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성언 감
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1 4) 대한한방부인과학회지 J Korean Obstet Gynecol VOL.26 NO.4 : (2013) 산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - 우석대학교한의과대학한방부인과학교실박가영, 이아영, 반지혜, 박정경, 이은희 ABSTRACT Effects of Herbal Medicine on Breastfeeding - Analysis of Marker Substances in Saenghwa-tang by HPLC and LC/MS/MS - Ka-Young Park, Ah-Young Lee, Ji-Hye Ban, Jung-Kyung Park, Eun-Hee Lee Dept. of Korean Obstetrics & Gynecology, College of Korean Medicine, Woo-Suk University Objectives: We took breast milk samples and analyzed them using HPLC and LC/MS/MS, to evaluate the effects of taking Saenghwa-tang during breastfeeding on breast milk. Methods: The study participants were 20 lactating women who admitted in Korean medical postpartum care center. Breast milks were collected from paticipants who have been administrated Saenghwa-tang for more than 3 days. We used HPLC and LC/MS/MS for the determinations of amygdalin, liquiritins, 6-gingerol, decursin and decursinol angelate in Saenghwa-tang. Results: 1. Participants' Mean±S.D (standard deviation) of age is 31.05±1.96, and 15 participants had normal delivery and 5 participants had cesarean delivery. 12 participants were primipara and 8 participants were multipara. Mean±S.D of lactating date is 9.4± Using HPLC, we learned LOQ level peak that matches the peak retention time of standard components of Saenghwa-tang was not detected from 20 breast milk samples. 3. Using LC/MS/MS, decursin of Angelicae Gigantis Radix was detected from HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11, and the each concentrations are 16, 2, 64, 11 ppb. Liquiritin of Glycyrrhizae Radix was not detected from HMSP 13~HMSP 18. Conclusions: Data obtained by this approach shows that this method is reliable and suitable for determining the safety of taking Saenghwa-tang during breastfeeding. Key Words: Saenghwa-tang, Breastfeeding, HPLC, LC/MS/MS, Herbal medicine, Marker Substance Corresponding author(eun-hee Lee) : Woo-Suk Univ. Jeonju Korean Medicine Hospital, 46, Eoeun-ro, Wansan-gu, Jeonju-si, Jeollabuk-do, Korea Tel : lovedmsl@hanmail.net 48

2 J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 Ⅰ. 서론 모유는생후첫 6개월동안영아의성장과발육에필요한모든영양분을공급하는가장이상적인식품이다 1). 이러한모유수유의장점이부각되면서 1970년대이후 WHO와 UNICEF를중심으로모유수유운동이전세계적으로전개되었고 2), 우리나라역시 2000년에약 10% 로저조했던생후 1개월된아기의완전모유수유율이 2005년에는 58.2% 에달할만큼증가 3) 하였으며, 실제임상에서산모들이모유수유에대해갖는관심은매우높다. 수유중인산모는임신혹은출산후발생한질환 ( 임신성당뇨및혈압, 유선염, 산후우울증, 치질, 피부질환, 폐수종, 각종관절통등 ), 치과치료나만성질환 ( 고혈압, 당뇨, 갑상선질환, 결핵, 류마티스관절염, 정신질환등 ) 으로인한다양한약물노출 3) 을경험하게된다. 이와더불어산모가약물복용시약물이모유로이동하는과정에관한지속적인연구가이루어지고있으나, 대다수의약물의임상시험이불가능한상황이다 4). 모유수유시약물복용의다양한가이드라인이제시되고있음에도불구하고, 의료인들의미흡한정보와이에따른산모의불안은수유를중단하게하는원인이되고있다 5). 우리나라여성들은산후의제반증상을치료하기위해서한방치료를받거나모유수유중한약을복용하는경우가많다. 장등 6) 의산후조리원한방의료현황조사에서알수있듯이우리나라는산후조리및산후한약복용에대한인지도가높다. 그중대표적인처방인生化湯은 傅靑主女科産後篇産後諸症治法에원방이수재되어있으며當歸, 川芎, 桃仁, 乾薑, 甘草로구성된산후의통치방으로산후임상에서다양하게활용하는처방이다. 生化湯및그加減方은산후자궁의회복과산후복통, 산후혈훈, 태반잔류및산후출혈등각종병증의예방과치료에효과가있음이실험과임상연구를통해밝혀져있다 7). 모유수유중한약복용에대한안전성연구는아직까지보고된예가많지않다. 2011년민족의학신문에 모유수유중한의사가처방하는한약의투여는안전하다 는주제로대한모유수유한의학회의기고 8) 가있었고, 전탕전과후의중금속, 잔류이산화황및잔류농약함량을조사한결과, 전탕후중금속함량은현저히감소하고, 잔류이산화황및잔류농약은검출되지않았다 9,10) 고밝힌연구가있었다. 특히 Hale이제시한가이드라인 11) 에서출산후다용하는한약재들이대부분 L3 : 과학적데이터가부족하나전문가처방에의해가이드라인대로투여시비교적안전한약물 에속하고있으나, 단일약재를사용하지않고복합처방을하게되는한약에있어서의정보제공및가이드라인은없는실정이다. 최근복합적인화합물로구성된한약처방의지표성분을 High performance liquid chromatography(hplc) 를통해정성정량분석하는연구가진행되고있다 12,13). 약리효능물질과지표물질이일치하지않는다는한계가있으나, 복합적인화합물로구성된한약을개별적인단일성분으로분석할수있는장점을가진 HPLC 를이용한접근은그의미를갖는다. 이에저자는모유수유중한약복용이 49

3 산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - 모유에미치는영향을평가하기위해生化湯加減方을복용하고있는건강한산모 20명을대상으로한약복용후이행유에해당하는모유를채취한후, HPLC 와 liquid chromatography tandem mass spectrometry(lc/ms/ms) 를이용하여生化湯의지표물질로 amygdalin, liquiritin, 6-gingerol, decursin 및 decursinol angelate 를선정, 분석하여다음과같은결과를얻었기에이를보고하는바이다. Ⅱ. 연구대상및방법 1. 임상시험형식본연구는 OO대학교부속한방병원에서구성한임상시험심사위원회 (Institutional Review Board, IRB) 의승인을받아실시하였으며, IRB 승인번호는 WSOH IRB 이었다. 본임상시험의목적과내용및구체적인방법에대해충분히설명한후, 임상시험참여동의서를작성한자에한하여연구를시작하였다. 2. 대상 1) 연구대상본연구는 2013년 4월부터 6월까지 OO 대학교부속한방병원산후클리닉에입원하여生化湯加減方을복용중이며, 임상시험모집과정에참여의사를밝힌건강한산모를대상으로하였다. 최초지원자는 21명이었으며, 모유채취에대한거부감으로 1명이임상시험참여를중단하여최종적으로총 20명이임상시험을마쳤다. 2) 선정기준 (1) 만 28세이상 40세이하의재태 기간 37~42주에단태분만하였으며, 임신시합병증이나산과적문제점이없는건강한산모 (2) 生化湯加減方을 3일이상 7일이하동안복용한산모중이행유의모유를제공할수있는자로, 활력징후가정상범위에속하며본임상시험에참여하기로동의한자 3) 배제기준 (1) 고혈압, 당뇨, 갑상선질환등의만성질환을갖고있는자 (2) 중금속및유기오염물질에대한직업적노출이있는자 (3) 출산후산부인과에서통상적으로처방한항생제및소염진통제가아닌다른민간요법약물 ( 호박즙, 가물치등 ) 을복용하였던자 (4) 출산후출혈, 발열등의산부인과적질환이발생한자 (5) 기타피험자로부적합하다고연구자가판단한자 4) 연구대상의복용한약 : 生化湯加減方 OO대학교부속한방병원산후클리닉에서生化湯加減方을복용중인산모를대상으로하는연구이므로, 본병원에서시행하는임상투여원칙에따라서진행하였다. 임상시험기간동안生化湯加減方의약재는동일한구입처에서일괄구입한것을사용했으며, 처방의첩당분량과구성및가감약재는아래와같다 (Table 1). 처방은生化湯원방을기준으로, 산모의증상에따라개별약재를가감하여활용하였다. 乳汁不足이나乳汁不通에王不留行, 木通을가미하고, 浮腫에澤蘭, 燈心, 黑小豆를가미하였다. 上熱感이있는경우에黃芩, 咳嗽가심 50

4 J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 한경우에桑白皮, 腰痛에杜冲, 續斷을가미하였다. 兒枕痛에白灼藥, 소화력이약한경우에香附子, 砂仁을가미하였고, 변비에大黃을가미하였다. 약재를첩당분량무게를맞추어거름망보자기에싼 후약탕기에넣고, 물을약재의 10배로첨가하여 100 에서 120분간전탕하였다. 生化湯加減方은 4 이하냉장보관을원칙으로하고, 냉장보관기간은 7일이내로하였다. Table 1. The Composition of Saenghwatanggagam-bang Herbal medicine Pharmaceutical name Amount (g) 當歸 Angelicae Gigantis Radix 16 川芎 Cnidii Rhizoma 12 乾薑炒黑 Zingiberris Siccatum Rhizoma 4 桃仁 Persicae Semen 4 炙甘草 Glycyrrhizae Radix 2 王不留行 Melandrii Herba 4 木通 Akebiae Caulis 4 澤蘭 Lycopi Herba 4 燈心 Junci Medulla 4 黑小豆 Glycine Semen Nigra 8 黃芩 Scutellariae Radix 4 桑白皮 Mori Cortex Radicis 4 杜仲 Eucommiae Cortex 4 續斷 Dipsaci Radix 4 白灼藥 Paeoniae Radix 4 香附子 Cyperi Rhizoma 4 砂仁 Amomi Fructus 4 大黃 Rhei Rhizoma 2 Total 38~54 5) 生化湯加減方의복용량및복용기간生化湯加減方을 1첩분량으로하여, 하루에 2첩을 3회에나누어 1회에 120 ml 를복용하였다. 대상산모는生化湯加減方을 5.55±1.05일동안복용하였으며, 최소 3일에서최대 7일동안복용하였다. 3. 방법 1) 모유채취모유채취당일아침, 연구자가방문혹은전화로피험자에게모유채취시간및채취방법에대해고지하였다. 오전 9 시에서 12시사이에피험자임의대로유축기를사용하거나손으로한쪽유방의모유를짜내며, 모유의전유와후유의불균형을방지하기위해피험자의판단에의해한쪽젖을다비울때까지유축하는것을원칙으로하였다. 유축한모유의양은 50~160 ml 정도로피험자에따라서다양하게나타났다. 다짜낸모유는 30~50 ml 정도의양을저밀도폴리에틸렌 (LLDPE) 재질의모유저장팩에담아밀봉하였다. 피험자가모유를보관하는시간및연구원이동시간을포 51

5 산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - 함하여냉장보관다섯시간이내에연구자가방문확인한후, 알미늄호일로싸서분석직전까지 -20 의냉동고에보관하였다. 2) 지표물질의정량분석 (1) 성분패턴비교분석 1 조제시약표준원액및내부표준용액의 diluent 로서사용하기위해메스실린더를이용하여 deionized water 와 methanol을각각 50 ml씩측정후 100 ml bottle 에넣고 5 분동안 sonication하여 50% methanol 수용액 (v/v) 을제조하였다. 조제시약은실온에서보관하고, 사용기한을조제후 2주간으로하였다. 2 시료의준비분석시료는모유약 20 ml를취하여 50 ml conical tube에넣고 ethyl acetate 10 ml를첨가하여현탁추출후 2500 rpm 및 4 에서 10분동안원심분리하였고, 상층액중일정량을취하여질소농축하고남은여액약 0.2~0.3 ml에 50% methanol 수용액 (v/v) 0.6 ml를첨가하여층분리및 rpm, 4 에서 5분동안원심분리하여 15 μl를 HPLC에주입하였다. 대조표준품으로는 amygdalin, liquiritin, 6-gingerol, decursin, decursinol angelate 를 μg/ml 농도로 1, 2, 5, 10, 20 μg/ml에희석하여사용하였다. 3 HPLC 기기및분석조건시료분석을위한 HPLC 기기는 Agilent 1200Series(USA) 로, Automatic liquid sampler(als, G1329A), Binary pump (G1312A), Multi-wavelength detector(g1365d), Thermostatted column compartment(tcc, G1316A), Degasser(G1322A) 를사용하였으며, 소프트웨어는 Chemstation(Agilent, USA) 을사용하였다. HPLC 분석을위해사용된컬럼은 Phenomenex사 (USA) 의 Gemini-NX C18 (5 μm, 3.0 mm 150 mm) 를사용하였고, 컬럼온도는 25 로유지하였다. 유속은 0.6 ml/min으로하였고, 주입량은 15 μl였다. 이동상은물 (HPLC grade) 과 acetonitrile (HPLC grade) 을혼합하여사용하였고, 용매비율은 0-5 min(3, B), 5-15 min(3 20, B), min(20 35, B), min(35 40, B), min(40 45, B), min(45 60, B), min(60 60, B), min(60 3, B) 로설정되었고, gradient elution 방법으로용리되었다. UV 파장은각성분의검출파장인 203 nm로설정되었다 (Table 2). 52

6 J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 Table 2. HPLC Analytical Condition of Marker Substance in Saenghwa-tang Column Phenomenex Gemini-NX C18 (5 μm, 3.0 mm 150 mm) Acetonitrile:water =25:75-68:32-25:75-25:75 (gradient elution) min DW(%) CH 3 CN(%) Mobile phase Detector UV wavelength at 203 nm Temperature 25 Flow rate 0.6 ml/min Injection volume 15 μl 4 LC/MS/MS 기기및분석조건일부시료의추가분석을위한 LC/MS/MS 기기는 Waters사 (Waters Corp., UK) 의 ACQUITY TQD로, Acquity TM Ultra Performance LC system과 Acquity TM TQD를구성으로하는 system 을사용하였다. 소프트웨어는 MassLynx TM 4.1과 Empower TM 2 system(waters Corp., UK) 을사용하였다. 분석에이용된 UPLC에적용된컬럼은 Acquity UPLC BEH C18 컬럼으로 2.1 mm 내경의 50 mm 길이였으며, pore size는 1.7 μm였다. 이동상조건은 0.1% 포름산수용액 (A) 과 0.1% 포름산을함유한아세토니트릴용액 (B) 로구성되어 gradient 분리방법을사용하였다. 용매비율은 0-4 min(30 90, B), min(90 30, B) 로설정되었다. 유속은 0.3 ml/min으로하였고, 주 입량은 5 μl였다. LC/MS/MS 분석조건으로 MRM(Multiple Reaction Monitoring) mode에서 monitor 되었으며, ESI(electrospray ionization source) interface 가사용되었다. Decursin 분석은 positive ion mode에서, liquiritin 분석은 negative ion mode에서수행하여확인하였다. Profile 데이터는 m/z 에서 scanning하였으며, decursin의이온화 monitoring 은 m/z 329>229로 liquiritin 의이온화 monitoring 은 m/z 417>225로확인하였다. Desolvation gas로질소를사용하였으며, decursin 분석을위한 collision voltage 와 energy 는각각 34와 28이었으며, liquiritin 분석을위한 collision voltage와 collision energy 는각각 34와 22이었다. ESI source temperature는 120 로설정되었다. 53

7 산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - Table 3. LC/MS/MS Analytical Condition of Marker Substance in Saenghwa-tang Column Waters Acquity BEH C18 (1.7 μm, 2.1 mm 50 mm) 0.1% Formic acid in water (A) : 0.1% formic acid in aetonitrile (B) =30:70-90:10-90:10-30:70 (gradient elution) min A B Mobile phase Temperature 25 Flow rate 0.3 ml/min Injection volume 5 μl MRM Ion Mode Specific Ion CV CE Mass Condition Decursin ES+ 329 > Liquiritin ES- 417 > ) 시험중지및탈락기준시험기간중발생한부작용으로인하여시험을계속할수없다고연구자가판단하거나피험자가시험중단을요구한경우, 유선염을비롯한모유성분에영향을줄수있는피험자의신체상의변화가발생한경우에해당피험자의시험참여를중지하였다. 피험자가자발적으로시험참여를중단하거나참가동의를철회한경우, 기타연구자가부적합하다고판단한자는탈락시켰다. 4. 통계처리연구결과의분석은한글판 SPSS for window 21.0을이용하여, P<0.05를유의기준으로하였다. Ⅲ. 결과 1. 일반적특성본임상시험에참여의사를밝힌사람은총 21명이었다. 이중모유채취에대 한거부감으로 1명이임상시험참여를중단하여총 20명이임상시험을시행하였다. 1) 연령및분만방식, 임신주수, 분만횟수대상산모의평균연령은 31.05±1.96세이며, 최소연령은 27세, 최대연령은 34 세였다. 대상산모의분만방식은자연분만 (Normal delivery, N/D) 이 15명 (75%), 제왕절개분만 (Caesarean delivery, C/S) 이 5명 (25%) 이었다. 대상산모의평균임신주수는 39.44±0.87주였으며, 최소임신주수는 38주 1일이었고, 최대임신주수는 41주 4일이었다. 대상산모의평균분만횟수는 1.5±0.69회였으며, 최소분만횟수는 1회, 최대분만횟수는 3회였다. 대상산모중초산부는 12명 (60%), 경산부는 8명 (40%) 이었다. 2) 신장및체중, 체질량지수 (BMI) 대상산모의신장은 ±4.11 cm, 임신전체중은 59.4±7.84 kg, 임신전체질량지수 (BMI) 는 22.85±3.09 kg/m 2, 만삭체중은 72.45±4.95 kg, 만삭 BMI는 27.9±2.37 kg/m 2, 입원당시체중은 68.79±5.01 kg, 54

J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 입원당시 BMI는 26.51±2.38 kg/m 2 이었다 (Table 4). 3) 모유채취시행일대상산모의모유채취는분만일을 1일로 하여분만일로부터 9.4±0.94일에이루어졌으며, 최소 8일에서최대 11일째에시행하였고, 입원일로부터 6.55±1.

8 J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 입원당시 BMI는 26.51±2.38 kg/m 2 이었다 (Table 4). 3) 모유채취시행일대상산모의모유채취는분만일을 1일로 하여분만일로부터 9.4±0.94일에이루어졌으며, 최소 8일에서최대 11일째에시행하였고, 입원일로부터 6.55±1.05 일에이루어졌으며최소 4일에서최대 8일째에시행하였다. Table 4. Characteristics of Study Subjects Characteristics Mean±SD Min d) Max e) Age 31.05± Height (cm) ± PG a) 59.4± Weight (kg) GMx b) 72.45± Initial c) 68.79± PG a) 22.85± BMI (kg/m 2 ) GMx b) 27.9± Initial c) 26.51± Values are number and mean±standard deviation (SD). a) PG (Pregravida), b) GMx (Gestational maximum), c) Initial (In admission day), d) Min (Minimum), e) Max (Maximum) 2. HPLC에의한모유시료의분석生化湯加減方을복용한산모에게서채취한모유의분석을위해 amygdalin, liquiritin, 6-gingerol, decursin 및 decursinol angelate 의표준물질을 HPLC을이용하여 profiling 을실시하였으며 (Table 2), 각표 준물질에대한 chromatogram 은다음과같다 (Fig. 1). 표준성분들의검출시간 (retention time) 은 amygdalin 이 3.6 min, liquiritin 은약 18.2 min, 6-gingerol 은약 33.6 min, decursin은약 43.2 min, decursinol angelate 는약 43.4 min으로확인되었다. Fig. 1. The Chromatogram of the Standard Component in the Standard Solution by HPLC. Amygdalin (1), Liquiritin (2), 6-Gingerol (3), Decursin (4), and Decursinol Angelate (5) as the Active Compound. 55

9 산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - 또한, amygdalin, liquiritin, 6-gingerol, decursin 및 decursinol angelate 등표준물질 5종의성분에대한검량선작성결 과 linearity(r ) 는유의하였으며, 직 선방정식은아래와같다 (Table 5). Table 5. Equation and Corelation Coefficient(r 2 ) Value of Active Compounds Analyte Equation Corelation coefficient(r 2 ) Amygdalin y=36.546x Liquiritin y= x Gingerol y= x Decursin y= x Decursinol angelate y= x 대상산모가복용한生化湯의 chromatogram 은다음과같다 (Fig. 2). 生化湯의주요약재들이함유하고있는표준성분들의검출시간은 amygdalin이약 13.6 min, liquiritin 은약 18.2 min, 6-gingerol 은약 33.6 min, decursin은약 43.2 min, decursinol angelate 는약 43.4 min으로확인되었다. Fig. 2. The Chromatogram of the Extract from Saenghwa-tang as a Medicinal Formula by HPLC-DAD. Amygdalin (1), Liquiritin (2), 6-Gingerol (3), Decursin (4), and Decursinol Angelate (5) as the Active Compound. 生化湯加減方을복용한대상산모에게서채취한모유의 chromatogram 에서 20 개의모유시료중해당표준성분의검 출시간과일치하는 limit of quantitation (LOQ) 수준의뚜렷한 peak는검출되지않았다. 그러나일부시료에서표준성분 56

모유시료 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에대해서 decursin 성분의검출여부를검토하고, HMSP 13~HMSP 18에대해 liquiritin 성분의검출여부를 LC/MS/MS를이용하여알아보았다. Fig. 3. The Chromatogram in a Breast Milk Extract by HPLC.

10 J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 중감초의 liquiritin (2), 당귀의 decursin (4) 및 decursinol angelate (5) 의검출시간과일치되는작은 peak가확인되었다 (Fig. 3). 하지만이들 peak들의 limit of detection(lod) 또는 signal to noise(s/n) ratio 가작아 peak로판단하기가어려워좀더정확한표준물질검증을위해 LC/MS/MS를이용한추가분석을실시하였다. 모유시료 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에대해서 decursin 성분의검출여부를검토하고, HMSP 13~HMSP 18에대해 liquiritin 성분의검출여부를 LC/MS/MS를이용하여알아보았다. Fig. 3. The Chromatogram in a Breast Milk Extract by HPLC. Amygdalin (1), Liquiritin (2), 6-Gingerol (3), Decursin (4) and Decursinol Angelate (5) as the Active Compound. The Lowest line ( ) means the Standard Compound. 3. LC/MS/MS에의한모유시료의분석 HPLC chromatogram 에서 LOD 또는 S/N ratio 가작아 peak로판단하기가어 려워일부시료를대상으로 LC/MS/MS 를이용하여추가분석을시행하였다. HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서나타난당귀의 decursin 에해당하 57

산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - 는 LC/MS/MS chromatogram 은다음과 같다 (Fig. 4). 다음에서 Std. 1-3 은 decursin 3 회반복이고, 해당시료의결과는 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서검출시간 2.

11 산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - 는 LC/MS/MS chromatogram 은다음과 같다 (Fig. 4). 다음에서 Std. 1-3 은 decursin 3 회반복이고, 해당시료의결과는 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서검출시간 2.96 min으로 decursin 이검출되었다. Fig. 4. Comparative Chromatograms of Decursin by LC/MS/MS. 당귀의 decursin 은 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서모두검출 되었으며, 그농도는각각 16, 2, 64, 11 ppb였다 (Table 6). Table 6. Contents of Decursin in Sample Extracts from the Breast Milk Sample number Contents of decursin (mg/l) HMSP HMSP HMSP HMSP HMSP 13~HMSP 18에서나타난감초의 liquiritin 에해당하는 LC/MS/MS chromatogram은다음과같다 (Fig. 5). 감 초의 liquiritin 은해당모유시료인 HMSP 13~HMSP 18에서모두검출되지않았다. 58

J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 Fig. 5. Comparative Chromatograms of Liquiritin by LC/MS/MS. Ⅳ. 고찰 세계보건기구 (WHO) 는모유수유가영아의건강한성장과발달을위한이상적인영양공급원이며, 생후 6개월까지모유만먹일것을권고하고있다 14).

12 J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 Fig. 5. Comparative Chromatograms of Liquiritin by LC/MS/MS. Ⅳ. 고찰 세계보건기구 (WHO) 는모유수유가영아의건강한성장과발달을위한이상적인영양공급원이며, 생후 6개월까지모유만먹일것을권고하고있다 14). 모유는각종면역물질과항체를포함하고있어감염질환발생을현저히줄여주며, 모유수유를한아기의지능지수가분유수유한아기보다더높은것으로알려져있다. 모유수유는산후출혈을예방하고, 체중감소에도움이되며, 산후우울증의발생을감소시키는등산모에게도긍정적인영향을미친다 15). 이러한모유수유의다양한장점이부각되면서우리나라역시모유수유증진운동의효과로 2000 년에약 10% 로저조하였던모유수유율이 2005년에는생후 1개월된아기의완 전모유수유율이 58.2 % 에달할만큼증가하였다 3). 하지만, 생후 1개월에과반수를넘는우리나라의모유수유율은생후 6개월에는 42.2%, 12개월에는 33.4% 정도로크게감소하는것으로보고되고있다 16). 모유수유를중단하게되는원인으로는유방울혈, 젖물리기의어려움, 유두손상, 젖양의부족, 유두통증등이있으며 17), 이외에도임신중혹은출산후발생한질환, 치과치료등을위해수유중복용한약물이아기에게미칠영향을걱정하여수유를중단하는경우도있다 18). 모유수유중복용한약물이아기에게미치는영향에대해정확히알지못하는불안감때문에산모가일시적으로모유수유를중단하기도하고, 임상에서의료인들역시모유수유를유지하며복용할수있는약물을선택하는데참고할만한정 59

13 산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - 보가부족하여산모에게정확히조언해줄수없는경우가많다. 모유수유중약물복용시약물성분이모유로이동하는기전에대해서현재까지다양한연구가진행되었다. 윤등 19) 은크게 Experimental model method(in vitro models와 In vivo models) 와 Predictive regression model method로나누어살펴보았다. Experimental model method 중 Animal model은백서와토끼의경우인간의모유에비해너무높은단백질과지질의구성을가지고있어, Milk/Plasma ratio(m/p ratio) 의차이가크며, 약물대사과정과비율, 혈장단백질결합, 신장제거율등이사람과다르므로그대로반영하기에어려움이있다. 인간을대상으로직접 milk 및 plasma의약물농도를측정하는것이가장이상적인방법이지만역시모유수유중인여성을실험대상으로해야한다는어려움이있다고밝혔다. 따라서 Predictive regression model method 는약동학적인이론을바탕으로 M/P ratio 를구할수있는방정식을도출하게되었으며, 이를통한추정값과그동안축적된약물의 M/P ratio 사이의비교연구를통하여방정식을실용화하는데주력한다고보고하고있다. 하지만이러한연구들에서약물의모유유입과아기에미치는영향에대한임상시험이대부분불가능하기때문에실제로적용하기에는한계가있다. 모유수유중복용하는약물의안전성이확인되지않은만큼아기에게미칠약물의부작용을우려하여, 산모들이산후제반증상을치료하기위해전통적으로널리활용되었던한약제제및천연식 품을복용하는경우도많다. 예를들어, 산후우울에 St. John's wort, 산후변비에는 senna, 수유중감기와같은상기도감염에 garlic과 echinacea를활용하는경우를보고하고있다 20). 하지만대부분민간요법으로쓰여오던효능위주로언급하며, 무작위화나대조군설정을하지않은연구가많아그안전성과효능에관해서정확한근거를제시하는연구는부족한실정이다. Barnes PM 등 21) 의조사에따르면, 22% 이상의미국여성들이한약제제를포함한천연제제의약물을건강을위해복용하고있으며, Nordeng H 등 22) 은출산후발생한질환으로인해복용하는약물의부작용에대한염려로모유수유중한약제제및천연식품복용이증가한다고보고하고있다. 강등 23) 의연구에따르면, 우리나라산모들은산후조리의개념에대해인식하고있을뿐만아니라, 출산후특별한산후조리의필요성에대해서도보편적으로공감하고있다. 이에따라국내에서는의료기관에부설된산후조리원이활발하게운영되고있으며, 산모들의한방산후조리프로그램에대한만족도및한약복용에대한인지도도높은편이다 24). 산후활용하는대표적인처방인生化湯은 傅靑主女科産後篇産後諸症治法에원방이수재되어있으며當歸, 川芎, 桃仁, 乾薑, 甘草로구성된다. 生化湯및그加減方은산후자궁의회복과산후복통, 산후혈훈, 태반잔류및산후출혈등각종병증의예방과치료에효과가있음이실험과임상연구를통해밝혀져있다 7). 生化湯은산후에특별한병증이발생하지않은경우분만후제 1일에서 2~3일내에 5~7일내외동안투 60

14 J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 여하는것이바람직하며, 특정증상이나질환이있을경우에는증상에따라가감하여기간에구애받지않고활용할수있는처방이다. 산후제반증상을치료하기위해임상에서많이활용되고있으며, 그효과에대한연구가활발히진행중이다 25,26). 일반적인한약재의안전성연구로는체내에잔류할수있는한약재내중금속함량과관련한연구로서, 물세척만으로도중금속이 20-38% 제거되어중금속함량을식약청기준치보다낮출수있었다는연구 27) 와전탕전과후의중금속, 잔류이산화황및잔류농약함량을조사한결과, 전탕후중금속함량은현저히감소하고, 잔류이산화황및잔류농약은검출되지않았다고밝힌연구 9,10) 가있었다. 또한한약제제나음료를이용하여중금속, 벤조피렌, 보존제, 당등의유해성물질을측정한결과기준치이하로안전하다는연구 28) 가있으며, 최근한약제제연구에서제시하고있는독성시험을통해다수의한약처방이단회독성또는반복독성이나타나지않는다는보고 29) 가있다. 임신중에사용하는처방인保生湯이임신중태아에미치는영향등한약이임신중모체및태아에미치는영향에관한연구 30,31) 들은다수있지만모유수유중노출되는한약성분의안전성을알아보는실험적연구는보고된바없으며, 모유를통해서한약이유아에게노출되는정도를측정하는방법에관한연구 19) 가있었다. 지금까지국내에서는모유의안전성을평가하는방법의하나로, 잔류성유기물질과같은유해물질이혈액과모유를통해노출되는경로에관한연구가다양하 게이루어졌다. 태아와신생아는유해물질노출에상대적으로취약하여낮은농도에서도장해발생가능성이높기때문에혈액과모유를통한노출수준조사는태아와신생아에서유해물질의노출을예측하기위한자료로서의미가있다. 서등 32) 은우리나라임산부의모체혈, 제대혈, 모유의 PFOA 와 PFOS 의농도를조사하여모체를통한태아와신생아의간접노출실태를파악하였고, 초유중 indicator PCBs의농도를측정하여영향인자를파악하고산모와유아의위해성평가를시도한연구가있었다 33). 한약은한약재하나의경우에도단일물질이아닌복합물질로구성되며, 대개여러한약재로구성된처방으로복용하기때문에기존에사용된단일성분인약물을대상으로혈장약물농도와모유약물농도를측정하여평가한방식을그대로적용하기에는무리가따른다. 따라서, 한약재의복합성분인처방자체를동일한단일약물로평가하거나복합성분인한약재를단일약물로평가할수있는방법의필요성에대해언급하며, Rath 등 34) 이한약재의유효성분을지표물질로삼아 HPLC를이용한측정방법을제시하고있다. 한약의표준화나약리활성물질분석의유용한도구가되고있는 HPLC는 U/V visible, RI(refractive index), fluorescence, ECD(electrochemical detector) 등검지기의발달로천연물, 의약품, 단백질, DNA 등의분리와분석에널리사용되고있다. HPLC를이용한분석법은표준품과의검출시간비교라는제한적특성과분석물질의표준품을반드시확보하고있어야하는단점이있다 12). 하지만 HPLC 61

15 산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - 의분리는분단위또는초단위로실시될수있으며시료의혼합물이각각의성분으로쉽게분리될수있는높은분리능을갖고있다. 또 HPLC의검출기는감도가좋아시료의 10-9 g 또는 1 ng까지도측정할수있으며, HPLC는유기물및무기물을포함한넓고다양한시료의형태까지응용될수있는장점이있어 19), 폭넓게활용되고있다. 최근 HPLC를이용하여한약재내의지표성분을분석하거나복합처방의지표성분을동시분석하는연구가활발하게진행되고있다. 엄등 35) 은감초내주요지표성분인 glycyrrhizic acid의 HPLC 정량분석을실시하여발효에의한지표성분변화를관찰하였고, 복합물질로이루어져있는한약처방을정성적, 정량적방법으로분석하기위해四物湯, 烏藥順氣散등의처방의대표적인지표물질을선정하여 HPLC를통해분석한연구가있었다 12,13). 모유수유중복용한약물이모유를통해아기에게미치는영향을파악하기위해 HPLC를사용하여성분분석을시도한연구는있었으나 36), 국내에서모유수유중복용한한약의지표물질을모유추출물시료에서분석한연구는아직까지보고된바없다. 산후의제반증상을치료하기위해임상에서보편적으로활용되는生化湯의경우, 변방인木香生化湯의안전성과유효성에관한임상연구보고 37) 가있을뿐, 처방의표준화나지표성분분석및모유를통해아기에게미치는영향에대한임상적연구는아직이루어지지않은상태이다. 본연구에서는生化湯加減方을복용하고있는 20명의건강한산모를대상으로 하여한약복용후이행유에해당하는모유를채취한후, HPLC와 LC/MS/MS 를이용하여生化湯의지표물질로선정한 amygdalin, liquiritin, 6-gingerol, decursin 및 decursinol angelate를분석하였다. 먼저, HPLC를이용한분석결과모든시료에서生化湯의지표물질로보이는성분은관찰되지않았다. 다만감초의 liquiritin 의 peak retention time과유사한 peak이 HMSP 13~HMSP 18에서나타났고, 당귀의 decursin 및 decursinol angelate 의 peak retention time과유사한 peak이 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서확인되었다. 이는 LOD 또는 S/N ratio 가작아 peak 로판단하기위해서는 LC/MS 또는 LC/MS/MS 등의보다감도가높은기기를이용하여분석할필요성이있었다. 의심되는모유시료를대상으로 LC/MS/MS 를이용하여추가분석한결과, 당귀의 decursin 은 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서모두검출되었으며, 그농도는각각 16, 2, 64, 11 ppb였다. 감초의 liquiritin은 HMSP 13~HMSP 18 에서모두검출되지않았다. 당귀의약리효과는 decursin 과 decursinol angelate 와관련하여보고되고있으며, 항종양효과, 박테리아성장억제효과, 순환계질환과관련된효과, 대사억제효과, 항염증효과, 항산화효과, 인지개선증진효과등으로요약할수있다 38). 또한, decursin과 decursinol angelate의급성및아급성독성연구보고에서간독성및신독성을보이지않으며, 혈액독성도없다는것을밝히고있다 39). 일반적으로약물이모유에들어가는양은산모의혈장역동학과지질의용해성, 62

16 J Korean Obstet Gynecol Vol.26 No.4 November 2013 분자량과기타요소들에의해결정되는데, 그중첫번째원칙은모유에서는모체몸속약물의 1% 이하보다적게발견된다는것이며, 아기의무게별약물용량이모체의것보다 10% 이하이면그약물은아기에게안전하다고볼수있다 5). LC/MS/MS를이용한질량분석을통해일부모유시료에서당귀의 decursin 성분이검출되었으나, 실제아기에게영향을미칠만한양은아닌것으로판단된다. 이상의결과로미루어보아모유수유중한약복용시모유를통해유아에게미치는정도를파악하기위한방법중에서유효성분의정량화를통한 Human model의접근이가장타당하며 19), 본연구는이를최초로시도한임상시험이었다는데그의의가있다. 향후더많은수의모유시료를수집하여확대연구를진행하거나, 生化湯加減方을복용하기전과복용후의모유시료를비교연구한다면生化湯加減方복용이모유에미치는영향에관해더욱정확하게검증할수있을것으로사료된다. Ⅴ. 결론 모유수유중生化湯加減方을일정기간복용한 20명의산모의모유를채취하여모유에나타난生化湯加減方의지표물질 amygdalin, liquiritin, 6-gingerol, decursin 및 decursinol angelate 의함량을정량분석하여다음과같은결과를얻었다. 1. 본연구에참여한산모의평균연령은 31.05±1.96세이며, 자연분만이 15명, 제 왕절개분만이 5명이었고, 초산부는 12 명, 경산부는 8명이었다. 대상산모의모유채취는분만일로부터 9.4±0.94일에이루어졌다. 2. HPLC 분석결과, 20개의모유시료중生化湯의해당표준성분의 peak retention time과일치하는 LOQ 수준의 peak는검출되지않았다. 3. LC/MS/MS 분석결과, 당귀의 decursin 은 HMSP 02, HMSP 04, HMSP 06, HMSP 11에서검출되었으며, 그농도는각각 16, 2, 64, 11 ppb였다. 감초의 liquiritin 은 HMSP 13~HMSP 18에서모두검출되지않았다. 투고일 : 2013년 10월 16일 심사일 : 2013년 10월 29일 게재확정일 : 2013년 11월 8일 참고문헌 1. Lawrence PB. Breast milk: Best source of nutrition for term and preterm infants. Pediatr Clin North Am. 1995;41: International Pediatric Association. Recommendations for action programmes to encourage breastfeeding. Acta Pediatr Scand. 1976;65(3): 육지형등. 한국마더세이프전문상담센터의수유부약물상담내용분석 ; 5년간의경험. 대한주산회지. 2011; 22(2): Fleishaker JC. Models and methods for predicting drug transfer into human milk. Advanced Drug Delivery Reviews. 2003;55(5):

17 산모의한약복용이모유에미치는영향 - HPLC 와 LC/MS/MS 를이용한생화탕지표성분분석 - 5. Rebecca M, et al. 모유수유 A to Z. 서울 : 민족의학신문. 2010: 장석우, 허수정, 조현주. 서울시소재산후조리원의의료인연계및한방의료현황조사. 대한한방부인과학회지. 2011;24(4): 이태균, 오주석, 김동일. < 부청주여과 > 를중심으로살펴본생화탕의운용에대한고찰. 대한한방부인과학회지. 1999; 12(2): 김성준. 한의사가처방한한약투여는안전합니다. 서울 : 민족의학신문 서창섭등. 전탕전과후의중금속, 잔류농약및잔류이산화황의농도변화- 소화기계약을중심으로. 대한본초학회지. 2009;24(1): 서창섭등. 전탕전과후의중금속, 잔류농약및잔류이산화황의농도변화-감기약을중심으로. 대한본초학회지. 2008;23(4): Hale TW. Medications and mother's milk. 14th edition. Amarillo:Pharmasoft Publishing. 2010: 유영법등. HPLC-MS/MS에의한사물탕의지표성분분석. 대한본초학회지. 2007;22(2): 서창섭, 김정훈, 신현규. HPLC-PDA 를이용한오약순기산중 6종성분의동시분석. 대한한의학방제학회지. 2012; 20(2): Sobti J, Mathur GP, Gupta A. WHO's proposed global strategy for infant and young child feeding: a viewpoint. J Indian Med Assoc. 2002;100(8): 대한산부인과학회. 산과학. 서울 : 군자출판사. 2007: 연승은, 이혜경. 산후모유수유교육 방법에따른초산모의모유수유적응, 태도및실천효과. 여성건강간호학회지. 2012;18(2): 양현주, 서지민. 효과적인모유수유개념분석. 여성건강간호학회지. 2011; 17(4): 차선화등. 수유중약물복용에따른불안과수유율. 대한주산회지. 2003; 14(3): 윤영진등. 모유를통한한약의유아노출정도측정법고찰. 대한한방부인과학회지. 2005;18(2): Budzynska K, et al. Systematic review of breastfeeding and herbs. Breastfeed Med. 2012;7(6): Barnes PM, Bloom B, Nahin RL. Complementary and alternative medicine use among adults and children: United States, Natl Health Stat Rep. 2008;10(12): Nordeng H, Havnen GC. Use of herbal drugs in pregnancy: a survey among 400 Norwegian women. Pharmacoepidemiol Drug Saf. 2004;13: 강종근, 이인선, 조혜숙. 연령에따른산후조리에대한인식과수행정도가산후풍발생에미치는영향. 대한한방부인과학회지. 2008;21(3): 박장경등. 협진의뢰산모의한방산후조리현황분석및만족도조사. 대한한방부인과학회지. 2010;23(1): 하정일, 김동일. 가미생화탕과가미보허탕의연속투여가산후체중정체와체성분변화에미치는영향. 대한한방부인과학회지. 2007;20(2): 박소월등. 보허탕과생화탕의산후회복효과에대한비교연구. 대한한방 64

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한약재품질표준화연구사업단 단삼 ( 丹參 ) Salviae Miltiorrhizae Radix 생약연구과

한약재품질표준화연구사업단 단삼 ( 丹參 ) Salviae Miltiorrhizae Radix 생약연구과 - 1 - KP 11 CP 2015 Salvia miltiorrhizae Radix Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma Salvia miltiorrhiza Bunge Salvia miltiorrhiza Bunge salvianolic