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이나 창
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1 한국산학기술학회논문지 Vol. 10, No. 1, pp , 2009 Haematococcus pluvialis 로부터 Haematococcus 추출물제조공정에서효소처리가추출효율과항산화활성에미치는영향 인만진 1* Effect of Enzyme Treatments on the Extraction Efficacy and Antioxidant Activity of Haematococcus Extract from Haematococcus pluvialis Man-Jin In 1* 요약우수한항산화제로알려진 astaxanthin을함유한 H. pluvialis 균체로부터작용기작이상이한 exo형과 endo형의단백질분해효소와복합다당류분해효소를이용하여식품용 haematococcus 추출물을효율적으로제조할수있는방법을조사하였다. 상업용단백질분해효소로는 Alcalase (endo형) 와 Flavourzyme (exo형) 을복합다당류분해효소로는 Viscozyme을사용하였다. 단백질분해효소는 endo형과 exo형을병용하는것이추출물의 astaxanthin 함량을증가시켰다. Viscozyme과함께 2종류의단백질분해효소를사용하는경우에는 Alcalase와 Flavourzyme을병용하여 1차로처리한후 Viscozyme을 2차로사용하는 2단계가수분해방법이적절하였다. 이조건에서 astaxanthin 함량은효소를사용하지않은대조구에비하여 320% (529 μg/g 2,256 μg/g) 이상향상되었다. 또한 DPPH법으로조사한항산화활성은 astaxanthin 함량에비례하여증가하였으며, 1차로 Alcalase와 Flavourzyme을병용하여처리한후 2차로 Viscozyme을사용하는조건에서가장우수하였다. Abstract An efficient production method of food-grade heamatococcus extract was developed based on stepwise enzymatic hydrolysis. In the first step, Haematococcus pluvialis cells hydrolysis carried out with commercially available exopeptidase(flavourzyme) and endopeptidase (Alcalase), resulted in increased astaxanthin content. In the second step, proteolytic hydrolyzed H. pluvialis cells treated with hetero-polysaccharides hydrolytic enzyme (Viscozyme). By two-stage treatments using Alcalase and Flavourzyme and Viscozyme, the highest astaxanthin content was obtained. The astaxanthin content was remarkably enhanced by 320% (529 μ g/g 2,256 μg/g) than that of the non-treated extract. And then, antioxidative activities determined by DPPH method were increased with increasing the astaxanthin content in haematococcus extract prepared by enzymatic hydrolysis. Key Words : Alcalase, astaxanthin, Flavourzyme, haematococcus extract, Viscozyme 1. 서론 천연의주황색혹은붉은색색소성분인 astaxanthin(3,3 -dihydroxy-β,β -carotene-4,4'-dione) 은 ketocarotenoid로 polyisoprenoid와 benzenoid ring의결합체이며 vitamin C나 α-tocopherol보다항산화력이 배우수하여면역증강, 항암, 시력보호등여러가지기능성이입증되었으며의약품, 화장품, 식품, 사 1 청운대학교식품영양학과 료등의첨가물로활용이기대되고있는물질이다 [1-3]. Astaxanthin을제조하는방법은화학적합성법, 갑각류껍질로부터추출법, 붉은효모인 Phaffia rhodozyma와미세조류인 Haematococcus pluvialis를배양한후추출하는방법이있다 [4]. 화학적으로합성된 astaxanthin은생체이용률과안정성이낮으며, 게나새우껍질에서추출된 astaxanthin은추출은용이하나불순물함량이높아사용상의제한이있다. 또한 P. rhodozyma는 astaxanthin 생산 * 교신저자 : 인만진 (manjin@chungwoon.ac.kr) 접수일 08 년 12 월 02 일수정일 09 년 01 월 02 일게재확정일 09 년 01 월 16 일 194

2 Haematococcus pluvialis 로부터 Haematococcus 추출물제조공정에서효소처리가추출효율과항산화활성에미치는영향 량이적으며생체이용률이낮은 3R, 3'R form만을생산하므로사료용으로만이용되고있다. H. pluvialis는현재까지가장효율적인 astaxanthin의생산원료로 astaxanthin 함량이 1.5-3% 수준으로다른원료에비해높고, 생체내에서안정성이우수하며생체이용률이높은 3S, 3'S form를생산하는장점이있다 [5,6]. H. pluvialis는녹색의단세포조류로외부환경에따라편모가있는영양세포 (green vegetable cell) 와운동성이없는포낭세포 (red cyst cell) 로구분된다. 외부환경조건이열악해지면녹색의영양세포들은적색의포낭세포로전환되며이때 astaxanthin이다량축적된다 [7]. H. pluvialis 균체로부터 astaxanthin을얻는방법은유기용매추출법과초임계 CO 2 로추출하는방법이보고되어있다 [8-10]. 초임계추출법은추출효율이높으나특별한추출장비가필요하며, 유기용매추출법에서식품첨가물로사용할수있는용매는주정 (95% ethanol) 과 acetone 뿐이므로비극성용매의사용에비하여추출효율이낮은단점이있다. 그러나용매추출법으로식품용 astaxanthin 제조시 H. pluvialis 균체에복합다당류분해효소와단백질분해효소를순차적으로처리하는것이추출효율향상에효과적인것으로보고되어있다 [11]. 본연구에서는작용기작이상이한두종류단백질분해효소를사용하여제조한 haematococcus 추출물에서효소처리조건에따른 astaxanthin 함량과항산화활성의변화를조사하였다. 2. 재료및방법 2.1 실험재료 Astaxanthin 추출원료인 H. pluvialis 균체는 Parry Nutraceutical사 (Oonaiyur, India) 의제품이었으며, 복합다당류분해효소인 Viscozyme과단백질분해효소인 Alcalase, Nutrase, Flavourzyme은 Novozyme사 (Bagsvaerd, Denmark) 에서구입하였다. 그밖의모든시약은 1급이상의것을사용하였다. 2.2 Haematococcus 추출물제조 One-stage 효소처리 H. pluvialis 균체분말 0.5 g을증류수 40 ml에현탁한후, 0.1 N NaOH로현탁액의 ph를 ph 7.0으로맞추고단백질분해효소인 Alcalase를 0.02 g, Flavourzyme을 0.06 g 첨가하였다. 효소를첨가한현탁액을 50 에서 2시간동안진탕반응시킨다음 3000 x g로 10분간원심분리하여상등액은버리고침전물을 acetone으로추출하였다 Two-stage 효소처리 One-stage 효소처리단계에서 2시간동안반응시킨반응액의 ph를 0.1 N HCl로 ph 4.5로낮춘후복합다당류분해효소인 Viscozyme을 0.02 g 첨가하고 50 에서 2 시간동안반응시켰다. 반응액을원심분리하여상등액은버리고침전물을 acetone으로추출하였다. 2.3 항산화활성측정효소처리후 acetone으로추출한 haematococcus 추출물의항산화활성은 DPPH radical의소거활성으로 Blois 의방법을변형하여다음과같이측정하였다 [12]. 추출물 0.2 ml에 0.2 mm DPPH 용액 0.4 ml와에탄올 0.8 ml를가한후, vortex mixer로 10초간혼합하고 30분후분광광도계 (UV-1201, Shimadzu, Kyoto, Japan) 로 517 nm에서흡광도를측정하였다. 추출물의전자공여능은시료첨가구와비첨가구의흡광도차이를백분율 (%) 로구하였다. 2.4 분석방법효소처리하여제조한침전물의 astaxanthin 함량은 cholesterol esterase를처리하여 ester형의 astaxanthin을유리상태로전환시킨후 petroleum ether로회수하고 methanol에용해시킨다음 HPLC(Agilent 1100, Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA) 로분석하였다 [13]. Methanol에용해시킨시료는초음파처리 (75 min, 40 khz; Power sonic 510, Hwashin, Korea) 하여준비하였으며 Apollo C18 column(5μ, 4.6 x 250 mm, Alltech Associates Inc., Deerfield, IL) 과 UV 검출기 (474 nm) 를사용하여분석하였다. 용매로는 95%(v/v) methanol을 1 ml/min의유속으로사용하였다 [14]. 또한추출수율은기존의방법 [15] 과동일하게고형분회수율 (solid recovery) 로나타내었으며원료로사용한 H. pluvialis 균체분말과효소처리후원심분리로얻은침전물을동결건조한건조물의중량비로계산하였다. 3. 결과및고찰 3.1 One-stage 효소처리 Astaxanthin의추출원료로사용되는 H. pluvialis 균체는열악한외부환경조건에서세포벽이매우두꺼워지며세포내 astaxanthin을다량축적한적색의포낭세포이므로 [7] 세포벽을효과적으로분해하는것은 astaxanthin의함량이높은 heamatococcus 추출물제조에매우중요하다. 그러므로세포벽분해효소와함께단백질분해효소의 195

3 한국산학기술학회논문지제 10 권제 1 호, 2009 처리조건에관한연구는필수적이다. H. pluvialis 균체로부터 astaxanthin 추출에적합한상업용단백질분해효소를선별한기존의보고 [11] 에근거하여추출물의 astaxanthin 함량향상에효과적인 Alcalase와수용성성분을제거시켜고형분회수율감소에효과적인 Nutrase를선택하여연구를진행하였다. 또한 endo형단백질분해효소인 Alcalase, Nutrase와는작용기작이상이한 exo형의단백질분해효소인 Flavourzyme을동시에처리하는연구를수행하였다. H. pluvialis 균체현탁액에 Alcalase, Nutrase, Flavourzyme을각각그리고 endo형과 exo형의조합으로두종류효소를동시에처리한후원심분리로상등액을제거한다음침전물의 astaxanthin 함량과고형분회수율을분석하였다. 두종류효소처리시 Alcalase와 Flavourzyme의조합은 ph 7.0에서, Nutrase와 Flavourzyme 의조합은 ph 6.0에서각각반응시켰다 [ 표 1]. [ 표 1] 단백질분해효소처리의영향 Treatment Solid recovery 1) Astaxanthin content 1) (%) (μg/g) No treatment ± ± 50 A 2) ± ± 250 N 3) ± ± 9 F 4) ± ) 1109 ± 48 5) A+F ± ± 26 N+F ± ± 102 1) Data are shown as means ± SD (n=3). 2) A: Alcalase 3) N: Nutrase 4) F: Flavourzyme 5) Taken from In et al. [11]. 단백질분해효소로처리한모든경우 H. pluvialis 균체에서수용성성분이제거되어효소처리후고형분회수율이낮아졌으며상대적으로지용성성분인 astaxanthin의함량이증가되었다. 단일효소처리의경우기존의결과 [11] 와유사하게 astaxanthin 함량은 Alcalase, Flavourzyme, Nutrase 순으로감소하였다. 또한 endo형효소와 exo형효소를동시에처리한경우 endo형혹은 exo형효소를단일처리한경우보다 astaxanthin 함량은 30-80% 향상되었다. 특히 Alcalase와 Flavourzyme을병용한경우를효소를사용하지않은대조구와비교하면 astaxanthin 함량은 250% (529 μg/g 1,981 μg/g) 이상향상되었다. 이는 H. pluvialis 균체에서효율적으로 astaxanthin을추출할수있는처리방법임을의미한다. 단백질분해효소의처리는 H. pluvialis 세포벽에존재하는것으로알려진 [16] 163종의단백질에작용하여세포벽의분해에기여하며, 특히 exo형단백질분해효소는단백질을아미노산단위로분해시켜저분자화함으로써 astaxanthin의추출에도움이되는것으로사료된다. 이러한결과는효모추출물과 heme-iron을제조하기위하여효모와헤모글로빈을 endo형효소와 exo형효소를동시에사용하여가수분해시켜가수분해도를향상시킨보고 [17,18] 와매우유사한것이다. 3.2 Two-stage 효소처리 Astaxanthin의추출효율을향상시키기위하여 Haematococcus pluvialis로부터 astaxanthin 추출에효과적인것으로보고 [11] 된복합다당류분해효소인 Viscozyme과단백질분해효소인 Alcalase와 Flavourzyme의병용효과를조사하였다. Viscozyme은 Aspergillus aculeatus 기원의 arabanase, cellulase, hemicellulase, xylanase, β-glucanase를함유한복합효소제제로포낭세포의단단한세포벽분해에효과적인것으로판단된다. 반응최적 ph가 4.5인 Viscozyme을반응최적 ph가 인 Alcalase, Flavourzyme과동시에처리하는것보다 2단계로반응시키는연구를수행하였다. 2단반응에서효소처리순서가 haematococcus 추출물의고형분회수율과 astaxanthin 함량에미치는효과를조사하였다 [ 표 2]. [ 표 2] 2 단계효소처리의영향 Treatment Solid recovery 1) Astaxanthin content 1) (%) (μg/g) No treatment ± ± 50 A V 2) ± ) 1986 ± 70 3) A+F V ± ± 94 V A+F ± ± 42 V A ± ± 19 A V F ± ± 4 1) Data are shown as means ± SD (n=3). 2) V: Viscozyme 3) Taken from In et al. [11]. 전체적으로 Viscozyme을추가로사용하여 2단계로가수분해시킨결과 Alcalase 혹은 Alcalase와 Flavourzyme 을처리한조건보다높은 astaxanthin 함량과낮은고형분회수율을보였다. 특이하게 Viscozyme을 1차로, Alcalase 와 Flavourzyme을병용하여 2차로처리한경우에는 astaxanthin 함량이감소하였다. 세종류의효소 196

4 Haematococcus pluvialis 로부터 Haematococcus 추출물제조공정에서효소처리가추출효율과항산화활성에미치는영향 (Viscozyme, Alcalase, Flavourzyme) 를사용하는조건에서는 Alcalase와 Flavourzyme을병용하여 1차로처리한후 Viscozyme을 2차로사용하는것이바람직하였다. 이때효소를사용하지않은대조구와비교하면 astaxanthin 함량은 320% (529 μg/g 2,256 μg/g) 이상향상되었다. 또한 Viscozyme과 Alcalase만을사용하는조건에서는기존의결과 [11] 와동일하게 Viscozyme, Alcalase의순서로사용하는것이효율적이었으며 astaxanthin 함량은 Alcalase와 Flavourzyme을병용하여 1차로처리한후 Viscozyme을 2차로사용하는경우와유사하였다. H. pluvialis 포낭세포에서 astaxanthin의추출효율을향상시키기위하여세포벽분해효소로처리하는결과가보고 [19] 되어있으나, 본연구에서는단백질분해효소, 특히작용기작이상이한두종류효소를추가로처리하면추출효율이더욱향상되는것으로조사되었다. 본연구에서 1차로 Alcalase와 Flavourzyme을 2차로 Viscozyme을처리한경우 H. pluvialis 세포가 astaxanthin을 1.5~3% (w/w) 수준으로축적한다는결과 [20] 를기준하면 astaxanthin 추출수율은 7~15% 정도로낮다. 그러나이는효소처리후 acetone으로 1회추출하여효소처리의효과를확인한결과이므로추후 acetone을사용한추출 조건에관한연구가필요한것으로사료된다. 이상의결과로부터단백질분해효소와복합다당류분해효소를사용하여 astaxanthin을다량함유하는식품용 haematococcus 추출물을제조하기위한기초적인 process diagram을제안하면 [ 그림 1] 과같다. H. pluvialis 현탁액 Alcalase, 효소처리 I Flavourzyme Viscozyme 효소처리 II 원심분리 상등액 acetone 용매추출 원심분리 침전물 감압진공농축 acetone Haematococcus 추출물 [ 그림 1] Haematococcus 추출물을제조하기위한기초적인 process diagram 3.3 항산화활성 효소처리방법에따라제조된침전물의 acetone 추출물에대하여항산화활성을 DPPH를이용한전자공여능으로조사하였다. DPPH법은안정한자유라디칼인 DPPH가수소공여체와반응하는능력을원리로측정하는방법으로, 항산화물질에의해환원되어탈색되므로항산화성분의활성을측정할때널리사용된다 [12]. DPPH 라디칼에대한전자공여활성을 [ 그림 2] 에나타내었다. Alcalase와 Flavourzyme을병용하여 1차로처리한후 Viscozyme을 2차로사용하는경우전자공여능은 49.23% 가장우수하였으며, 효소를사용하지않은대조구 (15.41%) 와비교하면크게향상되었다. 이는 astaxanthin 함량의증가에기인하는것으로판단된다. 모든조건에서전자공여능은 [ 표 1] 과 [ 표 2] 에제시된 astaxanthin 함량과일치하는경향이었다. 즉, astaxanthin 함량이증가하면전자공여능도증가하였다. 이는 astaxanthin의강력한항산화력에기인하는것이며, 단백질분해효소, 특히작용기작이상이한두종류효소와복다당류분해효소를순차적으로처리하면추출효율이더욱향상됨을나타내는결과이다. Radical scavenging activity (%) Control A F A+F A+F -> V V -> A [ 그림 2] 효소처리방법에따른 acetone 추출물의라디칼소거활성의변화 4. 결론 우수한항산화제로알려진 astaxanthin을함유한 H. pluvialis 균체로부터단백질분해효소와복합다당류분해효소를이용하여식품용 haematococcus 추출물을효율적으로제조할수있는방법을조사하였다. 특히작용기작이상이한 exo형과 endo형의단백질분해효소와복합다당류분해효소의처리순서를통하여효율적인 haematococcus 추출물의제조공정을제시하였다. 상업 197

5 한국산학기술학회논문지제 10 권제 1 호, 2009 용단백질분해효소로는 Alcalase (endo형) 와 Flavourzyme (exo형) 을복합다당류분해효소로는 Viscozyme을사용하였다. 단백질분해효소는 endo형과 exo형을병용하는것이추출물의 astaxanthin의함량을증가시켰다. Viscozyme과함께단백질분해효소를사용하는경우에는 Alcalase와 Flavourzyme을병용하여 1차로처리한후 Viscozyme을 2차로사용하는 2단계가수분해방법이적절하였다. 이조건에서 astaxanthin 함량을효소를사용하지않은대조구와비교하면 320% (529 μ g/g 2,256 μg/g) 이상향상되었다. 또한 DPPH법으로조사한각효소처리구의항산화활성은 astaxanthin 함량에비례하여증가하였으며, 1차로 Alcalase와 Flavourzyme을병용하여처리한후 2차로 Viscozyme을사용하는조건에서가장우수하였다. 참고문헌 [1] Guerin, M., Huntley, M. E. and Olaizola, M. (2003) Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition. Trends Biotechnol. 21, [2] Kobayashi, M., Kakizono, T., Nishio, N., Nagai, S., Kurimura, Y. and Tsuji, Y. (1997) Antioxidant role of astaxanthin in the green algae Haematococcus pluvialis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 48, [3] Jyonouchi, H., Sun, S., Iijima, K., and Gross, M. (2000) Antitumor activity of astaxanthin and its mode of action. Nutr. Cancer 36, [4] Higuera-Ciapara, I., Felix-Vanlenzuela, L. and Goycoolea, F. M. (2006) Astaxanthin: a review of its chemistry and applications. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 46, [5] Schroeder, W. A., and Johnson, E. A. (1993) Antioxidant role of carotenoids in Phaffia rhodozyma. J. Gen. Microbiol. 39, [6] Orosa, M., Franqueira, D., Cid, A. and Abalde, J. (2005) Analysis and enhancement of astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis. Bioresource Technol. 96, [7] Kobayashi, M., Kurimura, Y., Kakizono, T., Nishio, N. and Tsuji, Y. (1997) Morphological changes in the life cycle of the green algae Haematococcus pluvialis. J. Ferment. Bioeng. 84, [8] Kang, C. D. and Sim, S. J. (2007) Selective extraction of free astaxanthin from Haematococcus culture using a tandem organic solvent system. Biotechnol. Prog. 23, [9] Valderrama, J. O., Perrut, M. and Majewski, W. (2003) Extraction of astaxanthin and phycocyanine from microalgae with supercritical carbon dioxide. J. Chem. Eng. Data 48, [10] Machmudah, S., Shotipruk, A., Goto, M., Sasaki, M. and Horose, T. (2006) Extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using supercritical CO 2 and ethanol entrainer. Ind. Eng. Chem. Res. 45, [11] In, M. J., Choi, J. H., Kim, S., Chae, H. J. and Kim, D. H. (2008) Enhanced extraction of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using enzyme treatment. J. Korean Soc. Appl. Biol, Chem. 51, [12] Blois, M. S. (1958) Antioxidant determinations by the use of a stable free radical. Nature 181, [13] Orosa, M., Franqueira, D., Cid, A. and Abalde, J. (2005) Analysis and enhancement of astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis. Bioresource Technol. 96, [14] Kim, S., Cho, E., In, M. -J. and Chae, H. J. (2008) Extraction and analysis of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using sonication. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 37, [15] In, M. -J., Jang, J. E. and Kim, D. H. (2007) Enhancing extraction yield of chlorella extract by enzyme treatment. J. Appl. Biol. Chem. 50, [16] Wang, S. -B., Hu, Q., Sommerfield, M. and Chen, F. (2004) Cell wall proteomices of the green algae Haematococcus pluvialis(chlorophyceae). Proteomics 4, [17] Chae, H. J., Joo, H. and In, M. -J. (2001) Utilization of brewer s yeast cells for the production of food-grade yeast extract. Part 1: effects of different enzymatic treatments on solid and protein recovery and flavor characteristics, Bioresource Technol., 76, [18] In, M. -J., Chae, H. J. and Oh, N. S. (2002) Process development for heme-enriched peptide by enzymatic hydrolysis of hemoglobin. Bioresource Technol. 84, [19] Kobayashi, M., Kurimura, Y., Sakamoto, Y. and Tsuji, Y. (1997) Selective extraction of astaxanthin and chlorophyll from the green algae Haematococcus pluvialis. Biotechnol. Tech. 11, [20] Park, E. -K., Seo, M.-W. and Lee, C. -G. (2001) Effects of medium compositions for the growth and the astaxanthin production of Haematococcus pluvialis. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 29,

6 Haematococcus pluvialis 로부터 Haematococcus 추출물제조공정에서효소처리가추출효율과항산화활성에미치는영향 인만진 (Man-Jin In) [ 정회원 ] 1985 년 2 월 : 서울대학교농화학과 ( 농학사 ) 1987 년 2 월 : 서울대학교농화학과 ( 농학석사 ) 1997 년 2 월 : 서울대학교농화학과 ( 농학박사 ) 1999 년 9 월 ~ 현재 : 청운대학교식품영양학과부교수 < 관심분야 > 건강기능성식품및그소재 199

56(3)-14(하성호040).fm

56(3)-14(하성호040).fm Korean Chem. Eng. Res., 56(3), 376-380 (2018) https://doi.org/10.9713/kcer.2018.56.3.376 PISSN 0304-128X, EISSN 2233-9558 미세조류로부터의에너지효율적인 Astaxanthin 회수기술개발 김선영 오유관 *, 하성호 한남대학교화공신소재공학과 34054 대전광역시유성구유성대로