대한병리학회지 : 제 37 권제 6 호 2003 The Korean Journal of Pathology. 2003; 37: 379-83 만성육아종성염증에서파라핀포매조직을이용한결핵균 PCR 검사와 Ziehl-Neelsen 염색의비교분석 조민선 이시내 성순희 한운섭 이화여자대학교의과대학병리학교실 Comparison of Ziehl-Neelsen Stain and on Detection of Mycobacterium tuberculosis in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissues of Chronic Granulomatous Inflammation Min-Sun Cho, Shi Nae Lee, Sun Hee Sung and Woon Sup Han Department of Pathology, College of Medicine, Ewha Womans University, Seoul, Korea 접수 : 2003년 7월 23일게재승인 : 2003년 11월 6일 책임저자 : 한운섭우 158-056 서울특별시양천구목6동 911-1 이화여대부속목동병원병리과전화 : 02-2650-5730 Fax: 02-2650-5288 E-mail: woonshan@shinbiro.com * 이논문은이화여자대학교목동병원 2002 년도임상연구비의지원을받았음. Background : is a faster and more sensitive method to detect mycobacterium than acid-fast bacilli (AFB) stain, which is laborious and time consuming. We compared the sensitivity and specificity of AFB stain and and examined the possibility of as a confirmative test without AFB stain in the diagnosis of tuberculosis. Methods : We performed Ziehl-Neelsen stain and nested PCR using a commercially available kit amplifying IS6110 sequence in 81 cases of paraffin-embedded tissues diagnosed as chronic granulomatous inflammation. In addition, we evaluated the morphology of granuloma and the presence of caseation necrosis. Results : Of the 81 cases studied, 22 (27.2%) and 40 (49.4%) were positive for AFB stain and, respectively. Of 49 cases accompanying caseation necrosis, 19 (38.8%) were AFB stain positive and 37 (75.5%) were positive; a result that is comparable with that of other reports. Of the 22 AFB-positive cases, 2 were negative. Conclusion : is very helpful for the diagnosis of tuberculosis in routinely processed, formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples. Nevertheless, AFB stain should continue to be performed at the same time. Key Words : Chronic Granulomatous Diseases-Mycobacterium tuberculosis-stains-pcr 병리과에서의결핵감염에대한진단은일차적으로생검조직의 H&E 염색슬라이드를광학현미경으로관찰하여만성육아종성염증과건락성괴사를발견함으로써이루어진다. 결핵외의다른질환도만성육아종성염증을일으킬수있기때문에, 1 병리의사는통상적으로 Ziehl-Neelsen 염색에서항산성균을발견한경우에만결핵감염으로확진한다. 이염색은결핵균을확인할수있는경제적이고빠른상당히특이적인방법이다. 그러나민감도가낮은단점이있다. 특히파라핀포매조직은객담도말보다포르말린및 xylene이균의염색성을감소시켜민감도가더낮다. 2 또한광학현미경으로결핵균을찾는작업은균의크기가작고수가매우적어서 200배내지 400배율로전체슬라이드를정밀하게오랫동안보아야하기때문에시간과노력이많이요구된다. 근래 PCR을이용한결핵균검출법 ( 이하 ) 이개발되었다. 3-6 이검사는 Ziehl-Neelsen 염색에비해비용이많이들지만, 민감도는대략 50-90% 로 Ziehl-Neelsen 염색에비해높다고 알려져있다. 7-10 최근에는국내외의여러회사에서파라핀포매조직에쉽게적용할수있는 kit가개발되었고이를국내여러병원의병리과에서결핵진단에이용하고있는실정이다. 이에본연구자는조직학적으로만성육아종성염증이있었던예를대상으로 Ziehl-Neelsen 염색과함께 kit를이용하여 을동시에시행하고, 조직학적인소견과이두검사결과를비교분석하여, 결핵확진에있어서민감도가더높은 만을시행할수있는지를알아보고자하였다. 재료와방법재료이화여대부속목동병원에서 2001년 9월부터 2003년 6월까지만성육아종성염증으로 Ziehl-Neelsen 염색과 을시행 379
380 조민선 이시내 성순희외 1 인 하였던 81예를대상으로하였다. 성별은남자 42명, 여자 38명이었고연령분포는 1세에서 91세였다. 조직은림프절 26예, 폐 11예, 위장관 11예, 흉막 4예, 유방 4예, 골 4예등에서채취하였다. 그외흉벽, 척추주변부, 후두, 복막, 간, 전립선, 타액선, 피부, 요도, 연부조직등이있었다. 1 2 3 4 방법 병리학적소견검색모든예에서만성육아종성염증이관찰되었으며, 상피양세포가모여경계가분명하고가장자리에림프구가둘러싸고있는육아종을형성한경우를잘형성된육아종 (well-formed granuloma) 이있다고하였고 (Fig. 1), 상피양세포가있으나경계가불분명한군집을형성하고주변조직에만성염증이나섬유화가동반되어있는경우를경계가불분명한육아종 (ill-defined granuloma) 이있다고분류하였다. 또한병변에서건락성괴사의존재유무를관찰하였다. 괴사정도는현미경소견상한개의육아종내건락성괴사가있는경우소량의건락성괴사로간주하였고, 육아종들이융합하여넓은부위의건락성괴사가있는경우를융합성건락성괴사로정하였다. 두명의병리의사가조직슬라이드를각각관찰하였다. Ziehl-Neelsen 염색통상적인염색방법으로시행하였고광학현미경으로항산성균의유무를판독하였다. 파라핀포매조직에서 DNA의추출및PCR 파라핀포매조직을블록의크기가작은경우는 8 m의두께로 5-6장, 블록의크기가큰경우는 7 m 두께로 3-4장박절하여 1.5 ml 튜브에담았다. kit (M kit, Neodin, Seoul, Korea) 를이용하였으며권장하는방법에따라 PCR 을시행하였다. 파라핀을제거할때 kit는증류수를이용하기를권장하였으나, xylene을이용하는것이조직다루기에더용이하여 xylene으로파라핀을제거하였다. 그후 kit에포함된 DNA 추출액 50 L를파라핀을제거한조직에첨가하여잘섞고 100 에서 10분간가열한후, 12,000 rpm으로 1분간원심분리하여 resin을가라앉히고상층의액체부분만을 PCR에이용하였다. 일부예는이방법과함께 proteinase K를이용하여 DNA를추출하였는데, 조직에 proteinase K 400 g/ml이섞인용액을가하고 55 에모든조직이거의녹을때까지 ( 대부분 24-48시간 ) 둔후 SV PCR 정제키트 (Promega, Medison, WI, USA) 를이용하여 DNA 정제를한후사용하였다. Nested PCR 방법으로 PCR을시행하였다. 첫번째 PCR 혼합액 15.5 L에 DNA를 4.5 L ( 총량 20 L) 를넣고 95 에서 5분간변성시킨후, 94 에서 30초, 68 에서 30초, 72 에서 30초로 35회반응시키고72 에서 5분연장하였다. 두번째 PCR 혼합액 18.5 L에 Fig. 1. (A) The tissue shows chronic granulomatous inflammation with confluent caseous necrosis. Inset: Acid-fast bacilli on AFB stain. (B) Agarose electrophoresis of PCR products reveals a positive band of 181 base pair size representing M. tuberculosis complex. (Lane 1, molecular weight marker (100 bp ladder marker); Lane 2, positive control; Lane3, negative control; Lane 4, positive sample). 첫번째 PCR 산물 1.5 L를넣고 95 에서 5분간변성시킨후, 94 에서 30초, 65 에서 30초, 72 에서 30초로 35회반응시킨다음 72 에서 5분연장하였다. 2% agarose gel에서전기영동하여양성띠를확인하였다. 매회검사할때마다 kit에서제공하는양성대조군과음성대조군을병용검사하였다. 일차 PCR 산물은 256 염기쌍이며이차 PCR 산물은 181 염기쌍이다 (Fig. 1). 병리조직학적소견 결과 전체 81예중육아종을잘형성한경우는 67예 (82.7%) 였고경계가불분명한육아종을형성한경우는 14예 (17.3%) 였으며, 건락성괴사를동반한예는 49예 (60.5%) 였다. 전자 67예중 44 예 (65.7%) 가건락성괴사를동반하였으며, 23예 (34.3%) 는동반하지않았다. 경계가불분명한육아종을형성한 14예중 5예 (35.7%) 가건락성괴사를동반하였고, 9예 (64.3%) 는동반하지않았다. 건락성괴사를동반하지않은예중괴사가일어나기전의초기만성육아종성염증으로보이는예도있으나, Crohn 장염으로의심되는 7예, 육아종성유선염 4예, 사르코이드증, 이물질성육아종 (foreign body granuloma), 환상육아종등으로의심되는예등도포함하였다 (Table 1). 조직학적소견과 Ziehl-Neelsen 염색과 결과비교 전체 81예중 22예 (27.2%) 가 Ziehl-Neelsen 염색양성이었고, 40예 (49.4%) 가 양성이었다. 잘형성된육아종을보인 A B
결핵균 PCR 검사와 Ziehl-Neelsen 염색의비교 381 Table 1. Comparison beween histologic features, AFB stain, and Histologic features No. of cases AFB Positive cases (%) 67예중 19예 (28.3%) 가 Ziehl-Neelsen 염색양성이었고, 36예 (53.7%) 가 양성이었다. 14예의경계가불분명한육아종를보인예중 3예 (21.4%) 가 Ziehl-Neelsen 염색양성이었고, 4예 (28.6%) 가 양성이었다 (Table 1). 잘형성된육아종을보인 67예중 44예가건락성괴사를동반했는데, 이중 16예 (36.3%) 와 33예 (75%) 가각각 Ziehl-Neelsen 염색양성및 양성이었다. 괴사를동반하지않은 23예중 3예 (13%) 가 Ziehl-Neelsen 염색및 모두양성이었다. 경계가불분명한육아종을보인 14예중에 5예가건락성괴사를동반하였고, 5예중 3예 (60%) 및 4예 (80%) 가 Ziehl-Neelsen 염색및 양성이었고, 괴사를동반하지않은 9예는모두 음성이었다 (Table 1). 건락성괴사를기준으로보았을때, 이를동반한전체 49예중 19예 (38.8%) 및 37예 (75.5%) 가각각 Ziehl-Neelsen 염색및 양성이었다. 이에비해괴사를동반하지않았던 32예중 3예 (9.1%) 가 Ziehl-Neelsen 염색및 모두양성이었다 (Table 1). 융합성건락성괴사를보인 43예중 33예 (76.7%), 소량의건락성괴사를보인 6예중 4예 (66%) 가 양성이었고의미있는차이는보여주지않았다 (Table 2). 만성육아종성염증은아니지만여러가지이유로 을시행했던예들은모두음성이었다. Ziehl-Neelsen 염색과 의상관관계 Positive cases (%) Well-formed granuloma with caseous necrosis 44 16 (36.4) 33 (75.0) without caseous necrosis 23 3 (13.0) 3 (13.0) Subtotal 67 19 (28.3) 36 (53.7) Ill-defined granuloma with caseous necrosis 5 3 (60.0) 4 (80.0) without caseous necrosis 9 0 (0) 0 (0) Subtotal 14 3 (21.4) 4 (49.4) Total 81 22 (27.2) 40 (49.4) Ziehl-Neelsen 염색과 결과의상관관계를비교해보면, Ziehl-Neelsen 염색양성인 22예중 20예 (90.9%) 가 TB- PCR 양성이었고, 2예 (9.1%) 가음성이었다 (Table 3). 첫 TB- PCR 을시행했을때는 7예가음성이었으며, proteinase K를이용하여 DNA를재추출하고, 정제한후다시 을시행했을때는이중 5예가양성으로전환되어, 최종적으로 2예가 Ziehl- Neelsen 염색양성, 음성이었다. 양성인 40 예중 20예 (50%) 가 Ziehl-Neelsen 염색양성이었다. Table 2. Correlation of AFB stain-and -positive cases with amount of caseous necrosis Degree of caseous necrosis (No. of cases) AFB positive cases (%) 고찰 positive cases (%) Confluent necrosis (n=43) 18 (41.9) 33 (76.7) Minute necrosis (n=6) 1 (16.7) 4 (66.7) Total (n=49) 19 (38.8) 37 (75.7) Table 3. Results of AFB stain and Positive Negative Total AFB stain Positive 20 2 22 (27.2%) Negative 20 39 59 (72.8%) Total 40 (49.4%) 41 (50.6%) 81 (100%) 본연구자는만성육아종성염증의파라핀포매조직에대해 Ziehl-Neelsen 염색과 kit을이용한 을시행하였고, Ziehl-Neelsen 염색은 27.2% (22/81예), 은 49.4% (40/81예) 의양성률을얻었다. 여기에는결핵이아닌다른만성육아종성염증예도포함되어있었기때문에결핵의보다확실한소견인건락성괴사를동반한예만을대상으로하면, Ziehl-Neelsen 염색은 38.3% (19/49예), 은 75.5% (37/49예) 의양성률을보여이전연구결과와유사하였다. Ziehl- Neelsen 염색과 결과를비교했을때, 첫 PCR에서 22 예중 7예가, 재차시행한 PCR에서는 2예가 Ziehl-Neelsen 염색으로균이보였다. 그러나 은음성이어서두검사를모두시행하는것이필요하다는결론을내렸다. 결핵균의증명에있어서배양, Ziehl-Neelsen 염색, 등이이용되고있다. 결핵균배양은가장확실한방법이나시간이오래걸리고민감도가매우낮다. 11,12 Ziehl-Neelsen 염색은역시민감도가낮아서조직이나체액 1 ml당 10 4 bacilli가있어야검출이가능하다. 13 은파라핀포매조직을이용할경우에는검출률을높이기위해 one-step PCR보다 nested PCR 을하는데, 이방법은 Ziehl-Neelsen 염색보다 1,000-5,000배정도민감도가높다고보고되고있다. 14 그러나위음성도가능하여결핵균배양양성인예에서 91%, 95% 의 양성률이보고되어있다. 15 결핵균유전자의여러부분에대한 PCR primers 들이개발되어있으며, 그중 IS6110 sequence는박테리아한마리당 5-6 copy 정도존재하는유전자로서 MTB complex에속하는대부분의균주 (M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis bacillus Calmotte-Guerin, M. africanum, M. microti) 에존재하여결핵균진단에매우좋은표적유전자이고, 본연구에서사용하였다. IS6110 sequence의검출한계는 10 fg, 즉 2마리의결핵균만있으면양성띠가나타날수있다고보고되어있다. 16-18
382 조민선 이시내 성순희외 1 인 본연구에서 Ziehl-Neelsen 염색은양성이나 음성인예가있었는데, 이러한결과의원인은여러가지가될수있다. 먼저추출한결핵균 DNA의양이충분하지않거나질이적절하지않을수있다. 조직내에포함되어있는결핵균의수가희소하여파라핀블록을절편하는과정에서결핵균이들어있는부분이포함되지않을수있는데, 19,20 실제로재 PCR에서도음성이었던 2예중 1예는흉막생검으로조직이매우작았다. 나머지 1예는림프절로서조직의크기가컸지만발견된항산성균은거의한두개로변성에의해균이잘라져보여 DNA가분절되어있을가능성이있었다. 또한결핵균의세포벽이단단한편이어서때로 DNA 추출이완전하지않을수있다는보고가있다. 21 본연구에서이용한 kit는파라핀제거에물을사용할것을권장하고있으며, 이와함께고유한 DNA 추출액을제공하며그속에 resin이섞여있어추출액속의단백질등의불순물을제거한다. 본연구자는파라핀을물이아니라 xylene과 alcohol를사용하여제거하였지만, 추출과정을끝낸후에튜브의밑에용해되지않은조직이항상남아있어, 추출된 DNA의양이적거나아니면 DNA의순수도에문제가있을가능성이있을것으로생각했다. 따라서 Ziehl-Neelsen 염색에서항산균이보였으나, 첫 PCR에서음성이었던 7예를대상으로 proteinase K로조직을모두녹여 DNA 양을늘리고, DNA purification kit를이용하여dna 정제후재PCR을했을때, 5예에서양성띠를볼수있었다. 또다른가능성은결핵균자체가돌연변이로 IS6110 sequence 를소실한결핵균일수도있다. 22,23 아니면비정형미코박테륨감염일수있는데, 7예에대해비정형미코박테륨 PCR 을시행했을때모두음성이어서이가능성은제외할수있었다. 그외본연구에는해당되지않지만파라핀포매조직의경우오래된블록일수록검출률이감소하였다는보고가있다. 24 Park 등 25 은병리조직학적인소견과 Ziehl-Neelsen 염색, IS- 6110을이용한 결과등을비교하였는데, 잘형성된육아종과 Langerhans형거대세포와건락성괴사가있는경우가모두 양성이었으며, 만성육아종성염증인경우에전체적으로 68% 의양성률을얻었다. 그리고건락성괴사가동반된경우 86% 가양성이라고보고하였다. 본연구에서도건락성괴사가동반된경우양성률이높았다. 이들의연구에서도 Ziehl-Neelsen 염색양성이었던 14예중 3예가 음성이었다. 또한이들은육아종이없는만성염증에서도 36% 가 양성이라고보고하였는데, 본기관에서는만성육아종성염증은아니지만다른이유로 을시행하였던모든예에서양성반응을찾아볼수없었다. 은시행하는기관에따라오차가발생할수있는검사로서, 연구에의하면동일한 양성인파라핀조직절편을가지고여러기관에서각자의방법에따라 PCR을시행했을때위음성이 11-19% 로나타났다. 26 그리고부주의하게시약및기구를사용하였을때오염에의한위양성의위험성이상존한 다. 본연구자는상업적으로개발되어있는 kit를이용하는것이검사결과및위음성및위양성을관리하기용이하여 kit를사용하였다. 위양성인예는없었으나위음성인예가있어 과정중 DNA 추출과정에서주의가필요하다고생각한다. TB- PCR kit를이용한 은병리과에서결핵진단의민감도를높일수있는비교적용이한방법이며, 반드시 Ziehl-Neelsen 염색과병행해야한다. 감사의글슬라이드및자료수집에애써주신중국연변제2인민병원소속김명한선생께감사드립니다. 참고문헌 1. Collins T. Acute and chronic inflammation. In: Cotran RS, Kumar VK, Collins T, eds. Robbins pathologic basis of disease. 6th ed. Philadepphia: WB Saunders, 1999; 50-88. 2. Fukunaga H, Murakami T, Gondo T, Sugi K, Ishihara T. Sensitivity of acid-fast staining for Mycobacterium tuberculosis in formalin-fixed tissue. Am J Respir Crit Care Med 2002; 166: 994-7. 3. Brisson-Noel A, Gicquel B, Lecossier D, Levy-Frebault V, Nassif X, Hance AJ. Rapid diagnosis of tuberculosis by amplification of mycobacterial DNA in clinical samples. Lancet 1989; 2: 1069-71. 4. Shankar P, Manjunath N, Mohan KK, et al. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction. Lancet 1991; 337: 5-7. 5. Perosio PM, Frank TS. Detection and species identification of mycobacteria in paraffin sections of lung biopsy specimens by the polymerase chain reaction. Am J Clin Pathol 1993; 100: 643-7. 6. Hardman WJ, Benian GM, Howard T, McGowan JE Jr, Metchock B, Murtagh JJ. Rapid detection of mycobacteria in inflammatory necrotizing granulomas from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue by PCR in clinically high-risk patients with acid-fast stain and culturenegative tissue biopsies. Am J Clin Pathol 1996; 106: 384-9. 7. Afghani B, Lieberman JM, Duke MB, Stutman HR. Comparison of quantitative polymerase chain reaction, acid fast bacilli smear, and culture results in patients receiving therapy for pulmonary tuberculosis. Diagn Microbiol Infect Dis 1997; 29: 73-9. 8. Frevel T, Schafer KL, Totsch M, Bocker W, Dockhorn-Dworniczak B. PCR based detection of mycobacteria in paraffin wax embedded material routinely processed for morphological examination. Mol Pathol 1999; 52: 283-8. 9. Li JY, Lo ST, Ng CS. Molecular detection of Mycobacterium tuberculosis in tissues showing granulomatous inflammation without demo-
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