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1 40 The Annual Report of Busan Metropolitan 이승주 city 윤호철 Institute 정재훈 of 이지윤 조현철 진성현 Health & Environment 21(1) 40~48(2012) 보건환경연구원보 HPLC-MS/MS를이용한어린이기호식품의인공감미료분석및실태조사연구 이승주 윤호철 정재훈 이지윤 조현철 진성현식품분석과 Determination of Sweeteners in Children's Favorite Foods by HPLC-MS/MS and Monitoring Lee Seung-ju, Yun Ho-cheol, Jung Jae-hun, Lee Ji-yoon, Jo Hyeon-cheol and Jin Seong-hyeon Food Analysis Division Abstracts 1)In this study, we investigated five sweeteners (acesulfame-k, cyclamate, saccharin, stevioside and aspartame) in children's favorite foods which are sold in around the school. HPLC-MS/MS method was developed for simultaneous determination of five sweeteners (acesulfame-k, cyclamate, saccharin, stevioside and aspartame) in children's favorite foods. The procedure involves an extraction of the five sweeterners with 50% methanol solution, sample clean-up using the carrez clearing reagent and filtering with cartridge filter. The HPLC seperation was performed on a HECTOR-M C18 (150 mm X 2.1 mm 5μm ) column using the wate / acetonitril mobile phase (95:5). Mass spectrometric analysis was carried out using the TSQ Quantum in negative and positive ESI/SRM. With this method, good linear relationship, sensitivity and reproducibility were obtained. The spike recoveries of five sweeteners for 2 kinds of foods spiked into 0.5 mg/kg ranged from 88.4% to 97.6%. Aspartame contents in candies and cookies were 9.06, and mg/kg. Concentrations of stevioside in cookies were 4.41 and mg/kg. The method has been effected to letertion of five sweeteners in children's favorite foods. Key words : Sweeterners, SRM(Selective Reaction Monitoring), Children's food 서론오늘날식생활문화가서구화되고다양한가공식품이개발됨에따라식품첨가물의섭취가불가피하게되었다 1). 식품첨가물이란식품의보존성과기호성을향상시키며식품의가치를높이기위해의도적으로사용되고있는물질을말한다 2). 대부분화학적으로합성또는천연유래물 질에서용매등을사용하여추출 정제하여제조하기때문에안전성을확보해야하며식품에미량성분으로첨가되지만음식을통해일생동안섭취한다는점에서인체에미치는영향이크다고볼수있다 3). 식품첨가물중인공감미료는다양한가공식품, 인스턴트식품에서설탕을대신해감미를주는재료로서사용되고있으며, 그사용량또한증가하고있다. 그러나감미료는과량섭취시비만, Corresponding author. nowhappy@korea.kr Tel : , Fax :

2 HPLC-MS/MS 를이용한어린이기호식품의인공감미료분석및실태조사연구 41 당뇨병, 동맥경화, 충치, 심장질환등의발병과깊은상관관계를갖고있어소비자의관심이날로증가되고있다 4). 식품의약품안전청은인공감미료의안전성확보를위하여국제식량농업기구 / 세계보건기구합동식품첨가물자문위원회에서정하는일일섭취허용량을기초로인공감미료의종류와첨가물을관리하고있다 5). 최근에는식품에대한이해가부족한어린이들이건강을고려하여식품을선택할수있도록신호등표시등다양한표시방법의개발이나안전한식품환경을조성하려는노력이전세계적으로확산되고있으며어린이기호식품의수입도증가되고있어식품첨가물사용에대한안전성문제가지속적으로대두되고있다 6-7). 현재일반가공식품을대상으로인공감미료에대한섭취량조사가수행되고있으나학교주변에서판매되는어린이기호식품의인공감미료함유현황에대한조사는부족한실정이다. 이러한첨가물의사용은필요에의하여사용하는것이므로그종류와사용량을준수하여안전한가공식품을소비자에게제공하여야하며인체에유해한감미료사용여부에대한감시가필요하다. 현재우리나라에서식품첨가물로허용된감미료는삭카린나트륨, 아스파탐, 아세설팜칼륨및수크랄로스등이있으며현행식품첨가물공전에서는사용대상식품과그사용량을엄격히규제하고있다. 현재감미료의분석은고속액체크로마토그래피 8-9), 이온크로마토그래피등 10) 을이용한분석에관한연구가이루어지고있으나식품전반에다양하게사용되고있는허용감미료및유해감미료를신속정밀하게분석할수있는전처리및다성분동시분석법개발이절실히필요하며이를위해식품자체메트릭스로의간섭이적고분석활용도가높은 HPLC/MS/MS를이용한 5종의감미료동시분석법을확립하고자한다. 그러나, 국가간식품산업이나식습관, 지정필요성등의이유로식품첨가물지정현황이상이함에따라최근수입되는식품중국내에서허용되지않는식품첨가물이검출되는사례가빈번히발생되고있으며현재식품첨가물공전에수재된총 653품목으로식품공전의인공감미료시험법에는삭카린나트륨시험법만수재되어있으며 10), 식품첨가물분석법에는아세설팜칼륨, 아스파탐, 삭카린나트륨, 수크랄로스, 둘신및싸이클라메이트 6품목의분석법이수재되어있다. 국내인공감미료분석법은식품공전일반시험법중인공감미료시험법에삭카린나트륨시험법 (HPLC-UV법) 이수재되어있으며, 식품중식품첨가물분석법 에는삭카린나트륨 (GC, HPLC-UV), 수크랄로스 (HPLC-RI), 아스파탐 (HPLC-UV), 아세설 팜칼륨 (HPLC-UV), 싸이클라메이트 (HPLC-UV), 둘신 (HPLC-UV) 분석법이수재되어있다. 따라서서로다른분석방법으로개별인공감미료들을각각분석할경우번거롭고시간이많이소요되므로여러인공감미료를동시에분석할수있는분석방법확립이필요하다. 지금까지발표된다수의인공감미료동시분석법은소수의인공감미료만을검출하는데초점이맞춰져왔으나 11-12), 최근보다많은인공감미료를포함한분석방법들이발표되는등일부진전이있어왔다 13-16). 최근에 HPLC-MS/MS 법을이용한인공감미료등동시분석법이보고되고있어본연구는학교주변문구점등소규모소매상에서유통되고있는수입산, 국내산어린이기호식품을대상으로 HPLC - MS/MS를이용하여 5종의동시분석법을확립하기위하여분석조건및국내유통가공식품중함유량조사를위해다수의시료를동시분석하는방법이라판단되어져시험방법등제 개정안에대한기초자료로활용하고안전관리방안을마련하는데있다. 재료및방법실험재료초등학교주변의문구점등을대상으로과자류, 캔디류, 초코릿류등 93건을검사하였다. 시약및기구표준품으로아세설팜칼륨, 싸이클라메이트, 삭카린나트륨, 스테비오사이드및아스파탐을사용하였고그구조와상대감미도는 Table 1과같으며, 추출및 HPLC- MS/MS분석을위해 potassium hexacyanoferrate(Ⅱ) trihydrate(wako), acetonitril, methanol(hplc, J.T.baker) 를사용하였다. 전처리를위하여분쇄기, 초음파장치및교반기를사용하였다. 표준용액조제및표준검량선작성인공감미료분석에사용된표준품으로삭카린나트륨 (Sodium saccharin, Sigma) 아스파탐 (Aspartame, Sigma), 아세설팜칼륨 (Acesulfame potassium, Fluka), 스테비오사이드 (Stevioside, Sigma), 싸이클라메이트 (Cyclamate, Sigma) 제품을사용하여 methanol 용액으로각각표준원액 (100mg/kg) 을제조한후, 그농도를 0.05, 0.1, 0.5mg/L 로희석하여 HPLC-MS/MS로분

3 42 이승주 윤호철 정재훈 이지윤 조현철 진성현 Table 1. Chemical structure and Relative sweeteness of five sweeteners Sweetener Chemical structure Relative sweeteness Acesulfame K 200 Cyclamate 30 Saccharin 300 Stevioside 300 Aspartame 180 석하여표준검량선을작성하였다. 며, 3 회반복실험하였다. 시험용액의조제분쇄기로파쇄한시료 10g, 50% methanol 25mL과침전용 Carrez 시액으로는페로시안칼륨 (potassium ferrocyanide 3-hydrate) 150g에물을가하여 1,000mL 한것을 Clearing reagent Ⅰ로황산아연 (Zinc sulfate 7-hydrate) 300g에물을가하여 1,000mL 한것을 Clearing reagent Ⅱ로사용하여 Clearing reagent Ⅰ, Ⅱ 2mL를추출용기 50mL에넣고교반기로교반후초음파처리 (37 khw, 1200W, 30 분 ) 로추출한다. 추출후 0.22μm cartridge filter (Millipore corporation, USA) 로여과하여 HPLC-MS /MS로분석하였다. 회수율혼합감미료표준액 (0.5mg/kg) 을재료에첨가한후시료전처리와동일한방법으로처리하여회수율을구하였으 기기조건감미료를분석하기위해 Accela Tm LC system이부착된 TSQ Quantum Ultra(Thermo Scientific) 를사용하였고, HPLC 조건은 HECTOR-M C18 (150mm X 2.1 mm 5μm ) 컬럼을사용하였으며이동상으로는 water 와 acetonitril (95:5) 를이용화여 0분에서 2분간용리한후 2분에서 10분까지 linear gradient로 acetonitril이 80% 가되도록 7분간유지한다음 20분까지 acetonitril 5% 로유지하면서 0.3mL/min의유속으로분석하였고시료는 10μl주입하였다. 검출을위한 MS/MS 분석조건은 ESI(electrospray ionization) 이온화방식을선택하였다. positive 와 negative mode에서 SRM (selected reaction monitoring) 방식을사용하여 nebulizing gas 로질소가스, collision gas로아르곤가스를사용하였고기타 MS/MS 파라미터는 spray voltage 3800V, sheath gas pressure 20psi,

4 HPLC-MS/MS 를이용한어린이기호식품의인공감미료분석및실태조사연구 43 auxiliary gas 25psi, ion transfer capillary temperature 350 로설정하여최적화하였다. 결과및고찰원산지별현황총 93의시료를원산지별로분류하면중국 34건, 한국 27건, 인도네시아 11건, 말레이시아 7건, 일본 4건, 터키 3건, 필리핀, 미국각각 2건이며, 인도, 스페인, 독일이각각 1건이었다 (Fig. 1). 식품종별현황총 93의시료를식품종별로분류하면사탕이 49건, 과 자 32건, 츄잉검 9건, 기타어육가공품, 기타코코아가공품, 밀크쵸코릿등이각각 1건으로나타났다 (Fig. 2). 기기분석인공감미료표준물질을질량분석기로주입한후 ESI모드에서양이온 (+) 모드와음이온 (-) 모드를사용하여각성분의모드를살펴본결과아세설팜칼륨, 싸이클라메이트, 삭카린나트륨, 수크랄로스, 스테비오사이드의경우에는음이온모드에서아스파탐은양이온모드에서좋은감도를보였고, 분석의선택성과검출강도를높이기위해 MS/MS 분석시 SRM(selected reaction monitoring) 모드로각성분별로감응도가큰 collision energy를선정하여각각의성분에대한최적의분석조건을얻은결과 Fig. 1. Classification according to origin of countury in 93 samples. Fig. 2. Distribution according to food type in 93 samples.

5 44 이승주 윤호철 정재훈 이지윤 조현철 진성현 Table 3 에서와같이각감미료의최적 collision energy 는아세설팜칼륨 (14, 40V), 싸이클라메이트 (27, 23V), 삭카린나트륨 (18, 35V), 스테비오사이드 (35, 36V), 아스파탐 (29, 11V) 로이때각각의 parent ion, quantization ion, confirm ion은아세설팜칼륨 (162, 82, 78 m/z), 싸이클라메이트 (178, 80, 96m/z), 삭카린나트륨 (182, 106, 42m/z), 스테비오사이드 (803, 479, 641 m/z). 아스파탐 (295, 120, 235m/z) 이었다. Fig. 3 은감미료의 SRM 크로마토그램에서는아세설팜칼륨, 싸이클라메이트, 삭카린나트륨, 스테비오사이드및아스파 Table 3. SRM (Selective Reaction Monitoring) transition of five sweeteners Compounds Parents ion(m/z) Quantization ionion(m/z) Confirm ion(m/z) Collision Energy Polarity Acesulfame K ,40 Neg Cyclamate ,23 Neg Saccharin ,35 Neg Stevioside ,36 Neg Aspartame ,11 Pos Fig. 3. SRM(Selective Reaction Monitoring) chromatogram of five sweeteners.

6 HPLC-MS/MS 를이용한어린이기호식품의인공감미료분석및실태조사연구 45 탐의고유한 confirm ion 과 quantization ion 으로확인및정량하였고머무름시간은 1.18 ~ 7.76로 10분이 내로분석이가능하였다. 김등 8,9) 이 HPLC를이용한감미료분석시두개의검출기를사용하여동시분석이어려 Table 4. Recovery rates(%) of five sweeteners Compounds Correlation Coefficient(R 2 ) Candy Recovery rates(%) Cookie Acesulfame K Cyclamate Saccharin Stevioside Aspartame Fig. 4. Mass spectra of product ion scanning of standard solution.

7 46 이승주 윤호철 정재훈 이지윤 조현철 진성현 Table 5. The Content of 5 sweeteners in children's favorite foods Food type Concentration of sweeteners (mg/kg) Acesulfame K Cyclamate Saccharin Stevioside Aspartame Candy(49) N.D N.D N.D N.D 2 (9.06, 89.04) Cookie(32) N.D N.D N.D 2 (4.41, 16.52) 1 (17.21) Other processed Cocoa products(1) N.D N.D N.D N.D N.D Milk chocolate(1) N.D N.D N.D N.D N.D Other processed meat fish products(1) N.D N.D N.D N.D N.D Chewin gum(9) N.D N.D N.D N.D N.D Fig. 5. Correlation Coefficient(R 2 ) of five sweeteners.

8 HPLC-MS/MS 를이용한어린이기호식품의인공감미료분석및실태조사연구 47 웠으나, 본실험의경우동시분석이가능하였다. 정성에그치지않고정량함으로써기존분석방법과차별되는결과를얻었다. 검량선및회수율 5종의감미료표준액을 0.05~0.5 mg/kg의농도로조제한후분석검량선을작성한결과각각감미료의상관계수 (R 2 ) 은 ~1.0000로양호한직선상의그래프를얻을수있었다 (Fig. 5) 시료에대한감미료의분석법회수율은과자및캔디를잘게분쇄하여 10g를취한후에혼합표준용액 ( 각각 0.5mg/L) 를첨가한후회수율시험을 3회반복한결과는 Table 4에서보는바와같이과자의회수율은 88.40~97.6% 이고캔디는 92.3~96.1% 로전반적으로좋은회수율을보였다. 김등 9) 의식품에서아세설팜칼륨, 삭카린나트륨등을 HPLC로분석한회수율 92.5% ~97.3% 의결과와유사하였다. 어린이기호식품감미료분석부산시내에서유통중인어린이기호식품 93건에서 5 종류의감미료를측정한결과는과자류에서스테비오사이드 2건, 아스파탐이 1건이검출되었으며농도는각각스테비오사이드는 4.41, 16.52mg/kg 이었고아스파탐은 mg/kg 이었으며, 캔디류에서는아스파탐이 2건검출되었다. 농도는아스파탐 2건에 9.06, 89.04mg/kg 이검출되었다 (Table 5). 과자에서의아스파탐에대한사용량은 5,000mg/kg 이하이고스테비오사이드에대해서는규제치가없으며, 캔디에대해서는아스파탐과스테비오사이드에대한규제치는없다. 따라서검출된감미료는사용가능한감미료이며사용금지된감미료는검출되지않았다. 김등 17) 의식품에서 6종의감미료를 HPLC-MS/MS를이용한결과와분석할때분석시간은 10분이내로본실험방법에서의분석시간과회수율등의유사한결과가나타났다. 요약총 93의시료를원산지별로분류하면중국이 34건, 한국이 27건으로각각 29% 로 36.5% 로를차지하고있으며식품종별로는사탕이 49건, 과자 32건으로각각 34.4%, 52.7% 로나타났으며, 아세설팜칼륨, 싸이클라메이트, 삭 카린나트륨, 스테비오사이드, 아스파탐을 HPLC-MS /MS이용하여동시분석한결과각감미료별로고유한스팩트럼을얻어정량하여머무름시간은 1.18 ~ 7.76로 10분이내로분석이가능하였다. 각각감미료의상관계수 R 2 은 ~1.000로양호한직선상의그래프를얻을수있었다. 시료에대한 5종의감미료에대한분석법의회수율은과자의회수율은 88.40~97.6% 이고캔디는 92.3~96.1% 로전반적으로좋은회수율을보였다. 부산시내에서유통중인어린이기호식품 93건에서 5종류의감미료를측정한결과는과자류에서스테비오사이드 2건, 아스파탐이 1건이검출되었으며, 캔디류에서는아스파탐이 2건검출되었다. 그농도는과자에서는스테비오사이드는 4.41, 16.52mg/kg 이었고아스파탐은 mg/kg 이었으며, 캔디의경우아스파탐만검출되었으며 2건에 9.06, 89.04mg/kg이검출되었다. 참고문헌 1. Lee, C.H., Park. S.K., Yoon, H.J., Park, J.S., Lee, J.O. and Lee, C.W. : Estimation of daily intake of artificial sweeteners and antioxidants in food. Korea J. Food Sci. Technol., 32, pp.519~524(2000). 2. Jung, K.H. : Research directions for food additives safety. J. Fd. Hyg. Safety, 4, pp.398~407(2009). 3. Choi, C.W., Jeong J.Y., Park, H.S., Moon. J.H., Lee, K.H. and Lee, H.M. : Evaluation of toxicological data food additives and guidline for ADI establishment - Polydimethyl siloxane as emulsifier. J. Fd. Hyg. Safety, 24, pp.352~356(2009). 4. Kim, H.Y., Yoon, H.J., Hong, N.H., Lee, C.H., Park, S.K., Choi, J.D., Choi, W.J., Park, S.Y., Kim, J.H. and Lee, C.W. : A study on the analytical method of artificial sweeteners in foods. Korean J. Food Sci. Technol., 36, pp.14~18(2004). 5. Lee, Y.M., Na B.J., Lee,Y.S., Kim, S.C., Lee, D.H., Seo I.W., Choi,S.H. and Ha, S.D. : Monitoring of tar color content in children's snack and its exposure assessment. J. Fd. Hyg. safety, 26, pp.57~63(2011). 6. Choi, Y.S., Chang N.S., Joung, H.J., Cho, S.H. and Park, H.K. : A study on the guideline

9 48 이승주 윤호철 정재훈 이지윤 조현철 진성현 amounts of sugar, sodium and fats in processed foods met to children's taste. Korean J. nutr., 41, pp.561~562(2008). 7. Kim, H.Y., Nam, H.S., Jung, J.H.,,Lee, J.H., and Ha, S.C. : Tar color in foods distributed throughout the Gyeong-In region-monitoring favorate good items of children near elementary schools. Korean J. Food Sci. Technol., 40, pp.243~250(2008). 8. 김명길, 윤미혜, 전일형, 김양희, 정진아 : 식품중합성첨가물사용실태조사연구, 한국식품위생학회지 14(3), pp.244~248(1999). 9. 김희연, 윤혜정, 홍기형, 이창희, 박성관, 최장덕, 최우정, 박선영, 김지혜, 이철원 : 식품중인공감미료분석법에관한연구, 한국식품과학회지 36(1), pp.14~18 (2004). 10. 식품의약품안전청 : 식품첨가물공전 (2011) 11. Wu, P., Cheng, C., Chou, S. : Determination of acesulfame-k, saccharin, aspartam, dulcin and cyclamate in beverages. J. Chin. Agric. Chem. Soc., 33, pp.37~50(1995). 12. Kim, H.Y., Yoon, H.J., Hong, N.H., Lee, C.H., Park, S.K., Choi, J.D., Choi, W.J., Park, S.Y., Kim, J.H. and Lee, C.W. : A study on the analytical method of artificial sweeteners in foods. Korean J. Food Sci. Technol., 36, pp.14~18(2004). 13. Furio, T.E : CRC Handbook of food additives. 2nd ed. Volume 2. Boca Raton, Florida: CRC Press, Inc.(1980). 14. Wasik, A., McCourt. J., Buchgraber, M: Simultaneous determination of nine intense sweeteners in food stuffs by high perfomance liquid chromatography and evaporative light scattering detection; Development and single -laboratory validation. J, Chromator., A, 1157, pp.187~196(2007). 15. Koyama M., Yoshida K., Uchibori N., Wada I., Akiyama K., Sasaki T.: Analysis of nine kinds of sweeteners in foods by LC/MS, 46(3), pp.72~78(2005). 16.Yang, D.J., Chen, B.O. : Simultaneous of Nonnutritive Sweeteners in Foods by HPLC/ESI-MS. J. Agric. Food Chem., 57, pp.3022~3027(2009). 17. Kim, I.Y., DU, O.J., Lee, S.D., Park, Y.H., Kim, M.S., Beo C.H. and Chae, Y.Z. : Determination of Six Sweeteners in Children's Favorite Foods by HPLC-MS/MS J. Fd. Hyg. safety, 25(2), pp.118~121(2010).

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