(82-92)03.KJH027.hwp

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1 Korean J Hematol Vol. 40, No. 2, June, 2005 Original Article 한국인만성골수성백혈병환자의 Imatinib (STI-571) 내성및 BCR-ABL 유전자돌연변이검출 울산대학교의과대학서울아산병원 1 진단검사의학과, 2 내과 손용학 1 지현숙 1 박찬정 1 이규형 2 서을주 1 Clinical Resistance to the Tyrosine Kinase Inhibitor Imatinib (STI571) and Detection of BCR-ABL Gene Mutations in Korean Patients with Chronic Myeloid Leukemia Yong-Hak Sohn, M.D. 1, Hyun-Sook Chi, M.D. 1, Chan-Jeoung Park, M.D. 1, Kyoo-Hyung Lee, M.D. 2 and Eul-Ju Seo, M.D. 1 Departments of 1 Laboratory Medicine, 2 Internal Medicine, University of Ulsan College of Medicine and Asan Medical Center, Seoul, Korea Background: Imatinib mesylate, the tyrosine kinase activity of the BCR-ABL fusion gene, induces a remarkable remission in chronic myeloid leukemia (CML) patients. However, resistance to imatinib has been observed in a significant proportion of subjects, with the point mutations of the BCR-ABL kinase domain clinically identified as a possible mechanism. The aim of this study was to investigate clinical resistance to imatinib in Korean CML patients, and search for the point mutation of the BCR-ABL gene. Methods: The clinical data and cytogenetic results of thirty two CML patients, who were treated with imatinib, between Jan and Aug. 2003, were evaluated. Mutational analyses for the point mutations of the BCR-ABL kinase domain in clinically resistant patients were tested using RT-PCR and direct sequencing methods. Results: Complete hematological remission was obtained in all CML patients with a chronic phase and in 4 of 6 CML with accelerated or blast crisis. However, 4 patients (2 in the chronic phase and 2 with blast crisis) relapsed to blast crisis following continued treatment. A major cytogenetic response was observed in 67% of the chronic phase patients, but in 2, the Philadelphia chromosomes reemerged in a follow-up chromosome study. Mutational analyses showed point mutations in the 351st amino acid of the BCR-ABL kinase domain in 2 patients: M351T, which has previously been reported in many studies, and a novel substitution, M351L. Conclusion: The frequency of imatinib resistance in Koreans was similar to that found in well-controlled western studies. Point mutations of the BCR-ABL kinase domain were detected in two patients. Further studies, with more sensitive methods and a greater number of patients will help reveal other mechanisms of imatinib resistance and establish more effective treatment plans. (Korean J Hematol 2005;40:82-92.) Key Words: Chronic myelogenous leukemia, Imatinib resistance, BCR-ABL tyrosine kinase, Point mutation 접수 :2005 년 4 월 22 일, 수정 :2005 년 5 월 19 일승인 :2005 년 6 월 15 일교신저자 : 서을주, 서울시송파구풍납 2 동 } , 서울아산병원진단검사의학과 Tel: , Fax: ejseo@amc.seoul.kr 본연구는 1998 년도한국여자의사회중외제약학술연구비지원에의함. Correspondence to:eul-ju Seo, M.D. Department of Internal Medicine, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center Pungnap 2-dong, Songpa-gu, Seoul , Korea Tel: , Fax: ejseo@amc.seoul.kr 82

2 손용학외 : Imatinib 내성 BCR-ABL 유전자돌연변이검출 83 서 만성골수성백혈병 (chronic myeloid leukemia, CML) 은 9번과 22번염색체장완간의상호전좌에의하여발생한 Philadelphia 염색체 (Ph), 즉 BCR-ABL 유전자재배열로인한 tyrosine kinase의활성도증가에의해초래되는조혈모세포질환이다. 1) 이러한병리기전을토대로이를억제하는새로운치료제의개발이시도되었으며, 2-phenylamino pyrimidine인 imatinib mesylate (Glivec, STI-571) 가 Novartis (Basel, Switzerland) 에서개발되었다. 2) 이약제를대상으로한 in vitro 및 in 론 vivo 실험에서 imatinib은 BCR-ABL 유전자를발현하는세포의성장을억제하는것으로밝혀졌으며, 3) tyrosine kinase의 adenosine triphosphate (ATP) 결합시경쟁적으로작용하고, 4) 선택적으로 apoptosis를일으켜 BCR-ABL 발현세포의증식을억제한다고알려졌다. 3) 임상시험결과 imatinib은만성기 CML 환자의 95% 에서혈액학적완전관해 (complete hematologic response, CHR) 를유도하고, 60% 정도에서세포유전학적주요관해 (major cytogenetic response) 를유도할뿐아니라, 5) 가속기및급성기환자에서도의미있는혈액학적및세포유전학적관해소견을보여주었다. 6,7) Imatinib은대다수의환자들에대해놀라운치료효 Fig. 1. Amino acid sequences and characteristic domains of BCR-ABL tyrosine kinase and summary of previously reported mutations of BCR-ABL kinase domain in CML patients with imatinib-resistance. 9-16) The number between parenthesis following each mutation site means total number of patients with the mutation.

3 84 Korean J Hematol Vol. 40, No. 2, June, 2005 과를보였지만, 급성기와가속기의상당수의환자들및만성기의일부환자들에서 imatinib에대해반응하지않거나, 반응후에재발하는내성양상을보여주었다. 5-7) 또한세포유전학적관해가일어나지않는빈도는이보다높다. 5-7) Imatinib 내성에관한 in vitro 및 in vivo 연구에서유전자의증폭 (amplification) 으로인한 BCR-ABL 유전자의과발현, 다약제내성유전자1 (MDR1) 과발현에의한 imatinib의세포내유입의감소, ABL의 315번째아미노산이 threonine에서 isoleucine으로치환 (T315I) 된돌연변이, α-1 acid glycoprotein (AGP) 에의한내성기전등이제시되었다. 8) Imatinib 내성을보이는 CML 및 Ph 양성급성림프구성백혈병 (acute lymphoblastic leukemia, ALL) 환자를대상으로한연구들에서 BCR-ABL 유전자의 tyrosine kinase를생성하는부위의점돌연변이들을내성의주요한원인으로보고하였으며, 이결과로발생한단일아미노산의치환이 imatinib의결합을저해한다고하였다 (Fig. 1). 9-16) 여러연구에서보고된 BCR-ABL 유전자의 tyrosine kinase 부위의돌연변이빈도는차이가있었으나, 특정위치의돌연변이 (E255K, T315I, M351T) 가전체의 60% 정도를차지하였다 (Fig. 1). 돌연변이의발생과내성에대한설명으로, imatinib의투여로인해많은돌연변이가일어나기 (hypermutability) 보다는치료전부터소수있었던돌연변이클론이 imatinib 투여로인해우세해서증식되는결과로 (clonal selection and expansion model) 내성이일어난다고설명하였다. 14,15) Branford 등 16) 은전향적연구를통해 BCR-ABL 유전자의돌연변이가관찰된 27명중 24명 (89%) 에서획득내성이있다고보고하였다. 또한 ATP 결합부위 (Ploop) 에위치한돌연변이가다른부위에발생한돌연변이보다예후가좋지않다고하였다. 이러한결과는 BCR-ABL 유전자의돌연변이가발생하는경우대부분내성을일으키므로, 돌연변이가내성의직접적인원인이라는증거가될수있으며, 돌연변이가일어나는위치에따라임상적예후의차이를보여주어돌연변이위치의확인이향후치료방향결정및예후판정에도움을줄수있음을시사한다. 본연구는 imatinib을투여받은 CML 환자를대상으로혈액학적및세포유전학적반응정도를조사하여한국인 CML 환자에서 imatinib의내성정도를알아보고, 이환자중혈액학적및세포유전학적내성이있는환자들을대상으로가장중요한기전으로생각되는 BCR-ABL tyrosine kinase 부위의돌연변이여부를확인해보고, 그임상적의미를찾고자하였다. 대상및방법 1. 환자병력조사및내성여부확인 울산의대서울아산병원에서 2002 년 1 월부터 2003 년 8 월까지골수검사및세포유전학적검사가의뢰된 CML 환자중 imatinib을 3개월이상복용하였던 32명을대상으로하였다. 대상환자의의무기록지를조사하여, 연령, 성별, 진찰소견및혈액학적소견, imatinib 투여기간, 투여량, 치료경과등을확인하였다. 진단당시및치료전후에골수검사및세포유전학적검사를시행하였고, International STI571 Study Group의기준 5) 에따라혈액학적및세포유전학적반응도를확인하였다. 세포유전학적반응의확인은치료후 3개월이후결과를기준으로삼았다. 내성여부에대한정의는 Branford 등의기준 16) 을참조하여혈액학적내성은혈액학적완전관해가온이후, 계속적인치료에도불구하고지속적인혈액학적관해의소실이있거나, 가속기나급성기로진행한경우로정의하였다. 세포유전학적내성의일차내성은세포유전학적주요관해를얻지못한경우로, 이차내성은완전세포유전학적관해를얻은이후, 이것이소실된경우나 Ph 양성세포가기존보다 35% 이상증가한경우로정의하였다. 2. 돌연변이검출 혈액학적및세포유전학적내성이관찰된환자중검체를얻을수있었던 11명을대상으로 RT-PCR을시행한후직접염기서열분석 (PCR-based sequencing) 방법을이용하여 BCR-ABL 유전자의 tyrosine kinase 부위의돌연변이유무를확인하였다. 검체는세포유전학적내성결과를보였던당시에채취한골수검체또는혈액학적으로재발한당시의말초혈액을사용하였으며, 확보된검체에서 Chomczynski 방법의변형인 RNA-Bee TM (Tel-Test, Inc, Friendswood, Texas, USA) 을이용하여 RNA를분리하였다. 골수와말초혈액에서백혈구를분리한후 diethyl pyrocarbonate로처리된 PBS (DEPC-PBS) 로세척한다음, 각검체에 RNA-Bee TM 1mL와 chloroform 200μL 을넣고진탕한다음, 원심분리한후상층액인 RNA를추출하였다. BCR-ABL RNA 양성대조군으로 K562 세포주를사용하여같은방법으로분리하였다. 추출된 RNA 를 DEPC-DW에완전히녹이고 oligo (dt) n primer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), dntp, Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA),

4 손용학외 : Imatinib 내성 BCR-ABL 유전자돌연변이검출 85 Fig. 2. Schematic diagram and primers of semi-nested PCR for BCR-ABL tyrosine kinase domain. RNase inhibitor (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), DTT, 반응액을넣고 42 o C에서 1시간동안반응시킨후 70 o C에서 15분간불활성화하여 cdna를합성하였다. Housekeeping gene의하나인 GAPDH 유전자의 PCR을실시하여증폭할수있는 cdna의존재유무를확인하였다. 합성된 cdna를 5 -GTGGATATGTT GCCATCA-3, 5 -GACTCCACGACGTACTCA-3 두가지의 primer로 PCR을실시하여 220bp의산물을전기영동하여확인한후, GAPDH 양성인경우에 seminested PCR을시행하였다. BCR-ABL tyrosine kinase domain의 P-loop부터 activation loop까지증폭하였는데, PCR에사용된 primer는 Branford 등이사용한것 16) 을이용하였으며 (Fig. 2), 각단계의산물의크기는 1,576bp와 863bp였다. 1단계 PCR의반응액의조성은 10X buffer 2μL, 1.5mM MgCl 2, 0.25mM dntp, Taq polymerase 1U, primer 10pmol, cdna 2μL를넣어총량이 20μL가되도록하였다. 반응은 94 o C에서 5분간변성시키고, 94 o C 30초, 64 o C 30초, 68 o C 3분으로 35회실시하였다. 2단계 PCR은 1단계 PCR 산물을 10배희석한후 2μL 을 10X buffer 2μL, 2.5mM MgCl 2, 0.25mM dntp, Taq polymerase 1U, primer 10pmol에넣어총반응액이 20μL가되도록하였다. 반응은 94 o C에서 5분간변성시키고, 94 o C 30초, 58 o C 30초, 72 o C 1분으로 35회실시하였다. 2단계 PCR 산물 4μL 와 loading buffer 1μL 를혼합하여 1.5% agarose gel에서 100V로 20분간전기영동을실시하였다. 이 gel을 ethidium bromide에염색한후자외선하에서각분획을관찰하였다. 각분획을 agarose gel extraction kit (intron technology, Seongnam, Korea) 를이용하여정제한후, 이산물을 BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied-Biosystems, Foster City, CA, USA) 을이용하여 sequencing 반응을시행하였으며, 2단계 PCR에서사용한 primer를사용하였다. 반응이된산물을 DNA 자동염기서열분석기 (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Applied-Biosystems, Foster city, CA, USA) 에넣어염기서열을분석하였다. 각분석된염기서열의 BCR-ABL kinase 부위를 ABL 유전자의 NCBI reference sequence인 NM_ (gi: , Genbank No. M14752) 와비교하여해석하였다결과 1. 혈액학적및세포유전학적내성분석 CML 환자 32명이 imatinib을투여받을당시의병기는만성기 26명, 가속기 1명, 급성기 5명이었다. Imatinib을투여받은시기는진단직후부터진단후 27개월까지다양하였다. 각환자의치료기간및혈액학적, 세포유전학적내성을기술하였다 (Table 1, 2). 만성기환자들모두에서혈액학적완전관해가관찰되었고, 추적관찰동안 2명이급성기로진행되어혈액학적재발을보였다. 만성기환자들중 21명에서치료후 3개월이후에염색체검사가의뢰되었으며, 세포유전학적주요관해를보인환자는 14명 (67%) 이었으며, 이중 10명 (45%) 에서세포유전학적완전관해를보였다. 나머지 7 명은세포유전학적일차내성이관찰되었으며, 혈액학적재발이관찰되었던 2명도세포유전학적일차내성

5 86 Korean J Hematol Vol. 40, No. 2, June, 2005 Table 1. Clinical characteristics and hematologic/cytogenetic response to im atinib in chronic phase CML patents Hematologic response Cytogenetic response No. Stage at Treatment Age start of duration Best /Sex im tinib (month) Initial F/U Resistance response Resistance Comments (month) CP1 67/M Late-CP 5 CHR CHR No Complete (3) No CP2 27/F Early-CP 7 CHR CHR No Complete (5) No CP3 60/M Early-CP 27 CHR CHR No Complete (4) No CP4 47/F Early-CP 17 CHR CHR No Complete (6) No CP5 54/M Early-CP 13 CHR CHR No Complete (4) No CP6 21/M Early-CP 19 CHR CHR No Complete (3) No CP7 60/F Early-CP 6 CHR CHR No Complete (5) No CP8 44/F Early-CP 5 CHR CHR No Complete (5) No Before BMT CP9 58/F Early-CP 6 CHR CHR No Complete (4) Yes (2nd) CP10 11/M Early-CP 13 CHR CHR No Complete (3) Yes (2nd) CP11 35/F Late-CP 9 CHR CHR No Partial (5) No CP12 67/M Early-CP 9/(7)*/9 CHR CHR No Partial (4) No CP13 12/M Early-CP 3 CHR CHR No Partial (3) No Before BMT CP14 48/M Early-CP 3 CHR CHR No Partial (3) No Before BMT CP15 27/F Early-CP 6 CHR CHR No Minor (3) Yes (1st) CP16 64/M Early-CP 5 CHR CHR No Minor (4) Yes (1st) CP17 37/F Early-CP 15 CHR BC Yes Minor (3) Yes (1st) CP18 41/F Late-CP 16 CHR CHR No Minimal (6) Yes (1st) CP19 53/M Late-CP 26 CHR CHR No Minimal (5) Yes (1st) Clonal evoluton (+8) CP20 41/F Early-CP 14 CHR CHR No Minimal (5) Yes (1st) CP21 33/M Early-CP 9 CHR BC Yes No (5) Yes (1st) CP22 62/F Late-CP 6 CHR CHR No No (2) ND CP23 68/M Early-CP 1/(7)*/5 CHR CHR No No (2) ND CP24 69/F Late-CP 13 CHR CHR No NT ND CP25 24/M Late-CP 19 CHR CHR No NT ND CP26 5/F Early-CP 3 CHR CHR No NT ND Before BMT *Skipped period between imatinib treatment period, Patient s initial cytogenetic response (after 4 months) showed complete cytogenetic response, but follow-up after 6 months showed partial response (20%), Patient's initial cytogenetic response (after 2 and 3 months) showed complete cytogenetic response, but follow-up after 5.5 months showed partial response (20%), after 7 months minimal response (80%), Early-CP defined as <12 months from diagnosis. Late-CP defined as 12 months from diagnosis. Abbreviations: CP, Chronic phase; BC, Blast crisis; NT, Not tested; ND, Not determined; CHR, Complete hematologic response; BMT, Bone marrow transplantation. 을가지고있었다. 8명의환자는 imatinib 투여 6개월이후에도추가적인세포유전학적검사가이루어졌으며, 추가적인염색체변화 (clonal evolution) 는 1명에서 imatinib 투여 1년후에 Ph 음성세포에서 trisomy 8 클론이관찰되었으나, 다음 1년후에는관찰되지않았다. 세포유전학적주요관해를보였던환자중 2명에서추적세포유전학적검사결과세포유전학적이차내성을나타내었으며, 이들모두혈액학적관해를유지하고 있는상태였다. Imatinib의조기치료의효과를확인하기위해만성기환자를진단부터 imatinib 치료이전까지의경과기간에따라, 12개월을기준으로조기만성기 (12개월이내, 19명 ) 와후기만성기 (12개월이상, 7명 ) 로구별하였다. 조기만성기환자는모두혈액학적관해를보였으나 2명에서혈액학적재발이관찰되었다. 세포유전학적주요관해는 17명중 12명 (71%) 에서관찰되었으

6 손용학외 : Imatinib 내성 BCR-ABL 유전자돌연변이검출 87 Table 2. Clinical characteristics and hematologic/cytogenetic response to im atinib in accelerated phase and blast crisis CML patents Hematologic response Cytogenetic response No. Stage at Treatment Age start of duration Best /Sex imtinib (month) Initial F/U Resistance response Resistance Comments (month) AP1 32/M AP 27 CHR CHR No No (5) Yes (1st) BC1 64/F M-BC 3.5 CHR CHR No ND ND BC2 15/F B-BC 12 CHR BC Yes No (11) Yes (1st) BC3 69/F L-BC 9 CHR BC Yes NT ND BC4 24/F M-BC 2/(4)*/1 No BC Yes No (2) ND BC5 71/F M-BC 6 No BC Yes NT ND *Skipped period between im atinib treatment period, The quality of bone marrow sample for chromosome study was too poor to decide the cytogenetic response, Tested with peripheral blood sample. Abbreviations: AP, Accelerated phase; BC, Blast crisis (M, Myeloid; L, Lymphoid; B, Biphenotypic); NT, Not tested; ND, Not determined; CHR, Complete hematologic response. Table 3. Mutation analysis of BCR-ABL kinase domain in patients with hematologic and cytogenetic resistance No. Hematologic Cytogenetic BCR-ABL mrna Mutations of BCR-ABL response response BM/PB kinase domain CP 9 CHR 2nd resistance +/NT M351L CP10 CHR 2nd resistance -/- ND CP15 CHR 1st resistance -/NT ND CP16 CHR 1st resistance +/NT No CP17 Relapse to BC 1st resistance NT/+ No CP18 CHR 1st resistance +/+ No CP19 CHR 1st resistance +/+ No CP20 CHR 1st resistance -/+ No CP21 Relapse to BC 1st resistance -/+ No BC 2 Relapse to BC 1st resistance NT/+ M351T BC 4 Refractoriness 1st resistance NT/+ No Abbreviations: NT, Not tested; ND, Not determined; CHR, Complete hematologic response. 나이중 2명은세포유전학적재발을하였다. 후기만성기환자는모두혈액학적완전관해를보였고재발이관찰되지않았다. 세포유전학적검사를실시한 4명중 2명 (50%) 에서세포유전학적주요관해를보였다. 두군사이의세포유전학적주요관해의차이는유의하지않았다 (Fisher s exact test, P=0.574). 가속기및급성기환자 6명중 imatinib 투여후 4명 (67%) 에서 4주이상지속되는혈액학적완전관해를보였으나, 이중 2명에서재발하였다. 세포유전학적검사를시행한 4명의환자중 3명에서세포유전학적관 해가관찰되지않았으며, 한명은분석세포수가적어서판단할수없었다. 2. BCR-ABL 유전자돌연변이분석세포유적학적내성을보이거나혈액학적내성을보인 14명중검체가확보된 11명 ( 혈액학적내성 4명, 혈액학적내성이없는세포유전학적일차내성 5명, 세포유전학적이차내성 2명 ) 의골수및말초혈액에서 BCR-ABL 유전자부위의돌연변이여부를조사하였다 (Table 3).

7 88 Korean J Hematol Vol. 40, No. 2, June, 2005 Fig. 3. Sequence analysis of BCR-ABL kinase domain. Normal ABL gene (NM_005157) has ATG sequence coding for methionine (M) at codon 351 (A). A substitution at codon 351 changed ATG to ACG coding for threonine completely (M351T) in a patient, BC2 (B) and to TTG coding for leucine partially (M351 and M351L) in another patient, CP9 (C). Fig. 4. 3D structure of ABL kinase domain acquired from PDB Number 1IEP using Cn3D program ver 4.1. M351 is not in contact with imatinib and is not within the sequence of P-loop or activation-loop. RT-PCR을시행한후, BCR-ABL mrna가증폭되지않은 2명을제외한 9명의염기서열을분석하였다. 세포유전학적이차내성을가진 2명중 1명과혈액학적내성환자 4명중 1명에서 BCR-ABL tyrosine kinase 부 위의 351번째아미노산이치환되는돌연변이가관찰되었다 (Fig. 3, 4). 그중후자는치료당시가속기였으며, 이후혈액학적완전관해상태에있다가다시가속기로재발하였다. 이환자의재발후의말초혈액검체로염기서열을분석한결과 ABL cdna (NM_005157) 과비교하였을때 1,416번째염기가 thymine에서 cytosine으로완전히치환 (ATG ACG; 1426T>C) 되어 351번째아미노산이 methionine에서 threonine으로치환 (M351T) 되는소견이관찰되었다 (Fig. 3B). 다른 1명은혈액학적완전관해상태가유지되고있었으나, 세포유전학적으로는완전관해상태의소실이관찰되는이차내성을보이는환자였다. Ph 양성염색체가재출현하였던골수검체로염기서열을분석한결과 1,415번째염기가 adenine에서 thymine으로치환 (ATG TTG; 1425A>T) 되었고, 원래클론과치환된클론의 peak가같은크기로나타나혼재되어있는양상이었다 (Fig. 3C). 이로써, 351번째아미노산이 methionine 에서 leucine으로치환 (M351L) 된클론이있음이관찰되었다. 그외나머지 7명의경우 BCR-ABL tyrosine kinase 부위의돌연변이는관찰되지않았다. 또한, NM_ 염기서열과비교하였을때, 1258 (A G), 1426 (A G), 1739 (A G) 번째염기의변화

8 손용학외 : Imatinib 내성 BCR-ABL 유전자돌연변이검출 89 가 9명모두에서관찰되었으며, 이는기존에보고된 SNP (single nucleotide polymorphism) 에해당하는결과였으며, 13,16) 모두동일한 haplotype 양상 (G-G-G) 을보여주었다. 이 SNP들은한국인에서특징적으로관찰되는소견일가능성이있다. 고찰 Imatinib이 CML 환자의치료에사용되기시작되면서항암치료에있어서원인에대한치료 (target-directed therapy) 라는새장을열게되었다. 그러나탁월한치료효과에도불구하고 imatinib에대해내성을보이는환자들이생겨났고, 이를설명하기위한기전으로 BCR- ABL tyrosine kinase 부위의돌연변이가그원인으로보고되고있다. 본연구에서 imatinib으로치료받은 CML 환자들에대해병력을조사한결과, 만성기환자의 100%, 가속기및급성기환자의 67% 에서혈액학적관해소견을보였으며, 또한만성기환자의 67% 에서세포유전학적주요관해소견을보였다. 이는 international STI-571 group 의보고 5) 와유사하였으며, 한국인의특성이 imatinib의작용에영향을미치지않는다고하겠다. BCR-ABL kinase 부위의염기서열분석이가능하였던 9명의환자들중에서혈액학적내성이있던 4명중 1명, 혈액학적내성없이세포유전학적내성만있던 5 명중 1명에서 BCR-ABL 유전자의점돌연변이가관찰되었다. 두명모두 ABL 유전자의 351번째아미노산의돌연변이가있었으나, 돌연변이가일어난염기의위치는 1,416번째 thymine이 cytosine으로, 1,415번째 adenine이 thymine으로바뀌어아미노산이각각 threonine (ACG) 과 leucine (TTG) 으로치환되었다. 본연구에서돌연변이가관찰된부위인 351번째아미노산은가장많이보고되었던세가지위치중하나로서지금까지 25명에서관찰되었다. 보고 13,15,16) 된경우는모두 methionine (ATG) 이 threonine (ACG) 으로치환 (M351T) 되었으며, 본연구에서도혈액학적재발이있던환자 1명에서관찰되었다. 그러나세포유전학적재발만있었던다른환자에서는새로운돌연변이 (M351L) 가발견되었으며, 이는 in vitro 및환자들을대상으로한연구에서아직까지보고되지않았고, 치환된아미노산의차이가가지는임상적인의미도알려진바가없다. BCR-ABL 유전자의돌연변이들이 imatinib의작용을억제하고, BCR-ABL tyrosin kinase의재활성화를 일으키는기전은단백질의 crystal 구조연구를통해밝혀지고있다. Schindler 등 17) 과 Nagar 등 18) 의연구에의하면, imatinib의작용기전은 ABL tyrosine kinase의 activation loop ( 아미노산서열 ) 가불활성화구조상태에있어서자가인산화 (autophosphorylation) 를일으킬수없을때 imatinib이결합하여이상태를유지시킴으로써 ABL tyrosine kinase의활성화를억제한다고설명하고있다. 이러한연구를바탕으로하여환자에서관찰되었던 BCR-ABL 유전자의돌연변이를 imatinib의작용을억제하는기전에따라크게 3가지로나눌수있다. 19) 첫째, imatinib이 BCR-ABL tyrosine kinase에결합하는부위, 즉수소결합이나 Van der Waals 상호작용에의해직접접촉을하는부위의돌연변이 (V289A, T315I, F317L 등 ) 는 imatinib의결합능력을감소시킨다. 둘째, ATP-결합부위인 P-loop의돌연변이들 (Y253F/H, G250E, E255K, Q252H 등 ) 이있다. Y253H나 Y253F는 N322 위치의수소결합을없애는것으로알려져있으며, G250E는 imatinib-결합 pocket 의입구역할을감소시키는작용을한다. 마지막으로, activation loop의돌연변이 (H396R 등 ) 는 tyrosine kinase 를불활성화구조에서활성화구조로전환시켜결합을방해할것이라고설명하고있다. 본연구에서발견된 351번째아미노산은이러한세가지주요한부위에위치하지않는다 (Fig. 4). Schindler 등 17) 은 ABL kinase의모든부분의돌연변이가단백질구조의변화를일으켜 imatinib의결합을방해하여내성을일으킬수있다고하였다. M351T은 nonpolar 아미노산인 methionine에서 polar 아미노산인 threonine으로치환되는것이므로 BCR-ABL kinase 구조변화에영향을줄수있을것으로생각하며, 본연구의환자에서도이치환이발생함으로써 imatinib 결합에장애를주어혈액학적내성원인으로작용하였을것으로생각한다. 본연구에서발견된다른아미노산치환인 M351L은같은 nonpolar 계열인 leucine으로바뀌는것이어서구조적인영향이덜할것으로예상되어, 실제내성을일으키는지는불확실하다. Azam 등 20) 이 in vitro mutagenesis로 M351T와 M351I를만들었는데, cellular IC 50 (μm) 이 M351T는 4.9, M351I 는 1.6 으로차이를보였다. Isoleucine 이 leucine 과유사한 nonpolar 구조임을감안할때, M351L 치환의경우실제내성에미치는영향은작을것으로추측된다. Corbin 등 21) 은혈중농도보다낮은 IC 50 을가지는여러돌연변이들이 imatinib에감수성이있다고보고하였으며, 일시적으로감수성이떨어져내성이발생하였다면용량의증가가도움이될수있을것이라

9 90 Korean J Hematol Vol. 40, No. 2, June, 2005 하였다. 그러므로 M351L 치환이관찰된환자는아직혈액학적재발이일어나지않은상태이고, 추후이환자에서혈액학적내성이관찰될지는불확실하며, 추적관찰을통해혈액학적내성유무및돌연변이변화등을관찰할필요가있다. 염기서열분석이가능했던환자들중나머지환자에서는돌연변이가관찰되지않았다. 다른연구 9-16) 에비해돌연변이의빈도가낮은것은, 다른연구들이급성기환자또는 ALL의치료후재발하였던환자들을다수포함하였던것과달리본연구는주로만성기환자들을대상으로하였기때문에환자군선정에의한차이가한가지원인일수있다. 본연구에서염기서열분석이가능한 2명의급성기환자중한명만재발한환자였으며이경우돌연변이가관찰되었다. 만성기상태에서치료후혈액학적내성이있었던 2명에서돌연변이가관찰되지않았는데, 이는혈액학적내성의대부분이돌연변이가원인이라는 Shah의보고 15) 와일치하지않는다. 그러나 2명모두조기만성기환자 ( 진단후 12개월내 imatinib 투여 ) 였으며, 이것은조기만성기에서내성의원인으로돌연변이가한명도관찰되지않았던 Branford 등의결과 16) 와일치한다. Imatinib 조기치료에서드물지만내성이발생한경우는 BCR- ABL 유전자의돌연변이에의한것이아닌다른원인의가능성을제시한다. 본연구에서만성기 CML 환자에서조기치료군과후기치료군을비교한결과, 혈액학적세포유전학적관해에유의한차이가없었다. 그러나조기치료군환자중혈액학적재발이 2명에서, 세포유전학적재발이 2명에서관찰되었고, 후기치료군에서는관찰되지않았다. 후기치료군의관찰수가적어서비교하기에문제가있으며, 추후많은관찰수를통한연구에서결과를재확인하여야하겠다. 서론에기술한치료전클론의 expansion model이일반적인가설로서받아들여지면서, 치료전소량의클론을확인하기위한여러가지방법이제시되었다. Shannon 22) 은 PCR-SSCP나 DHPLC 방법이 5% 의돌연변이클론을검출할수있다고소개하였고, 다른연구에서는 ASO-PCR, 14) PNA-based PCR clamping technique 23) 등을이용하였으며, 검출의예민도가높아지면서대상검체를 mrna가아닌 DNA를이용하여치료전클론을확인하려는방법도시도되었다. 이러한검사방법이발전되어실제검사실에서 imatinib을투여하기전에치료전돌연변이클론을확인할수있다면, 병합치료나신약등치료방향의결정에도움을줄수있을것이다. 본연구에서돌연변이가관찰되었던 2명의환자들 도치료전에돌연변이클론이있었는지를예민한방법으로확인해볼필요가있다. 예민도를높이기위해 Shah 등 15) 은치료전검체가아닌내성당시의검체에서 BCR-ABL 유전자의돌연변이를검출하기위해클로닝을이용하였다. Branford 등 16) 은이를위해 RNA의질을중요시했으며, 이것이나쁜경우검사에서배제시킬것을강조하였다. 본연구에서는직접염기서열분석방법만을실시하였고, 이는돌연변이를가진클론이소량있는경우에는검출해내기어려운단점이있다. 본연구의일부검체에서 RT-PCR 산물을얻기가어려웠는데, 이는 imatinib 치료후골수와말초의세포수가절대적으로감소하고 BCR-ABL 양성세포수도현저히줄어든상태에서 1576 bp의긴염기서열을증폭하기에는 BCR-ABL mrna의양이절대적으로부족하기때문으로생각한다. BCR-ABL 유전자의돌연변이에대한연구가활발하게이루어졌음에도 imatinib의내성을모두설명할수는없다. 일차적혈액학적내성이나세포유전학적내성을보이면서혈액학적관해를보인환자에서 BCR- ABL 유전자의돌연변이의빈도가상당히낮았으므로, 이런환자에서다른기전이주요한역할을할것이다. Gorre 등 11) 과 Hochhaus 등 14) 은내성이있는환자의상당수에서 BCR-ABL 유전자의증폭 (amplification) 을관찰하였으며, 내성의원인중하나로서설명하였다. 본연구에서돌연변이가관찰되지않은나머지환자들에대해추가적으로 BCR-ABL 유전자의증폭에대해조사해볼필요성이있다. 또한 Hochaus 등 14) 은내성이발생한 CML 환자중세포유전학적검사가가능한 36 명중 19명에서추가적인염색체변화 (clonal evolution) 가일어났다고하였다. BCR-ABL 유전자의돌연변이가없는내성환자 6명에서 BCR-ABL kinase 활성도의재증가가관찰되지않았지만이중 2명에서추가적인염색체변화가있다고했다. 이것은 BCR-ABL tyrosine kinase가 imatinib에의해잘억제되어도내성이일어날수있는가능성을보여주었다. Markel 등 24) 은 imatinib 투여중인환자 102명중 15명에서추가적인염색체변화를관찰하였고이중 10명은혈액학적완전관해상태에있었다. 이들에서예후의차이가있었고, 추가적인염색체변화는질병진행의위험인자로작용하므로혈액학적완전관해상태에서세포유전학적검사의필요성을강조하였다. 본연구에서는만성기환자한명이세포유전학적내성상태에서 Ph 음성세포의일부가 trisomy 8을가지고있었고 1년후소실되었는데, 이경우내성과의연관성은명확하지않다.

10 손용학외 : Imatinib 내성 BCR-ABL 유전자돌연변이검출 91 본연구의결과 imatinib 사용후발생한내성의빈도는다른보고와유사하였으나, 그병리기전의하나인돌연변이의빈도는낮았다. 돌연변이의검출빈도를높이기위해검체및검사법의예민도를높여서추가적인검사를시행할필요가있으며, imatinib 내성에대한다른원인에대한부가적인연구가요구된다. 또한 imatinib 치료후주기적인세포유전학적검사가내성기전에대한이해및예후판정에도움을줄것으로사료된다. 요약배경 : BCR-ABL 유전자재배열로인해비정상적으로활성화된 tyrosine kinase를목표로하는 imatinib mesylate는만성골수성백혈병환자에서탁월한치료효과를보여주었다. 그러나일부환자에서 imatinib에대해내성을나타내었으며, BCR-ABL 유전자의돌연변이가주요원인으로알려지고있다. 본연구는한국인만성골수성백혈병환자를대상으로 imatinib의내성빈도를알아보고 BCR-ABL 유전자의돌연변이를확인하고자하였다. 방법 : 울산의대서울아산병원에서 2002년 1월부터 2003년 8월까지골수검사및세포유전학적검사가의뢰된 CML 환자중 imatinib을 3개월이상복용하였던 32명을대상으로혈액학적및세포유전학적내성정도를알아보았다. 내성을보였던환자들을대상으로 RT- PCR 및직접염기서열분석법을이용하여 BCR-ABL kinase domain의돌연변이를조사하였다. 결과 : 만성기환자모두와가속기및급성기환자의 67% 에서혈액학적완전관해가관찰되었고, 추적관찰동안 4명 ( 만성기 2명, 급성기 2명 ) 이재발하였다. 만성기환자의 67% 가세포유전학적주요관해를보였고, 이중 2명은추적검사에서세포유전학적재발을하였다. 돌연변이분석결과 2명에서 BCR-ABL kinase domain 의 351번째아미노산이치환되는돌연변이가관찰되었으며, 여러차례보고되었던 M351T와처음발견된 M351L이었다. 결론 : 한국인에서 imatinib 내성이다른보고와비슷한빈도로보고되었으며, BCR-ABL kinase domain의돌연변이가병리기전으로일부관찰되었다. 추후내성의여러기전을포함한계획적이고광범위한연구가진행되어야한다. 참고문헌 1) Sawyers CL. Chronic myeloid leukemia. N Engl J Med 1999;340: ) Druker BJ. Perspectives on the development of a molecularly targeted agent. Cancer Cell 2002;1: ) Druker BJ, Tamura S, Buchdunger E, et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med 1996; 2: ) Buchdunger E, Zimmermann J, Mett H, et al. Inhibition of the Abl protein-tyrosine kinase in vitro and in vivo by a 2-phenylaminopyrimidine derivative. Cancer Res 1996;56: ) Kantarjian H, Sawyers C, Hochhaus A, et al; International STI571 CML Study Group: Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia. N Engl J Med 2002;346: ) Druker BJ, Sawyers CL, Kantarjian H, et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med 2001;344: ) Talpaz M, Silver RT, Druker BJ, et al. Imatinib induces durable hematologic and cytogenetic responses in patients with accelerated phase chronic myeloid leukemia: results of a phase 2 study. Blood 2002;99: ) von Bubnoff N, Peschel C, Duyster J. Resistance of Philadelphia-chromosome positive leukemia towards the kinase inhibitor imatinib (STI571, Glivec): a targeted oncoprotein strikes back. Leukemia 2003;17: ) Gorre ME, Mohammed M, Ellwood K, et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR- ABL gene mutation or amplification. Science 2001; 293: ) Barthe C, Gharbi M, Lagarde V, et al. Mutation in the ATP-binding site of BCR-ABL in a patient with chronic myeloid leukaemia with increasing resitance to STI571. Br J Haematol 2002;119: ) Branford S, Rudzki Z, Walsh S, et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood 2002;99:

11 92 Korean J Hematol Vol. 40, No. 2, June, ) von Bubnoff N, Schneller F, Peschel C, Duyster J. BCR-ABL gene mutations in relation to clinical resistance of Philadelphia-chromosome positive leukemia to STI-571: a prospective study. Lancet 2002;359: ) Hochhaus A, Kreil S, Corbin AS, et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy. Leukemia 2002;16: ) Roche-Lestienne C, Soenen-Cornu V, Gradel-Duflos N, et al. Several types of mutations of the Abl gene can be found in chronic myeloid leukemia patients resistant to STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment. Blood 2002;100: ) Shah NP, Nicoll JM, Nagar B, et al. Multiple BCR- ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell 2002;2: ) Branford S, Rudzki Z, Walsh S, et al. Detection of BCR-ABL mutaitons in patients with CML treated with imatinib is virtually always accompanied by clinical resistance, and mutations in the ATP phosphate-binding loop (P-loop) are associated with a poor prognosis. Blood 2003;102: ) Schindler T, Bornmann W, Pellicena P, Miller WT, Clarkson B, Kuriyan J. Structural mechanism for STI-571 inhibition of Abelson tyrosine kinase. Sci ence 2000;289: ) Nagar B, Hantschel O, Young MA, et al. Structural basis of the autoinhibition of c-abl tyrosine kinase. Cell 2003;112: ) Gambacorti-Passerini CB, Gunby RH, Piazza R, Galietta A, Rostagno R, Scapozza L. Molecular mechanisms of resistance to imatinib in Philadelphia-chromosome-positive leukaemias. Lancet Oncol 2003;4: ) Azam M, Latek RR, Daley GQ. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/Imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell 2003;112: ) Cobin AS, La Rosee P, Stoffergen EP, Druker BJ, Deininger MW. Several Bcr-Abl kinase domain mutants associated with imatinib mesylate resistance remain sensitive to imatinib. Blood 2003;101: ) Shannon KM. Resistance in the land of molecular cancer therapeutics. Cancer Cell 2002;2: ) Kreuzer KA, le Coutre P, Landt O, et al. Preexistence and evolution of imatinib mesylate-resistant clones in chronic myelogenous leukemia detected by a PNA-based PCR clamping technique. Ann Hematol 2003;82: ) Marktel S, Marin D, Foot N, et al. Chronic myeloid leukemia in chronic phase responding to imatinib: the occurrence of additional abnormalities predicts disease progression. Haematologica 2003;88:260-7.