생약외티로시나제억제효과 519 COOH Melanin potymer tyrosinase 가활성화되는것으로이해되고있다.*** 이러 한 M SH 에외한조절기작이외에도 tyrosinase 의생산 단계에서의조절작용이델라닌색소생성에영향을미친 DOPA Tyrosinase DOPA

Size: px

Start display at page:

Download "생약외티로시나제억제효과 519 COOH Melanin potymer tyrosinase 가활성화되는것으로이해되고있다.*** 이러 한 M SH 에외한조절기작이외에도 tyrosinase 의생산 단계에서의조절작용이델라닌색소생성에영향을미친 DOPA Tyrosinase DOPA"

재셩 미
6 years ago
Views:

1 약학회지제 41 권제 4 호 518~523(1997) Yakhak Hoeji Vol. 41. No. 4 수종생약의티로시나제억제효과 박정일 * 신영근 신언경 백선경 * 이승기 정명희 ** 박영인 ** 서울대학교약학대학, 고려대학교생명공학원. 서울대학교의과대학 (Received Jun e 5, 1997) Tyrosinase Inhibition Activity of Some Herbal Drugs Jeong Hill Park*, Young Geun Shin, Un Kyung Shin, Sun Kyung Baek* Seung Ki Lee. Myung Hee Chung** and Young In Park** College of Pharmacy, Seoul National University, Seoul *Graduate School of Biotechnology, Korea University, Seoul **College of Medicine, Seoul National University, Seoul , Korea Abstract~ T o isolate biologically active compounds which exhibit tyrosinase inhibition activity and ultimately express skin whitening effect, 14 oriental herbal drugs were screened in terms of tyrosinase in hibition. For this purpose, in vitro enzyme assay system for tyrosinase, so called Pomerantz method with some modifications has been established. Crude methanolic extracts from 14 herbal drugs were made and examined for their inhibitory activity against tyrosinase. Those extracts from Cnidii Rhizoma, Arecae Semen, Caryophylli Flos. and Ephedrae Herba showed strong inhibitory activities on mushroom tyrosinase. Therefore, crude methanolic extracts from those 4 herbal drugs were further fractionated using ether, butanol and water, respectively. The ether and n-butanol extracts from Arecae Semen and the n- butanol and water extracts from Caryophylli Flos, respectively, showed relatively strong tyrosinase in hibitory activity compared to arbutin. Keywords Whitening effect, tyrosinase inhibition, herbal drugs. 경제개발에의한지구환경의지속적파괴는많온문제들을표면화하고있는데그중에서도화석원료와냉매가스외다량사용에따른대기권외오존층파괴는날로심화되어심각한수준에이르고있다. 특히오존층외파괴는지상에도달하는자외선외조사량을증가시키는결과를유발하는데자외선은퍼부반점. 기미, 주근깨등피부외같번또는흑화현상을일으킬뿐만아니라퍼부암의발생원인이되므로커다란사회문제가되고있다. 이러한측면에서자외선에대한저항기작으로인체에서생산되는델라닌색소에관한연구가활발히진행되고있다.** 본논문에관한문의는이저자에게로 ( 전화 ) ( 팩스 ) ( 전화 ) { 팩스 ) 피부같변현상은델라닌합성세포인 melanocyte 에 서델라닌색소의과잉생산에따른델라닌색소의이상적피부침착에주로기인된다.» 델라닌색소는 tyrosinase(ec ) 에외해 L-tyrosine 이산화 되는과정에의해그생함성이시작되며일단반응이개 시되면매우빠르게진행된다. 즉. Fig. 1 에나타낸 것처럼 tyrosinase 는첫단계로 tyrosine 을 hydroxy- lation 시켜 3.4-dihydroxyphenylalanine(DOPA) 을 합성하고이어서 2 단계에서 4-(2-carboxy-2-aminoe- thyl)~l,2 -benzoquinone(dopaquinone) 으로산화시 키며 indole-5,6 -quinone 외합성단계를거쳐델라닌 색소가합성되게된다. 델라닌색소는 tyrosinase 에의 해 tyrosine 으로부터생산된여러종류의중간체둘이 모여형성된복합체의형태로이루어져있지만이둘이 어떻게델라닌색소의구성성분이되는지에대해서는 518

2 생약외티로시나제억제효과 519 COOH Melanin potymer tyrosinase 가활성화되는것으로이해되고있다.*** 이러 한 M SH 에외한조절기작이외에도 tyrosinase 의생산 단계에서의조절작용이델라닌색소생성에영향을미친 DOPA Tyrosinase DOPA quinone COO" Le 니 COdopachrome Indole-5,6-q 니 inoe Indole blocking Indole conversion 5,6-dihydroxylndole Dopachrome conversion Fig. 1 B io s y n t h e t ic p a t h w a y o f m e la n in. COs, dopachrome D O P A :3.4 -d ih y d r o x y in d o le p h e n y la la n in e COO' D o p a q u in o n e ' 4 - ( 2 - c a r b o x y a m in o e th y l) b e n z o q u in o n e D o p a c h r o m e 2 -c a r b o x y l-2.3 -d ih y d r o in d o le q u in o n e 현재까지정확한기전이알려져있지않다. 이와같은 일련의델라닌색소외생합성과정에서핵심인처옴두 단계의반응을촉매하는 tyrosinase 는생합성과정상외 주요효소로서피부같변파밀접한연관이있다. Tyrosinase 는 melanosome 의막에결합되어있는 6 6 kda 의당단백질 * 인데 melanocyte stimulating hormone(msh) 에의해활성화된다고알려져있다.'" Mouse melanoma 세포를이용한연구결과에외하면 세포내에는활성화되어있지않은 tyrosinase 가다량존 재하는데이들이 M SH 에의해활성화되며이는 M SH 에의한 adenylate cyclase 의활성변화로설명되고있 다. 즉. 아직까지그정체가밝혀지지는않았지만 AMP- dependent protein kinase 로간주되는효소에의해 다는것이밝혀졌다. 실제로 post transcriptional regulation에의해 3가지종류외 tyrosinase 이성체가만들어지는데생성되는 tyrosinase m RN A 양과델라닌색소의생산량사이에비례관계가없옴이증명되었다. 본연구에서는버섯의티로시나제를이용하였는데, 버섯의티로시나제는사람의것과서로유사한이화학적성질을갖고있으며동일한저해제에의하여활성이억제되는것으로알려져있다. Tyrosinase의효소활성을억제하는저해제의개발은상업성과 m elanization 기작의이해라는차원에서연구되고있다. 우선 m elanization 과정을이해하고자하는측면에서외연구는피부암외발생기작과연관지어져왔는데이는괴부암의원인중하나가 tyrosinase외효소활성에관여하는생체내 glutathione 의감소로밝혀진이후더욱활발해졌다 / * ^ Glutathione은 tyrosinase가함유하고있는구리이온과결합하여효소의활성을억제하는것으로알려져있는물질로서효소활성저해제가피부암의발생과관여되어있옴을보여주는에가되고있다. 또한, 최근의생활수준향상에따라피부미용에대한관심이고조되고있는데특히단순히도포하고채색하는화장품으로부터피부에직접작용하여피부에번화률주는화장품, 즉화장품외의약품화가이루어지고있다. 그중에서도레저및스포츠등야외활동의증가에따른과다한자외선조사에기인한피부외같번현상을방지하려는목적으로자외선차단제와병용하여미백물질을사용하는추세이다. 이러한관점에서미백효과를가지는화장품은급격히그중요성이증대되고있다. 이제까지피부미백의목적으로사용되어왔거나, 피부미백작용이있다고알려진생약으로서는월글엽 (Vflcci'nMwj wi'fi's) 의추출성분인 arbutin, kojic mold 추출물인 kojic acid등이있는데이돌은모두 tyrosinase외효소활성의억제효과가검증되었으며이중 arbutin은이미상업화되어시판되고있다 * "" 이외에도 lactic acid는 tyrosinase 효소외전사과정을억제함으로써효소활성을억제하고 ascorbic acid, 알로에신과그유도체들의활성억제효과도관찰되었다. 뿐만아니라최근천연성분에대한선호도가높아짐에따라다양한종류의식물로부터 tyrosinase 효소활성억제작용을나타내는물 Vol. 41, No. 4, 1997

3 박 정 일 신 영 근 신언경 백선경 이승기 정명희 박영인 520 질들을 분리하여 이용하고자 하는 시도가 많이 보고되 H O H 외 앙을 liquid scintillation counter(pac- 고 있다.^^^* kard, model No. 1600)로 즉정하였다. 본 연구에서는 tyrosinase 외 효소활성을 저해하는 실험결과 및 고찰 기능이 있는 미백물질을 확인하고 분러하고자 미백효과 가 기대되는 14종의 생약둘을 대상으로 tyrosinase 저 해 활성을 검색하고, 활성이 있는 생약으로부터 활성 물 마황(Ep/iedme Herba), 천궁(On'ti/'i Rhizoym), 번랑 자C A re cfl Semen). 정향(C flry o p /iy / Z f Flos), 인삼( G i'«- 질을 추적하고자 하였다. seng Radix), 계피 (D'rniflmomKTorto), 시호(Bwp/euW Radix), 목향(Sflwsswrefle Radix), 방풍(LerfeiJOMr/e/Zfle 실험방법 Radix), t] 고초{Prunel}ae Spica), 황금(Scutellariae Ra- 생약의 추출 - 검색에 사용한 14종외 생약은 경동시 장에서 구입하였다. 이들 생약을 세절하여 10 0 g 씩을 dix), 오매(AlMme Fructus), 강 활 묘 e//faie koreana Radix), 익 지 인 Frutus) 등 14중의 검색대상 m ethanok M eoh) 300 m /로 50"C에서 30분간 추출 생약외 메탄올 주즐물에 대하여 한 후 여과하였다. 같은 방법으로 2 회 더 추출한 후 여 성에 대한 억제 효과를 검색하였다. 그 결과 T a b l e I 에 과액을 합하여 감압 농측한 다옴 tyrosinase 효소 억제 활성외 검색에 사용하였다. 나타난 바와 같이 익지인. 인삼, 하고초는 전혀 활성이 없었으며 황금. 시호, 목향. 강활. 오매. 방풍, 계피는 매 미백 활성 생약의 분획 - 14종 생약의 메탄을 추출물 우 미약한 활성을 보였다. 반면에 천궁. 번랑자. 정향과 에 대한 활성을 검색한 후 현저한 활성을 보이는 4 가지 마황은 상당히 강한 t y r o s i n a s e 효소 억제 활성을 보였 생약, 즉. 천궁, 마황, 정향 및 번랑자를 용매 추출하여 는데. 룩히 번랑자와 정향의 메탄올 추출물은 단일 물질 로의 정제가 되지 않은 조추출물 상태임에도 불구하고 3가지 분 획 ' 로 나누었다. 4종의 생약들의 메탄올 추출 물을 물 200 m /에 현탁시 킨 후 에텔 200 m l 씩으로 3회 추출하여 에텔 가용 분획을 얻고, 남은 수층을 계속하여 ty r o s in a s e 외 동일 농도에서 기지 물질로 사용한 a r b u tin 효소 활 과 비교할 만한 정도의 효소활성 억제 효과를 보였다. 수포화 n-butanol(n-buoh) 200 m l 썩으로 3회 추출 현저히 높은 효소 억제 활성을 나타낸 천궁. 번랑자. 하여 부탄올 가용 분획을 얻었다. 남은 수층을 감압 농 정향 및 마황에 대하여 에텔. 부탄올로 순차적으로 추 측하여 물 가용 분획을 얻었다. Tyrosinase 억제 활성 측정 - Pomerantz 가 사용한 출하여 3가지 분획을 얻고 각각의 활성을 검색하였다. charcoal adsorption 방범^*을 변형하여 이용하였다. 그 결과 번랑자의 에텔 분획과 부탄올 분획. 정향외 부 탄을 분획과 물 분획 이 강한 효소활성 억제 효과를 나 L-3. 5-^H tyrosine (Amersham) 이 버섯 유래의 tyrosinase(sigma )에 의하여 DOPA(L-Dihydroxyindole phosphate. Sigma) 로 변형되는 과정에서 1 iig/m l. 10 lag/m, ng/m/ 농도의 생약 추출물을 )완 를 취하여, 생산된 _ 리하였다. 분리된 상징액중 A r b u tin n4 x--^ 4 징액을 0.1 M citric acid 로 씻어낸 Dowex 50 W resin(sigma) 250 J7와 섞은 푸 5000 rpm 에서 원심분 IC so O n g /m /) _ rp m 에서 원심분리하여 상징액만을 취하였다. 상 H erb a l d ru gs E phedrae H erba C n id ii R hizom a A reca Sem en C ary o p h y lli Flos G in sen g R adix C in n a m o m i C ortex B u pleu ri R adix S au ssu reae R adix L edeb ou riellae R adix P ru n cllae Spica S cu tellariae R adix M u m e Fru ctu s A n g e l l i c a e korean ae R adix A lp in iae Frutu s ^ 간 반응시켰다. 0.1 M citric acid 에 50 m g /m /의 농도 로 현탁시킨 charcoal을 동량 가하여 잘 섞어준 후 e x tra c ts ^ 로하여 37 C에서 30 분 m e t h a n o li c I 각각 흔합하고 0.1 M sodium phosphate(ph 층용액으로 최종 용적을 100 of L 추출물을 가하였을 때의 반응 억제를 확인하였다. >ici/m/의 tyrosine, 100 u n it/m /의 tyrosinase 와 1 e ffe c ts "H O H 가 생산되는 원리를 이용하여 이 반응액에 생약 T a b le I I n h ib it o r y fr o m 1 4 h e r b a l d r u g s o n t y r o s i n a s e m e a n s t h a t s u b s t a n c e h a s n o in h ib it o r y e ffe c t. J. Pharm. Soc. Korea

4 생약의티로시나제억제효과 521 T a b le II I n h ib ito r y e ffe c t s o f f r a c t io n s o f 4 h e r b a l d r u g s o n t y r o s in a s e H e r b a l D r u g F r a c t i o n I C 5o(m g/m /) E t h e r Ephedrae Herba B u O H - H 2O - E t h e r Cnidii Rhizoma B u O H 0.69 H 2O - E t h e r 0.94 Caryophylli Flos B u O h 0.19 H 2O 0.20 E t h e r Areca Semen B u O H 0.6 H 2O - * ' - m e a n t h a t s u b s t a n c e h a s n o in h ib it o r y e ffe c t. 타내었다 (Table II). 정향의경우부탄올추출물과탈 이온수추출물은 1 mg/mz 외농도에서 arbutin 과유 사한효소활성억제효과룰나타내었으며에텔추출물 은불규칙적이고낮은억제효과를보여 arbutin 보다 3 배정도외 ^HOH 를생산하였다. 따라서정향의추출 물에는효소활성억제효과가강력한물질이포함되어 었는것으로예측된다 (Fig. 2). 번랑자외경우에는에 텔분획과물분획모두에서농도의존적으로저해효과 Concentrahon (mg/ml) F ig. 3 T y r o s in a s e in h ib it o r y a c t i v it y o f Areca Semen e x t r a c t s. B L J - E a n d B L J - H r e p r e s e n t e t h e r a n d w a t e r s o lu b le fr a c t io n s o f Areca Semen ^ r e s p e c tiv e ly. E x p e r im e n t a l p r o c e d u r e is a s in F ig. 2. 틀보였으나정향보다는낮은효소확성억제효과를나타내었다 (Fig. 3). 반면에마황의에텔추출물은억제효과률나타내지않았고, 천궁의경우는전체적으로는부탄올, 에텔, 물추출물모두가억제효과를나타내기는하지만 arbutin에비하여억제효과가별로높지않은것으로평가되었다 (Fig. 4). 위외결과들로보아 tyrosinase의효소활성억제제의검색대상은정향과빈랑자의두가지로측소되었으며현재활성을보이는분획으로부터미백활성성분을단일물질로분리하는 Concentration (m g/m l) F ig. 2 T y r o s in a s e in h ib it o r y a c t iv it y o f Caryophylli Flos e x tr a c t s. JH H E. J H - B a n d J H - H r e p r e s e n t e t h e r. b u ta n o l, a n d w a t e r s o lu b le fr a c tio n s o f Caryophylli Flos, r e s p e c t iv e ly. U s in g m u s h r o o m ty r o s in a s e a s e n z y m e s o u rce, a s s a y w e r e c a r rie d o u t w ith 1 M -Ci/mL o f L - 3,5 - ^ - t y r o s i n e a s s u b s tr a te d is s o lv e d in 0.1 M s o d iu m p h o s p h a te b u ffe r (p H 6.8), a n d e a c h e x t r a c t w a s a d d e d v a r io u s c o n c e n tra tio n. T h e ^H O H fo rm a tio n w a s m e a s u r e d b y liq u id s c in t illa t io n co u n te r. Concenlralion (m g/ml) F ig. 4 T y r o s in a s e in h ib it o r y a c t iv it y o f Cnidii Rhizoma a n d Ephedrae Herba e x t r a c t s. C O E. C O B a n d C G r-h r e p r e s e n t e th e r, b u t a n o l, a n d w a t e r s o lu b le fr a c tio n s o f Cnidii Rhizoma, r e s p e c t iv e ly. M H - E r e p r e s e n t s e t h e r s o lu b le fr a c t io n o f Ephedrae Herba. E x p e r im e n t a l p r o c e d u r e is a s in F ig. 2. Vol. 41, No. 4, 1997

5 522 박정일 신영근 신언경 백선경 이승기 정명희 박영인 연구를계속진행하고있다. ( ). 5 ) M a s o n. H. S. :T h e c h e m i s t r y o f m e l a n i n. J. Biol Chem ( ). 6 ) B a u s e, E. : S t r u c t u r a l r e q u i r e m e n t o f N - g l y c o s y l a t i o n o f p r o t e i n s. Biochem. /. 209, ( ). 7 ) K a m e y a m a, K.. T a k e m u r a, T.. H a m a d a, Y.. S a k a i. C.. K o n d o h, S.. a n d N i s h i y a m a, S. :P i g m e n t p r o d u c t i o n in m u r i n e m e l a n o m a c e lls is r e g u l a t e d b y t y r o s i n a s e, t y r o s i n a s e ^ r e la t e d p r o t e i n 1 ( T R P 1 ). D O P A c h r o m e t a u t o m e r a s e ( T R P 2 ). a n d a m e l a n o g e n i c in h ib it o r. /. Invest. Dermatol ( ). 8 ) K o r n o r. A., a n d P a w e l e k, J. :A c t i v a t i o n o f m e l a n o m a t y r o s i n a s e b y a c y c li c A M P - d e p e n - d e n t p r o t e in k i n a s e i n a c e ll f r e e s y s t e m. Nature 2 6 7, ( ). 9 ) N a e y a e r t. J. M., E l l e r, M., G o r d o n. P. R.. P a r k. H. Y.. a n d G i l c h r e s t, B. A. :P i g m e n t c o n t e n t o f c u l t u r e d h u m a n m e l a n o c y t e d o e s n o t c o r r e la t e w i t h t y r o s i n a s e m e s s e a g e le v e l. J. Invest. Dermatol. 125, ( ). 10 ) C h e n. Y. M., C h a v i n, W. :M e l a n o g e n e s i s in h u 감사의말씀 이연구는과학기술처외연구비지원에외하여이루 어졌으며이에감사를드립니다. m a n m e l a n o m a s. Cancer Res. 35, ( ). 1 1 ) C R C - B A C R - A I C R i n t e r n a t i o n a l w o r k s h o p. M e l a n o g e n e s i s i t 's c h e m i s t i y a s a t h e r a p e u t i c s t r a t e g y i n m e l a n o m a. Br. }. Cancer ( ). 문 헌 1 2 ) B e n e d e t t o, J. P., O r t o n n e, J. P.. V o l u t o, C.. K h a t c h d o u r i a n, C.. P r o t a, G., a n d T h i v o le t. J. : R o l e o f t h i o l c o m p o u n d s i n m a m m a l i a n m e 1 ) P a v e l, S. :D y n a m i c s o f m e l a n o g e n e s i s i n t e r m e d i a t e. J. Invest. Dermatol S ( ). 2) G ilc h e r s t, B. A.. Z h a i. S.. E U e r.m. S.. Y a r o s h, D. B.. a n d Y a a, r. M. ' T r e a t m e n t o f h u m a n m e la n o c y t e s a n d S 9 1 m e la n o m a c e lls w i t h t h e D N A r e p a i r e n z y m e T 4 e n d o n u c l e a s e V e n h a n c e s m e la n o g e n e s is a f t e r u lt r a v io le t ir r a d ia t io n. J. Invest. Dermatol ( ). 3 ) K a u f m a n, R. J. :V e c t o r s u s e d f o r e x p r e s s i o n in m a r. i i n a l i a n c e l l s. Meth. Enzymol ( ). 4 ) R o m s d a h l, M. M.. a n d O 'N e i l l, P. A. ' T y r o s i n a s e i n h i b i t i o n s t u d i e s i n h u m a n m a l i g n e n t l a n i n p i g m e n t a t i o n. II. g l u t a t h i o n e a n d r e l a t e d e n z y m a t i c a c t i v i t i e s. I Invest. Dermatol ( ). 1 3 ) P r o t a. G. ' R e g u l a t i o n m e c h a n i s m o f m e l a n o g e n e s i s :b e y o n d t h e t y r o s i n a s e c o n c e p t. J. Invest. Dermatol S ( ). 1 4 ) M a e d a, K.. a n d F u k u d a, M. :In vitro e f f e c t i v e n e s s o f s e v e r a l w h i t e n i n g c o s m e t ic c o m p o n e n t s i n h u m a n m e l a n o c y t e. J. Soc. Cosmet. Chem. 42, ( ). 1 5 ) S u z u k i. T.. a n d I m o k a w a, G. :D e p i g m e n t i n g c o s m e t ic s a n d t h e f u t u r e. Nippon Koshohin Kagakkaishi ( ). m e l a n o m a g r o w n i n v i t r o. Pigment Cell 1. I l l 1 6 ) M i s h i m a, Y.. K o n d o h, H., a n d H a t a e, S. :O v e r v i e w fo r d e v e l o p m e n t o f f u t u r e i n n o v a t i v e s k i n w h i t e n i n g a g e n t s. Fragrance J ( ). 1 7 ) A n d o. S.. A n d o. O.. S u e m o t o. Y.. a n d M i s h i m a. Y. :T y r o s i n a s e g e n e t r a n s c r i p t i o n a n d i t s c o n t r o l b y m e l a n o g e n i c i n h i b i t o r s. / Invest. Dermatol S ( ). 18 ) Y a g i. A.. K a n b a r a, T.. a n d M o r in o b u, N. :I n h i b i t i o n o f m u s h r o o m - t y r o s i n a s e b y Aloe e x t r a c t. Planta Medica ( ). 1 9 ) H id e r, R. C., a n d L e r c h. K. T h e in h ib it io n o f t y r o s i n a s e b y p y r id in o n e s. Biochem. / ( ). 20 ) S h i r o t a. S., M i y a z a k i. K., A i y a m a, R., I c h io k a, M.. a n d Y o k o k u r a. T. :T y r o s i n a s e i n h i b i t o r s f r o m c r u d e D r u g s. Biol Pharm. Biochem, ( ). 2 1 ) M a e d a. K.. a n d F u k u d a. M. ' In vitro e f f e c t i v e n e s s o f s e v e r a l w h i t e n i n g c o s m e t ic c o m p o n e n t s in h u m a n m e l a n o c y t e s. I Soc. Cosmet. Chem ( ). 2 2 ) M o r i t a, H.. K a y a s h i t a, T.. T a k e y a, K., a n d I Pharm. Soc. Korea

6 생약의티로시나제억제효과 523 I t o k a w a, H. : C y c l i c p e p t i d e s f r o m h i g h e r p l a n t s. C o n f o r m a t i o n a l a n a y s i s o f t y r o s i n a s e i n h i b i t o r y c y c li c p e n t a - p e p t i d e, p s e u d o s t e l l a r i n A. f r o m Pseudostellaria heterophylla. Tetrahedron 50, ( ). 2 3 ) M o r it a, H.. K a y a s h i t a, T., K o b a t a, H.. G o n d a, t i d e s f r o m h i g h e r p l a n t s. 7. P s e u d o s t e l l a r i n D - F. n e w t y r o s i n a s e i n h i b i t o r y c y c l i c p e p t i d e s f r o m Pseudostellaria heterophylla. Tetrahedron 50, ( ). 2 4 ) P o m e r a n t z, S. H. C h a r c o a l a d s o r p t i o n m e t h o d. Science ( ). A.. T a k e y a. K.. a n d I t o k a w a, H. :C y c l i c p e p Vol. 41, No. 4, 1997

(120629)_세포배양_불활화_인플루엔자_백신_평가_가이드라인.hwp

(120629)_세포배양_불활화_인플루엔자_백신_평가_가이드라인.hwp 행정간행물등록번호 11-1470000-002739-14 세포배양불활화인플루엔자백신평가가이드라인 Guideline on the Cell Culture Inactivated Influenza Vaccines for Human Use 2012. 6. 바이오생약국바이오생약심사부 세포배양불활화인플루엔자백신평가가이드라인 Guideline on the Cell Culture