CERTIFICAT DI AALISI - 테스트인증서 LTT/LT ARTICL/ARTICLE C.V (limit 5 %) data/date H8459 MG01F- HB8 < 5 % 13/06/08 Si certifica che il lotto sopra indicato

Size: px

Start display at page:

Download "CERTIFICAT DI AALISI - 테스트인증서 LTT/LT ARTICL/ARTICLE C.V (limit 5 %) data/date H8459 MG01F- HB8 < 5 % 13/06/08 Si certifica che il lotto sopra indicato"

현수 우
6 years ago
Views:

1 방법 14 방법 14 은제 2 차항체의표면에묶여있는비오틴분자에대한 Streptavidin 의민감성을활용하는것이다. 방법 14 는현재품질관리실험에쓰인다. 코팅 1. 5 µ g/ml 의토끼 Anti-HIgM 100µ l/well 0.1M 탄산염버퍼 ph 9.6 에투여하고 4 C 에서밤새배양한다 M PBS ph 7.2 으로 4 번세척한다. 3. 남아있는활성부위를저해하기위해 BSA 1% 150 µ l/well 를 0.1M PBS ph 7.2 에투여하고 4 C 에밤새배양한다. 4. 용액을따라내고, 플레이트를사용할때까지 4 C 에보관한다. 실험 5. 비오틴화된염소항토끼 IgG (concentration from 62 to 0.7 ng/ml) 100 µ l/well 를투여하고실내온도에 1 시간동안배양한다. 6. PBS ph % Tweenn 20 으로 4 번세척한다 ng/ml of Streptavidin-PD 100 µ l/well 를투여하고실내온도에 1 시간동안배양한다. 8. PBS ph % Tweenn 20 으로 4 번세척한다. 9. TMB 100 µ l/well 를투여한다 초후에 H2S4 1 를추가하여반응을멈춘다 nm 에서결과를측정한다. 방법 Biomat HB Biomat MB comp. HB ,7 1, 비오틴화된항체의 ng/ml 21

2 CERTIFICAT DI AALISI - 테스트인증서 LTT/LT ARTICL/ARTICLE C.V (limit 5 %) data/date H8459 MG01F- HB8 < 5 % 13/06/08 Si certifica che il lotto sopra indicato è stato prodotto secondo le procedure operative in accordo con la norma UI E IS 9001:2000 Questo prodotto è stato analizzato ed è risultato conforme alle specifiche stabilite. 바이오맷은이부분이적용될수있는표준실행절차인현 IS 9001:2000 규제에따라서제조되었음을증명한다.. 이제품은실험되었고, 모든확립되어있는규제를통과하였다. Metodo di analisi Soluzione di coating: 2.5 µ g/ml di Rabbit IgG in 0.1M Tampone Carbonato ph 9.6. Coniugato : Goat Anti-IgG-HRP Method of analysis Coating solution: 2.5 µ g/ml of Rabbit IgG in 0.1 M Carbonate Buffer ph 9.6. Conjugate: Goat Anti-IgG-HRP Controllo finale Il prodotto finito è stato ispezionato ed approvato per le seguenti caratteristiche fisiche: 최종관리 이제품은실험되었고, 아래에기술된물질적특성에대해승인받았다. Test esame visivo aspetto generale imballaggio Risultato approvato approvato approvato Test visual examination general appearance packaging Result approved approved approved Dr. Maurizia Pettenati 품질관리매니저 22

3 기술노트. 11 무바인딩표면 단백질이 well 에결합하는것을막는표면. well 표면에일어날수있는반응에의한분자의활동 ( 예 : 효소 ) 의변화를피할필요가있는처리를말한다. Two types of tests were made for checking the properties of our o Binding capacity surface : a. o binding capacity against IgG (met. 14) 1. coating: dispense 100µ l/well of Rabbit Anti-HIgM (concentration of 25 µ g/ml in Carbonate Buffer ph 9.6) and incubate 24 h at 4 C washing with PBS ph blocking: dispense 150 µ l/well of BSA 1% in PBS ph 7.2 and incubate overnight at 4 C. 4. wash 4 times with 0.1M PBS ph %Tweenn dispense 100 µ l/well of Biotinylated Goat Anti- Rabbit IgG (concentration from to µ g/ml) and incubate 1 hr at room temperature 6. wash 4 times with 0.1M PBS ph %Tweenn dispense 100 µ l/well of Streptavidin-PD (concentration 0.16 µ g/ml) and incubate 1 hr at room temperature 8. wash 4 times with 0.1M PBS ph %Tweenn dispense 100 µ l/well of TMB 10 after 30' stop the reaction with H2S4 1 (100 µ l/well) 11. reading is made at 450 nm after 5' results.d. values binding Medium binding High binding HB 8 RT C 60 n.a C 61 n.a The test was performed after 7 days in the above conditions b. o binding capacity against Albumin (met. 25) 1. coating: dispense 100µ l/well of a mixture of 20 ng/ml Biotinylated Albumin diluted in 3 µ g/ml of BSA in 0.1 M PBS ph 7.2 and incubate 24 h at 4 C. 2. wash 4 times with 0.1M PBS ph %Tweenn dispense 100 µ l/well of 0.1 µ g/ml Streptavidin-PD and incubate 30' at room temperature 4. wash 4 times with 0.1M PBS ph %Tweenn dispense 100 µ l/well of TMB 6. after 10' stop the reaction with H2S4 1 (100 µ l/well) 7. reading is made at 450 nm results binding Medium binding.d. values

4 23

5 아민화된표면 제 1차또는제2차아미노그룹공유결합이이루어진표면은잘알려진 homo-heterobifunctional 링커 ( 예 : -Hydroxysuccinimide (HS) 나 Succinimidyl 4-(-maleidomethyl) cyclohexane-1- carboxylate (SMCC)) 를매개로한아미노, 카르복실, 티올그룹같은반응적인부분을포함한화합물의공유결합고정을만들어내기위해기여한다. 이런종류의고정은표면에의, 분자의물리적흡착작용과연관된일부의한계를극복할있다 : 약하게결합되어있는분자의고정이나, 물리적흡착에의하지않은, 적은펩티드 (M.W ), 약, 독소나호르몬. 자신의특정한부위의완전성과접근성을보장하기위한분자의지향된고정은 Fab-SH 항체조각이나 streptavidin, polysaccharides나핵산같은분자의우연한물리적흡착에의해일어나는, 이런부위의억제의위험을피하게한다. 물리적흡착의안정성과비교했을때, 자연발생적인흡수의위험이감소되었기때문에보관안정성이증가하다. 1차아민 - biotinylated HS의공유결합 ug/ml of HS-B 플레이트들은실험되고증명된다. 획일성 재생성 아미노그룹활동 24

6 기술노트. 6 아민화된표면 준비의소개와면역감시분석에의아민화된표면이용. 사용방법 생물학적분자들을아미노그룹과묶기위해다양한방법이주기적으로사용되었다. 사용을위한특정한방법은의도된적용에대한지식을요구한다. 일반적인가이드라인으로, 표면상의아미노그룹과합쳐질분자의기능적인그룹의상호작용은 homo 와 heterofunctional 가교제에의해매개된공유결합에기초한다. 특별히, - hydroxysuccinimide 을첨가하든, 하지않든 Ethyldiethylaminopropylcarbodiimide (EDC) 은카르복실그룹의분자와표면의아미노그룹간의강한가교제이다. 만약결합될생체분자가리신아미노그룹을포함한다면, 가장간단한방법은, Sodium Cyanoborohydride. 의감소로인한, 안정된아민결합인 Glutaraldehyde 를매개로하여결합시키는것이다. 이런목적을위한다른가교제는 Dimethylpimelidate 와 Dissucinimidyl suberate 이다.Fab-SH 와같이티롤그룹을포함한생체분자나끝부분에 cystein 이있는펩티드는아미노그룹과반응하기위해 Succinimidyl 4-(- maleimidomethyl)cycloexane-1-carboxylate (SMCC) 같은가교제를포함한많은수의 maleimido 그룹을활용할수있다. 바이오맷 H 2 표면의화학적물리적분자배열도 PS surface H 2 반응법의예 : HS 의분리를통해바이오맷 H 2 와공유결합된임의적 HS 에스테르화화합물 ( R) PS surface H 2 + C R PS surface H C R + H

7 25

8 아래는바이오맷 H2 표면과반응그룹과의공유결합코팅에사용될가교제의예이다. A. Disuccinimidyl suberate (DSS). 이대칭의 ( 동형두기능의 ) 링커는 1 차또는 2 차아미노그룹을포함하는화합물을연결할수있고, 그러므로펩티드, 단백질, 글리코단백질, 리포단밸질의공유결합고정에사용될수있다. 반응 A 표면 DSS H 2 + C 2 H + H 2 펩티드, 단백질, 글리코단백질, 리포단백질 C H H 펩티드단백질 CH H 2 CH 2 C H 글리코단백질, 리포단백질 B. Sulfosuccinimidyl maleimidomethyl cyclohexane carboxylate (SMCC). 이이형 - 두기능링커는 SH- 를포함한화합물과다른화합물을연결할수있다. 이것은특별히, Fab-SH 항원조각이나영구적으로시스테인화된항원펩티드의공유결합고정에쓰이고, 그때문에이화합물의활성화된끝부분을을액체상태에노출시킨다. 반응 B 표면 SMCC H + 2 C + H S Fab Cyspeptide H 표면 H H C S Fab Cyspeptide

9 26

10 C. -Hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-HS) 또는 1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide Hydrochloride(EDC) 와합쳐진 -Hydroxysuccinimide (HS). Sulfo-HS 와합쳐진 EDC 링커는카르복실그룹을매개로해서작은펩티드들 (M.W. around 1000) 을 H 활성화된스트립표면에합칠수있다.r c 반응 C H + RCH EDC RC PS 표면 H + 2 RC PS 표면 HCR peptide 2. Sulfo HS (or HS) 3. EDC 4. intermediate active compound resulting from the reaction 5. biomat H 2 surface 6. peptide covalently immobilised on biomat H 2 surface Codes and suppliers of linkers product supplier code DSS PIERCE Sulfo-SMCC PIERCE Sulfo-HS PIERCE EDC PIERCE

11 기술노트. 12 아민화된 & 카르복실화된표면 아미노와카르복실그룹의표면사용을위한일반적방법 바이오맷은 biomat H/ H 2 와 CH 같은화학그룹을소개하는. 변형된폴리스티렌표면을개발했다. 이그룹은플라스틱표면에화합물의공유결합을일으킬수있다. 폴리스티렌의시각적특성은바뀌지않았고, 이그룹은변형된표면을진단적인분석을위한강력한수단으로사용할수있게한다. 이표면들은아래의가능성을제공한다. 물리적흡착에의해전혀결합하지않거나, 약하게결합하는작은분자의공유결합고정. 고체상태에서명확한방법으로분자의고정을지향. 아래는사용자가자신만의생물적으로구체적인분석을개발할수있는지침이될만한적용의예시들이다. 1. HS- 활성화화합물의결합 바이오맷 H/H 2 표면의가장단순하고쉬운적용은 -hydroxysuccinimide 유도체 (HS) 에의한에스테르화에의해활성화된분자결합이다. 우리의실험에서는비오틴의 n- Hydroxysuccinimide 활성에스테르가즉각그탄소그룹을매개로해서그림 1 에보여지는것처럼표면에있는아미노그룹과결합한다. 그림 1 H C H HC CH H 2 C S C ( ) 4 C H + H 2 바이오맷 H 2 표면 HS Biotin C H H HC CH H H C 2 S C ( ) 4 C H + H HS Biotin coupled to 바이오맷 H 와결합된비오틴, 표면 28

12 시약과완충제준비 재료 Solid phase: Biomat plates MT02F-AM1 (primary amino groups) MT02F-AM2 (secondary amino groups) MT01F-HB (high binding capacity) ε-caproylamido-biotin-hydroxysuccinimide ester (HS- biotin) BI-SPA Cat o. B Dimetilformamide (DMF) Fluka Cat o Tween 20 Merck Cat o Streptavidin BI-SPA Cat. o. S Streptavidin-peroxidase conjugate BI-SPA Cat. o. SB01-61 BSA Intergen Cat. o TMB peroxidase substrate Kirkegard & Perry Cat. o HS-Biotin stock solution HS-biotin 6mg DMF 2 ml HS-Biotin solution 150µ g/ml HS Biotin stock solution 500µ l PBS 0,1M ph 7,2-0,15% Tween 20..to 10ml HS-Biotin solution 100µ g/ml HS Biotin stock solution 333µ l PBS 0,1M ph 7,2-0,15% Tween 20..to 10ml HS-Biotin solution 50µ g/ml HS Biotin stock solution 167µ l PBS 0,1M ph 7,2-0,15% Tween 20..to 10ml HS-Biotin solution 10µ g/ml HS Biotin stock solution 33µ l PBS 0,1M ph 7,2-0,15% Tween 20..to 10ml Streptavidin-mix Streptavidin 50µ g Streptavidin-peroxidase 1µ g PBS-BSA 1% 10ml 실험 µ l HS- 비오틴용액 µ g/ml 와 0 µ g/ml 0,1M PBS-Tween 20 0,15% ph 7,2 를 well 에추가하라 (1 차아민과 HB 와함께 ). 증발을막기위해접착테이프로 well 을봉인한다. 2. 실내온도에밤새도록배양한다. 3. well 을비우고 0,1M PBS-Tween 20 0,05%, ph 7,2 으로 4 번세척한다. 4. streptavidin 믹스 100µ l 을각 well 에첨가하고, 실내온도에 30 분동안배양한다. 5. well 을비우고 0,1M PBS-Tween 20 0,05%, ph 7,2 으로 4 번세척한다. 6. TMB substrate 용액을 100 µ l /well 첨가하고실내온도로 10 분간배양한다. 29

13 7. 황산 1 을 100µ l 추가함으로써, 기질반응을멈추고, 시각적농도값을 450nm 에서측정한다. 결과 이결과는 ( 그림. 2 를보라.) well 에첨가된 HS- 비오틴농도와바이오맷의 H 2 표면에결합한비오틴의양사이에분명한상관관계가있음을보여준다. 반면에, 1 차아미노그룹이표면에융합되어있지않으면어떤비오틴도플레이트에결합되지않는다. 그것은비오틴과효소결합체사이에서수동적활용이일어나지않았음을보여준다. 그러므로우리는 HS- 비오틴이바이오맷 H2 표면에보여진아미노그룹 에공유결합을했다고결론내렸다. 그림 Biomat-AM1 Biomat-HB ug/ml of biotinylated HS 30

anti-mouse IgG 등 ) 으로판매되고있으며, 자신이이용하는일차항체의급 (isotype) 에맞는효소결합항 체를구입하여사용하면된다. 3) Sandwich ELISA ( 샌드위치정량법 ); 항원의정량, 정성에이용항원이 plate에잘결합하도록, 항원에대한항체를먼저플레

anti-mouse IgG 등 ) 으로판매되고있으며, 자신이이용하는일차항체의급 (isotype) 에맞는효소결합항 체를구입하여사용하면된다. 3) Sandwich ELISA ( 샌드위치정량법 ); 항원의정량, 정성에이용항원이 plate에잘결합하도록, 항원에대한항체를먼저플레 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay) ( 주 ) 다인바이오연구소 효소면역정량법 (ELISA) 는오늘날가장널리이용되는면역정량법이다. 이방법은 Ag-Ab interaction을이용하여 Ag or Ab를정성, 정량할수있는감도가매우우수한실험법 ( 수 ng/ml) 이다. 이방법은항체에효소를결합시켜항원-항체반응을확인하는방법으로, 그방법이간단하고비용이많이들지않으며다량분석이가능하여현재가장널리쓰이고있는항원-항체분석법의하나가되고있다.