Korean J Hematol Vol. 43, No. 2, June, 2008 Original Article 혈소판 ADP 수용체 P2Y1 유전자단일염기다형성과허혈성혈관질환과의상관관계연구 1 중앙대학교의과대학내과학교실, 서울대학교의과대학 2 내과학교실, 3 예방의학교실, 4 서울대학교천연물연구소 박은경 1 ㆍ김효수 2 ㆍ박성효 2 ㆍ박진식 2 ㆍ김인호 2 ㆍ박선양 2 박소연 3 ㆍ김진희 3 ㆍ홍윤철 3 ㆍ윤혜숙 4 ㆍ이상재 1 The Relationship of P2Y1 ADP Receptor Polymorphisms and Ischemic Vascular Disease Eunkyung Park 1, Hyo-Soo Kim 2, Sung Hyo Park 2, Jin Sik Park 2, In Ho Kim 2, Seonyang Park 2, So-Yeon Park 3, Jin Hee Kim 3, Yun-Chul Hong 3, Hye Sook Yun 4 and Sang Jae Lee 1 1 Department of Internal Medicine, Chung-Ang University College of Medicine, Departments of 2 Internal Medicine and 3 Preventive Medicine, Seoul National University College of Medicine, 4 Natural Product Research Institute, Seoul National University, Seoul, Korea Background: The platelet ADP receptor P2Y1 plays a key role in platelet aggregation. Methods: We tested eight sites of P2Y1 and studied the possible link between the presence of P2Y1 polymorphisms and the risk of is chemic vascular disease in a case-control study. The polymorphisms A1622G, C647G and C2259G were selected according to linkage disequilibrium. We evaluated 275 patients with is chemic cerebrovascular disease and 275 control subjects. We also evaluated 171 patients with acute myocardial infarction (AMI), 166 patients with unstable angina (UA), 173 patients with stable angina (SA) and 188 control subjects. Results: For the cerebrovascular disease patients, A1622G AA, AG [odds ratio (OR), 1.170; 95% confidence interval (CI), 0.784 to 1.748] and GG (OR, 1.031; 95% CI, 0.554 to 1.918) did not show any difference between the case and control subjects. C647G CC, CG (OR, 0.995; 95% CI, 0.639 to 1.550) and GG (OR, 1.012; 95% CI, 0.450 to 2.277) did not show any difference between the case and control subjects. C2259G CC, CG (OR, 0.619; 95% CI, 0.354 to 1.082) and GG did not show any difference between the case and control subjects. For coronary artery disease patients, C2259G GG, CG (for AMI patients OR, 0.880, 95% CI, 0.384 to 2.016; for UA patients, OR, 0.885, 95% CI, 0.410 to 1.911; for SA patients, OR, 1.156, 95% CI, 0.534 to 2.501) and CC did not show any difference between AMI, UA and SA patients and each control subject. C647G GG, CG (for AMI patients OR, 1.351, 95% CI, 0.731 to 2.497; for UA patients OR, 1.292, 95% CI, 0.723 to 2.309; for SA patients OR, 0.977, 95% CI, 0.530 to 1.803) and CC (for AMI patients OR, 0.355, 95% CI, 0.093 to 1.358; for UA patients OR, 0.645, 95% CI, 0.205 to 2.028; for SA patients OR, 0.385, 95% CI, 0.113 to 1.311) did not show any difference between AMI, UA and SA patients and each control subject. A1622G AA, AG (for AMI patients OR, 1.416, 95% CI, 0.786 to 2.549; for UA patients OR, 1.079, 95% CI, 0.611 to 1.904; for SA patients OR, 0.958, 95% CI, 0.529 to 1.732) and GG (for AMI patients OR, 0.525, 95% CI, 0.195 to 1.411; for UA patients OR, 0.568, 95% CI, 0.231 to 1.401; for SA patients OR, 0.441, 95% CI, 0.169 접수 :2008 년 4 월 12 일, 수정 :2008 년 5 월 26 일승인 :2008 년 6 월 2 일교신저자 : 박은경, 서울특별시동작구흑석동 224-1 156-755, 중앙대학교병원내과 Tel: 02-6299-1410, Fax: 02-6280-5631 E-mail: lisa1114@naver.com 69 Correspondence to:eunkyung Park Department of Internal Medicine, Chung-Ang University Hospital 224-1, Heukseok-dong, Dongjak-gu, Seoul 156-755, Korea Tel: +82-2-6299-1410, Fax: +82-2-6280-5631 E-mail: lisa1114@naver.com
70 Korean J Hematol Vol. 43, No. 2, June, 2008 to 1.154) did not show any difference between AMI, UA and, SA patients and the control subjects. Conclusion: The distribution of P2Y1 polymorphisms did not show any association with ischemic vascular disease. (Korean J Hematol 2008;43:69-76.) Key Words: Platelet receptor, Polymorphism, Platelet aggregation, Ischemic vascular disease 서 허혈성혈관질환 (ischemic vascular diseases) 은선진국에서는발병률과사망률이가장높은질환군으로우리나라에서도평균수명의증가와더불어발생이증가하는추세에있다. 관상동맥질환과허혈성뇌혈관질환은 1차발병후재발의위험이높으며, 합병증및후유증도심각하다. 허혈성혈관질환의병인은유전적소인, 호르몬, 흡연, 과체중등의환경적요인과고혈압, 당뇨병, 호모시스틴혈증 (homocysteinemia), 이상지혈증 (dyslipidemia) 등과같은여러요인이복잡하게관련되나, 직접적인병인은혈소판의활성화와이로인한혈전생성에따른혈액흐름의방해및이에의한경색, 허혈이다. 1) 최근까지우리나라를포함하여동양인에서는인종적요인또는생활습관의차이로허혈성혈관질환의발생빈도가서구보다낮다고막연히알려져있었다. 최근산업구조의서구화에따라각종후천적인혈전호발요소가점차증가하고동양인의허혈성혈관질환의발병률이빠른속도로증가하고있어이에대한보다나은예방및치료를위해발병원인또는발병가능성을증가시키는요인에대한연구는중요한과제이다. 손상된혈관주변에혈소판은여러단계의과정을거쳐응집괴를형성한다. 활성화된혈소판은유용성응착물질 (soluble adhesion molecule) 과결합하고상호응집되며섬유소 (fibrin) 와결합하여혈전을형성한다. 이러한과정에여러리간드 (ligand) 들이복잡하게관여하며, 각각의리간드가결합하는혈소판수용체들이밝혀지고있다. 이중혈소판에서유리된 ADP에결합하는수용체에는 P2Y1, P2Y12, P2X1의 3종이알려져있으며혈소판응집과정에서의역할등에대해연구가이루어지고있는데, 최근에는 P2Y1 A1622G SNP에따라 ADP에대한혈소판반응이다름이보고되었다. 2) 혈소판의활성화에따른허혈성혈관질환발병에는누적된환경적, 후천적요인과함께유전적요인이상당한역할을할것으로생각된다. 유전적요인은인종 론 간에상당한차이가있다고알려져있으나, 동양에서혈소판과관련한단일염기다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 연구는일본및국내에서일부이루어지고있을뿐이다. 3-10) 혈소판응집관련 SNP에의한유전적인요인과질환의관련성에대하여특수유전성질환과의연관성에대하여는상당한진척이있으나, 허혈성혈관질환과유전자 SNP의상관성에대한연구보고는매우제한적이다. 혈소판응집에대한개인별민감성차이에대하여국내에서도최근연구가시작되고있다. 6) 본연구자들은지난 2005년허혈성뇌혈관질환환자와정상인의혈소판수용체 SNP 차이를확인하고자 100명의허혈성뇌혈관질환환자와 97명의정상대조군에서연구를진행하였다. 기존에알려진혈소판수용체각각에대해보고된 SNP 위치 9개를임의로선택하여 GP IIIa (C1565T), GP Ia (C807T), GP Ibα (Kozak T/C polymorphism, HPA-2), GP IIb (HPA-3), P2Y1 (A1622G), P2Y12 (G52T), thromboxane A2 receptor (C795T, T924T) 에대하여분석하였고, P2Y1 ADP 수용체유전자다형성 (A1622G의 G allele) 이통계적으로유의하지는않았으나환자군에서높은경향을보였다 (P=0.09). 11) 본연구에서는기존연구결과를토대로혈소판 ADP 수용체중 P2Y1 SNP 발현과허혈성혈관질환의관계를보고자하였으며, 대상환자수와대상 SNP의수를증가시켜통계학적검정력을늘리고자하였다. 이러한상관관계를확인한다면, 관련유전자검사로서한국인에서허혈성혈관질환의발병을예측할수있을것이다. 1. 연구대상 대상및방법 대조군은만 20 59세의건강한정상인으로본실험에관한설명과함께참여의사여부를확인하여동의하는사람만을선별하여피험자로모집하였다. 환자군은만 20 59세의세계보건기구 (World Health Organization) 진단기준에합당한심근경색증, 불안정성협
박은경외 : P2Y1 SNP 와허혈성혈관질환 71 심증, 안정성협심증또는뇌동맥경색증의현병력을가진혈전성심혈관질환자를대상으로하였다. 2. 연구기간및윤리심사본연구의연구기간은 2006년 3월부터 2008년 2월까지로하였다. 본연구는서울대학교병원임상시험심의위원회의승인을거쳐시행되었다. 3. 혈액채취및시료제작 3.8% 구연산삼나트륨 (trisodium citrate, 1:9) 이담겨있는플라스틱관에혈액을채취하였다. 180g에서 10 분간원심분리하여상층액혈소판풍부혈장 (platelet rich plasma, PRP) 을얻고, 나머지는 2,000g에서 15분간원심분리하여혈소판결핍혈장 (platelet poor plasma, PRP) 을얻었다. PUREGENE blood DNA kit (Gentra Inc. Minneapolis, MN, USA) 를이용하여핵산을추출하고 80 o C에서보관하였다. 4. 단일염기확장방법 (single base extension analysis) 에의한 SNP의분석 SNP 표지자의위치바로앞까지해당하는염기서열로짜여진유전자형분석시발체 (genotyping primer) 를이용하여 SNP의유전형을분석하였으며 (Table 1) SNaPshot 분석기기를이용하였다. SNP 유전자형분석은 ABI PRISM SNaPShot Multiplex kit (ABI, Foster City, CA, USA) 를이용한단일염기확장방법을통해시행하였다. 핵산은전진성 (forward) 및후진성 (reverse) 시발체와표준중합효소연쇄반응 (PCR) 용액을이용하여 PCR반응을시행하였다. 10ng의핵산, 0.5pM의각올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 시발체, 1μL 의 10X PCR Gold 완충액 (buffer), 250uM dntp (deoxynucleotides), 3mM MgCl 2, 0.25 unit i-startaq 핵산중합효소 (intron Biotechnology, Sungnam, Kyungki-Do, Korea) 가포함된 10μL 반응액을사용하여 PCR반응으로증폭시켰다. PCR반응은다음과같이진행하였다. 95 o C에서 10분동안 1주기를시행하였고, 95 o C에서 30초동안, 55 o C에서 1분동안, 72 o C에서 1분동안 30 주기를시행한뒤, 72 o C에서 7분동안 1주기를시행하 였다. 증폭이후, PCR반응의생산물을새우알칼리성인산효소 (shrimp alkaline phosphatase, SAP) (Roche) 와핵산외부가수분해효소 (exonuclease) I (USB Corporation) 각 1 unit를이용하여 37 o C에서 60분, 72 o C에서 15분동안처리하여증폭된생산물을정제하였다. 1μL의정제증폭된생산물을 0.15 pmols의시발체연장반응을위한유전자형분석시발체를포함한 SNaPshot Multiplex Ready 반응혼합물에첨가하였다. 시발체연장반응은 96 o C에서 10초동안, 50 o C에서 5초동안, 60 o C 에서 30초동안 25주기를시행하였다. 과다한형광염료시약을제거하기위하여 1 unit의 SAP를 PCR반응생산물과함께 37 o C에서 1시간동안, 72 o C에서 15분동안처리하였다. 연장생산물을포함한최종반응용액 1μL 를 9μL의 Hi-Di formamide (ABI, Foster City, CA) 에첨가하였다. 혼합물을 95 o C에서 5분간배양하고얼음에서 5분간처리한후 ABI Prism 3730xl DNA analyzer 를이용하여전기영동하였다. 결과는 Gene Scan analysis software (ABI) 를이용하여분석하였다. 5. P2Y1 SNP의선택 P2Y1 유전자에서발견가능한 A2591T, C1382T, A1622G, C893T, C1881G, C2259G, A1747T, C647G의유전자형분석을시행하였다. 8개의 SNP 중 A2591T는대립유전자빈도가 A:T=1:0으로분석에서제외시켰다. C1382T와 A1622G, C893T와 C1881G, A1747T와 C647G는각각서로인접한위치에있어 A1622G, C893T, C647G를다시선별하고인접한다른 SNP는제외시켰다. C893T와 A1622G는완전연관 (complete linkage) 되어있었다 ( D' =1). 최종적으로 C2259G, A1622G, C647G의 3개 SNP를환자-대조군분석에이용하였다 (Fig. 1). Table 1. P2Y1 primers Primer Sequence (5' 3') P2Y1-A1622G-F TCCTCTGAGGAGAAAATCGATGGATGTA CCTGGT P2Y1-A1622G-R AGACACAGCAAAAACAGTCAGTAC Fig. 1. The selection of P2Y1 polymorphism site.
72 Korean J Hematol Vol. 43, No. 2, June, 2008 6. P2Y1 SNP와허혈성혈관질환과의상관성에대한분석 1) 허혈성뇌혈관질환환자와정상인의 P2Y1 SNP 비교환자-대조군연구로서허혈성뇌혈관질환환자 275 명과연령, 성별보정정상대조군 275명에대하여시행되었다. 핵산의보존상태가좋지않았던대상자를제외하면 A1622G는환자군 271명, 대조군 275명, C647G는환자군 267명, 대조군 267명, C2259G는환자군 271명, 대조군 275명을분석하였다. 2) 관상동맥질환 (coronary artery disease) 환자와정상인의 P2Y1 SNP 비교환자-대조군연구로서급성심근경색증 (acute myocardial infarction) 171명, 불안정성협심증 (unstable angina) 166명, 안정성협심증 (stable angina) 173명과연령, 성별보정정상대조군 188명에대하여시행하였다. 핵산의보존상태가좋지않았던대상자를제외하면 A1622G는급성심근경색증군 171명, 불안정성협심증군 166명, 안정성협심증군 173명, 연령, 성별보정정상대조군 188명, C647G는급성심근경색증군 167 명, 불안정성협심증군 165명, 안정성협심증군 170명, 연령, 성별보정정상대조군 185명, C2259G는급성심근경색증군 167명, 불안정성협심증군 164명, 안정성협심증군 170명, 연령, 성별보정정상대조군 188명을분석하였다. 7. 통계적분석환자군과대조군에서각인자들이차이가있는지알아보기위해로지스틱회귀분석 (logistic regression) 을사용하였다. 통계적유의수준은 P<0.05로하여 odds ratio (OR) 와 95% confidence interval (95% CI) 를사용하였다. 흡연, 고혈압, 당뇨병의혈전형성위험인자의차이에대하여대조군및환자군 ( 허혈성뇌혈관질환, 급성심근경색증, 불안정성협심증, 안정성협심증 ) 에서 분석을하였고, 연속변수에대하여 ANOVA (analysis of variance), 비연속변수에대하여카이-제곱검정 (chisquare test) 을사용하였다. P2Y1 환자-대조군연구에서혈전형성에영향을주는유의한인자에대하여는통계적보정을하였다. 통계프로그램은 SAS version 8.1 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 를사용하였다. 결과 1. 허혈성혈관질환환자혈소판수용체의 P2Y1 SNP 1) 허혈성뇌혈관질환환자혈소판수용체의 P2Y1 SNP 환자군의연령은 63.5±12.3세 (mean±standard deviation), 대조군의연령은 63.1±12.0로차이가없었고, 성비는양군에서모두 1.3:1 (M:F) 이었다. A1622G는 AA가환자군 124명, 대조군 122명, AG 가환자군 114명, 대조군 122명, GG가환자군 33명, 대조군 31명으로환자군과대조군에서유의한차이를보이지않았다. C647G는 CC가환자군 158명, 대조군 149명, CG가환자군 91명, 대조군 97명, GG가환자군 18명, 대조군 18명으로환자군과대조군에서유의한차이를보이지않았다. C2259G는 CC가환자군 227명, 대조군 241명, CG가환자군 44명, 대조군 33명, GG가환자군 0명, 대조군 1명으로환자군과대조군에서유의한차이를보이지않았다 (Table 2). 2) 관상동맥질환환자혈소판수용체의 P2Y1 SNP 관상동맥질환환자군의연령은급성심근경색증군 62.8±9.6세, 불안정성협심증군 62.9±9.6세, 안정성협심증군 63.1±9.7세, 대조군의연령은 62.4±9.6세로차이가없었다. 성비는급성심근경색증군에서 1.12:1, 불안정성협심증군에서 1.18:1, 안정성협심증군에서 1.16:1, 대조군에서 1.29:1이었다. 각 SNP는각각의관상동맥질환환자군과대조군에서유의한차이를보 Table 2. The P2Y1 polymorphism in patients with ischemic cerebrovascular diseases P2Y1 genotype Control N (%) Case N (%) OR (95% CI) A1622G AA 122 (44.4) 124 (45.8) 1.000 AG 122 (44.4) 114 (42.1) 1.170 (0.784, 1.748) GG 31 (11.2) 33 (12.1) 1.031 (0.554, 1.918) C647G CC 149 (56.5) 158 (59.2) 1.000 CG 97 (36.7) 91 (34.1) 0.995 (0.639, 1.550) GG 18 (6.8) 18 (6.7) 1.012 (0.450, 2.277) C2259G CC 241 (87.5) 227 (83.8) 1.000 CG 33 (12.1) 44 (16.2) 0.619 (0.354, 1.082) GG 1 (0.4) 0
박은경외 : P2Y1 SNP 와허혈성혈관질환 73 이지않았다 (Table 3). C2259G의 GG는대조군 162명, 급성심근경색증군 142명, 불안정성협심증군 139명, 안정성협심증군 146명으로대조군과급성심근경색증군사이, 대조군과불안정성협심증군사이, 대조군과안정성협심증군사이에차이가없었다. C2259G의 CG는대조군 26명, 급성심근경색증군 22명, 불안정성협심증군 24명, 안정성협심증군 24명으로대조군과급성심근경색증군사이, 대조군과불안정성협심증군사이, 대조군과안정성협심증군사이에차이가없었다. C2259G 의 CC는대조군 0명, 급성심근경색증군 3명, 불안정성협심증군 1명, 안정성협심증군 0명으로환자수가적어서통계분석이불가능하였다. C647G의 GG는대조군 110명, 급성심근경색증군 103명, 불안정성협심증군 95 명, 안정성협심증군 99명으로대조군과급성심근경색증군사이, 대조군과불안정성협심증군사이, 대조군과안정성협심증군사이에차이가없었다. C647G의 CG는대조군 60명, 급성심근경색증군 57명, 불안정성협심증군 63명, 안정성협심증군 59명으로대조군과급성심근경색증군사이, 대조군과불안정성협심증군사이, 대조군과안정성협심증군사이에차이가없었다. C647G의 CC는대조군 15명, 급성심근경색증군 7명, 불안정성협심증군 7명, 안정성협심증군 12명으로대조군과급성심근경색증군사이, 대조군과불안정성협심증군사이, 대조군과안정성협심증군사이에차이가없었다. A1622G의 AA는대조군 90명, 급성심근경색증군 79명, 불안정성협심증군 78명, 안정성협심증군 81명으로대조군과급성심근경색증군사이, 대조군과불안정성협심증군사이, 대조군과안정성협심증군사이에차이가없었다. A1622G의 AG는대조군 73명, 급성심근경색증군 80명, 불안정성협심증군 74명, 안정성협심증군 74명으로대조군과급성심근경색증군사이, 대조군과불안정성협심증군사이, 대조군과안정성협심증군사이에차이가없었다. A1622G의 GG는대조군 25명, 급성심근경색증군 12명, 불안정성협심증군 14명, 안정성협심증군 18명으로대조군과급성심근경색증군사이, 대조군과불안정성협심증군사이, 대조군과안정성협심증군사이에차이가없었다 (Table 3). 2. 기타혈전형성의위험인자와혈소판수용체의 P2Y1 SNP 1) 허혈성뇌혈관질환환자와혈전형성의위험인자허혈성뇌혈관질환환자군과대조군의흡연, 고혈압, 당뇨병에대한차이를조사하였다. 각 275명의환자군과대조군에서흡연자는환자군 99명, 대조군 67명으로환자군에서많았다 (P=0.004). 고혈압은환자군 55 명, 대조군 15명으로환자군에서많았다 (P<0.001). 당뇨병은환자군 68명, 대조군 22명으로환자군에서많았다 (P<0.001). 흡연, 고혈압, 당뇨병에대하여각각하위집단분석 (subgroup analysis) 을시행하였고허혈성뇌혈관질환환자군과대조군사이에혈소판수용체 P2Y1 SNP의유의한차이는없었다. Table 3. The P2Y1 polymorphism in patients with coronary artery diseases Geno Control N (%) AMI N (%) OR (95% CI)* UA N (%) OR (95% CI)* CSA N (%) OR (95% CI)* types A1622G AA 90 (47.9) 79 (46.2) 1.000 78 (47.0) 1.000 81 (46.8) 1.000 AG 73 (38.8) 80 (46.8) 1.416 (0.786, 2.549) 74 (44.6) 1.079 (0.611, 1.904) 74 (42.8) 0.958 (0.529, 1.732) GG 25 (13.3) 12 (7.0) 0.525 (0.195, 1.411) 14 (8.4) 0.568 (0.231, 1.401) 18 (10.4) 0.441 (0.169, 1.154) AG+GG 98 (52.1) 92 (53.8) 1.169 (0.670, 2.038) 88 (53.0) 0.939 (0.550, 1.604) 92 (53.2) 0.812 (0.464, 1.419) C647G GG 110 (59.5) 103 (61.7) 1.000 95 (57.6) 1.000 99 (58.2) 1.000 CG 60 (32.4) 57 (34.1) 1.351 (0.731, 2.497) 63 (38.2) 1.292 (0.723, 2.309) 59 (34.7) 0.977 (0.530, 1.803) CC 15 (8.1) 7 (4.2) 0.355 (0.093, 1.358) 7 (4.2) 0.645 (0.205, 2.028) 12 (7.1) 0.385 (0.113, 1.311) CG+CC 75 (40.5) 64 (38.3) 1.115 (0.621, 2.001) 70 (42.4) 1.154 (0.666, 2.002) 71 (41.8) 0.837 (0.469, 1.496) C2259G GG 162 (86.2) 142 (85.0) 1.000 139 (84.8) 1.000 146 (85.9) 1.000 CG 26 (13.8) 22 (13.2) 0.880 (0.384, 2.016) 24 (14.6) 0.885 (0.410, 1.911) 24 (14.1) 1.156 (0.534, 2.501) CC 0 (0) 3 (1.8) 1 (0.6) 0 (0) CG+CC 26 (13.8) 25 (15.0) 1.107 (0.504, 2.430) 25 (15.2) 0.910 (0.424, 1.952) 24 (14.1) 1.156 (0.534, 2.501) *OR adjusted with age, sex, and smoking status. Abbreviations: AMI, acute myocardial infarction; UA, unstabel angina; CSA, chronic stable angina.
74 Korean J Hematol Vol. 43, No. 2, June, 2008 2) 관상동맥질환환자와혈전형성의위험인자 관상동맥질환환자군과대조군의흡연, 고혈압, 당뇨병에대한차이를조사하였다. 192명의대조군, 173 명의급성심근경색증군, 167명의불안정성협심증군, 173명의안정성협심증군에서흡연자는대조군 48명, 급성심근경색증군 61명, 불안정성협심증군 56명, 안정성협심증군 49명으로각군에서차이를보였다 (P= 0.009). 고혈압은대조군 9명, 급성심근경색증군 85명, 불안정성협심증군 75명, 안정성협심증군 91명으로각군에서유의한차이를보였다 (P=0.012). 당뇨병은대조군 8명, 급성심근경색증군 40명, 불안정성협심증군 42명, 안정성협심증군 51명으로각군에서유의한차이를보였다 (P<0.001). 흡연, 고혈압, 당뇨병에대하여각각하위집단분석을시행하였고각관상동맥질환환자군과대조군사이에혈소판수용체 P2Y1 SNP 의유의한차이는없었다. 고 혈소판의활성화와혈전형성과정에는여러리간드들이결합하는혈소판수용체들이있다. 혈소판수용체의 SNP는동종면역성혈소판감소증 (alloimmune thrombocytopenia) 이나수혈불응증 (transfusion refractoriness), 수혈후자반증 (post transfusion purpura) 등의발생에중요한역할을담당하는데혈소판막당단백중에서특히 GP Ia, GP Ib, GP IIIa의 SNP가허혈성혈관질환위험의증가와관련이있다고보고되었다. 12-17) ADP 수용체에는 P2Y12, P2Y1, P2X1의 3가지퓨린수용체가있는데, P2Y12와 P2Y1 SNP는 ADP에대한다양한혈소판반응과연관이있다. 2,18-23) P2Y1 수용체는 G 단백질을통하여혈소판의활성화에관여하고혈소판의형태를변화시킨다. 19,20) P2Y12 수용체는 adenylate cyclase와결합하여 camp의생성을저해한다. 20) 이는혈소판의응집을극대화하고응괴를안정시킨다. 18,21) P2Y1 수용체와 P2Y12 수용체는정상적인 ADP에의해유도되는혈소판응집에필수적으로작용한다. P2X1 수용체는자극이되면비특이적인이온채널을통하여 Na + 와 Ca 2+ 이온이내향전류를일으키는데, 이수용체의역할은아직까지불분명한상태이다. 20,21,24) P2Y12 SNP는 H1과 H2, 2개의 haplotype이보고되어있는데, H1은 G52T의 G 유전자, H2는 G52T의 T 유전자에해당한다. Fontana 등은 H2가 ADP에대한혈소판의반응증가와관련이있다고보고하였으며, 환자- 찰 대조군연구에서말초동맥질환과연관된다고보고하였다. 25) Hetherington 등도 P2Y12 SNP의혈소판응집반응에따른차이를분석하였는데 H2와혈소판응집반응증가와의연관성은없었다. 2) ADP 수용체의다른한가지인 P2Y1에대하여 Hetherington 등은 A1622G SNP가혈소판 ADP 반응과유의한관련이있다고보고하였다. 2) G 대립유전자를가진사람일수록 ADP에의해유도되는혈소판응집반응이높았다. 그러나이 SNP와관련하여혈전질환의위험을임상적으로증명하는자료는아직보고되지않았다. 본연구에서 P2Y1 SNP에관하여 A1622G 이외에기존에보고된적이없는 A2591T, C1382T, C893T, C1881G, C2259G, A1747T, C647G의 7개 SNP를추가하여동시에분석하였다. 총 8개의 SNP에대하여 haplotype을구성하여전부분석하였으나허혈성혈관질환과정상인사이의유의한차이를보이지않았다. P2Y1 은 3,122 염기로구성된단일엑손으로비교적크기가작은유전자이므로 8개의 SNP 위치를찾아분석한것은 P2Y1 전반에걸쳐분석한것이라고할수있다. 최근국내에서허혈성혈관질환과연관되는 SNP를찾는연구가몇가지이루어졌다. 김등이기질금속성단백질분해효소 (matrix metalloproteinase)-9의프로모터부분의 C1562T SNP에서 1562T가급성심근경색의유의한위험인자가된다고보고하였다. 9) 정등은아디포넥틴 (adiponectin) G276T 및 T45G SNP와관상동맥질환과의연관성을규명하고자하였으나, 유의한연관성을찾지못하였다. 10) 기존의허혈성혈관질환과 SNP 의유전적차이의관련성을찾기위한연구들은대부분 1개또는 2개의단편적인 SNP에대하여분석하였다. 본연구에서는 P2Y1 SNP에관하여 A1622G 이외에기존에보고된적이없는 A2591T, C1382T, C893T, C1881G, C2259G, A1747T, C647G의총 8개 SNP를동시에분석하였다. 동맥경화증과이에따른혈전성합병증은다양한원인에의하고환경의영향을받기때문에 SNP가필연적으로이러한질환의개인취약성과연관이있다고제안하기위해서는신중을기하여야할것이다. 본연구에서도흡연, 고혈압, 당뇨병이허혈성혈관질환환자에서높은비율을보여 SNP 단독으로인한혈전형성의영향을비교분석하는데제한이있었다. SNP 이외의유의한혈전위험인자의영향을배제하고분석하기위해서는보다많은수의대상인원이확보되어야통계적인유의성을찾을수있을것이다. 향후다수의 SNP 블록연구또는다른허혈성혈관질환과관련
박은경외 : P2Y1 SNP 와허혈성혈관질환 75 된혈소판유전자연구, 허혈성혈관질환의발병기전에관여하는다른효소나수용체에대한 SNP 연구가대단위의환자군에서이루어진다면관련유전자검사로서한국인의허혈성혈관질환발병을예측하는데도움이될것이다. 요약배경 : 혈소판 ADP 수용체 P2Y1은혈소판응집에중요하다. 방법 : 허혈성혈관질환및관상동맥질환환자와정상인에서 P2Y1의유전적차이를 SNP를이용하여발견하여발병가능성을예측하고자하였다. P2Y1에서발견가능한 8개유전자를분석을시행하여환자-대조군연구를시행하였다. 연관값을고려하여최종적으로 A1622G, C647G, C2259G의 3개위치를선택하였다. 허혈성뇌혈관질환에대하여허혈성뇌혈관질환환자군 275명과대조군 275명, 관상동맥질환에대하여급성심근경색증 171명, 불안정성협심증 166명, 안정성협심증 173명과대조군 188명을대상으로하였다. SNP는 SNaPshot방법으로분석하였다. 결과 : 허혈성뇌혈관질환환자에서 A1622G의 AA, AG (OR, 1.170; 95% CI, 0.784 1.748), GG (OR, 1.031; 95% CI, 0.554 1.918) 는환자군과대조군에서차이를보이지않았다. C647G의 CC, CG (OR, 0.995; 95% CI, 0.639 1.550), GG (OR, 1.012; 95% CI, 0.450 2.277) 는환자군과대조군에서차이를보이지않았다. C2259G 의 CC, CG (OR, 0.619; 95% CI, 0.354 1.082), GG는환자군과대조군에서차이를보이지않았다. 관상동맥질환환자에서 C2259G의 GG, CG (AMI, OR, 0.880, 95% CI, 0.384 2.016; UA, OR, 0.885, 95% CI, 0.410 1.911; SA, OR, 1.156, 95% CI, 0.534 2.501), CC는급성심근경색, 불안정성협심증, 안정성협심증및각대조군에서차이를보이지않았다. C647G의 GG, CG (AMI, OR, 1.351, 95% CI, 0.731 to 2.497; UA, OR, 1.292, 95% CI, 0.723 to 2.309; SA, OR, 0.977, 95% CI, 0.530 to 1.803), CC (AMI, OR, 0.355, 95% CI, 0.093 to 1.358; UA, OR, 0.645, 95% CI, 0.205 to 2.028; SA, OR, 0.385, 95% CI, 0.113 to 1.311) 는급성심근경색, 불안정성협심증, 안정성협심증및각대조군에서차이를보이지않았다. A1622G의 AA, AG (AMI, OR, 1.416, 95% CI, 0.786 2.549; UA, OR, 1.079, 95% CI, 0.611 1.904; SA, OR, 0.958, 95% CI, 0.529 1.732), GG (AMI, OR, 0.525, 95% CI, 0.195 1.411; UA, OR, 0.568, 95% CI, 0.231 1.401; SA, OR, 0.441, 95% CI, 0.169 1.154) 는급성심근경색, 불안정성협심증, 안정성협심증및각대조군에서차이를보이지않았다. 결론 : P2Y1 유전자단일염기다형성은허혈성혈관질환환자와대조군사이에서유의한차이를보이지않았다. 참고문헌 1) Rauch U, Osende JI, Fuster V, Badimon JJ, Fayad Z, Chesebro JH. Thrombus formation on atherosclerotic plaques: pathogenesis and clinical consequences. Ann Intern Med 2001;134:224-38. 2) Hetherington SL, Singh RK, Lodwick D, Thompson JR, Goodall AH, Samani NJ. Dimorphism in the P2Y1 ADP receptor gene is associated with increased platelet activation response to ADP. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:252-7. 3) Yamada S, Akita H, Kanazawa K, et al. T102C polymorphism of the serotonin (5-HT) 2A receptor gene in patients with non-fatal acute myocardial infarction. Atherosclerosis 2000;150:143-8. 4) Kim GY. Genetic polymorphism of a platelet glycoprotein IIIa as an inherited risk factor for coronary artery disease in Koreans. Korean Circ J 1997;27: 1082-6. 5) Park S, Park HY, Park C, et al. Association of the gene polymorphisms of platelet glycoprotein Ia and IIb/IIIa with myocardial infarction and extent of coronary artery disease in the Korean population. Yonsei Med J 2004;45:428-34. 6) Pyo MK, Yun-Choi HS, Hong YJ. Apparent heterogeneous responsiveness of human platelet rich plasma to catecholamines. Platelets 2003;14:171-8. 7) Kambayashi J, Shinoki N, Nakamura T, et al. Prevalence of impaired responsiveness to epinephrine in platelets among Japanese. Thromb Res 1996;81: 85-90. 8) Yun-Choi HS, Park KM, Pyo MK. Epinephrine induced platelet aggregation in rat platelet-rich plasma. Thromb Res 2000;100:511-8. 9) Kim PJ, Chang K, Koh YS, et al. Functional polymorphism in the promoter region of matrix metalloproteinase-9 is strongly associated with acute myocardial infarction. Korean Circ J 2005;35:192-6. 10) Jung CH, Rhee EJ, Kim SY, et al. Association between two SNPs (+45T>G and +276G>T) of the adiponectin gene and coronary artery diseases. Korean J Med 2006;70:393-401. 11) Kim JM, Lee YY, Koo YK, et al. Association between
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