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1 Weed Turf. Sci. 2(3):306~311, 2013 DOI:dx.doi.org/ /WTS Print ISSN , Online ISSN Research Note Open Access Weed & Turfgrass Science The Korean Society of Weed Science and The Turfgrass Society of Korea Pythium aphanidermatum 에의한 Chewing Fescue 에잎마름병발생 장태현 1 * 이용세 2 1 경북대학교생태환경대학생태환경시스템학부, 2 대구대학교생명환경과학부 Occurrence of Pythium Blight Caused by Pythium aphanidermatum on Chewing Fescue Taehyun Chang 1* and Yong Se Lee 2 1 School of Ecology & Environmental System, College of Ecology & Environmental Sciences, Kyungpook National University, Sangju, , Korea 2 Division of Life and Environmental Science, Daegu University, Gyeongsan, , Korea (Received on August ; Revised on September 05, 2013; Accepted on September 09, 2013) ABSTRACT. Pythium blight occurred by Pythium aphanidermatum on chewing fescue cv. Jamestowm II from early June, 2010 and 2011 at the test field in Daegu University in Gyeongbuk Province, Korea. Disease symptoms on the turfgrass were leaf blights dying from the leaf tip and root rot, which appeared patches of brown to dark brown color or gray brown color in the field. The pathogens (40-1 isolate) of Pythium blight was isolated from the diseased leaf and crown tissue and cultured on potato-dextrose agar (PDA) for identification. Lobulate sporangia were inflated, complex structures, and filamentous sporangia were usually indistinguishable from vegetative hyphae. Sequences of ribosomal RNA gene of the fungus were homologous with similarity of 100% to those of P. aphanidermatum isolates in GenBank database. Pathogenicity was also confirmed on the chewing fescue, creeping betgrass and Kentucky bluegrass by Koch's postulates. This is the first report of Pythium blight on chewing fescue caused by P. aphanidermatum in Korea. Key words: Filamentous sporangia, Hyphae, Lobulate sporangia, Pythium blight 전세계여러식물에서발생하는 Pythium 마름병은 Pythium spp. 의해다양하게발생하는병으로 Pythium 속에는 100 여종이상이식물병에관여하는것으로알려져있다. 이들종중전세계에분포하고있는중요한식물병원균중에하나인 P. graminicola은주로벼, 옥수수등의곡물류와사탕수수, 잔디등에서발생하는병으로종자와뿌리썩음및묘잘록병을일으키며, 분류상으로포자를형성하 는거대한그룹에속한다 (Van der Plaats-Niterink, 1981). 포자를형성하는이들그룹에는또다른중요한식물병원성종인 P. aphanidermatum (Edson) Fitzp, P. arrhenomanes Drechsler, P. myriotylum Drechsler 및 P. vanterpoolii V. Kouyeas and H. Kouyeas이속해있다 (Van der Plaats- Niterink, 1981). 잔디에서병을일으키는 Pythium spp. 은대부분의잔디 *Corresponding author: Phone) , Fax) ) thchang@knu.ac.kr 에서모잘록병을일으키는것으로보고되었다 (Andrews, 1943; Freeman, 1980). Pythium에의한잎마름병을유발하는병원균은주로 P. aphanidermatum, P. graminicola, P. myriotylum, P. ultimum등에의해발생한다고보고하였고, 대부분의잔디는 Pythium spp. 에감수성을나타낸다고하였다. 그외에도잔디에잎마름병을일으키거나 (Muse et al., 1974), 지제부와뿌리썩음병 (root rot) 을일으키는병원균인 P. arrhenomanes, P. catenulatum, P. irregulae 등도보고되었다 (Abad et al., 1994; Hendrix et al., 1970; Hsiang et al., 1995; Saladini et al., 1983). Pythium spp. 의동정은과거에는주로형태적인특징으로동정되어왔다 (Dick, 1990; Matthews, 1931). 다양한배양조건에따른형태적인특성등을근거로동정을하지만, 매우어렵고혼돈이되는것은이들종들은형태적으로다양한배양적인특성과균학적인특성을갖고있어구체적으로이들그룹에종을표시하기는어려움이있는데 (Dick, 1990), 그예로 P. arrhenomanes 와 P. graminicola은혼돈 306

2 Pythium aphanidermatum 에의한 Chewing Fescue 에잎마름병발생 307 하기쉽다 (Van der Plaats-Niterink, 1981). 분자생물학의발달은 Pythium spp. 의동정에도주로사용하고있다. ITS(internal transcribed spacer) 에대한 RFLP (restriction fragment length polymorphic) 와 rdna(ribosomal RNA) 분석함으로써 Pythium spp. 과밀접하게연관돤종을동정하는데유용하게사용되고있는데 (Chen and Hoy, 1993; Matumoto et al., 2000), 특히, ITS 염기서열분석은 Pythium 속안에연관성을명확하게구분할수있다 (Uzuhashi et al., 2010; White et al., 1990). 피시움잎마름병은여름철고온다습한시기에빈번하게발병하는병으로 (Couch, 1995), 국내골프장에서도한지형잔디인 Kentucky bluegrass(poa pratensis), creeping bentgrass(agrostis palustris) 및한국잔디인 Zoysigrass (Zoysia spp.) 에서발생하는 Pythium spp. 이보고되었다 (Kim and Park, 1997). 본연구는국내에서는주로러프용잔디로주로사용되는 chewing fescue종인 Jamestowm II품종과 Kentucky bluegrass 혼합품종 (Midnight 33%, Moonnight 33%, Prosperity 33%) 에서잎마름병증상을보인잔디에서분리한 Pythium spp. 을형태적인방법과유전자분석을통하여병원균을동정하여골프장과스포츠필드에서잎마름병방제에기초자료로활용하려고한다. 병발생과증상 Pythium spp. 에의한잎마름과뿌리썩음병으로보이는 병이대구대학교잔디시험포장에 chewing fescue 3품종에서 2010과 2011년 6월초순에발생하였고 (Fig. 1A), 2012 년과 2013년 7월하순경에는경상북도상주시에소재한골프장에러프잔디로심은 Kentucky bluegrass에서전형적인잎마름병이심하게발생하였다 (Fig. 1B). 발병초기증상은잎의선단부가갈색으로변하고발병된잔디의잎은말라서부정형과타원형의작은 patch를형성하였다 (Fig. 1A, B). Chewing fescue종에나타난잎마름병증상이나타난 patch의크기는주로 3-5 cm로나타나지만, 점차여러병반 patch들이주위병반과합쳐지면서큰모양의 patch가나타나기도하였다 (Fig. 1A). 7월에하순에골프장러프잔디로심어진Kentucky bluegrass종에서나타난 patch 증상은초기에는 chewing fescue 품종에서와비슷한증상을보이다가점차심해지면서잔디가움푹패여뿌리까지죽는 patch형태로나타났으며, 병든잔디잎은짙은갈색과회갈색으로말라죽었고, patch의크기는직경이 3-7 cm에달했다 (Fig. 1B). 병원균은토양속에있거나토양과닫는부분에생존하면서잎, 뿌리및지하경에서병을일으킨다 (Dick, 1990; Matthews, 1931). 초기증상은노란색과괴사된 patch를형성하고점차넓은지역으로확대된다. 감염된식물은뿌리, 근부및번식체에짙은갈색으로퇴화되고잔디는죽는다 (Couch, 1995). 발병증상은마름증상과뿌리썩음으로인하여 patch로나타나는데, 온도가높고습도가높은봄철부터가을철까지잔디가생육하는기간에는흔하게나 Fig. 1. Disease symptoms on chewing fescue (A) and Kentucky bluegrass (B) caused by Pythium aphanidermatum. A: Symptoms on early June were brownish colored and leaf dried patches; B: Patch symptoms by leaf dries (blighted) and damping off on late July; C: Lobulate sporangia are inflated, complex structures; D: Filamentous sporangia are usually indistinguishable from vegetative hyphae. Bars=20 µm with X400. E: Mycelial growth on PDA medium for 72 hour after inoculation.

3 308 장태현 이용세 타난다 (Feng and Dernoeden, 1999; Hodges and Coleman, 1985). Patch의크기는보통 2-5 cm이나가끔은 15 cm까지크게나타나지만. 잎마름병증상은 o C 조건에서는갑자기나타나고, 특히밤온도가 20도이상이고, 비오는날이나습도가 90% 이상으로 14시간유지가되면잘나타난다. 이른아침에는잔디잎은수침상이나타나며, patch 는어두운색으로보이고, 그모양이나크기는불규칙적이고일정하지않다 (Abad et al., 1994; Couch, 1995; Dick, 1990; Matthews, 1931). Pythium에의한병은생육기에잔디를주로짧게예초를할경우에잘나타나는데, 이때나타나는증상은작게나타나서온도와습도가알맞으면빠르게크게확대되며, 봄철과가을철은습한조건에서증상은작고, 점차갈색의 patchs로확대가되며, 보통직경의크기는 4-7 cm가된다 (Couch, 1995; Saladini et al., 1983). P. aphanidermatum에의한병은주로묘의잎마름과관련이있는중요한종으로알려져왔으나 (Montheith, 1933; Muse et al., 1974), 일부발표에의하면면부병 ( 솜털같은균사에의한마름병 : cottony blight) 의유발하는우점종 으로보고되었고 (Hendrix et al., 1970; Saladini et al., 1983), 뿌리썩음병 (root rot) 의주요병원균으로도보고하였다 (Abad et al., 1994). 병원균의분리와동정병원균은 2010년과 2011년에경상북도대구대학교시험포장과상주시골프장러프잔디에서 6월상순과 7월하순에전형적인피시움잎마름증상을보이는 chewing fescue Jamestowm II 품종과 Kentucky bluegrass의 3종혼합품종에서이병식물의잎과줄기가포함된것을채집하였다. 병원균분리를위하여이병잎과줄기의감염조직을잘라 1% sodium hypochlorite에서 1분간표면살균후, 70% ethanol에서다시 30초간살균하였다. 표면살균한이병조직은멸균수로세척하여, 멸균된거름종이 (Whatman No. 1) 에올려놓아수분을제거하고, water agar(wa) 에항생제용액 ( 살균증류수 100 ml에 pimaricin 100 mg과 ampicillin 1000 mg 함유 ) 을 1% 을첨가하여만든배지에치상하여 25 o C 항온기에서 24일간배양하였다. 치상한이병조직에서자라나온균사는선단부분의균사를떼어서 PDA(potato dextrose agar) 배지로옮겨 25 o C 항온기에서배양한 20개균주중생리적반응이동일한균주인 40-1을대표균주로보관하면서본실험을수행하였다. 공시균주의보관은 25 o C 항온기에서계대배양을하면서시험하거나, 24 시간배양한균총의선단부에서직경 5mm의균사조각을떼어내어 cap tube( 직경 : 1 cm; 높이 : 10 cm) 에 5조각씩넣고, 보관용액 5ml( 살균수 : 5 ml; streptomycin (3,000 µg): 0.5 ml) 를넣어 25 o C 항온기에보관하며실험에사용하였다. 형태적인관찰을위하여공시균주를 CPA(carrot potato agar) 배지에접종하여 25 o C 항온기에 7일간배양한후균사를조사한결과 lobulate sporangia(fig. 1C) 를관찰할수있었고, 영양생장균사로부터가는실같은포자낭 (filamentous sporangia) 을관찰할수있었다 (Fig. 1D). 그리고온도별 (20 o C, 25 o C, 28 o C, 30 o C) 로배양한결과, 균사생장에차이를보였다. 균사는격막 (septum) 없었고, 균총은형태적으로차이를보이지않았지만, 솜털처럼왕성하게생장하는것을볼수있었다 (Fig. 1E). 모든 Pythium spp. 은잔디에서병원성을가지며, 균사는흰색으로솜털처럼자라며, 동체성균사 (homothallic) 로난포자를생산하고, 인공배지에서는유주자낭을형성한다 (Van der Plaats-Niterink, 1981). 조직에서관찰되는난포자의직경은 um이며, 형태적인동정은웅성생식기관인장정기 (antheridia), 장난기및포자낭의특성에주로근거를둔다 (Dick, 1990; Matthews, 1931). rdna의 ITS 염기서열분석분자생물학적동정을위하여 25 o C 항온기에서 2일간배양한후 DNA를추출하여 rdna의 ITS1-ITS4 프라이머을쌍으로증폭하였다 (White et al., 1990). DNA의증폭을위하여 universal primer인 ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3) 와 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGA TAT GCG-3') 를사용하였다 (White et al., 1990). PCR산물은 2% agarose gel을만들어 50V에서 120분동안전기영동하여밴드를확인하고, PCR 산물은 PCR purification kit를사용하여순화하여, Eugentech( 대전 ) 에 sequencing을의뢰하였다. 리보소옴 ITS 지역의 DNA 염기서열을분석하기위하여 ITS1(5'-TTCGTAGGTGAACCTGCGG-3') 와 ITS4(5'- AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3') primers 사용하여분석하였다 (White et al., 1990). 공시균주인 40-1을 ITS 염기서열을분석한결과, 증폭한 rdna-its지역의크기는 bp이었다. Phylogenetic tree는 MEGA version 4를사용하여 P. aphanidermatum UZ051 AB 염기서열과 GenBank의염기서열을참고로하여작성하였다 (Uzuhashi et al. 2010). phylogenetic tree는 Tamura-Nei parameter model을이용하여 Neighbor- Joining(NJ) 분석을통하여구축하였다. 공시균주인 40-1을 rdna의 ITS 지역을분석을한결과 P. aphanidermatum UZ051 AB 균주와 100% 일치하는결과를보임으로써공시균주인 40-1은 P. aphanidermatum 로동정되었다 (Fig. 2). Pythium spp. 의분류를위해 7종에대한 ITS-RFLP 분석을한결과, 종간에차이를볼수있었고, 그길이는 820 bp-

4 Pythium aphanidermatum 에의한 Chewing Fescue 에잎마름병발생 309 Fig. 2. Taxonomic position of 40-1 strain based on internal transcribed spacer (ITS) region of ribosomal RNA. Pythium strains were compared with strains of Uzuhashi et al. (2010). ITS region sequences were first analyzed using the Tamura-Nei parameter distance calculation model with gamma-distributed substitution rates, which were then used to construct the Neighbor-Joining tree with MEGA version Numbers below or above nodes are bootstrap values. Fig. 3. Mycelial growth on potato dextrose agar. Mycelial growth was measured sizes of colony diameter with digmatic caliper on 24 hour after inoculation using a 5 mm cork borer. Error bars indicate standard deviation and showed significant difference at P=0.05 level according to Tukey s HSD test bp이었으나, P. aphanidermatum, P. arrhenomanes 및 P. perplocum 이 820 bp 이었다고하였다 (Kageyama et al., 1998). 배양적인특성분리동정한병원균을 PDA배지에접종후 25 o C 항온기에서 24시간자란균사조각을떼어내어광학현미경하에서격막등을관찰하였고, 생리적인특성은생육온도와배지종류에대한반응을조사하였다. 공시균주인 40-1은생육온도에대한반응을조사하기위하여 PDA배지에서 24간배양한균총의가장자리부분을직경 5 mm 크기의균사조각을떼어내어 PDA배지에접종후 15 o C, 20 o C, 25 o C, 28 o C 및 30 o C에서 24시간배양하여균총직경을조사하였다. 공시균주인 40-1은생육은온도에따라서큰차이를보였다 (Fig. 3). 28 o C에서가장왕성한생장을보였다. 본시험에서는온도의차이를 28 o C와 30 o C로세분화한것은구체적으로생육적온을조사하기위하여생육이왕성한 25 o C와 30 o C 사이인 28 o C에서균사생장량을조사한결과, 24시간동안균사가 28 mm 생장하는것을볼수있었다. Kageyama et al. (1998) 에의하면 7종의 Pythium을 CPA 배지에서 15 o C부터 5도차이로 35 o C까지배양한결과, 온도차이에따른생육의차이는없었다고하였으며, 모든균은 30 o C에서최대생장을보였고, 하루의최대생장은 mm이었다. 그러나다른연구에서는 25 o C-30 o C에서 Fig. 4. Mycelial growth on several media. Mycelial growth was measured sizes of colony diameter with digmatic caliper on 24 hour after inoculation using a 5 mm cork borer. CMA: Corn Meal Agar; OMA: Oat Meal Agar; PDA: Potato Dextrose Agar; V-8: V-8 Juice Agar. Error bars indicate standard deviation and mean in column followed by the different letter that indicates significant difference at P=0.05 level according to Tukey s HSD test. 생장이왕성하다고하였다 (Couch, 1995; Montheith, 1933). 배지의종류에대한균사생장반응을조사하기위하여생육온도와같은방법으로공시균주를 CMA (corn meal agar), OMA (oat meal agar), PDA 및 V-8 (V-8 juice agar) 배지에접종한후 25 o C에서 24시간배양후균사생장량을측정하였다 (Fig. 4). V-8 배지에서가장왕성한성장을보였다. 균사의colony 형태관찰이나, 형태적인동정을위한난포자나포자낭생산을위해서는 CMA배지, CPA 및 V-8배지에서배양하는것이좋다고한다 (Abad et al., 1994). 배지의 ph에따른균사의생육을조사하기위해서는 PDA배지에 KOH와 HCl을이용하여 ph를 5, 6, 7 및 8로조절하고공시균을접종한후 25 o C에서 24시간과 48시

310 장태현 이용세 Fig. 5. Response of mycelial growth on different ph media. Mycelial growth was measured sizes of colony diameter with digmatic caliper on 24hr. and 48hr.

05 level according to Tukey s HSD test. 간 배양 후 균사 생장량을 측정하였다(Fig. 5). ph7에서 균사 생육이 자장 좋은 것으로 조사되었다.

5 310 장태현 이용세 Fig. 5. Response of mycelial growth on different ph media. Mycelial growth was measured sizes of colony diameter with digmatic caliper on 24hr. and 48hr. after inoculation using a 5 mm cork borer. Error bars indicate standard deviation and mean in column followed by the different letter that indicates significant difference at P = 0.05 level according to Tukey s HSD test. 간 배양 후 균사 생장량을 측정하였다(Fig. 5). ph7에서 균사 생육이 자장 좋은 것으로 조사되었다. 병원성 검정 병원성을 검정하기 위하여 포장에서 병이 발생한 chewing fescue 품종인 Jamestowm II, Kentucky bluegrass 혼용 품 종(Midnight 33%, Moonlight 33%, prosperity 33%) 및 creeping bentgrass 품종인 Penn Cross 에서 병원성 시험 을 실시하였다. 잔디는 관행 관리에 의해 1년 이상 자란 시험포장 잔디를 홀 컷터로 잘라내어 화분에 옮긴 후 온실 에서 20일간 관리한 잔디에 병원균을 접종하였다(Chang, 2011; Chang and Lee, 2013). PDA 배지에서 자란 활력이 양 호한 균총의 가장자리 균사를 지름 5 mm의 크기로 자른 균총 1조각을 PDB (Potato Dextrose Broth) 배지에 접종 한 뒤 25±1oC 암 상태에서 5일간 배양하였다. 배양된 균사 는 수확하여 멸균된 거름종이에 올려놓아 수분을 제거하고 동일한 량의 균사를 다시 멸균수에 넣고 30초간 균일하게 균사를 마쇄하였다. 접종원은 균사 생체 중 0.1 g ml-1가 함 유된 1 ml를 포트당 접종을 하고, 미리 준비한 플라스틱 상 자 바닥에 1 cm 높이로 물을 채운 접종한 포트를 넣고 뚜 껑을 닫고 밀봉하여 3일간 25±1oC 암 상태의 생장상(growth chamber)에서 배양한 후 온실로 옮겨 발병 정도를 조사하 였다. 인공 접종한 병원균은 3종류의 잔디에서 병원성을 나타 내었다(Fig. 6). 감염 초기에 잎의 선단부가 갈변하고 이 병 부위가 수침상으로 변하면서 점차 갈색이 퇴화하고 시 간이 경과됨에 따라 patch 형태를 유지하면서 잎과 줄기 는 고사하여 최종 회갈색이 되었다(Fig. 6A, B,C). 인공 접종하여 발병된 병반부에서 다시 병원균을 재 분리하여 PDA배지에서 배양한 후 병원균의 특성과 광학현미경에서 균사의 격막과 균사모양을 관찰한 결과 동일한 균으로 확 인되었다(Fig. 1D). 따라서 본 병은 한지형 잔디인 chewing fescue 종에서 P. aphanidermatum에 의해 잎마름증상과 뿌리썩음증상을 동반한 잎마름병으로 국내에서 처음 보고하며, 병명은 기 존 병명과 동일한 잎마름병으로 보고하고자 한다. 요 약 Pythium aphanidermatum에 의한 잎마름병(pythium blights)이 chewing fescue Jamestowm II 품종에서 2011 년 6월 상순에 대구대학교 시험포장에서 발생하였다. 잔 디에 발병증상은 잎 끝으로부터 잎마름 증상과 뿌리 썩음 증상이 나타나고, 잎색은 진한갈색,회 갈색으로 나타났다. 병원균은 병든 잎과 지제부에서 분리를 하였으며, 동정을 위하여 PDA에서 배양하였다. 균사에는 잎 같은 포자가 복 잡한 구조로 부풀어져 있고, 균사로부터 구별되지 않은 실 같은 포자낭이 있다. 리보소옴 DNA의 염기서열을 분석한 결과, 유전자은행 DB에 P. aphanidermatum 균주 와의 100% 상동성을 나타낸다는 것을 확인하였다. 병원성은 chewing Fig. 6. Pathogenicity test on chewing fescue cultivar Jamestone II (A), creeping bentgrass cultivar Penn cross (B) and Kentucky bluegrass mixed cultivars (Midnight 33%, Moonlight 33%, and prosperity 33%) (C). Inoculation was applied with mycelium suspension of 1ml by injection in the pots. Disease symptom showed on 5 days after inoculation.

6 Pythium aphanidermatum 에의한 Chewing Fescue 에잎마름병발생 311 fescue, creeping bentgrass 및 Kentucky bluegrass에서코흐의원칙에따라확인하였다. 이것은 chewing fescue 종에서 P. aphanidermatum 에의한잎마름병을국내에서처음보고한다. 주요어 : 실같은포자, 균사, 잎같은포자, 잎마름병 References Abad, Z.G., Shew, H.D. and Lucas, L.T Characterization and pathogenicity of Pythium, species isolated from turfgrass with symp-toms of root and crown rot in North Carolina. Pytopathology 84: Andrews, E.A Seedling blight and root rot of grasses in Minnesota. Phytopathology 33: Chen, W. and, Hoy, J.W Molecular and morphological comparison of Pythium arrhenomanes and P. graminicola. Mycol. Res. 97: Couch, H.B Disease of Turfgrass. 3rd (eds). Krieger Publishing Co., Malabar, FL, USA. Chang, T Difference of susceptibility on bentgrass cultivars to pink snow mold caused by Microdochium nivale. Asian J. Turfgrass Sci. 25(2): Chang, T. and Lee, Y.S Occurrence of brown patch on Kentucky bluegrass caused by Rhizoctonia solani AG-1 IB. Weed Turf. Sci. 2(1): (In Korean) Dick, M.W Keys to Pythum. University of Reading Press, Reading, UK. Feng, Y. and Dernoeden, P.H Pythum species associated with root dysfunction of creeping bentgrass in Maryland. Plant Dis. 83: Freeman, T.E Seedling disease of turf-grasses incited by Pythium. pp in: Advances in turfgrass pathology. Larsen, P.O. and Joyner, B.G. (eds). Harcourt Brace Jovanovich, Duluth, MN, USA. Hendrix, Jr. F.F., Campbell, W.A. and Mon-crief, J.B Pythium species associated with golf turfgrass in the South and Southeast. Plant Dis. Rep. 54: Hodges, C.F. and Coleman, L.W Pythium-induced root dysfunction of secondary roots of Agrostis palustris. Plant Dis. 69: Hsiang, T., Wu, C., Yang, L. and Liu, L Pythium root rot associated with cool-season dieback of turfgrass in Ontario and Quebec. Can. Plant Dis. Surv. 75: Kageyama, K., Uchino, H. and Hyakumachi, M Characterization of hyphal swelling group of Pythium: DNA polymorphisms and cultural and morphological characteristics. Plant Dis. 82: Kim, J.W. and Park, E.W Pythium spp. isolated from turfgrass at golf courses in Korea. Kor. J. Mycol. 25(4): (In Korean) Matthews, V.D Studies on the genus Pythium. University of North Carolina Press, Chapel Hill, NC, USA. Matumoto, C., Kageyama, K., Suga, H. and Hyakumachi, M Intraspecific DNA polymorphisms of Pythium irregular. Mycol. Res. 104: Montheith, J A Pythium disease of turf. Phytopathology 23:23-24 Muse, R.R., Schmitthenner, A.F. and Parthka, R.E Pythium spp. Associated with foliar blighting of creeping bentgrass. Phytopathology 64: Saladini, J.L., Schmitthenner, A.F. and Larsen, P.O Prevalence of Pythium species as-sociated with cottonyblighted and healthy turfgrass in Ohio. Plant Dis. 67: Uzuhashi, S., Tojo, M. and Kakishima, M Phylogeny of the genus Pythium and description of new genera. Mycoscience 51(5): Van der Plaats-Niterink, A.J Monograph of the genus Pythium. Studies in Mycology No. 21, Centraalbureau Voor Schimmelcul-tures, Baarn, Netherlands. p White, T.J., Bruns, T., Lee, S. and Taylor, J Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and, White, T.J. (eds) PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic, San Diego, USA. pp

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