이용하여 spectrophotometer (Beckman Co., USA) 에서단백질농도를정량하였다. 단백의전기영동은 Laemmli방법 15) 으로 sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis (SDS- PAGE) 를시행하였다. 단백에 sample buffer (0.125 M Tris ph 6.8, 2% SDS, 25% glycerol, bromphenol blue, 2-mercaptoethanol) 를섞어 100 C 에서진탕후 sample buffer에녹인단백 (40 μg) 을 12% 와 15% 의 gradient gel에서전기영동하였다. 전기영동시 mini gel 전기영동장치 (SE 600 Hoefer Sci. Ins. USA) 를이용하였고 90 V의전압을가하여 2시간동안진행하였다. 전기영동후젤 (gel) 을 Coomassie brilliant blue R-250 으로 1시간동안염색시키고탈염색액 (10% acetic acid & 10% methanol) 으로탈색시켜젤상에서단백밴드를확인하였다. Gel에존재하는단백중에서 AIF 와 caspase-3 단백을확인할목적으로 Western blotting 법을시행하였다. 단백 transfer 장치 (Hoefer Semiphor, Phamacia Bio., USA) 를이용하여 120 ma에서 2시간동안 gel 의단백을 0.45 μm 의 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막 (Millipore Co., USA) 으로옮겼다. 이 PVDF 막을일차항체의비특이적결합을차단하기위하여 Tris buffer saline (TBS) (ph 7.6) 에 3% bovine serum albumin 을녹인 blocking buffer에넣어 1시간동안반응시켰다. 여기에일차항체인 AIF (Chemicon, USA) 와 caspase-3 (Cell Signaling Techmology, USA) 을 4 C 에서하룻밤 실험동물에서 caspase-3 mrna 발현을관찰하기위하여전뇌허혈-재순환손상 1일후해마를채취하였는데이는허혈손상흰쥐에서 caspase-3 mrna의발현이소상 6 시간째에증가하기시작하여손상 24 시간째에가장많이증가한다는선행연구자들 16-18) 의실험결과를기준으로허혈-재순환손상 1일후에실험동물을희생하여해마에서 RNA 을추출하였다. RNA 추출을위해조직분쇄기를이용하여조직을 RNA 용출액 (Tri reagent, MRC. USA) 에분쇄시키고원심분리기를이용하여 RNA 수용층을분리하였다. 분리된 RNA 수용층에 chloroform을첨가하여혼합시키고원심분리하여단백을제거하였다. 이후 RNA 수용층에 isopropanol을첨가하고원심분리시켜 RNA 만침전된것을획득한후건조하였다. 0.1% DEPC를처리하여 RNase를제거한물로 RNA를용해시켜 spectrophotometer (Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech, USA) 를이용해정량하였다. RT-PCR을수행하기위해전체 RNA (1 μg) 에 Oligonucleotide dt primer와 buffer, 10 mm DTT, 0.5 mm dntp Mix 그리고 200 unit의역전사효소 (LifeTech, USA) 를넣고 42 C 에서 1시간반응시킨후 70 C 에서 15분간불활성화시켰다. 역전사된 cdna에 0.2 μmol/l caspase-3 primer와 0.08 μmol/l GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) primer를넣고 dntp mix, Taq 중합효소 (Bioneer, KOR) 를넣고 94 C, 30 s; 64 C, 30 s; 72 C, 30 s; 30 cycles의반응조건으로중합반응을실시하였다. Primer는다음과같이제작하였다. caspase-3 primer anti-sense : 5 -TAA ATC AAA TCC GAT GTT CC-3 sense : 5 -ATT CAT AGT GGC ACC AAA TC-3

4 안훈철외 : 흰쥐해마에서일과성전뇌허혈 - 재순환손상후세포고사에대한 α-lipoic Acid 의효과 / 137 GAPDH primer anti-sense : 5 -TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3 sense : 5 -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 중합반응물을 1.5% 아가로스겔을이용하여 100 V 로 40 분동안전기영동을실시하였다. 아가로스겔을 long wave UV lamp (Cole-Parmer 97500, USA) 에놓고 PCR 산 물의밴드 (caspase-3: 216 bp, GAPDH: 450 bp) 를확인하고디지털카메라를이용하여디지털화상으로저장하였다. 6. Caspase-3 mrna 및단백의정량적분석 Western blotting 법에의하여관찰된 AIF와 caspase-3 단백의발현정도를분석하기위하여 scanner (HP 4P, USA) 를이용하여 PVDF 막에발색된 AIF와 caspase-3 단백양상을컴퓨터에저장하였다. 자동영상분석장치 (Image-Pro Plus, USA) 를이용하여면적과밀도를측정하여곱한값을비교환산하여최종 AIF 와 caspase-3 단백발현양으로정의하였다. 또한같은조건에서전기영동을실시한 β-actin의발현양을 AIF와 caspase-3 단백과같은방법으로발현양을분석하였다. β-actin 단백발현양을기준으로 AIF 와 caspase-3 단백발현양을표준화하고 sham 수술군의 AIF와 caspase-3 단백발현양을기준으로각실험군의 AIF 와 caspase-3 단백발현양을정량적으로표현하였다. 한편, RT-PCR의실험결과분석은자동영상분석장치 (Image-Pro 3.1, USA) 를이용하여 caspase-3 와 GAPDH의 PCR 산물의면적과밀도를측정하여곱한값을발현양으로환산하였다. GAPDH의발현값을기준으로 caspase-3 mrna 발현양을표준화하고 sham 수술군의 caspase-3 mrna 발현양을기준으로각실험군의 caspase-3 mrna의발현양을정량적으로환산하였다. 7. 통계분석 실험결과는평균 (means) ± 표준편차 (S.D.) 로나타내었으며실험군간의통계처리는 Kruskall-Wallis test를이용하였다. p값이 0.05 미만인경우에통계적유의성이있는것으로간주하였다. 결 1. 전뇌허혈 - 재순환손상후해마에서 TUNEL 양성세포의발현에대한 α-lipoic acid 의효과 과 허혈-재순환손상 5일후 TUNEL 염색기법을이용하여해마 CA1의피라미드세포층에서 DNA 분절현상을동반한신경세포고사를관찰하였다. 이때 TUNEL 양성세포는진한암갈색의핵을갖고있는것으로관찰되었다. Sham 수술군의 CA1 피라미드세포층에서 TUNEL 양성뉴론은 7±2.2 cells/mm로거의발현되지않았으나생리식염수를투여한허혈-재순환손상군에서는 67±6.4 cells/mm 로유의한증가를보였다 (p<0.01). 그러나 LA 투여실험군에서 TUNEL 양성세포수는 20±4.5 cells/mm로생리식염수만투여한실험군에비하여유의한감소가관찰되었다 (p<0.01)(fig. 1). 2. 전뇌허혈 - 재순환손상후해마에서 AIF 단백발현에대한 α-lipoic acid 의효과 허혈-재순환손상후해마에서세포고사를활성화시키는것으로알려진 AIF 단백발현을관찰하였다. AIF 단백발현양을관찰하기위하여허혈-재순환손상 1, 3, 5일후해마로부터단백을분리하여 Western blot를실시하였다. Western blot검사상 AIF 단백 (57 kda) 발현은 Sham 수술군 (1±0.12) 과비교하여생리식염수투여군에서허혈- 재순환손상 24시간후에 (1.7±0.21) 유의하게증가하였다 (p<0.05). 그러나허혈-재순환손상 3, 5일후에 Sham 수술군과비교하여유의한증가를보이지않았다. LA 투여실험군은손상 24시간후 (0.05±0.05) 와 3일후 (0.08±0.11) 에생리식염수투여군보다 AIF 단백발현이유의하게감소하였다 (p<0.01). 그러나이러한 AIF 단백발현감소는손상 5일후에는관찰되지않았다 (Fig. 2). 3. 전뇌허혈 - 재순환손상후해마에서 Caspase-3 단백발현에대한 α-lipoic acid 의효과 허혈-재순환손상후시간의경과에따른 caspase-3 단백발현양의변화를관찰하기위하여허혈-재순환손상 1, 3, 그리고 5일후해마에서단백을분리하여 Western blot를실시하였다. Westren 검사상분자량이 32 kda에서 caspase-3 전구단백 (precursor protein) 이그리고 17 kda에서활성형인 caspase-3 분절단백 (cleavage protein) 이관찰되었다. 이들단백중 caspase-3 전구단백의발현변화는허혈-재순환손상후유의한차이가없었으나활성형인 caspase-3 분절단백의발현변화가관찰되었다. Caspase-3 분절단백은 sham 수술군과비교하여생리식염수투여군에서허혈-재순환손상 1일후 5.2±0.6(p <0.01) 으로유의하게증가하였으며허혈-재순환손상 3, 5일째에각각 4.3±0.4(p<0.01), 4.9±0.5(p<0.01) 로유의한증가를보였다. 그러나, LA 투여군의해마에서허혈-재순환손상 1, 3, 5일째에 caspase-3 분절단백량이

5 138 / 대한응급의학회지 : 제 18 권제 2 호 2007 Fig. 1. The effect of α-lipoic acid (LA) on expression of TUNEL-positive apoptotic cells (arrow) in the pyramidal cells layer of hippocampal CA1 area 5 days after transient cerebral ischemia (Isch). Scale: solid bar, 400 μm. Bar histograph shows changes in the number of TUNEL- positive cells that was counted by image analysis software in the CA1. The number of rats in each group is 6. Values are mean±s.d. *Denotes significant difference between Isch and LA (*p<0.01). Denotes significant difference between Sham and Isch ( p<0.05; p<0.01). Fig. 2. The effect of α-lipoic acid (LA) on expression AIF (57 kda) proteins on a filter membrane from the whole cell lysate of the hippocampus 24 hours, 3, 5 days after transient forebrain ischemia-reperfusion injury. Bar histograph shows changes AIF protein in the hippocampus 24 hours, 3, 5 days after transient forebrain ischemia-reperfusion injury. Animals of Sham group were sacrificed 24 hours after surgical procedures. Values are mean±s.d of triplet (n=3). * Denotes significant difference between Ischemia (IS) and LA (*p<0.01). Denotes significant difference between Sham and IS ( p<0.05; p<0.01). AIF = Apoptosis-inducing factor

6 안훈철외 : 흰쥐해마에서일과성전뇌허혈 - 재순환손상후세포고사에대한 α-lipoic Acid 의효과 / 139 생리식염수투여군과비교하여유의하게감소하였다 (p <0.01)(Fig. 3). 4. 전뇌허혈 - 재순환손상후 caspase-3 mrna 발현에대한 α-lipoic acid 의효과 허혈-재순환손상해마에서세포고사에중요한역할을하는것으로알려진 caspase-3 효소에대한 mrna 발현양을관찰하였다. caspase-3 mrna 발현양을관찰하기위하여허혈-재순환손상 1일후해마및대뇌피질로부터 RNA 를분리하여 RT-PCR 기법을이용하여 caspase-3에대한 PCR 산물을정량하였다. Sham 수술군과비교하여생리식염수를투여한허혈-재순환손상군의해마에서 caspase-3 mrna 발현이각각 3.9±0.57 배로유의하게증가하였다 (p<0.01). 그러나 LA 투여군의해마에서는 Sham 수술군의발현양과비교하여 caspase-3 mrna의발현이각각 0.51±0.3배로생리식염수투여군의발현양과비교하여유의하게감소되었다 (p<0.01)(fig. 4). Fig. 4. The effect of α-lipoic acid (LA) on expression RT- PCR product for caspase-3 mrna in the hippocampus 24 hours after transient forebrain ischemia. Bar histograph shows changes RT-PCR product for caspase-3 mrna in the hippocampus 24 hours after transient forebrain ischemia-reperfusion injury. Values are mean±s.d of triplet (n=3). *Denotes significant difference between Ischemia (IS) and LA (*p<0.01). Denotes significant difference between Sham and Ischemia ( p<0.01). Fig. 3. The effect of α-lipoic acid (LA) on expression caspase-3 precursor protein (32 kda), inactive form, and its larger cleavage form (17 kda) proteins on a filter membrane from the whole cell lysate of the hippocampus 24 hours, 3, 5 days after transient forebrain ischemia-reperfusion injury. Bar histograph shows changes of active caspase-3 protein (17 kda) in the hippocampus 24 hours, 3, 5 days after transient forebrain ischemia-reperfusion injury. Animals of Sham group were sacrificed 24 hours after surgical procedures. Values are mean±s.d of triplet(n=3). *Denotes significant difference between Ischemia (IS) and LA (*p<0.01). Denotes significant difference between Sham and Ischemia ( p<0.05; p<0.01).

7 140 / 대한응급의학회지 : 제 18 권제 2 호 2007 고찰본연구에서뇌허혈-재순환손상의병태생리의연구를위해치사율이낮으면서재현가능한동물모델로흰쥐를대상으로 4-vessels occlusion (VO) 방법을이용하여전뇌에일과성허혈-재순환손상을가하였다. 생리식염수만을투여한실험군의해마 CA1 의피라미드세포층에서허혈- 재순환손상 5일후진한암갈색의핵을갖은 TUNEL 양성세포가유의하게증가됨으로써전형적인 DNA 분절현상을동반한전형적인세포고사 (apoptosis) 현상이관찰되었다. 본실험결과중해마에서허혈-재순환손상 1-5 일후 caspase-3 전구단백의발현변화는유의성이없었으나활성형인 caspase-3 분절단백 (17 kda) 의발현이유의하게증가되었다. Chen 등 17) 및 Rami 등 19) 은본연구과같은실험동물모델을이용하였으며, 해마에서 casapse-3 활성형분절단백이전뇌허혈손상 3일째에가장많이증가되었으며이러한증가는손상 7일이후에도유의하게증가하였다라는결과를얻었다. 이때손상 3일이내에는 CA1 영역에서단백발현이저명하였으며이후에는치상 (dentate gyrus) 에서도관찰됨으로써해마내신경회로망의흥분순서와관련되어있음을제시하였다 19,20). 따라서본실험에서는해마전체를균질화하여 Western 검사를시행했기때문에전뇌허혈손상후 5일까지증가된 caspase-3 분절단백의증가는세포고사가많이이루어지는 CA1 영역뿐만아니라치상에서의 caspase-3 분절단백의발현을포함하고있는것으로사료된다. 이와함께선행연구들 17,18) 에서전뇌허혈-재순환손상흰쥐의해마에서 caspase-3 mrna의발현이손상 6시간째부터유의하게증가하여 72 시간까지 mrna의발현이증가되었으며특히 CA1 영역에서유의한증가를보였으나그밖의해마영역에서는유의한증가를보이지않았다. 그러나 Iwasaki 등 16) 은허혈-재순환손상흰쥐의해마에서 RT-PCR 검사상 caspase-3 mrna의발현이손상 24 시간에유의한증가를보였으나 72 시간에증가되었지만유의한차이는없다고보고하였다. 본실험에서 RT-PCR 기법을이용하여허혈-재순환손상 1일후해마에서 caspase-3 mrna 발현이약 4배정도유의하게증가함을관찰하였다. 이러한증가는이전의연구자들의결과 16-18) 와일치하는것으로허혈손상에의해세포고사가쉽게발생하는 CA1 영역에서발현증가를의미할것으로사료된다. Prehn 등 12) 이 LA 의환원제인 dihydrolipoate가배양된신경세포에서 gluatmate 및 cyanide에의해유발되는신경세포사멸을억제하고영구적허혈손상생쥐및흰쥐에서신경세포의허혈손상을억제함을처음으로보고하였다. 이후허혈손상유발 1시간전에 LA 를정맥으로 1회투여 하였을때 LA 가뇌-혈관장벽을통과하여뇌에서축적되고전뇌허혈-재순환손상흰쥐에서치사율을 50% 이상감소되었고, 해마 CA1 의신경세포사멸이억제되고운동기능의회복이촉진되었다고보고되었다 13). 이와더불어영구적일측뇌허혈손상유발전에서 LA 를비타민 E와병행투여하였을때혈청지방의과산화 (peroxidation) 를감소시키고뇌손상을 50% 이상감소시켜운동기능의회복이촉진되었다. 또한허혈-재순환손상후성상세포와신경교세포의활성화 (reactive gliosis) 를억제함으로써이들세들에의한이차적신경세포손상을방어하였다 14). 한편본실험에서 LA 를전처치한경우전뇌혈손상 5일째 CA1 영역의피라미드세포층에서허혈-재순환손상후세포고사의지표인 TUNEL 양성뉴론의수가생리식염수투여군과비교하여유의하게감소되였는데이러한본실험결과는이전의연구자들이관찰한 LA 투여에의한전뇌허혈-재순환손상에해마신경세포의손상억제효과가세포고사현상의억제에기인함을제시하고있다. LA 투여군의해마에서허혈-재순환손상 1, 3, 5일째에 caspase-3 활성형인 caspase-3 분절단백발현양이생리식염수투여군과비교하여유의하게감소하였을뿐만아니라손상 24 시간째에 caspase-3 mrna의발현이유의하게억제되었다. 최근 Bojunga 등 21) 는 LA 투여가당뇨병흰쥐의심장에서 caspase 효소활성을억제하고세포고사유도단백인 Bak, Bax 단백을억제함을보고하였다. Cui 등 22) 은 LA 투여에의하여 D-gaalctose의독성에의한해마신경세포의세포고사를억제하여 TUNEL 양성세포와 caspase-3 단백발현을감소시키고신경세포의재생을촉진시키는것으로보고하였다. 한편 Cui 등 22) 은그들이관찰한세포고사와관련된분자생물학적현상에대한 LA 의억제효과와관련된기전을세가지관점에서추론하였다. 첫째로 LA 은 cystein, vitamin C, GSH 등의세포내항산화제를증가시켜 ROS 를제거하며, 둘째로 ROS 로부터미토콘드리아를보호하여미토콘드리아에의한세포고사기작의활성화를억제하며, 마지막으로항산화효소들의합성을유도하여항산화기능을유지함으로써지방, 단백질, 및 DNA 의손상을억제할수있음을제시하였다. AIF 단백은정상세포에서는미토콘드리아에존재하며세포사멸과정에서미토콘드리아에서방출되어원형질과핵으로이동하는것이특징이다. 핵에서 AIF 는 50 kbp 이상의큰단위로 DNA 를분절시키고핵응축 (nuclear condensation) 을유발하여세포사멸을초래한다. 이러한일련의 AIF 의활성화에의한세포고사과정은 caspase 효소와무관하게진행됨으로써 AIF 단백이 caspase 비의존성세포고사기전의중요한역할을하고있다. 또한 AIF 가 poly (AD-ribose)polymerase-1 (PARP-1) 의활성화를통하여세포사멸을유도하고반대로 PARP-1의활성화가 AIF 의미토콘드리아에서핵으로의이동에필요한선행조건이

8 안훈철외 : 흰쥐해마에서일과성전뇌허혈 - 재순환손상후세포고사에대한 α-lipoic Acid 의효과 / 141 며, 이때 PARP-1의활성화는 ROS 에의해이루어지는것으로알려져있다 23). 일과성전뇌허혈실험모델의해마조직에서 AIF 의발현에대한많은연구가이루어지지않은실정이며다만들쥐 24) 및흰쥐 25) 의해마에서일과성전뇌허혈-재순환손상후 24~27시간사이에 AIF 단백이신경세포의원형질과핵에서발현이증가되었으며 caspase-3 효소의활성과무관하게이루어졌다. 본실험에서허혈-재순환손상후해마조직을완충액에넣고분쇄한다음원심분리후상층액을분리하여 Western blot 를실시하였다. Western blot검사상 AIF 단백발현은 Sham 수술군과비교하여생리식염수투여군에서허혈-재순환손상 24 시간후에유의한증가를보였으나손상 3, 5일후에 Sham 수술군과비교하여유의한증가를보이지않았다. 선행연구자들의실험결과를고려해볼때본실험의 AIF 단백발현에대한 Western blot 검사결과는해마신경세포에서허혈-재순환손상후원형질과핵에서발현증가를반영할것으로추측된다. 그러나본실험에서는 caspase-3 활성형단백발현을관찰하기위한조직균질상층액단백을사용하여 AIF 단백발현을관찰하였기때문에본연구결과로써는신경세포내소기관별 AIF 의발현변화를정확히반영하지못하는실험방법상의한계성을보이고있다. 따라서본연구결과에대한보다정확한결과를확인하기위하여서해마조직에서세포소기관의분획을대상으로 AIF 의발현에대한추후연구가진행되어져야할것으로사료된다. 한편 LA 투여실험군에서전뇌허혈-재순환손상 1일과 3일후에생리식염수투여군보다 AIF 단백발현이유의하게감소하였으나손상 5일후에는유의한차이가관찰되지않았다. 뇌조직에서 AIF 발현에대한 LA의효과를관찰한실험들이현재까지거의이루어지지않았으며따라서본실험에서관찰한허혈-재순환손상후시간의경과에따른 LA 의효과에대한정확한이유는정확히알수없는실정이다. 다만본실험결과를고려할때 AIF 단백발현에대한 LA 의효과는허혈-재순환손상초기에보다효과적으로 AIF 단백발현을억제함을보여주고있다. Szabados 등 26) 이허혈-재순환손상심장근에서 lipoic acid의아미노유도체인 lipoamide가세포손상후 AIF 단백이미토콘드리아에서세포질및핵으로이동하는데관여하는 PARP 단백의활성화와관련된신호전달계를억제하여 PARP 단백의활성화를억제함을보고하였다. 더불어이들은이러한 lipoamide의 PARP 단백의활성화의억제효과는허혈-재순환손상후미토콘드리아에서 ROS 의생성에대한강력한억제작용에기인함을제시하였다. LA가산화성세포손상후미토콘드리아의세포막전위를감소를억제하고 27), 노화과정동안미토콘드리아의세포막전위를안정화하면서 Na + /K + ATPase 효소량을유지한다 28). 따라서이상의선행연구자들의실험결과를고려할때본연구에서 LA 투여 군에서 AIF 의발현감소는 LA의 PARP 활성화의억제효과및미토콘드리아의기능유지기능에기인할것으로추측되며이에대한정확한기전을규명하기위하여배양된신경세포에서추후연구가진행되어야할것으로사료된다. 허혈-재순환손상 5일째에생리식염수군과 LA 투여군에서 AIF 단백발현이유의한차이가없다는것과손상 3일째에생리식염수투여군에서 Sham 수술군과유의한차이가없는데도불구하고 LA 투여군에서생리식염수투여군보다 AIF의발현이유의하게감소함으로써 caspase-3 활성화분절단백에대한발현에대한 LA 의효과와차이가있음을알수있다. 이러한실험결과의차이에대한이유에대하여현재로써는정확히설명하기어려우며다만허혈-재순환손상후 AIF 단백이 caspase-3 단백에비의존성세포고사에관여함으로써 AIF 단백과 caspase-3 단백의신호전달계가다르게작동하고이에따라 LA 의효과도다르게나타날수있을것으로추측할뿐이다. 따라서허헐-재순환손상후신경세포에서세포소기관내 AIF 발현에대한 LA의효과를관찰하고미토콘드리아의기능과관련된 caspase-3 및 AIF 발현의차이에대한연구가추후진행되어야할것으로사료된다. 이와더불어실험동물을대상으로일과성전뇌허혈-재순환손상후사망률, 기억력의변화및해마에서전기생리학적변화에대한 LA 의효과에관련된추후연구를진행함으로써 LA 의신경세포보호효과에대한정확한기전을이해하는데도움이될것으로사료된다. 결 이상의본실험결과와다른연구자들의결과를종합하면 LA 가전뇌의일과성허혈-재순환손상후해마에서 caspase-3 및 AIF 단백의활성화와관련된세포사멸기작을억제하여 DNA 의분절현상을감소시키는것으로사료되며이데대한정확한분자생물학적기전규명에대한보다많은연구가진행되어야할것으로사료된다. 론 참고문헌 01. Krause GS, Kumar K, White BC, Aust SD, Wiegenstein JG. Ischemia, resuscitation and reperfusion: mechanism of tissue injury and prospects for protection. Am Heart J 1986;111: White BC, Sullivan JM, DeGracia DJ, O Neil BJ, Neumar RW, Grossman LI, et al. Brain ischemia and reperfusion: molecular mechanisms of neuronal injury. J Neurol Sci 2000;179: Pulsinelli WA, Bucham AM. The four-vessel occlusion ray model: method for complete occlusion of vertebral

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