J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 37(10), 1363~1368(2008) DOI: 10.3746/jkfn.2008.37.10.1363 연구노트 초음파처리를이용한 Haematococcus pluvialis로부터의아스타잔틴의추출및분석 김소영 1,2 조은아 1 유지민 1 인만진 3 채희정 1,2 1 호서대학교식품생물공학과, 식품기능안전연구센터 2 SGM바이오텍 ( 주 ) 3 청운대학교식품영양학과 Extraction and Analysis of Astaxanthin from Haematococcus pluvialis Using Sonication Soyoung Kim 1,2, Eunah Cho 1, Jimin Yoo 1, Man-Jin In 3, and Hee Jeong Chae 1,2 1 Dept. of Food and Biotechnology, Center for Food Function and Safety, Hoseo University, Asan 336-795, Korea 2 SGM Biotech Co., Ltd, Asan 336-795, Korea 3 Dept. of Human Nutrition and Food Science, Chungwoon University, Hongseong 350-701, Korea Abstract The extraction and quantitative analysis conditions for astaxanthin from Haematococcus pluvialis, and the structural characteristics of H. pluvialis extract, H. pluvialis hydrolysate and synthetic astaxanthin were investigated using UV/visible and FT-IR spectrometers. Astaxanthin was dissolved in methanol, and then treated to enhance the solubility by sonication for 45 min. With sonication pretreatment, the solubility of astaxanthin increased up to 1.5 times compared to that without sonication. The extracts were hydrolyzed by cholesterol esterase for the analysis of H. pluvialis extract containing astaxanthin ester. A HPLC method using reverse phase C18 column with methanol-water (95:5, v/v) as mobile phase was developed to analyze astaxanthin. After hydrolysis, the absorption spectrum of H. pluvialis hydrolysate was changed to similar pattern to synthetic astaxanthin, confirming the extraction and analysis condition of astaxanthin from H. pluvialis. Key words: astaxanthin, Haematococcus pluvialis, HPLC analysis 서론최근식생활수준의향상과더불어생활환경에의해체내에활성산소가점차증가하고있는추세이고, 이러한활성산소는노화진행의가속화와함께각종질병을유발하는원인이된다. 또한노화억제와질병치료에영향을미치는기능성식품과천연물에대한관심이높아지며, 항산화물질에대한관심이증가되고있다. 그중지용성비타민 E인알파-토코페롤 (α-tocopherol) 에비하여항산화력이 550배에해당하는강력한항산화물질인아스타잔틴 (astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione) 은갑각류, 조류등의해양생물에존재하는케토-카로티노이드 (keto-carotenoid) 로서베타-카로틴 (β-carotene) 과매우유사한구조를지니고있다 (1). 이물질은면역증강 (2), 항암효과 (3,4), 시력보호 (5) 등여러가지다양한기능성이입증되면서의약품이나화장품, 식품등의소재로활용이기대되고있는물질이다. 아스타잔틴의천연공급원으로는게, 새우등의갑각류나효모, 해양생물이있다. 갑각류 ( 게, 새우 ) 에서추출된아스타잔틴은추출이용이한장점은있으나높은회분과키틴함량으로사용이제한되고있다 (6). 효모인 Phaffia rhodozyma는소량의아스타잔틴을함유하고생체이용률이낮은 3R, 3'R form 만을생산하여현재식품으로사용이금지되어있고동물사료로만활용되고있는실정이다 (7-9). Haematococcus pluvialis는새로이주목되고있는아스타잔틴의생산원료로서, 헤마토코커스는아스타잔틴의함량이 1.5~3% 수준으로다른공급원에비해높은함량을지니고있고, 생체내에서안정한에스터 (ester) 형태의아스타잔틴을 95% 이상생산한다. 또한, 생체이용률이높은이성체인 3S, 3'S isomer 를생산하여상업화가능성이높은공급원이다 (10-12). 헤마토코커스는광합성미생물중의하나인녹색단세포조류 (unicellular green algae) 로외부성장환경에따라크게두가지형태, 즉두개의편모를가지고유영하는녹색의 Corresponding author. E-mail: hjchae@hoseo.edu Phone: 82-41-540-5642, Fax: 82-41-532-5640
1364 김소영 조은아 유지민 인만진 채희정 영양세포형태 (green vegetative cells) 와이동성이없는적색의휴면포낭세포형태 (red cyst cells) 로나눠진다. 우호적환경에서녹색의영양세포가안정적으로성장하다가여러가지외부환경조건변화에따라발생하는비우호적환경에노출시녹색의세포들은자기보호기작에따라적색의포낭세포로전환하며, 적색의휴면단계에서아스타잔틴을다량축적한다 (13,14). 기존에아스타잔틴등의카로테노이드류의함량을분석하는방법으로는분광광도법을이용한방법과 HPLC를이용한방법이알려져있다 (6). 분광광도법은분석은간단하지만다른카로테노이드까지함께분석되기때문에총카로테노이드함량분석시주로이용되고, 정확한아스타잔틴의함량산출을위해서는 HPLC 방법이많이이용되고있다. 그러나, 헤마토코커스추출물의 HPLC 분석시, 헤마토코커스추출물은에스터형태의아스타잔틴을다량함유하고있어일반적인분석시스템 ( 역상칼럼, UV/visible 검출기 ) 으로는검출에어려움이있다. 따라서헤마토코커스에서추출된아스타잔틴은효소처리나염기성용매를이용하여에스터결합을제거시킨후정량하는방법이알려져있다 (15-19). 본연구에서는 H. pluvialis cracked cell로부터추출된아스타잔틴의함량분석을위해 HPLC 분석방법을확립하였고, UV/visible 및 FT-IR 분광분석법을이용하여분광학적으로헤마토코커스추출물과합성아스타잔틴의구조를비교분석하였다. 재료및방법재료및시약합성아스타잔틴 (astaxanthin) 은 Sigma사 (St. Louis, MO, USA) 의제품으로서순도가 92% 이상인것을사용하였다. 아스타잔틴의추출원료인 Haematococcus pluvialis cracked cell은순도 1.5% 의 Parry Nutraceutical사 (Pudukkottai, India) 의제품을사용하였고, 비교를위해사용한 Phaffia rhodozyma 추출물은아스타잔틴의순도가 0.8% 인 Astaxanthin Partners사 (Yorkshire, UK) 의제품을구입하였다. Cholesterol esterase는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였고, 메탄올 (methanol), 증류수, 아세토나이트릴 (acetonitrile) 은 Burdick & Jackson사 (Muskegon, MI, USA) 의제품으로모두 HPLC급을사용하였다. 그밖의모든시약은 1급이상의것을사용하였으며실험에사용된모든증류수는 3차증류수를이용하였다. 초음파처리에의한아스타잔틴의추출조건 0.05 M 인산완충용액 (ph 5~7) 에헤마토코커스분말을 0.5%(w/v) 의비율로현탁시킨후, 40 o C에서 1시간동안반응시켰다. 반응종료후, 원심분리로침전물을회수하여아세톤을 0.5%(w/v) 의농도로첨가한후초음파처리 (75 min, 40 khz; Power sonic 510, Hwashin, Korea) 하여아스타잔틴을추출하였다. 추출물의가수분해전처리조건헤마토코커스로부터추출된에스터형아스타잔틴을유리상태의아스타잔틴으로전환시키기위해헤마토코커스추출물을다음과같이효소처리하였고, 이를헤마토코커스가수분해물 (H. pluvialis hydrolysate) 라고명명하였다. 용매추출물 1.5 ml를취하여 2 ml의 0.05 M Tris-HCl 완충용액 (ph 7.0) 과혼합하여 37 o C에서 2분동안예열시킨후, cholesterol esterase(1.7~6.8 unit/ml, 0.05 M Tris-HCl 완충용액, ph 7.0) 0.5 ml를첨가하여 37 o C로조절된항온수조에서 30~90분까지반응시켰다. 반응이끝난후, 무수황산나트륨 (anhydrous sodium sulfate, Na 2SO 4) 0.44 g과석유에테르 (petroleum ether) 4 ml를첨가하여 30초동안강하게교반한후원심분리 (3200 rpm, 10 min) 하여석유에테르층을회수하였다. 회수된층을새로운시험관으로옮겨용매를휘발시킨후, 메탄올에용해시켜 HPLC 분석에사용하였다 (15,16). HPLC 분석조건 HPLC 시스템 (Agilent 1100, Agilent Technologies Inc., CA, USA) 을이용하여컬럼은 Apollo C18(5 μ, 4.6 250 mm, Alltech Associates, IL, USA), 검출기는 UV/visible 검출기 (474 nm) 를사용하여유속 1 ml/min 로하고컬럼오븐온도는 40 o C에서, 이동상으로는메탄올과증류수를 95:5 의비율로혼합한용매를사용하여분석하였다. 시료는메탄올에용해하여초음파처리 (45 min, 40 khz; Power sonic 510, Hwashin, Korea) 를한후, 분석에사용하였다. 상대용해도 (relative solubility) 는 45분간초음파처리한시료의피크의면적을 100으로하여상대적세기 (%) 로환산하여나타내었다. 분광학적분석 UV/visible spectrophotometer(cary 100 Conc, Varian, CA, USA) 를이용하여실온에서 600~350 nm의파장에서흡광스펙트럼을측정하였고, FT-IR spectrometer(spectrum GX, Perkin Elmer, CT, USA) 를사용하여실온에서 4000~ 400 cm -1 에서스펙트럼을측정하여구조를확인하였다. 결과및고찰헤마토코커스아스타잔틴의추출 분석조건합성아스타잔틴과헤마토코커스추출물 (H. pluvialis extract) 의아스타잔틴함량을분석하기위해 HPLC 분석조건을확립하였다. 합성아스타잔틴을메탄올에용해하여단순히교반한후 HPLC 분석을한결과 HPLC 크로마토그램상피크면적이작아정량분석에어려움이있었으며합성아
초음파처리를이용한 Haematococcus pluvialis 로부터의아스타잔틴의추출및분석 1365 스타잔틴의용해도향상을위해용매 ( 아세토나이트릴, 클로로포름, 헥산, 메탄올 ) 와용해조건 ( 교반, 초음파처리 ) 을변경하여실험하였다. 용매로서는메탄올을사용하였을경우 HPLC 크로마토그램상명확히피크분리가일어나는것을확인하였고, 용해조건은용매에넣고단순히교반하는것보다초음파처리를하는것이용해가잘이루어지는것을알수있었다. 교반은 4시간이상실시하여도초음파처리와비교하여크게용해율이증가하지않음을확인하였다. Fig. 1 에서보는바와같이 45분정도초음파처리를했을때교반시간을길게하는것보다아스타잔틴이최대한메탄올에용해되는것으로나타났고, 향후 HPLC 분석에사용한모든아스타잔틴시료는 45분동안 40 khz의조건에서초음파처리를통해메탄올에용해한후사용하였다. 헤마토코커스추출물의 HPLC 분석시, 헤마토코커스추출물은에스터형태의아스타잔틴을다량함유하고있어본연구에서사용한분석시스템 ( 역상칼럼, UV/visible 검출기 ) 으로는검출에어려움이있었다. 기존의보고된연구결과에서도헤마토코커스에서추출된아스타잔틴은 cholesterol esterase 효소처리나염기성용매를이용하여에스터결합 을제거하고 HPLC 분석을수행하였을때아스타잔틴이검출되는것으로보고되었다 (15-19). 본연구에서는 cholesterol esterase를이용해헤마토코커스추출물을가수분해처리를하여조제한헤마토코커스가수분해물 (H. pluvialis hydrolysate) 의 HPLC 분석을수행하였다. 가수분해시 cholesterol esterase 의최적반응비와시간을확인하기위해 1.7~6.8 unit/ml의농도에서 30~90분까지반응시켜분석한결과 3.4~6.8 unit/ml 의농도에서는큰차이를나타내지않았고, 45~90분간반응시에도차이가없음을확인할수있었다. 따라서헤마토코커스추출물을가수분해처리시 cholesterol esterase의 3.4 unit/ml를첨가하고 45분간반응시킨후분석하였다. 헤마토코커스추출물을 cholesterol esterase를이용해에스터결합을끊어유리아스타잔틴으로전환시킨후분석시표준물질인합성아스타잔틴과같은 (a) 100 (a) Relative solubility (%) 90 80 70 RT=8.69 min (b) 60 0 10 20 30 40 50 60 70 Sonication time (min) 100 (b) Relative solubility (%) 90 80 70 RT=8.65 min (c) 60 50 0 1 2 3 4 5 Stirring time (hr) Fig. 1. Effects of sonication (a) and stirring (b) for the pretreatment of astaxanthin sample. Fig. 2. HPLC chromatogram of H. pluvialis extract (ester form) before enzymatic hydrolysis (a), H. pluvialis hydrolysate (free form) (b) and synthetic astaxanthin (c).
1366 김소영 조은아 유지민 인만진 채희정 R 2 = 0.9951 Fig. 3. Calibration curve for HPLC analysis of astaxanthin. 시간대 (RT=8.6 min) 에서피크가검출되는것을확인하였다 (Fig. 2(c)). 반면, cholesterol esterase를처리하지않고헤마토코커스추출물을분석한경우피크가분리되지않았다 (Fig. 2(b)). 기존의보고된문헌에의하면유리아스타잔틴을대부분함유하는갑각류나효모의경우추출후가수분해를하지않고역상칼럼에서도분석이되는것을볼수있었고 (8,9,19), 본연구에서도헤마토코커스와비교를위해효모 (Phaffia rhodozyma) 에서추출한아스타잔틴을동일한조건으로분석하였을때 cholesterol esterase를처리한후오히려함량이감소되는것을확인할수있었다 ( 데이터제시생략 ). 이것은유리형의아스타잔틴의경우오히려 cholesterol esterase 효소에의해변성이일어나는것을보여주는결과이다. 에스터형태의아스타잔틴을분석시에는가수분해처리를통해에스터결합을제거시킨후분석을수행해야하는것을확인할수있었다. HPLC 분석조건은 C18 역상칼럼 (Apollo C18) 을사용하고유속은 1 ml/min, 이동상은메탄올과물의혼합비는 95:5 로하였을때, 추출물의피크가명확히분리되었고표준물질인합성아스타잔틴과헤마토코커스가수분해물의분석이원활히이루어지는것을확인할수있었다. 아스타잔틴의함량은표준물질의분석유효범위인 12.5 ppm부터 0.78 ppm 까지작성된검량선으로부터산출하였다 (Fig. 3). 기존의보고된아스타잔틴의 HPLC 분석에서도일반적으로 C18 역상칼럼을사용하였고, 이동상은메탄올, 아세토나이트릴, 다이클로로메탄과물중 2가지이상혼합된용액이주로사용되었다 (20-25). 분광학적분석합성아스타잔틴, 헤마토코커스추출물및효소처리헤마토코커스추출물의구조적차이를검토하기위해 UV/visible 스펙트럼과 FT-IR 스펙트럼을분석하였다. UV/visible spectrophotometer를사용하여 300~600 nm Fig. 4. UV/visible spectra of H. pluvialis extract (a), H. pluvialis hydrolysate (b) and synthetic astaxanthin (c). 파장범위에서최대흡수파장을검토한결과, Fig. 4에서보는바와같이합성아스타잔틴은 476 nm(fig. 4(c)), 헤마토코커스추출물은 408 nm에서최대흡수값을나타냈고 (Fig. 4(a)), cholesterol esterase를이용하여에스터기를제거시켜유리형으로전환시킨헤마토코커스가수분해물은 409, 466 nm에서최대흡수값을나타내었다 (Fig. 4(b)). 합성아스타잔틴 (Fig. 4(c)) 과헤마토코커스추출물 (Fig. 4(a)) 은다른흡수파장을나타냈는데, 이것은순도에의한차이에기인하기보다는합성아스타잔틴이유리형인반면헤마토코커스추출물이에스터형의아스타잔틴을함유하는등구조적차이가있음을보여주는결과이다. 또한 cholesterol esterase의처리에의해아스타잔틴을유리형으로전환시킨헤마토코커스가수분해물의스펙트럼 (Fig 4(b)) 은가수분해전의스펙트럼과비교하여 409 nm 파장에서의흡수율이줄어드는것을확인하였고, 466 nm의파장에서새로운피크가확인되었다. 이러한결과는추출물이효소에의해유리형으로구조적으로전환된것을완전히뒷받침할수는없으나, 가수분해처리에의해어느정도추출물내의조성물에변화가일어났음을간접적으로시사하는결과이다. FT-IR 스펙트럼분석을통해합성아스타잔틴과에스터형헤마토코커스추출물과가수분해효소처리헤마토코커스가수분해물 ( 유리형 ) 의구조적차이를검토하였다. Fig. 5에서보는바와같이유리형합성아스타잔틴과헤마토코커스추출물 ( 에스터형아스타잔틴함유 ) 과헤마토코커스가수분해물 ( 유리형아스타잔틴함유 ) 은구조적차이를나타냈다. 유리형합성아스타잔틴의경우 1750 cm -1 에서 C=O 결합피크, 3500 cm -1 에서 O-H 결합피크와 1000 cm -1 에서 C-O 결합피크가강하게나타난것으로확인할수있었다 (Fig. 5(c)). 이것은 Chen(26) 등과 Yuan(27) 등이보고한합성아스타잔틴의 FT-IR 스펙트럼과비슷한경향을나타냄을확인할수있었다. 헤마토코커스추출물의스펙트럼에
초음파처리를이용한 Haematococcus pluvialis 로부터의아스타잔틴의추출및분석 1367 (b) (a) 틴과유사한패턴으로변화하는것을확인함으로써헤마토코커스로부터의아스타잔틴의추출및분석조건을확립하였다. (c) 문 헌 4000 3000 2000 Wave number (cm -1 ) 1000 Fig. 5. FT-IR spectra of H. pluvialis extract (a), H. pluvialis hydrolysate (b) and synthetic astaxanthin (c). 서는유리형합성아스타잔틴의스펙트럼과다르게 3300 cm -1 에서피크가나타났으나 (Fig. 5(b)), 가수분해처리후에는피크가나타나지않음을확인하였다 (Fig. 5(a)). 또한, 유리형합성아스타잔틴의경우에는 1750 cm -1 에서 C=O 결합피크가단일하게나타났으나, 헤마토코커스추출물의스펙트럼에서는 C=O 피크옆에에스터결합상의 alkyl chain에서유래한것으로판단되는피크하나가붙어서나타났으며, 가수분해후에는피크가없어진것을확인하였다. 헤마토코커스가수분해물, 헤마토코커스추출물및합성아스타잔틴간에스펙트럼이일치하진않았으나, 유리형의아스타잔틴을함유할것으로추정되는헤마토코커스가수분해물과합성아스타잔틴과같은경우에는피크의양상이비슷하게나타났고, 헤마토코커스추출물과헤마토코커스가수분해물은구조적차이를나타냄을확인하였다. 요 본연구에서는헤마토코커스플루비알리스 (H. pluvialis) 의파쇄세포 (cracked cell) 로부터추출된아스타잔틴의 HPLC 분석방법을확립하고, UV/visible 및 FT-IR 분광분석법을이용하여헤마토코커스추출물과합성아스타잔틴의구조적특성을조사하였다. 아스타잔틴을메탄올용매에녹이고, 45분정도초음파로처리할경우교반처리하는경우보다 1.5배정도용해율이높아지는것을확인하였다. 에스터형태로존재하는추출물중의아스타잔틴의분석을위해 cholesterol esterase를이용해헤마토코커스추출물을가수분해처리를하여유리형으로전환시킨후 HPLC 분석을수행하였다. 아스타잔틴의함량을분석하기위해역상칼럼 (C18) 과 UV/visible 검출기를사용하였고, 이동상은메탄올과물 (95:5) 의혼합용매를사용하여분석하였다. 효소처리후, 헤마토코커스추출물의흡수스펙트럼이합성아스타잔 약 1. Shimidzu N, Goto M, Miki W. 1996. Carotenoids as singlet oxygen quenchers in marine organisms. Fish Sci 62: 134-137. 2. Bendich A. 1991. Non vitamin a activity of carotenoids: immuno enhancement. Food Sci Technol Res 2: 127-130. 3. Chew BP, Park JS, Wong MW, Wong TS. 1999. A comparison of the anticancer activities of dietary beta-carotene, canthaxanthin and astaxanthin in mice in vivo. Anticancer Res 19: 1849-1854. 4. Jyonouchi H, Sun S, Iijima K, Gross M. 2000. Antitumor activity of astaxanthin and its mode of action. Nutr Cancer 36: 59-65. 5. Snodderly DM. 1995. Evidence for portection against age-related macular degeneration by carotenoids andantioxidant vitamins. Am J Clin Nutr 62: 1448-1461. 6. Lee CK. 2003. Process development for astaxanthin production by microalgae. Ministry of Maritime Affairs & Ficheries, Korea. 7. Johnson EA, Schroeder WA. 1995. Microbial carotenoids production. Adv Biochem Eng 53: 119-178. 8. Schroeder WA, Johnson EA. 1993. Antioxidant role of carotenoids in Phaffia rhodozyma. J Gen Microbiol 39: 907-912. 9. Sedmak JJ, Weerasinghe DK, Jolly SO. 1990. Extraction and quantitation of astaxanthin from Phaffia rhodozyma. Biotechnol Technol 4: 107-112. 10. Lorenz RT, Cysewski GR. 2000. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Tibtech 18: 160-167. 11. Park EK, Seo MW, Lee CK. 2001. Effects of medium compositions for the growth and the astaxanthin production of Haematococcus pluvialis. Kor J Appl Microbiol Biotechnol 29: 227-233. 12. Grung M, Jensen SL. 1991. Algal carotenoids 51. Secondary carotenoids 2. Haematococcus pluvialis aplanospores as a source of (3S,3S)-astaxanthin esters. J Appl Phycol 4: 165-171. 13. Kobayashi M. 2003. Astaxanthin biosynthesis enhanced by reactive oxygen species in the green alga Haematococcus pluvialis. Biotechnol Bioprocess Eng 8: 322-330. 14. Kang CD, Park TH, Sim SJ. 2006. Biological CO 2 fixation to antioxidant carotenoids by photosynthesis using the green microalga Haematococcus pluvialis. Kor Chem Eng Res 44: 46-51. 15. Orosa M, Franqueira D, Cid A, Abalde J. 2005. Analysis and enhancement of astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis. Bioresour Technol 96: 373-378. 16. Kim ZH, Kim SH, Lee HS, Lee CG. 2006. Enhanced production of astaxanthin by flashing light using Haematococcus pluvialis. Enzyme Microb Technol 39: 414-419. 17. Lim KB, Lee EK, Lee SY. 2003. Extraction method of astaxanthin using supercritical fluid extraction. Korean Patent 0465556. 18. Han JY, Lee SJ, Jung MK, Choi SK. 2000. Process for extracting astaxanthin pigment from blue-green algae and extracted pigment thereof. Korean Patent 0411364.
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