발간등록번호 안내서 건강기능식품기능성평가가이드

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1 발간등록번호 안내서 건강기능식품기능성평가가이드

2 명칭 등록대상여부 지침서ㆍ안내서구분 기타확인사항 지침서 ᆞ 안내서제 ᆞ 개정점검표 건강기능식품기능성평가가이드 _ 면역과민반응에의한피부상태개선에도움아래에해당하는사항에체크하여주시기바랍니다. 이미등록된지침서ㆍ안내서중동일ㆍ유사한내용의지침서ㆍ안내서가있습니까? 예 아니오 상기질문에 예 라고답하신경우기존의지침서ㆍ안내서의개정을우선적으로고려하시기바랍니다. 그럼에도불구하고동지침서ㆍ안내서의제정이필요한경우그사유를아래에기재해주시기바랍니다. ( 사유 : ) 법령 ( 법ㆍ시행령ㆍ시행규칙 ) 또는행정규칙 ( 고시ㆍ훈령 예ㆍ예규 ) 의내용을단순편집또는나열한것입니까? 아니오 예 단순한사실을대외적으로알리는공고의내용입니까? 아니오 1년이내한시적적용또는일회성지시ㆍ명령에 예해당하는내용입니까? 아니오 예 외국규정을번역하거나설명하는내용입니까? 아니오 신규직원교육을위해법령또는행정규칙을알기 예쉽게정리한자료입니까? 아니오 상기사항중어느하나라도 예 에해당되는경우에지침서ㆍ안내서등록대상이아닙니다. 지침서ㆍ안내서제ㆍ개정절차를적용하실필요는없습니다. 내부적으로행정사무의통일을기하기위하여반복적으로행정사무의세부기준이나절차를제시하는것입니까? ( 공무원용 ) 대내외적으로법령또는고시ㆍ훈령ㆍ예규등을알기쉽게풀어서설명하거나특정한사안에대하여식품의약품안전처의입장을기술하는것입니까? ( 민원인용 ) 상위법령을일탈하여새로운규제를신설ㆍ강화하거나민원인을구속하는내용이있습니까? 예 ( 지침서 ) 아니오 예 ( 안내서 ) 아니오 예 아니오 상기질문에 예 라고답하신경우상위법령일탈내용을삭제하시고지침서ㆍ안내서제ㆍ개정절차를진행하시기바랍니다. 상기사항에대하여확인하였음 년 6 월 1 일 담당자확인 ( 부서장 ) 구태현오금순

3 이안내서는기능성평가에대하여알기쉽게설명하거나 식품의약품안전처의입장을기술한것입니다. 본안내서는대외적으로법적효력을가지는것이아니므로본문의기술방식 ( 하여야한다 등 ) 에도불구하고민원인여러분께서반드시준수하셔야하는사항이아님을알려드립니다. 또한, 본안내서는 2016 년 6월 27일현재의과학적ㆍ기술적사실및유효한법규를토대로작성되었으므로이후최신개정법규내용및구체적인사실관계등에따라달리적용될수있음을알려드립니다. 민원인안내서 란대내외적으로법령또는고시ㆍ훈령ㆍ예규등을알기쉽게풀어서설명하거나특정한사안에대하여식품의약품안전처의입장을기술하는것 ( 식품의약품안전처지침서등의관리에관한규정제 2 조 ) 본안내서에대한의견이나문의사항이있을경우식품의약품안전평가원식품위해평가부영양기능연구팀으로문의하시기바랍니다. 전화번호 : 팩스번호 :

4 제 개정이력 연번제개정번호승인일자주요내용 1 B 제정 2 안내서 식약처지침서등의관리에관한규정 에따른등록번호일괄정비 ( 규제개혁담당관실- 3761호, )

5 목차 약어 서론 일반적사항 개요 보건학적중요성 기능성시험방법 바이오마커의선정 바이오마커의측정방법 참고문헌 - 2 -

6 약 어 BALFs Bronchoalveolar lavage fluids ECP Eosinophil cationic protein ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FLG Filaggrin gene H&E Hematoxylin and eosin HPLC High performance liquid chromatography ICAM-1 Intercellular adhesion molecule-1 IgE Immunoglobulin E PAR-2 Protease-activated receptor-2 PBMC Peripheral blood mononuclear cells PCA Pyrrolidone carboxylic acid RAST Radioallergosorbent test SCORAD Scoring of Atopic Dermatitis SPC Sphingosylphosphorylcholine SPINK5 Serine protease inhibitor Kazal type 5 SSH Skin surface hydration TARC Thymus and activation-regulated chemokine TEC Total eosinophil count TEWL Transepidermal Water Loss Th1/Th2 Type 1/2 helper TLRs Toll like receptors TSLP Thymic stromal lymphopoietin UCA Urocanic acid - 1 -

7 Ⅰ 서론 이가이드라인은건강기능식품기능성원료를개발하는연구자및영업자에게기능성 ( 면역과민반응에의한피부상태개선에도움 ) 에대한바이오마커등의정보를제공함으로써산업체의기능성원료연구개발에적정을기하고효율성을높이고자작성되었다. Ⅱ 일반적사항 1. 개요 가. 피부의구조및역할 1) 피부의구조피부는표피, 진피, 피하지방으로구성되어있으며, 그안에신경과혈관, 한선, 피지선, 아포크린한선, 모발이존재한다. 피부전체의두께는 mm이며표피의평균두께는 mm 정도이다. 가 ) 표피 (epidermis) 표피는피부의가장바깥쪽층으로신체의표면을덮는방수및보호기능을한다. 표피는지속적으로재생성되는중층편평상피 (stratified squamous epithelium) 이며각질형성세포 (keratinocyte) 가 80 %, 수지상세포 (dendritic cell) 가 20 % 를차지한다. 수지상세포에는멜라닌세포 (melanocyte), 랑게르한스세포 (Langerhans cell), 메르켈세포 (Merkel cell) 가있다. 다양하게분화되는각질형성세포는여러층으로이루어져있다. 멜 - 2 -

8 라닌세포, 랑게르한스세포, 메르켈세포는기저층과기저층직상부사이에존재한다. 표피에는혈관이없고신경이거의존재하지않는다. 진피로부터확산에의해영양분을공급받는다. 표피의주구성성분인각질형성세포는분화정도에따라형태가변하여 5개의층으로나누어지는데, 내측으로부터기저층 (basal layer), 유극층 (prickle layer, spinous layer), 과립층 (granular layer), 각질층 (horny layer, cornified layer, stratum corneum) 으로구분된다. 신생세포는잇달아위로밀려올라가며그사이에분화하며변형해간다. 유극층에서는많은돌기로세포들이결합되어있고, 과립층에서는세포는점차편평하게되어간다. 표층으로이동하면세포는점점편평해짐과동시에각화를일으켜핵이소실되고결국에는표면에서떨어져나간다. 표피의심층은알칼리성 (ph ) 인데, 표층은피지선에서의분비물등으로인해산성 (ph ) 이되어미생물의번식을저지한다. 각질층은우리몸에서외부로의수분과전해질의손실을막고, 외부의물리적, 화학적손상으로부터우리몸을보호하는기능을갖고있다. 각질층은단백질로이루어진각질세포 (corneocyte) 와각질세포를둘러싸고있는지질로구성되어있다. 건강한피부상태를유지하기위해각질층은약 30 % 정도의수분을함유하여야하며, 크게 1) 피지, 2) 아미노산, 요소, 유기산등의자연보습인자, 3) 각질세포간지질이관여한다. 각질층내의지질은각질세포사이에다층의라멜라 (lamella) 구조로존재하며, 건조각질층무게의 14 % 정도를차지하며세라마이드 (40-50 %), 유리지방산 (15-25 %), 콜레스테롤 (20-25 %) 및콜레스테롤설페이트 (5-10 %) 로구성되어있다. 건조피부는이러한요소들의균형이깨어지거나결핍될때유발될수있다

9 나 ) 진피 (dermis) 진피는결합조직으로이루어진표피밑의피부층으로, 완충작용을하여신체를압력과장력으로부터보호한다. 진피는기저막을통해표피와단단히연결되어있다. 진피에는접촉과열을감지하는많은수의신경말단이있고, 모낭, 땀샘, 피지선, 아포크린샘, 림프관, 혈관등이있다. 진피안의혈관은세포에영양분을공급해주고노폐물을제거해준다. 진피는구조적으로표피에인접한위쪽영역인유두층 (papillary region) 과깊고굵은아래쪽영역인망상층 (reticular region) 으로구분된다. 표피에접하는결합조직층은교원섬유가촘촘한그물모양으로되어있다. 진피의일부는곳곳에서표피내부로들어가있는데, 이를진피유두라고하며, 혈관망이나감각기가있다. 표피심층부의세포는멜라닌색소를갖고있는데, 진피중에서여기에접하는부분의세포에도멜라닌색소를함유하는것이있다. 모발은피부부속기관의하나로서표피의세포가진피속에깊숙이침입하여피하조직과의경계에서결합조직과함께모근을형성하여이곳에서모발이만들어져위로보내어진다. 다 ) 피하지방진피밑에자리잡고있는조직으로서지방이축적되는층이다. 열의발산을막아주고, 수분을조절하며, 탄력성을유지하여외부의충격으로부터몸을보호하는기능을한다

10 그림 1. 피부의구조 2) 피부의기능 피부는다음과같은기능을수행한다. 신체보호 : 압력 충격 마찰, 세균과미생물침입, 광선등으로부터신체를보호한다. 배설 : 신체내에서만들어진노폐물을피지나땀을통해서배설한다. 체온조절 : 외부기온에반응하여체온을유지하는기능을한다. 호흡 : 적은양의호흡을통해피부신진대사결과로나오는탄산가스배출및산소흡수등의기능을한다. 감각 : 많은수의신경말단을지니고있어서압각, 촉각, 통각, 온각, 냉각등에반응한다. 영양소저장과합성 : 지질과수분의저장고이며비타민 D 합성기능을수행한다. 흡수 : 지방이나수분에용해된물질을흡수하는기능을한다

11 나. 피부의면역과민반응기능관련인자 1) 개요과민반응이란특정항원에대해과도한면역반응이일어나조직손상등의부적절한피해를주는면역반응을지칭한다. 과민반응은제 1형부터제 4형까지분류되며, 제 1형과민반응은알레르기로잘알려져있다. 알레르기 (allergy) 란그리스어인 allos 에서유래되었으며이는 변형된것 을의미하며 1906년프랑스학자 Clemens Von Pirquet가처음으로알레르기란용어를사용하였다. 그는알레르기를 이물질에대한신체의잘못변화된능력 으로정의하였는데, 이는면역학적반응을포함하는극히광범위한정의로간주된다. 현재알레르기는 다양한항원에대한면역계의반응으로발생하는질병 으로보다제한된의미로정의된다. 알레르기는과민반응 (hypersensitivity reactions) 으로서면역반응들의여러유해반응들중하나이며, 이런유해반응들은조직손상을일으키며심각한질병을일으킬수있다. 피부는대다수알레르겐들의출입구에대한효과적인방어벽을형성하나, 소량의알레르겐이국소적으로주입되면방어벽은무너질수있다. 표피나진피로의알레르겐침입은국소적인알레르기반응을유발한다. 피부에서의국소적으로비만세포 (mast cell) 가활성화되면즉시혈관투과성을국소적으로증가시켜수분 ( 혈장단백질과혈장액 ) 을혈관외로이동시키며부종을일으킨다. 알레르겐에의해활성화된비만세포가분비한히스타민은피부에가려움을동반하는붉은팽창을일으킨다. 때로는보다오래지속되는염증반응이피부에서나타나는데, 이것은주로알레르기소인이있는어린이들에서발생한다. 이들어린이들은습진혹은아토피피부염이라부르는지속적인피부발적이생기는만성염증을유발한다

12 아토피피부염은피부의면역과민반응을특징으로하며, 산업이발달하고서구화된나라에서더욱흔히나타나는질환으로소아는 %, 성인은 1-3 % 정도의유병률을보이며우리나라도이와유사한유병률을나타내고있다. 아토피피부염은 % 정도에서가족력이있을만큼유전적인소인이매우중요하게작용하지만, 환경적인요인도강력하게영향을미치는것으로알려져있다. 대표적인증상은건조하고가려운피부, 얼굴과팔꿈치안쪽과무릎뒤및손발의발진등이다. 2) 주요작용기전 가 ) 비정상적인면역반응 ( 면역조절기능이상 ) 피부의면역과민반응시에는혈청 immunoglobulin E(IgE) 및알레르겐감작증가, 급성병변에서 type 2 helper (Th2) 사이토카인증가, 피부림프구관련항원 (cutaneous lymphocyte-associated antigen) 이발현된 T세포의증가, 랑게르한스세포와염증성수지상표피세포 (inflammatory dendritic epidermal cell) 에서 FcεRI 발현증가등이나타난다. 피부장벽이손상되면외부항원및균의침투를막기위하여피부에서는각질형성세포와항원전달세포들을통하여즉각적인선천면역반응이일어나고후천면역반응도이어지는데, 피부가면역과민반응상태인자에서는이들선천면역계와후천면역계가비정상적으로반응하여알레르기염증반응이발생하는것으로알려져있다. 1 혈청 IgE 및알레르겐감작증가 피부의면역과민반응과 IgE 의연관성은혈청 IgE 증가가습진의증상 정도와비례하며, 천식및알레르기비염에서도혈청 IgE 가증가하며, 항 - 7 -

13 원노출후호염구 (basophil) 에서 IgE 분비가증가하고, 비만세포 (mast cell) 와호염구에서 IgE 수용체가발견되는것등으로설명되었다. 하지만경구면역억제제를사용하여증상을개선시켜도혈청 IgE 수치는비례하여감소하지않고자가 IgE 항체가발견되어 IgE 이외에다른요소들또한주목받기시작했다. 2 선천면역계이상반응피부의각질형성세포와항원전달세포는많은수의 pattern recognition receptors라고불리는선천면역수용체를발현하는데이중 toll like receptors(tlrs) 가가장널리알려져있다. 피부장벽의손상이나외부균에의하여 TLRs가자극을받으면항균펩타이드, 사이토카인, 케모카인등을분비하고, 더이상의외부균침투를막기위하여밀착연접 (tight junction) 을강화하도록유도한다. 피부가면역과민반응상태인자에서는이런 TLRs의기능이저하되어있는것이발견되었다. 즉, 이러한자들에서나타나는대표적인선천면역계이상은 TLR2 유전자의과오돌연변이 (missense mutation) 로서 TLR2 변이를가진자는임상적중증도가심하고, 혈청 IgE가높다. 또한 Th2 사이토카인에의해표피항균펩타이드발현이감소하는데이것은피부면역과민반응상태인자가세균과바이러스노출에취약하게만드는데관여한다. 3 후천면역계이상반응피부가면역과민반응상태인자에서후천면역반응은급성기동안에일어나는 Th2 사이토카인 (IL-4, 13, 31) 과 Th22 사이토카인 (IL-22) 의증가와연관된다. 관련부위에는피부림프구관련항원이발현된 T세포가증가되어있다. 손상된피부장벽을통하여외부항원이침투하게 - 8 -

14 되면수지상세포가항원을인식하여 Th2 세포를활성화시킨다. 활성화된 Th2 세포에서 IL-4, 5, 10, 13, 17, 31 등의사이토카인이분비되며, IL-4, 13에의해 B 세포가활성화되어 IgE가분비된다. IL-5에의해호산구가모여들며, 분비된 IgE가비만세포와호염구의 IgE 수용체에결합한후히스타민, 중성단백질분해효소, 프로스타글란딘 D 2, 류코트리엔 C4/D4/E4 등의다양한염증매개물질을분비시켜피부면역과민반응상태의임상증상을만든다. Th2 사이토카인인 IL-4, 5, 13 등은표피분화단백질인필라그린 (filaggrin) 등의발현을억제하고항균펩타이드생성을감소시킨다. 유전학적인측면에서는사이토카인관련유전자에변이가발생하면여러 Th2 염증반응에영향을주어피부면역과민반응을유발할수있다. 또한 IL-4, IL-4 수용체, IL-13 등의유전자변이와피부면역과민반응의상관성이보고되었다. Th22 세포는 IL-22를생산하며만성적인피부면역과민반응과관련된피부부위에서증가되어있다. 또한 IL-22 수용체가각질형성세포에서높게발현되며, IL-22의증가는표피에서각질형성세포의최종분화결함과표피의과도한증식등을일으키는요인이된다. 따라서피부가면역과민반응상태인자의피부장벽손상을더욱악화시키는데에는 Th2 세포와 Th22 세포가모두관여한다. Th17 세포는 IL-17과 IL-22를분비하며급성기피부면역과민반응상태인자의혈액과피부에서증가되고, 만성기에는 Th2 세포에서분비되는사이토카인에의해 IL-17의분비가줄어든다. Th22 세포에서는 IL-22를분비하여표피의증식을야기하며, 주로만성기에높게나타는것으로알려져있다. 따라서급성기에는피부장벽손상에의해외부항원이쉽게침투하여랑게르한스세포에의해감작이일어나며, Th2와 Th17의염증반응이우세하여관련사이토카인들에의해호산구와호중구가모이게되지만, 만성기에는 - 9 -

15 반복되는자극물질과알레르겐등의노출에의해 Th1, Th2, Th22의염증반응이우세하게되어관련사이토카인에의해표피의증식및각질형성세포손상등의반응이나타난다. 이과정에서 IgE의분비가증가되며피부면역과민반응상태부위의랑게르한스세포와염증성수지상표피세포에서는 FcεRI의발현이증가하게된다. Th1 및 Th2 세포와는다른종류의사이토카인을생산하여정상적으로면역억제기능을가지는조절T(Treg) 세포가피부면역과민반응상태인자의말초혈액내에증가되어있으나, 초항원 (superantigen) 인포도상구균내독소 (staphylococcal enterotoxin B) 에의해이런면역억제능이소실된다. 이는초항원이 T세포를활성화시켜서피부의염증을더악화시키는기전을설명해준다. 그러나많은경우에전신과피부면역반응사이에차이를보이듯이피부면역과민반응상태의피부병변에서는조절 T세포가결핍되어있다. 아토피피부염에서유전및여러환경요인에의해피부장벽이손상되면외부로부터침투한각종알레르겐에쉽게노출되고, 각질형성세포에서는 IL-7과유사한사이토카인인 thymic stromal lymphopoietin(tslp) 를분비한다. TSLP는알레르기염증반응의 master switch 라고도불리는데비만세포, 호염구, 호산구등피부염증을일으키는주요세포에영향을주고, 선천면역및후천면역반응모두에영향을주며, Th2 면역반응을유도하여피부를면역과민반응상태로이르게함에있어매우중요한요소로인식되고있다. 피부가면역과민반응상태인자의피부와혈액에서는 TSLP가증가되는데, 알레르겐에의해각질형성세포의 PAR-2 발현이증가되면표피에서 TSLP 분비가증가되고이로인하여 Th2 염증반응이우세하게일어나서아토피피부염의임상양상으로나타난다. TSLP 유전자에돌연변이가있을

16 경우에 TSLP 분비가더증가되고 Th2 면역반응이더심하게나타난다. 또한피부면역과민반응의원인에대한환경적인요소로서거론되는위생가설은과도한깨끗함이영유아와어린이들에게면역계를자극할만한자극원을없앰으로서감염자극의노출이줄어들게되며, 이로인해면역계에서감염반응과알레르기반응의불균형을초래한다는것이다. 이것은 Th1/Th2 면역상태의균형이 Th2 위주로유지됨으로써피부의면역과민반응이발생한다는면역학적기전에근거를제공하는것으로, 출생전후의위생조건이이물질에대한면역반응결정에큰영향을준다는가능성을설명하고있다. 즉세균에서나오는내독소또는장내세균의분포에의해알레르기질환이영향을받는다는것으로장내세균의분포와관련된피부면역과민반응의원인을설명하는근거가되고있다. 나 ) 피부장벽기능이상피부의면역과민반응상태에대한원인으로, 위와같이비정상적인면역기능이외에최근에는피부장벽기능이상또한매우중요하게다루어지고있다. 물과전해질의투과를조절하는표피투과장벽 (epidermal permeability barrier) 기능은피부의가장중요한기능으로간주되며표피의가장바깥층인각질층이이러한기능을담당하고있다. 각질세포 (corneocyte) 는각질형성세포 (keratinocyte) 의최종분화단계세포로핵과세포내기관이소실되고 keratin fiber로응축되어납작해져있고, 벽돌 의역할을담당한다. 각질세포간지질은과립세포 (granular cell) 에서층판과립 (lamellar granule) 의형태로세포외로분비되어형성되며, 각질세포를둘러싸는 `회반죽 (mortar) 의역할을한다

17 그림 2. 면역조절기능이상에의한과민피부상태발생기전 각질교소체 (corneodesmosome) 은각질세포를견고히연결시켜각질층의구조를유지하는데중요한작용을하며, 벽의장력을유지하기위한역할을한다. 손상된피부장벽이피부를통해항원이쉽게침투하도록하여항원과진피내항원제시세포및면역세포와의상호작용을증가시켜피부의면역과민반응발생에중요한초기반응으로작용한다는 outside-inside" 가설은피부의면역과민반응에서피부장벽손상이자극원과알레르겐에대한염증반응의결과라는기존의 inside-outside" 가설과는반대되는것이지만어느한가설로는모두설명될수없고피부의면역과민반응에대한발생단계와중증도, 내인성또는외인성여부에따라두가지가설이각기다르게작용할가능성이크다. 피부장벽기능이상과관련된병인들중대표적인것으로필라그린유전자 (filaggrin gene, FLG) 돌연변이, 각질층세라마이드감소, 항균펩타이드감소, 세린계단백질분해효소억제제 (serine proteases inhibitor) 감소, 밀착연접 (tight junction) 이상등이있다

18 1 필라그린유전자 (FLG) 돌연변이피부가면역과민반응상태인자의비병변피부에서표피분화단백질중필라그린발현만이유일하게감소되었다는결과가보고된이후로피부면역과민반응에대한원인으로필라그린에대한많은연구가진행되었다. FLG 변이율은인종에따른뚜렷한차이를보이고있다. 필라그린은표피과립층에서케라토히알린과립 (keratohyalin granule) 을형성하는단백질인프로필라그린 (profilaggrin) 의형태로존재하다가, 각질형성세포의최종분화과정에서필라그린으로분해된후에각질세포막을형성할때케라틴필라멘트를응집하여각질세포의단단하고편평한구조를만듦으로써피부장벽에서벽돌의역할을수행하게된다. 이후필라그린은각질층상부로올라가면서아미노산으로분해되어자유아미노산, pyrrolidone carboxylic acid(pca), urocanic acid(uca), 다양한유기산등으로변화하게된다. 자연보습인자중에서자유아미노산이 40 %, PCA가 12 % 를차지하며, 이들필라그린분해산물은각질층의수화뿐아니라각질층 ph의정상화, 투과장벽, 각질층의견고함, 항균및항염작용등에서다양한역할을수행한다. FLG 변이가발생하면필라그린단백질생성이감소되어각질세포막형성을약화시키고각질세포사이의접착력을감소시키며경표피수분손실 (transepidermal water loss) 이증가됨으로써전반적인피부장벽기능이감소되어외부알레르겐의체내침투증가에의한감작및이로인한알레르기반응이쉽게일어난다. 2 각질층의세라마이드 (ceramide) 및항균펩타이드 (antimicrobial peptide) 의감소피부가면역과민반응상태인자의병변뿐만아니라건조피부만을보이는비병변피부에서도각질세포간지질막을형성하는주성분인세라마이드가뚜렷하게감소하고, 특히가장긴사슬구조인세라마이드 1이가장

19 많이감소함을보여서, 세라마이드의감소를필라그린분해산물인자연보습인자의감소와함께거의모든피부면역과민반응상태인자에서관찰되는건조피부의중요한원인으로간주되었다. 이러한사람들의피부는항균펩타이드가감소되어있고특히각질층에서세라마이드분해산물이며가장강력한항균작용을하는스핑고신 (sphingosine) 의생성이감소되어있어세균, 바이러스, 진균등의노출에취약하게된다. 그림 3. 피부장벽기능이상으로인한건조피부발생기전 3 세린계단백질분해효소 (serine protease) 억제제의감소피부가면역과민반응상태인자의피부표면 ph는정상인보다높은데, 각질층 ph가증가하면각질세포의탈락을유도하는세린계단백질분해효소의활성이촉진되고 protease- activated receptor-2(par-2) 의활성이증가되어 Th2 면역반응이우선하는알레르기염증반응이일어나게된다. 이분해효소의작용을억제시키는역할을수행하는단백질이 lymphoepithelial Kazal type-related inhibitor(lekti) 로 serine protease inhibitor Kazal type 5 유전자 (SPINK5) 의산물이다. 염색체 5q32에위치한 SPINK5 변이가보고되었고, 이들에서는활성화된세린계단백질분해효소의작용을적절하게억제하지못하여알레르기염증반응이증가하는것으로설명된다

20 4 밀착연접 (tight junction) 이상밀착연접은상피세포에존재하며이웃한세포막측면을서로고정시키고세포측면공간을통한수분과체액의흐름을방지하는장벽이다. 각질층이손상되면서각질층과과립층사이에존재하는체액의경표피수분손실과함께칼슘이온농도가감소하면바로아래의과립층상부의밀착연접이열리고, 밀착연접바로아래까지위치하고있던랑게르한스세포의수지 (dendrite) 가밀착연접위로올라오게된다. 이때손상된각질층을통과하여들어온분자량이큰단백질항원들은랑게르한스세포의수지에의해포집되고인식되어국소림프절로이동하고, 이들단백질항원의세린계단백분해효소성분은각질형성세포막에존재하는 PAR-2를활성화시킨다. 한편각질층을침투한균들은 toll-like receptor(tlr) 를활성화하게된다. 이후각질형성세포에서여러케모카인과 TNF-α, IL-1, thymic stromal lymphopoietin(tslp) 등의사이토카인들이분비되어아토피피부염을촉진하고악화시킨다. 또한밀착연접단백질의발현이피부가면역과민반응상태인자의피부에서정상인에비하여현저하게감소하여있음이보고되었다

21 2. 보건학적중요성 피부의면역과민반응은우리나라를포함한산업이발달하고서구화된나라에서흔히나타나고있다. 대개유소아기에시작하여장기간지속되며사춘기까지약 90 % 는자연치유되는경향이있으나나머지 10 % 의경우성인이되어서도지속될수있다. 특히어린시절에발생하여장기간지속되기때문에정상적인성장발달과정을저해할수있으며여러가지환경항원에의노출이나심한소양감으로인해긁는행위자체가피부상태를더욱악화시킨다는특성상이를돌보는가족들에게육체적피로뿐만아니라정서적인면, 가족관계및사회생활등여러가지면에서영향을끼치게된다. 이는전반적으로삶의질에도많은영향을끼치는것으로알려져있다. 또한장기간의지속적인치료가필요하다는점에서경제적비용또한상당하다. 따라서피부의면역과민반응상태를개선시킬수있는건강기능식품은피부의정상적인기능유지에도움을줄수있으며, 더나아가아토피피부염으로진행될수있는요인을억제할수있으므로보건학적으로중요한의미를지닌다

22 Ⅲ 기능성시험방법 1. 바이오마커의선정 과민피부상태개선기능성평가시각바이오마커별측정가능한시험 연구유형은다음과같다. ε

23 * 피부장벽기능이상기전에도측정가능함

24 2. 바이오마커의측정방법 가. 면역조절기능이상 1) IgE 피부의면역과민반응상태가 IgE 매개성인경우혈청총 IgE가증가한다. 세포실험에서 IgE 생성을측정할수있고, 실험동물의혈액에서혈장또는혈청을분리하여효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 를이용한 IgE detection kit로측정할수있다. 즉 goat 유래 anti-dog IgE polyclonal antibodies를 1시간동안실온에서코팅한후, 분리한혈청샘플과표준샘플을 1시간동안실온에서반응시킨다. 완충액으로 5회세정한후, rabbit 유래 anti-dog IgE polyclonal antibodies를 1시간동안실온에서반응하고, 세정한후 TMB substrate로발색하여 O.D. 값을측정한다. 사람의혈청 IgE의농도또한효소면역측정법이나면역방사계수측정법 (immunoradiometric assay) 으로측정할수있다. 2) 호산구내 Fcε 수용체 IgE는비만세포 (mast cell) 와호염기구 (basophil) 표면에있는 Fc 수용체에결합하여 IgE 매개알레르기반응을개시하고, 사람의 Fc 수용체는호산구, 단핵구, 대식세포및혈소판에도존재한다. Fcε 수용체는 Fcε RI( 제I형 Fcε 수용체 ) 와 FcεRII( 제II형 Fcε 수용체 ) 의두가지가있으며, IgE는두 Fcε 수용체모두를더많이발현하도록조절할수있다. 세포실험이나실험동물과사람의혈액으로부터호산구를분리하여정제한후, IL-4, IgE를처리하고, Flow-Cytometric Analysis 방법을이용하여 Fcε 수용체발현을분석할수있다. 호산구를모아 PBS(3 % FCS, 0.1 % NaN

25 함유 ) 로 2회세정한다. 그다음 CRA-1 또는 control mab(igg2bκ) 를 5 μ g/ml 첨가하여 60분동안얼음속에둔다. 다시세포를세정하여 FITC-conjugated F(ab ) 2 fragment of goat anti-mouse IgG(7 μg/ml) 로 30 분동안얼음속에서염색한다. 염색된세포를세정하고, 각세포에대한형광강도를유세포분석기 (flow cytometry) 를이용하여측정한다. 3) Th1 cytokine(il-2, IFN-γ 등 ) 세포실험의경우세포에시험물질을처리하고일정시간후배양상층액을취하여각각의사이토카인을효소면역측정법으로측정한다. 동물시험에서기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluids, BALFs) 을원심분리한상층액, 잘라낸조직세포를배양한배양상층액, 생검을통한피부조직의균질상층액등에서 ELISA kits를사용하여분석한다. Microplates를 anti-mouse IFN-γ를처리하여 overnight 유지시키고, 3 % BSA(in PBS) 를처리한후검체샘플을 overnight 유지시킨다. 세정후붙지않은물질들을제거하고접착된사이토카인은 biotinylated antibodies와 streptavidinalkaline phosphatase로검출한다. 세정후 substrate p-nitrophenyl phosphate를 well에첨가하여 20분동안유지시키고, 각 well에대한 optical density를 microplate reader를이용하여 405nm에서측정한다. 사람의경우혈청 (serum), 혈장 (plasma), 말초혈액단핵구 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) 에서효소면역측정법으로정량한다. 4) Th2 cytokine(il-4, IL-5, IL-10, IL-13 등 ) 세포실험의경우, 세포에시험물질을처리하고, 일정시간후배양상층액을취하여각각의사이토카인을효소면역측정법으로측정한다. 동물시험에서기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluids, BALFs) 을원심분

26 리한상층액, 잘라낸조직세포를배양한배양상층액, 생검을통한피부 조직의균질상층액등에서 ELISA kits 를사용하여분석할수있다. 사람의 경우, 혈청, 혈장, 말초혈액단핵구에서효소면역측정법으로정량한다. 5) Th1 cytokine/th2 cytokine 제 1형피부의면역과민반응상태에서는 Th1 세포반응보다 Th2 세포반응이우세하게관찰된다. 즉, 과민피부상태는 T 세포기능의조절이상과연관이있고, Th2 세포반응이 Th1 세포반응보다우세한사이토카인생성의불균형이특징이다. 세포실험의경우시험물질을처리하고일정시간후배양상층액을취하여각각의사이토카인을효소면역법으로측정하고, Th1 cytokine/th2 cytokine을구한다. 실험동물의조직을떼어내고, 세포를배양하여배양상층액에서 Th1 cytokine, Th2 cytokine의농도를 ELISA kits를사용하여측정하고, Th1 cytokine/th2 cytokine을구할수있다. 사람의혈청, 혈장등에서사이토카인의농도를효소면역측정법으로정량하고, Th1 cytokine/th2 cytokine을구한다. 6) CD4+ T cell/cd8+ T cell 피부의면역과민반응상태의병변에존재하는 T 세포는 CD4+ T 세포뿐만아니라 CD+8 T 세포도존재하기때문에 CD4+ T 세포에서생성한 cytokine만있는것이아니다. 억제 T 세포 (CD8+ T cell) 도생성한 cytokine에따라 Th1, Th2와같이 TC1와 TC2로구분할수있다. 과민피부상태에서는 CD4+/CD8+ T cell이감소하는것으로알려져있다. 세포실험이나동물이나사람의전혈 (whole blood) 에서유세포분석기를이용하여그구성변화를측정함으로써어떠한면역반응이일어났는지알수있다

27 7) TSLP(Thymic stromal lymphopoietin) 피부의면역과민반응상태에서또하나의중요한사이토카인인 thymic stromal lymphopoietin(tslp) 는 CD11c+ myeloid dendritic cell을유도하여 Th2 염증반응을일으키는것으로알려져있다. 이러한 TSLP는과민피부상태에따른병변부에서증가되어있으며과민피부상태의중증도와도연관되어있다. 세포실험, 실험동물의피부생검조직등에서 TSLP의 mrna 발현을 RT-PCR 방법을이용하여측정할수있다. 사람의경우, 채취혈액에서혈청을분리하여 ELISA kit를사용하여분석할수있다. 8) TARC(Thymus and activation-regulated chemokine) TARC/CCL17(Thymus and activation-regulated chemokine) 은 CCR4 세포 (CC chemokine receptor 4-positive) 의반응을불러일으키는 Th2 chemokine의하나로서피부의면역과민반응상태에서표피의각질형성세포, 혈관내피세포, T 세포와수지상세포에서발현하는것으로알려져있다. 피부생검을이용하여실험동물의피부에서 TARC 수준을 ELISA 방법으로측정할수있다. 병변이있는피부를잘라내어 lysis buffer를넣고균질화한후, 냉동 / 해동과정을 3회반복한다. 그다음원심분리하고총세포단백질을함유한상층액을정량하고 TARC 농도를측정하여결과값을조직용해액내총단백질량을이용하여환산한다. 사람의경우채취혈액의혈청을분리하여 ELISA 방법으로측정할수있다. 9) 총호산구수호산구는말초혈액백혈구의 1~3 % 를차지하고있는과립구의일종으로피부의면역과민반응상태에서혈청총호산구수의증가는임상적중증도와상관관계가있는것으로보고된다. 특히, 과민피부상태가 IgE 매개

28 성인경우총호산구수증가가더욱현저하게관찰된다고보고되고있다. 실험동물의혈액을채취하여헤파린을처리하고혈구계를이용하여총백혈구수와총호산구수를측정할수있다. 사람의경우자동혈구계산기를이용하여측정할수있다. 10) 호산구양이온단백질 (eosinophil cationic protein; ECP) 호산구양이온단백질은호산구과립에서분비되는물질로서, 염증반응을야기하는것으로알려져있다. 호산구의탈과립 (degranulation) 은 IgA, IgG, IgE 등의항체가호산구표면에존재하는수용체에결합하는것에서도유발된다. 실험동물이나사람의혈청에서 ELISA 방법으로측정할수있다. 11) Eotaxin Eosinophil chemotactic proteins으로 CC 계열 chemokine의일종으로서호산구에작용하여조직내호산구축적에역할을하는것으로알려져있다. 수치가낮을수록염증개선효과가있다고판정한다. 피부생검을이용하여실험동물의피부에서 eotaxin 수준을 ELISA 방법으로측정할수있다. 병변이있는피부를잘라내어 lysis buffer를넣고균질화한후, 냉동 / 해동과정을 3회반복한다. 그다음원심분리하고총세포단백질을함유한상층액을정량하고 eotaxin 농도를측정하여, 결과값을조직용해액내총단백질량을이용하여환산한다. 사람의경우, 채취혈액에서혈청을분리하여 ELISA 방법으로측정할수있다

29 12) Scratching behavior frequency(itching time) 동물시험에서육안관찰로일정시간동안긁는횟수를측정한다. 예를 들어 10 분간총 5 회 ( 총 50 분 ) 동안긁는횟수를측정한다. 13) Dermatitis Severity 평가동물시험에서육안관찰을통해서피부염증상을평가할수있다. Dermatitis severity에대한총점수는 5가지징후나증상 (itch, erythema/ hemorrhage, edema, excoriation/erosion, scaling/dryness) 각각에대한점수, 즉 0; 증상없음, 1; 경증, 2; 중등, 3; 중증의합으로판정한다. 총점수가높을수록피부염증세가심함을의미한다. 14) 조직병리학적검사동물시험에서실험동물의피부조직을취하여염색 (staining) 하여, 피부두께 ( 각질상태 ), 피부염증세포의침윤 (mast cell의 infiltration, eosinophil 축적등 ) 을평가할수있다. 예를들어, 마우스의안면피부와등피부를생검하여 10 % phosphate-buffered formalin(ph 7.2) 에고정시킨후파라핀포매한다. 4 mm로잘라 hematoxylin and eosin(h&e) 과 toluidine blue로염색하여현미경을이용하여확대하여다양한염증세포와비만세포 (mast cells) 의변화를관찰하도록한다. 15) 피부단자검사알레르기질환의원인물질을규명하기위한진단방법으로비교적간편하게시행할수있고신속하게검사결과를알수있다는장점이있다. 여러가지항원이들어있는액체를등이나팔에올려놓고그부위를소독된침혹은주사바늘로피부를약간들어올려점석한검사핵이표피에

30 도달하도록한다. 15분이경과한후관찰하여붉은발진과부어오른팽진의정도에따라알레르기반응정도를판단하며, 팽진의크기가음성대조 (negative control) 보다 3mm 이상큰경우양성으로판독한다. 음성으로나오면해당알레르겐은원인이아니라고할수있으나, 양성으로나오는경우해당알레르겐이원인이라고확진할수없다. 16) RAST(Radioallergosorbent test) 알레르기질환의알레르기항원을혈청학적으로진단하는검사법으로서즉시형알레르기를유도하는 IgE 항체와고상에흡착시킨알레르기항원을반응시키고, 반응한 IgE 항체에 125 I-표지항IgE 항체를다시반응시켜그계수로대상자의 IgE 항체의특이성을알아내는방법이다. RAST법은여러종류의알레르기항원을많은부위의피하에주사하는종래의피부반응과유사하기때문에임상검사에활용하고있고, 또한최근에는 125 I 대신에효소를표지한항IgE 항체를사용하는효소항체법을사용하고있다. 17) SCORAD score(scoring of Atopic Dermatitis) SCORAD score는아토피피부염의임상적인경과를평가하기위하여현재까지개발된등급체계중에서가장객관적이고널리사용되는임상평가의방법이다. European Task Force on atopic dermatitis에서제안한방법에따라병변의범위 (A), 임상적강도 (B), 소양감과수면박탈의두가지주관적증상 (C) 의세가지항목으로나누어점수화한다. 병변의범위는 % 로구하고, 임상적강도는홍반, 찰상, 부종및구진, 삼출물 / 가피, 건조함, 태선화의 6가지를각각 0 3등급으로나누며, 주관적증상은가려움증과수면박탈을각각 0 10등급으로나누어평가한다. 세가지항목의점수를통해 SCORAD score=a/5+7b/2+c의식에따라

31 SCORAD score 를계산한다. SCORAD score 는관찰자간의편견을없애 기위해전문가 1 인에의해평가되도록한다. 나. 피부장벽기능이상 1) 필라그린 (Filaggrin) 필라그린은표피의과립세포에존재하는 keratohyaline granule를구성하는 profilaggrin이분해됨으로써생성되는 histidine이풍부한양이온단백질로서각질형성세포내에서케라틴필라멘트를응집하여피부장벽에중요한역할을담당한다. 정상부위에비하여급성과민피부상태에서는 IL-4와 IL-13의발현이증가되어분화된각질형성세포에서필라그린발현이현저히감소되고따라서피부장벽의손상이유발된다. 실험동물의표피조직에서필라그린의발현량을 Western blot analysis 방법으로측정할수있다. 사람의경우펀치생검 (punch biopsy) 등으로얻은피부조직에서 real-time RT-PCR과 Western blotting의방법으로 mrna 발현량과단백질발현량을측정할수있다. 2) 세라마이드 (Ceradmide) 세라마이드는피부각질층의각질세포간지질의주성분으로각질층전체지질의약 50 % 를차지하고, 수분 ( 결합수 ) 와함께지질 2중막을형성하여함습과장벽기능을갖게하는주성분이다. 세라마이드가층상구조로나란히배열되고, 그사이에물이보충되어수분유지능력을갖게하며, 이층상구조가전체적인장벽기능을발휘하고있다. 과민피부상태에서는정상인과비교하여상대적인세라마이드함량이감소되어피부장벽기능이

32 저하되는것으로알려져있고, 세라마이드의생성량은 glucocerebrosidase, sphingomyelinase, ceramidase 등의활성에의해서결정되는것으로알려져있다. 피부의세라마이드함량을측정할수있으며, 동물시험에서피부생검조직에 Tris-HCl buffer(1m, ph 7.5) 를가하고균질화한후, 동량의 folch 용액 ( 클로로포름 : 메탄올 =2:1 v/v) 을가한후 3,000 g에서 5분동안원심분리한다. 2회반복후모아진하층액을 N 2 gas로건조시키고, hexane(2 % isopropanol 함유 ) 을첨가하여필터링한다. 필터링하여얻은샘플을 HPLC(high performance liquid chromatography) 를이용하여분석한다. 사람의경우팔안쪽에서각질층을취하여지질을추출하고추출된지질을박층크로마토그래피 (thin layer chromatography, TLC) 를이용하여세라마이드함량을측정할수있다. 3) Serine palmitoyltransferase 표피에서 serine은 palmitoyl-coa와결합하여 serine palmitoyltransferase 에의해세라마이드를생성하여보습인자로서의역할을한다. 세포실험과시험동물의피부생검조직등에서 serine palmitoyltransferase의발현을 RT-PCR이나 Western blotting 등의방법을이용하여측정한다. 또한 de novo 세라마이드합성능을측정하는방법으로효소의활성을측정할수있는데, 검체에 14 C-serine을처리하고 16시간배양하여 HPTLC를이용하여세라마이드를분획하고세라마이드에병합된 14 C를분석함으로써효소의활성을측정할수있다. 4) Ceramidase 피부에서세라마이드의분해에관여한다. 세포실험과시험동물의피부 생검조직등에서 ceramidase 의발현을 RT-PCR 이나 Western blotting 등

33 의방법을이용하여측정할수있다. 5) Sphingomyelin deacylase 과민피부상태에서는 ceramidase 외에도 sphingomyelin deacylase라는효소가특이하게발현하여세라마이드함량을감소시킨다고보고되었으며, 이효소의작용으로세라마이드대신생성된 SPC(sphingosylphosphorylcholine) 는세포의성장과분화를조절하고, ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 발현과 arachidonic acid cascade를자극하여피부면역반응과민상태에서염증반응을가져오는것으로알려져있다. 사람의경우, tape-stripping 방법에의한피부각질, 펀치생검 (punch biopsy) 등으로얻은피부조직을검체로하여측정할수있고, sphingomyelin deacylase 활성의직접적인측정을위해 16-(9-anthroyloxy) hexadecanoylsphingosylphosphorylcholine 이나 [palmitic acid-14c] sphingomyelin 을합성하고, 이들을기질로이용하여 sphingomyelin deacylase 활성에의해서생성되는표지된 (labeled) 유리지방산을측정함으로써효소활성을측정할수있다. 6) Serine hydroxymethyl transferase Serine은 glycine의전구체로서 serine hydroxymethyl transferase에의해 glycine으로전환되며, 이는피부에서보습인자로서역할을한다. 세포실험에서 serine hydroxymethyl transferase의발현을 RT-PCR이나 Western blotting 등의방법을이용하여측정할수있다. 7) Serine protease activity 과민피부상태에서는피부표면의 ph 가증가하고, serine protease inhibitor 단백질인 LEKTI 1 의활성도가감소하면각질세포의탈락을유도

34 하는 serine protease의활성이촉진된다. 사람의팔에반복적인 tape strippings을실시하고, tape strippings의단백질함량을 850 nm에서측정하고, 측정직후에 tape stripping을 1.5 ml 튜브에넣고, 750 μl의 buffer(0.1 mol/l Tris/HCl, 0.5 % Triton X-100, ph 8.0) 를넣어 25, 1000 rpm에서 15분동안추출한다. 추출액 250 μl에 1.25 μl의 5 mmol L -1 fluorogenic peptide substrates(dimethylsulphoxide에녹임 ) 를처리한다. ( 최종 substrate 농도가 25 μmol L -1 가되도록함 ). 용액을 37, 1000 rpm에서혼합하고, 2시간후에반응용액 100 μl에아세트산 1 % 를 100 μl 처리하여반응을종료시킨다. Aminomethyl coumarin(amc) 을 reverse-phase high-performance liquid chromatography(hplc) 로정량한다. 8) 피부 ph 피부표면의 ph는산성이며, 이는피부장벽의항상성유지에매우중요하다. 피부장벽기능의악화는피부알카리화와연관되므로, 피부 ph를측정함으로써피부장벽기능을평가할수있다. 실험동물이나사람의피부표면에서 ph 측정기를사용하여측정한다 , 습도 % 의조건에서측정하도록한다. 9) 경표피수분손실량 (Transepidermal Water Loss; TEWL) 피부의면역과민반응상태에서는경표피수분손실량이증가한다. 실험동물과사람의피부표면에서측정기기를이용하여측정할수있으며, 측정할수있는기기는개방형과패쇄형으로구분되며, 개방형은측정시피부에정확히수직으로세워야하고, 측정시간이길며, 외부공기의흐름에영향을받는단점이있다. 폐쇄형은이러한단점을보완한방법으로알려져있다

35 10) 피부수분함유량 (Skin surface hydration; SSH) - 각질층수분함량, 수분결합력, 수분유지력피부의면역과민반응상태에서는각질층수분함량이저하된다. 따라서각질층을통해서유입되는수분과각질층내의수분함량이중요하다. 수분함유량측정기기는정전부하용량 (capacitance) 을이용한측정기기와전기전도도 (conductance) 를이용한기기가있다. 시험동물표피의수분함량은 22-24, 습도 % 에서등피부표면 (dorsal skin surface) 에서측정기기를이용하여측정할수있고, 사람의피부표면에서도측정기기를사용하여측정한다

36 Ⅵ 참고문헌

37 임정희 서병주 김정은 채창석 임신혁 한윤수 박용하 김치에서분리한 의면역조절특성

38 주영현 원종현 김지윤 조광현 민경업 김규한 마우스에서의아토피피부염모델개발및피부염병변에대한다래추출물 의효과 대한피부과학회지 호성현 박은진 최재혁 어해관 홍은실 김선영 김선희 개의아토피성피부염에대한다래 열매의열수추출물 의치료효과 생약학회지

39 건강기능식품기능성평가가이드 - 면역과민반응에의한피부상태개선에도움을줄수있음 편 - 발행인 편집위원장 편집위원 : 손여원 : 서세정 : 구용의, 이화정, 권용관, 허수정, 서일원, 구태현, 신용운, 황경미, 오재명, 배윤영, 강윤정, 문명희, 임푸름, 배민주, 정태용 발행처 발행일 문의처 : 식품의약품안전평가원 : : 영양기능연구팀 ( )

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화장품독성시험동물대체시험법가이드라인 (I) 독성평가연구부특수독성과 화장품독성시험동물대체시험법가이드라인 (I) 2007. 11. 독성평가연구부특수독성과 지침서 ᆞ 안내서제 ᆞ 개정점검표 명칭화장품독성시험동물대체시험법가이드라인 (I) ( 민원인안내서 ) 아래에해당하는사항에체크하여주시기바랍니다. 이미등록된지침서ㆍ안내서중동일ㆍ유사한내용의 지침서ㆍ안내서가있습니까? 예 아니오 등록대상 여부 상기질문에 예 라고답하신경우기존의지침서ㆍ안내서의개정을우선적