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민호 구
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1 동의생리병리학회지제 22 권 2 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(2): , 2008 寒多熱少湯의항 Allergy 및항염증효과 김재원 신상우 1 이영선 2 이금홍 박종현 * 대구한의대학교한의과대학병리학교실, 1 : 부산대학교한의학전문대학원, 2 : 성덕대학전통건강자원개발과 Anti-Allergic Effect of Handayeolso-Tang Jae Won Kim, Sang Woo Shin 1, Young Sun Lee 2, Geum Hong Lee, Jong Hyun Park* Department Pathology, College of Oriental Medicine, DeaguHaany University, 1:Pusan National University, 2:College of Sung Duks Handayeolso-Tang(HDT) has been used as traditional medicine for the treatment of Taeumin TaeYang-Hanguel. The present study was conducted to investigate the anti-allergic activity of Handayeolso-Tang(HDT). We investigated the anti-allergic effects of HDT in RBL-2H3 basophilic leukemia cells by compound48/80, a mast cell degranulator and compound 48/80 induced anaphylactic shock in mice. HDT significantly inhibited β-hexosaminidase and histamine release from compound 48/80 stimulated RBL-2H3 cells. In addition, HDT effectively inhibited anaphylactic shock in mice by 45% at a dose 120 mg/mouse versus PBS treated control after the I.p injection(8 mg/kg) of compound 48/80. The in vitro anti-inflammatory activities of HDT in LPS-stimulated RAW cells were investigated. HDT inhibited NO production in LPS-stimulated RAW cells and effectively dowregulated the expression of inos mrna and inos protein expression in LPS -stimulated RAW cells. These result provide evidences that HDT may be beneficial in the treatment of allergic inflammtory disease. Key words : Handayeolso-Tang, compound48/80, β-hexosaminidase, histamine release, nitric oxide 서론 알레르기성비염은최근환경오염과공해의증가등에따라세계적으로점차증가추세에있으며, 알레르기성비염이아토피질환중가장흔한질환에속한다고보고되고있다 1). 알레르기비염은발작성이고반복적인噴嚔, 水樣性鼻漏, 鼻閉塞및鼻瘙痒感, 眼痒등을주요증상으로하는鼻粘膜의염증성질환으로, 화분, 집먼지, 비듬, 깃털, 음식물등의흡인성및식이성항원에의해유발되는제 Ⅰ형과민반응의일종이다 2). 서양의학적치료방법으로는원인항원에대한회피요법과약물요법이사용되고있으나아직까지도병을완치시킬수있는약제가없고, 대부분의약제가장기간사용할경우효과가떨어지는등의한계에직면해있어 3) 한의학적인치료방법이알레르기질환치료에시도되고있으며, 또한체질과의관련성을중요하게생각하는경향이높아지고있다 4). 한의학에서알레르기비염은鼻鼽, 噴嚔, 鼻涕등의범주에 * 교신저자 : 박종현, 대구시수성구상동대구한의대학교한의과대학 moguri@dhu.ac.kr, Tel : 접수 : 2008/01/23 채택 : 2008/02/14 속하는데 5), 폐가外感六淫, 특히風寒에傷하였을때발생하거나, 內鬱七情으로장부기혈에영향을미쳤을때발생한다고보고있다 6). 그동안알레르기비염에관한한의학적연구로는강등 7), 신등 8) 을비롯한많은후세방의실험적혹은임상적연구는물론, 최근에는사상체질관점에서의연구도활발히진행되어황 6) 은사상의학적치료가알레르기성비염에효과가있다고보고하였고, 고등 9) 도알레르기성비염환자의사상체질분류와치료가임상적으로효과가있다고보고하였으며, 사상처방의항알레르기작용에대한실험연구결과도보고되고있다 10-12). 寒多熱少湯은李 13) 의 東醫壽世保元 에처음으로收載되어太陰人의太陽寒厥症에사용된처방으로, 실제임상에서肺虛한상태에서風寒邪가침입하여발생되는알레르기성鼻炎에도활용되고있으나이에대한연구보고는아직없었다. 이에著者는寒多熱少湯의항알레르기효과에관한과학적인증거를제시하고자정상세포증식에미치는영향, 알레르기반응의주요세포인비만세포와상동성이높은 RBL-2H3 basophilic leukemia 세포주를이용하여알레르기반응시이들세포의탈과립지표로알려진 β-hexosaminidase 및 histamine 분비억제에미치는영향, 비면역자극제인 compound 48/80 자

2 김재원 신상우 이영선 이금홍 박종현 극에의한 anaphylatic shock에미치는영향과 RAW 대식세포주를이용하여염증반응과관련된 Nitric Oxide 생성및조절기전에미치는영향등을관찰하였다. 1. 재료 1) 검액의준비 재료및방법 실험에사용한藥材는옴니허브에서구입하여良質의것을精選하여사용하였으며, 처방은 東醫壽世保元 13) 에收載된寒多熱少湯으로서내용및 1첩분량은다음과같다. Table 1. Components of Handayeolso-tang(HDT) Oriental Crude Drug Crude Drug Scientific name Dose (g) 薏苡仁 Coicis Semen Coix Lachryma-jobi L. 12 乾栗 Castaneae Semen Castanea crenata Siebold et Zuccarini 12 萊菔子 Raphani Semen Raphanus sativus L. 8 杏仁 Armeniacae Semen Prunus armeniaca var. ansu Maxim 4 黃芩 Scutellariae Radix Scutellaria baikalensis Georgi 4 麻黃 Ephedrae Herba Ephedra sinica Stapf 4 麥門冬 Ophiopogonis Radix Liriope platyphylla Wang. et Tang 4 桔梗 Platycodi Radix Platycodon grandiflorum 4 총량 52 寒多熱少湯의 10첩분량 520 g을증류식약탕기 (CME 592, 미강기업, Korea) 에전탕하였다. 전탕후얻어진 3 L를 rotary evaporator (Eyela N-11, Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Japan) 를이용하여 30 에서감압농축하여 750 ml를얻었다. 寒多熱少湯의농축액은 -70 에서하루동안동결시킨뒤동결건조기 (VFDT , Biocros, Korea) 를이용하여 -70 에서동결건조시켰다. 농축시당도는 21.21brix이고, 동결건조후무게는 g( 수율 14.5%) 으로 PBS에녹여 2.5 μm와 0.45 μm의 membrane filter (Milipore Co., USA) 로여과하여실험에사용하였다. 2) 실험동물 무균환경에서사육된 5주령의수컷 ICR 마우스와 6주령의암컷마우스를 ( 주 ) 오리엔트 ( 경기도가평, 한국 ) 에서구입하여각실험에사용하였다. 마우스는사료와물을무제한으로공급하면서실험전약 1주간안정화시킨후실험에사용하였다. 사육실의조명은 12시간씩 dark/light 주기로실시하였고, 온도는 22±2, 습도는 55±2% 를유지하였다. 2. 방법 1) 비장세포분리 마우스를경추탈골시킨후무균적으로비장을적출하여주위조직을제거하였다. Slide glass로부드럽게압착하여비장을분쇄한후 4 Hanks Balanced Salt Solution (GibcoBRL, NY, U.S.A) 용액으로 2회세척하였다. Ficoll-pague (Amersham Biosciences, Sweden) 을이용하여 1,800rpm 에서 30분원심분리하여임파구층을수거한후, RPMI 1640 (GibcoBRL, NY, U.S.A) media로 1회더세척하고 10% fetal bovine serum (FBS) 이첨가된 RPMI 1640에현탁시켰다. 현탁된세포는일정액을취하여 0.4% tryphan blue에동량으로혼합한후 hemacytometer를이용하여세포수를산정하였다. 2) 세포주배양마우스대식세포세포주 RAW (America Type Culture Collection, Rockville, MD, U.S.A) 은 Dulbecco s Modified Eagle s Medium (GibcoBRL, NY, U.S.A) 에 10% heat-inactivated fetal bovine serum (GibcoBRL, NY, U.S.A) 과 1mM sodium pyruvate, 100 IU/ ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin (GibcoBRL, NY, U.S.A) 을첨가하여 100 mm dish에 80% 세포의밀도를유지하면서 37, 5% CO 2 incubator에서배양하였다. Rat의 basophilic 세포주인 RBL-2H3 세포주는 RPMI 1640 Medium (GibcoBRL, NY, U.S.A) 에 10% heat-inactivated fetal bovine serum (GibcoBRL, NY, U.S.A) 과 1 mm sodium pyruvate, 100 IU/ ml penicillin, 50 μg / ml streptomycin (GibcoBRL, NY, U.S.A) 을첨가하여 37, 5% CO 2 incubator에서배양하였다. 3) 비장세포의증식능측정마우스비장세포를 cells/ ml세포가되게세포수를조정하여 96 well culture plate에 100 μl분주한다음각 well에시료를농도별로첨가한후 37, 5% CO 2 incubator에넣어 48시간배양하였다. 배양후배양액 100 μl에세포증식능시약을 20 μl를첨가한후 37, 5% CO 2 incubator에 1시간 30분배양한후 490 nm에서흡광도를측정하였다. 임파구증식능을측정하기위해 CellTiter 96R AQueous one solution cell proliferation assay kit (Promega, Madison, WI, U.S.A) 시약을사용하였다. 4) β-hexosaminidase의측정 RBL-2H3 세포를수거하여 Tyroid buffer (137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 1.8 mm CaCl 2, 1.1 mm MgCl 2, 11.9 mm NaHCO 3, 0.4 mm NaH 2PO 4, 5.6mM glucose, PH 7.2) 로 1회세척하였다 cells/ ml로조절한후 Tyroid buffer에서부유시켰다. 부유된세포에농도별로寒多熱少湯을첨가하여 37 배양기에서 15 분간반응시킨후 compound 48/80 (1 mg / ml, Sigma, U.S.A) 을첨가하고 37 배양기에서 20분간반응시켰다. 배양후 RBL-2H3 세포주를 4 에서 10분간방치하여반응을종결시키고상층액을회수하였다. 상층액에동량의 1mM p-nitrophenyl-β-acetylglucosamide를넣고 37 배양기에서 1시간동안반응시킨후 2 배량의 sodium bicarbonate (PH 10.2) 의첨가로반응을종결시키고 407 nm 파장에서흡광도를측정하였다. β-hexosaminidase의분비지표 (release index) 는다음과같이계산하였다. β-hexosaminidase release index = (O.D at 470nm of sample)/(o.d at 470nm of positive control ) 100 5) Histamine의측정 RBL-2H3 세포를수거하여 Tyroid buffer(137 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 1.8 mm CaCl 2, 1.1 mm MgCl 2, 11.9 mm NaHCO 3,

3 寒多熱少湯의항 Allergy 및항염증효과 mm NaH 2PO 4, 5.6 mm glucose, ph 7.2) 로 1회세척하였다. 세포수를 cells/ ml로조절한후 Tyroid buffer에서부유시켰다. 부유된세포에농도별寒多熱少湯을첨가하여, 37 배양기에서 15분간반응시킨후 compound 48/80 (1 mg / ml, Sigma, U.S.A) 를첨가하고 37 배양기에서 20분간반응시켰다. 배양후 RBL-2H3 세포주를 4 에서 10분간방치하여반응을종결시킨후상층액을회수하였다. Histamine의정량은 Shore가보고한 fluorometer를이용한측정방법을사용하였다. 간단히설명하면, 회수한상층액 1 ml에 0.2 ml의 1N NaOH, 0.1 ml의 1% OPA (o-phthalaldehyde) 를첨가하고실온에서 5분간방치하였다. 여기에 1N HCl 0.2 ml첨가하여반응을종결시킨다음, fluorometer (Genios, Tecan, Austria) 를사용하여 360 nm의 excitation 파장과 450 nm의 emission 파장을사용하여측정하였다. 6) Nitric oxide 측정 RAW 세포주로부터생성된 nitric oxide (NO) 의양은 - 세포배양액중에존재하는 NO 2 의형태로서 Griess (Sigma) 시약을이용하여측정하였다. 세포배양상등액 100 μl와 Griess 시약 (1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid + 1% α -naphthylamide in H 2O) 100 μl를혼합하여 96 well plate에서 - 10분동안반응시킨후 540 nm에서흡광도를측정하였다. NO 2 의농도는 sodium nitrite를사용하여만든표준곡선에의해산출하였다. 7) RT-PCR을이용한 inos 유전자분석 RNA분리는 RNA-Bee (TEL-TEST, INC, U.S.A) 를이용하여분리하였다. 마우스비장세포에서 RNA를분리하기위하여 0.1% DEPC (diethyl pyrocarbonate) 가첨가된 PBS로비장세포를 3회세척후 RNA-Bee 900 μl를첨가하여균질화시켰다. 여기에클로로포름 100 μl를넣고 15분간얼음에정치시켰다. 그후 4, 12,000rpm에서 15분간원심분리하고상등액을조심스럽게취한후동량의 isopropanol을첨가하여 -20 에서 45분간정치한후원심분리하여, 70% DEPC-Ethanol로 1회세척하였다. RNA를실온에서건조시킨후 DEPC가첨가된증류수에일정량희석하여 spectrophotometer로농도를측정하였다. 5 RT buffer 2 μl (10 mm datp 0.25 μl, 10 mm dgtp 0.25 μl, 10 mm dttp 0.25 μl, 10 mm dctp 0.25 μl, MMLV reverse transcriptase (200 U/ μl ) 0.25 μl, RNase inhibitor (28 U/ μl ) 0.25 μl, 50 um oligo dt primer 0.5 μl, DEPC-distilled water 4 μl ) 를 PCR tube에넣어 42 에서 60분간열처리하여역전사반응을완료하였다. PCR 은 10 PCR buffer 3 μl (25 mm MgCl μl, 10 mm datp 0.3 μl, 10 mm dgtp 0.3 μl, 10 mm dttp 0.3 μl, 10 mm dctp 0.3 μl, 50 um sense 및 antisense primer 0.25 μl, Tag polymerase (5 U/ μl, Promega Co.) 0.25 μl ) 를혼합하고, 여기에증류수로최종부피가 20 μl되게하여 PCR mixture를만들었다. PCR mixture를 PCR tube에넣고여기에역전사산물을 5 μl첨가하여혼합한뒤 PCR 장치에넣어다음의조건으로 PCR을실시하였다. PCR 반응은 94 에 3분간 1 cycle 반응후 초, 57 45초, 72 45초간 35 cycle 반응시켰으며, 72 에서 10 분간 extension을시행한후반응을완료시켰다. 증폭된산물은 1.2% agarose gel에전기영동하여 Gel Doc (Bio Lad, Italy) 를이용하여 DNA band를확인하였다. RT-PCR에사용한 primer는 ( 주 ) 바이오니아사 (Bioneer Co, Choongbook) 에의뢰하여합성하였으며, 각 primer의염기서열은아래표 (Table 2) 와같다. Table 2. Primer sequences of inos gene expression Oligonucleotide sequence 5 -CCA CCC AGA AGA CTG TGG ATG GC-3 G3PDH 3 -CAT GTA GGC CAT GAG GTC CAC CAC-5 5 -GAC AAG CTG CAT GTG ACA TC-3 inos 3 -GCT GGT AGG TTC CTG TTG TT-5 8) Western blotting을이용한 inos 단백질발현분석세포를차가운 PBS로 3회수세한다음 lysis buffer (10 mm Tris-HCl, ph 7.4, 1% NP-40, 10 μg / ml leupeptin, 2 mm PMSF, 2 μg / ml aprotinin 10 μg / ml Na3VO4, 10μg / ml Na5P 2O 7) 를가하여 (100 μl / cells) 균질화하고단백질을추출한다음 4 에서 15분간원심분리하여상등액을모았다. BCA protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, U.S.A) 로정량한후동일량의단백질 (30 또는 40 μg ) 을 sodium dodecyl sulfate-polyacrlyamide gel eletrophoresis (SDS-PAGE) 로분리한후, nitrocellulose membrane (NC, Schleicher & Schuell BioScience, Germany) 에 transfer하였다. 이 NC를 3% non-fat dry milk를함유한 Tris buffered saline-tween (TBS-T; 10mM Tris-HCl ph 7.4, 0.1 M NaCl, 0.1% Tween 20) 으로 1시간동안반응시켜비특이적단백질에대한반응성을차단하고 anti-inos 항체와반응시킨후 2차항체인 anti-mouse IgG로 1시간 30분반응시켰다. 각반응사이에 TBS-T로 10분씩 3회 30분동안수세하였다. 이어서항체에대한대응단백질 band를 enhanced chemiluminescence (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, UK) detection 방법으로확인하였다. 9) Compound 48/80 에의한전신성아나필락시스측정비만세포의탈과립제로 compound 48/80 8 mg / kg을생쥐의복강내에주사하였으며, 寒多熱少湯을 1, 20, 40 및 80 mg /mouse 용량으로 compound 48/80 주사 1시간전에경구투여하였다. 치사율실험은아나필락시스쇼크를유발시킨후 1시간동안관찰하였다. 결과 1. 비장세포증식능에미치는영향寒多熱少湯이면역계에미치는영향을조사하기위하여마우스비장세포증식능에미치는효과를관찰하였다. 한다열소탕열수추출액을농도별 (100, 200, 400, 800 μg / ml ) 로분리된마우스비장세포에처리하여 24시간, 48시간세포증식능을관찰하였다. 그결과 24시간배양후마우스비장세포의증식능은한다열소탕처리농도에따라 0.138±0, 0.154±0.013, 0.154±0.001 및 0.17±0.003 으로대조군 0.13±0.003 에비해 200, 400, 800 mg / ml에서유의한세포증식능이관찰되었다. 48시간배양후마우스비장세포의증식능은한다열소탕처리농도에따라 0.142±0.01,

김재원 신상우 이영선 이금홍 박종현 0.156±0.007, 0.161±0.004, 0.177±0.007의결과를보였고 200, 400, 800μg / ml에서유의한세포증식능이관찰되었다 (Fig. 1). 과, compound 48/80 자극에의한 histamine 분비가 compound 48/80 단독처리 66.1±1.

Mouse spleen cells (2 10 6 cells/ ml ) were cultured with 100, 200, 400, 800 mg / ml of Handayeolso-tang(HDT) for 24hr and 48hr. Control group was incubated with RPMI1640 medium only.

RBL-2H3 세포에서 β-hexosaminidase 분비억제에미치는영향 寒多熱少湯의항알러지효과를살펴보기위해비만세포나호염구세포의분비과립에초래하는 β-hexosaminidase 분비에미치는영향을 RBL-2H3 basophilic 세포주에서관찰하였다.

4 김재원 신상우 이영선 이금홍 박종현 0.156±0.007, 0.161±0.004, 0.177±0.007의결과를보였고 200, 400, 800μg / ml에서유의한세포증식능이관찰되었다 (Fig. 1). 과, compound 48/80 자극에의한 histamine 분비가 compound 48/80 단독처리 66.1±1.5% 에비해한다열소탕처리에의해 histamine 분비가 62.9±2.3, 61.6±1.2, 63.6±1.7, 58.5±2.6% 로나타나 800 μg / ml에서유의하게억제되었다 (Fig. 3) Fig. 1. Effect of on the cell proliferation in mouse spleen cells. Mouse spleen cells ( cells/ ml ) were cultured with 100, 200, 400, 800 mg / ml of Handayeolso-tang(HDT) for 24hr and 48hr. Control group was incubated with RPMI1640 medium only. Results are expressed as means + S.D in triplicate cultures. *, # significant difference from control(p<0.05). 2. RBL-2H3 세포에서 β-hexosaminidase 분비억제에미치는영향 寒多熱少湯의항알러지효과를살펴보기위해비만세포나호염구세포의분비과립에초래하는 β-hexosaminidase 분비에미치는영향을 RBL-2H3 basophilic 세포주에서관찰하였다. RBL-2H3 세포에탈과립을유도하기위하여세포내칼슘유입을증가시켜세포내탈과립을유도할수있는 compound 48/80을사용하였다. 실험결과, compound 48/80 자극에의한 β -hexosaminidase 분비가 compound 48/80 단독처리 50.4±0.9% 에비해한다열소탕처리시농도별에따라 51.7±0.8, 50.5±1.0, 44.2±0.9, 44.7±0.4% 의결과가관찰되었고 400, 800 μg / ml에서유의하게 β-hexosaminidase 분비가억제되었다 (Fig. 2). Fig. 3. Inhitory effect of Handayeolso-tang(HDT) on the histamine released from RBL-2H3 cells by Compound 48/80. Results were expressed as % release of histamine. All values are means ± S.D from three experiments. * significant difference from compound 48/80 alone (P<0.05) 4. LPS로자극된 RAW 마우스대식세포에서 NO 생성억제에미치는영향 한다열소탕의항알러지효과를살펴보기위해알레르기반응의원인세포로알려진비만세포나호염구세포의분비과립에존재하는 histamine의분비에미치는영향을 RBL-2H3 basophilic 세포주를이용하여관찰하였다. RBL-2H3 세포에탈과립을유도하기위해 compound 48/80을사용하였다. 실험결과, compound 48/80 자극에의한 histamine 분비가 compound 48/80 단독처리 66.1±1.5(μM/ ml ) 에비해한다열소탕처리에의해 histamine 분비가 62.9±2.3, 61.6±1.2, 63.6±1.7, 58.5±2.6(μM/ ml ) 으로나타나 800μg / ml에서유의하게억제되었다 (Fig. 4) Fig. 2. Inhitory effect of Handayeolso-tang(HDT) on the β -hexosaminidase released from RBL-2H3 cells by compound 48/80. β-hexosaminidase release (%) induced by compound 48/80. All values are means ± S.D from three experiments. * significant difference from compound 48/80 alone (P<0.05) 3. RBL-2H3 세포에서 Histamine 분비억제에미치는영향 한다열소탕의항알러지효과를살펴보기위해알레르기반응의원인세포로알려진비만세포나호염구세포의분비과립에존재하는 histamine의분비에미치는영향을 RBL-2H3 basophilic 세포주를이용하여관찰하였다. RBL-2H3 세포에탈과립을유도하기위해 compound 48/80을사용하였다. 실험결 Fig. 4. Effect of Handayeolso-tang(HDT) on production by LPS-stimulated RAW cells. RAW cells were incubated with lipopolysaccharide (LPS ; 1 μg / ml ) for 24hr in the presence or absence of HDT at indicated doses. The amount of NO released by cells were measured by the method of Griess. All values are means ± S.D from three experiments. * significant difference from LPS alone (P<0.05) 5. LPS로자극된 RAW 264.7에서 inos mrna 및 inos 단백질발현에미치는영향. 한다열소탕에의한 RAW 마우스대식세포에서 NO 생성의억제가 inos mrna 유전자발현및 inos 단백질발현과

寒多熱少湯의항 Allergy 및항염증효과 의관련성을조사하기위해 RAW 264.7 마우스대식세포주에 LPS와한다열소탕을처리한후 inos mrna 유전자발현과 inos 단백질발현을 RT-PCR 과 Western blotting 으로관찰하였다.

5 寒多熱少湯의항 Allergy 및항염증효과 의관련성을조사하기위해 RAW 마우스대식세포주에 LPS와한다열소탕을처리한후 inos mrna 유전자발현과 inos 단백질발현을 RT-PCR 과 Western blotting 으로관찰하였다. 실험결과, LPS 단독처리시 inos mrna 유전자발현이강하게유도됨이관찰되었으며, 이러한유전자발현은한다열소탕처리에의해감소됨이관찰되었으며, inos 단백질발현또한한다열소탕처리에의해감소됨이관찰되었다 (Fig. 5, 6). Fig. 5. Effect of Handayeolso-tang(HDT) on inos mrna expression by LPS -stimulated with LPS (1 μg / ml ) in the presence or absence of various concentration of HDT for 24hr. After stimulation, total RNA was isolated from cultured cells using RNA-Bee and RT-PCR performed. G3PDH was used control genes. M; 100bp site marker. Fig. 6. Effect of Handayeolso-tang(HDT) on inos protein expression by LPS-stimulated RAW cells. RAW cells were stimulated with lipopolysaccharide (LPS ; 1 μg / ml ) in the presence or absence of various concentration of HDT for 24hr. The protein extracts were prepared, and the samples analyzed for inos expression by western blotting as described in the method. HSP70 was control protein. Table 3. Compound48/80-induced systemic anaphylaxis Dose(mg/mouse) Compound 48/80(8 mg/kg) Mortality(%) Saline HDT Saline or Handayeolso-tang(HDT) was orally administrated at various doses 1hr before the compound 48/80 i.p injection. Mortality (%) within 2hr following compound 48/80 injection was represented as the number of dead mice 100/total mice of experimental mice. Each group consists of 10 mice. 6. Compound48/80 에의해유도된아나필락시스반응에미치는영향 한다열소탕의즉시형과민반응에미치는영향을조사하기위해비면역학적자극물질인 Compound 48/80을사용하여전신성아나필락시스를유도후치사율을관찰하였다. Compound 48/80을복강에투여후치사율을관찰한결과, 생리식염수를경구투여한대조군은 100% 치사율이관찰되었다. 그러나 Compound 48/80 복강투여 1시간전한다열소탕을 1, 20, 40, 80, 100, 120( mg /mouse) 를경구투여군에서는 120 mg /mouse 에서만치사율이 55% 로감소되었다 (Table 3). 고찰 비염은鼻腔을싸고있는粘膜의염증이라고정의되며이러한鼻腔粘膜의염증이알레르기抗原에대한過敏反應에의해유발될경우를알레르기성鼻炎이라고말하는데 14,15), 증상발현의시기에따라通年性과季節性으로구별한다. 通年性알레르기성鼻炎은코가가렵고, 발작적으로재채기를하며물같이맑은콧물을흘리고때로는코막힘을호소하는데, 症狀이慢性的이고持續的이어서患者는항상입을벌리고호흡을하거나, 코를골거나부비동염또는감기를달고산다는표현을하기도한다. 季節性알레르기성鼻炎은원인抗原과접촉이있는특정한계절에만증상이나타나는것으로재채기가주로나타나고, 코가려움증, 물같은콧물, 코막힘등의전형적인알레르기성鼻炎의症狀외에도결막, 인두, 위장관기타다양한症狀이동반될수있으며, 심하면천식이동반될수있다 16). 알레르기성비염에대한서양의학적인치법으로는회피요법, 대증요법, 그리고면역요법이있다. 회피요법이란알레르기를일으킬수있는인자로부터의회피를말하는것으로봄, 여름에는꽃가루와의접촉을피하기위해창문을닫아두거나겨울에는공기건조를막기위해적정습도를유지해주며자주공기를정화하고진드기가많은카펫트등을제거하는등의방법이다. 대증요법은약물요법과수술요법이있는데회피요법이곤란한경우시행하게되며, 수술요법은하비갑개소작술인신경절단술이있다. 위의방법으로치료되지않는경우에는면역요법을시도하게된다. 면역요법은기인성항원을찾아내어이를면역학적으로처리하는탈감작요법이시행되고있다. 이렇듯알레르기성비염의서양의학적치료가여러측면에서연구검토되고있고치료효과도현저하게나타나지만이것이일시적이고그부작용으로인하여장기투여할수없다는것이한계이다 17). 한의학에서알레르기鼻炎은鼻鼽, 噴嚔, 鼻涕, 鼽涕등의범주에해당되는데 18), 素問玄機原病式ㆍ六氣爲病編 19) 에서는 鼽爲鼻出淸涕也, 嚔, 鼻中因痒而氣噴作于聲也 라하여 鼽 는알레르기鼻炎의水樣性鼻漏의증상과 嚔 는발작성噴嚔의증상과유사하다는것을알수있으며, 한의학적으로볼때肺氣가虛弱한상태에서風寒에外感되어서肺의宣發肅降기능이실조되거나, 脾肺陽氣가虛한상태에서寒冷한기운에노출되거나, 生冷한음식물에손상을받아水濕이犯肺하여鬱滯하거나腎陽이虛損되어肺失溫照하게되는경우에나타나는질환이다 20). 寒多熱少湯은李 13) 의 東醫壽世保元 에처음기재된처방으로, 薏苡仁, 麥門冬, 萊菔子, 桔梗, 麻黃, 黃芩및杏仁으로구성되어太陰人太陽寒厥症에응용되어왔는데 21), 李 13) 는단지惡寒만있고發熱이없는것을厥이라하고太陰人寒厥症의原因을勞心焦思之餘에胃脘이衰弱해서表局이虛한틈을寒邪가外被하여正邪相爭하는形勢로나타난것이라하였다

6 김재원 신상우 이영선 이금홍 박종현 寒多熱少湯을구성하고있는약재들의효능을살펴보면, 薏苡仁은凉無毒味甘淡으로利水滲濕, 除濕痺, 淸肺排膿, 健脾止瀉하고, 麥門冬은寒無毒味甘微苦로滋陰淸熱, 潤肺生津, 强心利尿하며, 萊菔子는平無毒味辛甘으로行滯消食, 降氣袪痰하고, 桔梗은平無毒味苦辛으로宣肺袪痰, 排膿利氣하며, 麻黃은溫無毒味辛苦로發汗解表, 宣肺平喘, 利水하고, 黃芩은寒無毒味苦로淸熱燥濕, 止血安胎하며, 杏仁은溫有小毒味苦로止咳定喘, 潤腸通便하고 22), 乾栗은溫無毒味鹹으로厚腸胃, 補腎氣한다. 따라서上記處方이發汗시켜表寒之邪를풀어주며潤肺祛痰시켜肺의淸陽을升提 23) 시켜주는藥物들로구성되어있음을알수있으며, 肺虛한상태에서風寒邪가침입하여발생되는알레르기성鼻炎에도유효하다는것을알수있다. 이에본연구에서는寒多熱少湯의항알레르기효과를조사하기위해寒多熱少湯이정상면역세포에미치는영향, 알레르기반응의주요세포인비만세포및호염구에서알레르기반응시탈과립지표로알려진 β-hexosaminidase 및 histamine 분비억제에미치는영향, 비면역자극제인 compound48/80 자극에의한 Anaphylatic shock에미치는영향, RAW264.7 대식세포주를이용염증반응과관련된 Nitric Oxide 생성및조절기전에미치는영향등을관찰하였다. 비장세포는 2차면역장기로대식세포와많은적혈구로구성되어있고노화된적혈구가파괴되고제거되는곳으로면역반응에중요한역할을하는곳으로알려져있다 33). 따라서본실험에서는한다열소탕을시간별 (24시간, 48시간 ) 농도별 (100, 200, 400, 800 μg / ml ) 로처리하여마우스비장세포의증식에미치는영향을관찰하였다. 실험결과, 처리시간 24시간과 48시간양쪽모두에서 200, 400, 800 μg / ml에서대조군에비해세포증식능이유의성있게증가하였다. 이는寒多熱少湯이면역세포를활성화하여저하된면역기능을강화시켜줄수있음을알수있었다. 염증반응에관여하는면역세포로는대식세포, 비만세포, 호염구등이알려져있지만특히알레르기염증반응의대표적인세포로는비만세포와호염구가알려져있다 24,27,42). 비만세포는즉시형과민반응에서일어나는염증반응에서핵심적인역할을수행할뿐아니라그외다른염증과정이나생리적인면역의진행과조절에주도적인역할을하고있음이알려져있다 25,26,28,42). Histamine 과 β-hexosaminidase는이들세포에서탈과립의지표로알려져있어알레르기억제물질의생물활성측정에유용하게사용되고있다 24,28,39,41). 본연구에서는랫드점막비만세포와상동성이높은랫드 RBL 2H3 basophilic leukemia 세포주인 RBL-2H3 세포주를지시세포로사용하여비만세포의탈과립을유도하는 compound 48/80을사용하여탈과립을유도하였다. Compound 48/80 은비만세포내로칼슘유입을증가시켜세포내칼슘수준을증가시키고세포내 camp phosphodiesterase를활성화시켜세포내 camp 수준을감소시킴으로써비만세포의탈과립을일으키는비면역학적자극제로알려져있다 26,27). Compound 48/80 은고농도에서비만세포로부터약 90% 의히스타민을유리시키는것으로알려져있으며적당량의 compound 48/80은아나필락시스의기전을연구하기위한히스 타민유리촉진제로서사용되고있다 26,36,42). 따라서본실험에서는寒多熱少湯의항알러지효과를알아보기위해 RBL-2H3 세포주에비면역자극제인 compound 48/80로자극후이들세포의분비과립에존재하는 β-hexosaminidase와 histamine 분비에미치는영향을관찰하였다. 그결과, β-hexosaminidase 분비가寒多熱少湯처리시 400, 800 μg / ml에서유의하게억제됨이관찰되었으며, Histamine 분비는 800 μg / ml에서유의하게억제됨이관찰되었다. 이러한결과는寒多熱少湯이비만세포의탈과립으로촉발되는알레르기염증질환에효과적일것이라는것을시사하였다. 대식세포는면역반응의초기반응과비특이적면역반응을담당하며, 생체내에서감염, 염증등의반응에중요한역할을하는데, 선천면역뿐만아니라적응면역등다양한숙주반응에관여하여숙주방어와항상성유지에관여하는것으로알려져있다 32-34,37,40). 대식세포는 superoxide, hydrogen peroxide 및 NO와같은중간물질을생산하며, 탐식된이물질을분해시킬때생성되는 IL-1, TNF-a 및 NO는숙주에치명적인결과를초래할수있는것으로보고되고있다. 그중산화질소 (nitric oxide; NO) 는주로대식세포에서생성되는작고불안정한무기가스로이중적생물학적성질을가지고있어서, 저농도의 NO는신경전달물질등과같은작용을하나, 과도한 NO 생성은급 만성염증에관여하여, 숙주세포의파괴와염증조직의상해를초래하는것으로보고되어있다. 이렇듯 NO는상황에따라서세포, 조직혹은개체에이로울수도있고해로울수도있어서상황에맞게 NO 분비를촉진시키거나억제시킴으로써인체생리현상을조절할수있으므로, NO 생성을조절할수있는물질을찾고자하는많은연구가활발히진행되고있다 29,30,35). 따라서본실험에서寒多熱少湯의항염증성효과를관찰하기위해 LPS로 RAW 마우스대식세포주를자극하여과도한 NO 생성을유도한후寒多熱少湯의 NO 생성조절에미치는영향을관찰하였다. 그결과, LPS로자극된 RAW 세포에서유도된 NO 생성은寒多熱少湯의처리농도별에 200, 400, 800 μg / ml에서유의하게억제됨이관찰되었으며 NOS mrna 유전자발현및 inos 단백질발현이감소됨이관찰되었다. 이러한결과는寒多熱少湯이염증성질환의예방및치료에효과적일것으로생각된다. 알레르기는발생기전에따라 Ⅰ-Ⅳ 형으로나누는데제Ⅰ형과민면역반응의특징은감작된개체가동일한항원에다시노출되면즉시알레르기반응이일어나는데이러한반응을아나필락시스라한다 27,38). Ⅰ형알레르기의대표적반응인전신아나필락시스쇼크는비만세포의세포질에칼슘농도를증가시켜 histamine을유리하는물질인 compound 48/80를복강내주입하여비만세포의탈과립을유도하면제 Ⅰ형알레르기는순간적인 histamine 방출에의해서혈관확장되어저혈압등으로사망을유발시키기는것으로알려져있다. 寒多熱少湯의아나필락시스쇼크에미치는효과를살펴보기위해비면역학적자극물질인 compound 48/80을사용하여전신성아나필락시스를유도후치사율을관찰한결과, 120 mg /mouse 에서만치사율이 55% 로감소되었다

7 寒多熱少湯의항 Allergy 및항염증효과 以上의실험결과를종합하여볼때太陰人寒多熱少湯의항알레르기및항염증효과가알레르기반응시비만세포세포의탈과립지표로알려진 β-hexosaminidase 및 histamine 분비억제, 염증반응과관련된 NO 생성조절등에관여됨이관찰되었으므로새로운항알레르기성, 항염증성기능물질로이용될수있을것이라생각된다. 결론 寒多熱少湯의항알레르기효과를관찰하기위하여寒多熱少湯이정상세포의증식에미치는영향, 알레르기반응의주요세포인비만세포와상동성이높은 RBL-2H3 basophilic leukemia 세포주를이용하여이들세포의탈과립지표로알려진 β -hexosaminidase 및 histamine 분비억제에미치는영향, 비면역자극제인 compound 48/80 자극에의한 anaphylatic shock에미치는영향, RAW264.7 대식세포주를이용하여염증반응과관련된 NO 생성및조절기전에미치는영향등을관찰하여다음과같은결론을얻었다. 寒多熱少湯이정상면역세포에미치는영향을살펴보기위해 2차면역장기인비장의세포증식능을조사한결과, 寒多熱少湯을처리에의해비장세포증식능이유의성있게증가되었다. 寒多熱少湯의항알레르기효과를측정하기위하여비만세포의탈과립을일으키는비면역학적자극제인 compound 48/80을사용 β -hexosaminidase분비에미치는영향을관찰한결과, 寒多熱少湯의처리에의해 β-hexosaminidase 분비가유의하게억제되었다. 寒多熱少湯의항알레르기효과를측정하기위하여비만세포의탈과립을일으키는비면역학적자극제인 compound 48/80을사용 histamine 분비에미치는영향을관찰한결과, 寒多熱少湯의처리에의해 Histamine 분비가유의하게억제되었다. 寒多熱少湯의항염증효과를관찰하기위해급 만성염증시과도한생성되는 NO 조절에미치는영향을조사한결과寒多熱少湯이 LPS 로자극된 RAW 세포에서유도된 NO 생성을유의하게감소시킴이관찰되었으며 inos mrna 유전자발현및 inos 단백질발현또한억제되었다. 이상의결과로보아寒多熱少湯은알레르기반응세포의탈과립지표인 β-hexosaminidase 및 histamine 분비억제와염증반응과관련된 NO 생성억제를통해염증과관련된알레르기질환에유용하게사용될수있을것이라생각되며추후새로운항알레르기성, 항염증성기능물질로이용될수있을것이라사료된다. 참고문헌 1. 신민호. 알레르기성비염의약물요법. 대한알레르기학회지 12(4): , 김선곤. 알레르기성비염에있어특이적 IgE측정법 (MAST CLA) 의임상적의의. 대한이비인후과학회지 38(9): , 민양기. 임상비과학. 서울, 일조각, p 240, 송일병. 사상체질의학과 allergy 질환. 사상체질학회지 14(2): 18-24, 金璟濬, 蔡炳允. 桂枝湯加味方의알레르기비염에대한치험보고. 대한외관과학회지 10(1):99-106, 황경식. 알레르기비염에대한사상의학적치료. 대한한의학회지 14(2): , 강상훈외. 辛荑淸肺飮이알레르기비염에미치는효과에대한실험적연구. 대한안이비인후피부과학회지 18(3):18-25, 신경숙외. 荊芥連翹湯加味가알레르기성비염에미치는효과에대한임상보고. 혜화의학. 1(3): , 고우석외. allergy성비염환자의사상체질분류와치료에대한임상적고찰. 맥진학회지 6: 75-87, 안보국, 송정모. 소음인곽향정기산의항 Allergy 작용. 대한외관과학회지 13(3):75-88, 박승찬. 태음인청심연자탕의항 Allergy 작용에관한실험적연구. 사상체질의학회지 15(2): , 서웅. 소양인荊防地黃湯의항 Allergy 작용. 박사학위논문, 李濟馬. 東醫壽世保元. 서울, 행림출판, pp , 123, 盧寬澤. 耳鼻咽喉科學. 서울, 一潮閣, pp , 柳慧定外. 鼻塞症에關한文獻考察, 大韓外官科學會誌 16(2):32, 의학교육연수원편. 가정의학. 서울, 서울대학교출판부, pp 54-55, 민양기, 최종욱, 김리석. 일차진료를위한이비인후과학임상. 서울, 일조각, pp 52-59, 채병윤. 동의안이비인후과학. 서울, 집문당, pp , 劉完素. 河間三六書. 서울, 成輔社, pp , 王凍應. 中醫耳鼻咽喉科學. 北京, 科學出版社, pp , 전국한의과대학사상의학교실. 改訂增補四象醫學. 서울, 集文堂, pp , 421, 辛民敎. 原色臨床本草學. 서울, 永林出版社, p 232, 308, 392, 420, 516, 564, 578, 王昻. 增補本草備要. 서울, 高文社, p 146, 최선필, 강미영, 남석현. 생화학, 분자생물학. 호염구세포주와복강비만세포에서유색미겨추출물의알레르기염증억제활성. 한국응용생명화학회지 ( 구한국농화학회지 ) 48(4): , 조정제, 임강현. 사람비만세포주에서사이토카인발현에대한다엽주성분 Epigallocatechin Gallate 의억제효과. 대한본초학회지 ( 본초분과학회지 ) 16(2):57-63, 김성화, 김대근, 채병숙, 신태용. 원보 : 비만세포매개즉시형알레르기반응에대한연명초의억제효과. 생약학회지 34(2): , 박은수, 신민교, 송호준. 자작나무및벚나무껍질추출물이항알레르기효과에대한실험적연구. 대한본초학회지 ( 본초분과학회지 ) 13(2):57-68, Eun-Kyung Park, Min-Kyung Choo, Myung Joo Han, Dong-Hyun Kim. Ginsenoside Rh1 possesses antiallergic and anti-inflammatory activities.nt Arch Allergy Immunol. 133(2): ,

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를