(51) Int. Cl. C12N 15/74 (2006.01) C12N 1/21 (2006.01) C12N 1/16 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2006 년 06 월 30 일 10-0594607 2006 년 06 월 21 일 (21) 출원번호 10-2004-0089046 (65) 공개번호 10-2006-0039815 (22) 출원일자 2004년11월03일 (43) 공개일자 2006년05월09일 (73) 특허권자재단법인서울대학교산학협력재단서울특별시관악구봉천동산 4-2 (72) 발명자최윤재서울강남구대치동 1014-3 대치삼성아파트 103 동 1502 호 이창훈전북익산시함라면신대리 55-3 이황주유소 우정희서울마포구아현동 603-34 호 30 통 1 반 강승하경기수원시권선구호매실동 LG 아파트 106 동 1001 호 최승훈경기수원시영통구영통동 956-2 동신아파트 311 동 904 호 강상기서울동작구상도 5 동 141-14 번지 (21/1) (74) 대리인이덕록 (56) 선행기술조사문헌 KR1019940000579 A KR1020040087056 A * 심사관에의하여인용된문헌 KR1020030073388 A WO199820035 A1 심사관 : 박정웅 (54) 신규한경구투여용재조합인간성장호르몬분비미생물제제및그제조방법 요약 - 1 -
본발명은신규한경구투여용재조합인간성장호르몬분비미생물제제및그제조방법에관한것으로, 경구투여를통해장내에안전하게전달되어인간성장호르몬과 IgG1 의 Fc 프래그먼트가결합되어있는융합단백질을발현할수있는유산균또는효모의미생물제제를제공하는뛰어난효과가있다. 또한, 본발명은장상피세포에서트랜스사이토시스를유발할수있는융합단백질을발현하는발현벡터를제공하는뛰어난효과가있다. 따라서, 본발명은경구투여용단백질이장내에서흡수가능함을증명하고, 또한유산균을이용한경구투여용단백질의전달방법은흰쥐실험을통해매우우수한효율이있음을보여줌으로써단백질계약물의전달체로서유산균의우수성을입증한바, 이로인해경제적인측면이나이용의편리성측면에서상당한기여를할것으로기대되므로의약학산업을비롯하여미생물산업상매우유용한발명이다. 대표도 도 2 색인어 성장호르몬, 면역글로불린, 유산균, 트랜스사이토시스, 효모 명세서 도면의간단한설명 도 1 은본발명재조합인간성장호르몬과트랜스사이토시스도메인의융합단백질의구조를나타낸것이다. 도 2 는본발명유산균발현벡터 pnz123(1-5n) 의개열지도및구조를나타낸것이다. 도 3 은콜로니 PCR 을통한유산균형질전환체의확인결과를도시한젤사진도이다. 도 4 는본발명유산균형질전환체에서분비된 H6 융합단백질의 SDS-PAGE 및웨스턴블랏팅결과를도시한것이다. 도 5 는본발명재조합융합단백질의유전자를효모발현벡터인 ppicz 에클로닝하는과정을도시한것이다. 도 6 은본발명효모균주에서발현되는융합단백질의 SDS-PAGE 및웨스턴블랏팅결과를도시한것이다. 도 7 은본발명미생물제제의트랜스사이토시스능을측정하기위한트랜스웰시스템의구조및이를이용한트랜스사이토시스분석방법을도시한것이다. 도 8 은본발명효모균주에서발현되는융합단백질의 ELISA 및웨스턴블랏팅을통한트랜스사이토시스분석결과를나타낸것이다. 도 9 는본발명효모균주에서발현되는융합단백질을첨가하여 24 시간동안배양한 HepG2 세포에서 IGF1 생산반응결과를도시한것이다. 도 10 은본발명유산균형질전환체 H6 에서생산되는융합단백질의 IGF1 생산반응및트랜스사이토시스활성을측정한결과이다. 도 11 은본발명유산균형질전환체 H6 의흰쥐생장에미치는영향을나타낸 in vivo 실험결과를도시한것이다. 발명의상세한설명 발명의목적 발명이속하는기술및그분야의종래기술 - 2 -
본발명은신규한경구투여용재조합인간성장호르몬분비미생물제제및그제조방법에관한것이다. 보다상세하게는, 본발명은인간성장호르몬과인간면역글로불린의 Fc 프래그먼트가결합된융합단백질을발현하는유산균또는효모형질전환체를제조함으로써경구투여를통해소장에안전하게도달하여체내에흡수될수있도록하는경구투여용미생물제제에관한것이다. 성장호르몬 (growth hormone) 과같은단백질계약물은기존의화학계약물에비해독성이적고강한효과와생체친화적특성으로인해최근개발이가속화되고있다. 그러나, 단백질계약물은생체효소에의해쉽게분해되고비교적거대분자 (macromolecule) 이기때문에생체막투과에제약을받는단점이있어이러한문제점을극복할수있는새로운약물전달시스템이요구되고있다. 질병또는상처의치료나건강증진을목적으로약물을투여하는방법에는주사, 경구투여, 연고, 패치 (patch) 등의여러가지방법이있는데, 그중에서주사투약방식은약물의빠른약효발현으로널리이용되고있다. 그러나, 주사방식은약물을정기적으로투여해야하는경우통증및과민반응등을야기하기도하여환자에게많은스트레스를주고번거로운단점이있다. 반면에, 경구투약방식은환자들의거부감이적고숙련된인력이나주사기, 링거 (Ringer's solution) 등의별도의기구가필요하지않기때문에가장편리하고수용하기쉬운경제적인투약형태라고할수있다. 그러나, 단백질계약물을경구투여할경우에는생체의소화기관을통과하면서위산이나장내에서분비되는각종소화효소의공격을받아대부분그활성을잃게되며, 비록그중일부가온전한형태로소장내에도달하더라도외부물질을선택적으로받아들이는장상피세포층의효과적인차단에의해체내로흡수되어제기능을발휘하기는매우어렵다. 따라서, 현재까지는이러한약물의투약을여전히번거로운주사방식에의존하고있다. 위에서제시한것과같이경구투여는투약의편이성과환자의복약순응도를높일수있다는측면에서환자의자가치료 (self-administration) 에있어서가장이상적인투여경로이다. 그럼에도불구하고, 현재까지경구를통한단백질계약물의흡수율은 1% 미만으로, 소화관통과시의불안정성, 낮은장점막투과성등은아직도해결하지못한난제로남아있는실정이다. 최근생명공학의비약적인발전으로인해다양한단백질계약물이화학요법을대체할차세대약물로써개발되고있는현시점에서, 개발된단백질계약물의이용성을획기적으로증진시키기위해서는무엇보다도안정적으로약물을체내로이송할수있는효율성높은경구투약시스템을개발하는것이시급하다고할수있다. 한편, 유산균연구는현재까지축적된연구성과들을토대로가속화되고있으며본격적으로유산균을활용한고부가가치제품들의연구가활발히이루어지고있다. 지난 20 여년간의유산균에대한유전공학적인연구는대부분이유산구균 (Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris) 에집중되었다. 최근들어유산간균인유산균속 (Lactobacilli) 에대한연구가활발히진행되어이들에서분리된다양한플라스미드의특성규명과벡터의개발이이루어지고있다. 유전자조작에의해특정유전자를불활성시키거나또는플라스미드를이용하거나염색체 DNA 에삽입시키는방식으로유전자들을도입시킴으로써이들유산균에대한활용이증대되고있다. 유산균에대한관심은비병원성균 (nonphathogenic bacteria) 이라는장점으로최근에는산업분야는물론의학분야에이르기까지널리그이용의범위가증가하고있다. 이러한넓은이용범위때문에재조합유산균의개발은많은연구자들에의해서연구가진행중이며, 최근에는생점막백신벡터 (live mucosal vaccine vector) 나경구전달시스템 (oral delivery systems) 으로관심이증가되고있다 (Claassen 등. 1993; Pozzi 등. 1992; Rush 등. 1994). 그러나이러한경구전달시스템에있어서재조합외래단백질을생산하는데있어서는유산균에서효과적이고안정적인발현시스템이필요하였다. 오늘날까지유산균에서몇가지외래단백질을발현시켰다는연구보고는있었지만아직까지는산업적으로이용하기에는그발현량이미비한실정이었다. 이점에착안하여본발명자들은수용체매개물질운송기전 (receptor mediated endocytosis) 에의해장점막을투과하는단백질리간드 (peptide ligand) 를단백질계약물에도입해유산균에유전자형태로전이해기능성생균제형태로제조함으로써소화관을안전하게통과할수있는고효율의경구용약물전달체를개발하고자하였다. 따라서, 본발명의목적은성장호르몬등거대분자를경구투여를통해소장에안전하게도달하여체내에흡수될수있도록하는경구투여용미생물제제와그제조방법을제공하고자한다. 발명이이루고자하는기술적과제 본발명의상기목적은장상피세포에서트랜스사이토시스 (transcytosis) 를유도할수있는인간의면역글로불린 (human IgG) 의 CH2 와 CH3 도메인을이용하여모델약물인성장호르몬유전자와융합단백질을제작하고, 효모발현시스템 (Pichia pastoris expression system) 과유산균발현벡터시스템을이용하여상기융합단백질을분비하는유산균 (Lactobacillus) 과효모 (Pichia pastoris) 형질전환체를생산하고이들의트랜스사이토시스능평가, IGF1 생산능및흰쥐를이용한 in vivo 사양실험을검정하여경구투여용성장호르몬분비미생물제제를개발함으로써달성하였다. 발명의구성및작용 - 3 -
본발명은인간의면역글로불린 (human IgG) 의 CH2 와 CH3 도메인과인간의성장호르몬유전자와의융합단백질의제작단계 ; 효모발현시스템 (Pichia pastoris expression system) 및유산균발현벡터시스템을이용한상기융합단백질을분비하는유산균 (Lactobacillus) 과효모 (Pichia pastoris) 형질전환체의생산단계 ; 및상기형질전환체의트랜스사이토시스능평가, IGF1 생산능및흰쥐를이용한 in vivo 사양실험검정단계로구성된다. 본발명은유산균 (Lactobacillus brevis) ATCC 8287 로부터분리한플라스미드 pnz123 에서유래하고, 인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 hinge-c2-c3 도메인의유전자를포함하는도 2 에도시된개열지도를갖는재조합유산균발현벡터 pnz123(1-5n) 를제공함을특징으로한다. 본발명은인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 hinge-c2-c3 도메인의융합단백질을발현함을특징으로하는유산균 (Lactobacillus brevis) H6 KACC 91137 을제공함을특징으로한다. 본발명은인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 C2-C3 도메인의융합단백질을발현함을특징으로하는효모 (Pichia pastoris) C2 KACC 93017 를제공함을특징으로한다. 본발명은인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 hinge-c2-c3 도메인의융합단백질을발현함을특징으로하는효모 (Pichia pastoris) H6 KACC 93018 을제공함을특징으로한다. 본발명은인간성장호르몬과트랜스사이토시스도메인을포함하는재조합발현벡터 pnz123(1-5n) 를제작하고, 이를유산균 (Lactobacillus) 에형질전환시켜얻음을특징으로하는경구투여용재조합인간성장호르몬분비미생물제제의제조방법을제공함을특징으로한다. 이하, 본발명의구체적인구성을실시예를통해설명하지만, 본발명의권리범위가이들실시예에만한정되는것은아니다. [ 실시예 ] 실시예 1: 장상피세포에서트랜스사이토시스를유도할수있는후보단백질군의제작및발현 본발명경구투여용미생물제제를제조하기위해장상피세포에서트랜스사이토시스를유도할수있는후보단백질군을제작하였다. 도 1 에도시된바와같이, 성숙한인간성장호르몬코딩유전자 (hgh) 와트랜스사이토시스도메인으로서인간의면역글로불린 1(IgG1) 의 Fc 프래그먼트를융합시킨유산균발현벡터 plb-h6 를제작하였다. C2 융합단백질은 hinge 부위가없는 IgG1 의 Fc 프래그먼트 CH2-CH3 도메인과성숙한인간성장호르몬유전자시퀀스가융합되어있고, H6 융합단백질은 hinge 부위의시퀀스를포함한 Fc 프래그먼트와성숙한인간성장호르몬유전자시퀀스가융합되어있다. 상기와같이플라스미드발현벡터의숙주로서유산균 (Lactobacillus brevis) ATCC 8287 균주를사용하였으며, 성숙한인간성장호르몬은 Vent DNA 폴리머라제를이용하여 PCR 을통해증폭하였다. 도 2 에는상기의유산균발현벡터에유산균분비시그널이융합되어있는 pnz123 유래인 pnz123(1-5n) 발현벡터를도시하였다. 상기벡터는 S-layer 의 P-2 프로모터, 분비시그널시퀀스및클로닝사이트 (Xba I/Xho I) 로이루어져있다. 여기에, 도 1 에서제작한 3 가지타입의융합단백질을삽입하여 pnz123(1-5n) 를구축하였다. 도 2 의플라스미드벡터 plb-h6, plb-c2 및 plb-gh 를유산균 (Lactobacillus brevis) ATCC 8287 에일렉트로포레이션 (electroporation: 2.5kV, 4000Ohm, 25uF) 을이용하여도입시킨후, 37 에서 2 시간동안 MRS 배지 ( 미국디프코사제품 ) 에서회복시킨다음, 5 μg /ml 의클로람페니콜이포함되어있는 MRS 아가플레이트에서배양하였다. 형질전환체는콜로니 PCR 방법에따라확인하고도 3 에그결과를나타내었다. 레인 1-4 는 plb-h6 플라스미드벡터로형질전환된유산균, 레인 5-6 은 plb-c2 플라스미드벡터로형질전환된유산균, 레인 7-9 는 plb-gh 플라스미드벡터로형질전환된유산균을나타낸다. 상기융합단백질의발현및분비여부를확인하기위해, 상기로부터선별된형질전환체를 5 μg /ml 의클로람페니콜이포함되어있는 MRS 배지에서 37 에서진탕배양한후, 상기배양액을 5 μg /ml 의클로람페니콜이포함되어있는 buffered MRS 배지로세척하고 1500 g 에서 10 분동안원심분리하여세포와배양상등액을분리하였다. 암모늄설페이트침전법에따라배양상등액에서단백질을추출하고, 통상의방법에따라세포펠렛은 TGE 완충액 (buffer) 으로용해시키고무타노라이신 (mutanolysin) 과라이소자임 (lysozyme) 을처리하였다. SDS-PAGE 를통해단백질분획을분리하고 PVDF 멤브 - 4 -
레인에일렉트로블랏팅을실시하였다. 인간성장호르몬과 Fc 프래그먼트가융합되어있는융합단백질은웨스턴블랏팅을통해분석하였다. 이때 1 차항체로서 1/5000 로희석시킨모노클로날마우스안티 hgh 를사용하였고, 2 차항체는 HRP 가결합되어있는코우트안티마우스 IgG 를사용하였다. 도 4a 는유산균에서분비된 H6 융합단백질에대한 SDS-PAGE 를 4b 는웨스턴블랏팅결과를도시한것으로, 상기단백질이발현됨을확인할수있었다. 실험예 1: 효모발현시스템을이용한융합단백질의트랜스사이토시스활성측정 융합단백질의트랜스사이토시스능을시험하기위해트랜스웰시스템을이용하여트랜스사이토시스분석을실시하였다. 우선, 유산균발현스템에서는단백질을충분히얻기어렵기때문에, 효모발현시스템을이용하여융합단백질을준비하였다. 이를위해, 후보단백질의코딩유전자를제작하여 PicZa 벡터에상기유전자를삽입시켰다 ( 도 5 참조 ). 메탄올유도에따라상기융합단백질을발현시키고 SDS-PAGE 및웨스턴블랏팅을이용하여단백질을측정하였다. 상기융합단백질은암모늄설페이트침전법에따라농축하고 HBSS(pH6.0) 로투석하여 NTA 컬럼 ( 머크사제품 ) 및 Protein G 컬럼 ( 밀리포어사제품 ) 을이용하여어피니티크로마토그래피를실시하여단백질을정제하였다. 도 6a(SDS-PAGE) 및 6b( 웨스턴블랏팅 ) 에나타난바와같이, 효모에서발현된 H6 융합단백질은약 55 kda( 레인 1-2) 이고, C2 융합단백질은약 52 kda( 레인 3-4) 였으며, hgh 융합단백질은약 22 kda( 레인 5-6) 으로측정되었다. 한편, 인간의장상피세포주인 T84 에서융합단백질의트랜스사이토시스능을시험하기위해, 컨플루언스 (confluence) 상태의 T84 단세포층을도 7 에도시된 3.0 μm크기의트랜스웰 ( 코스타제품 ) 에서전기적저항이 800-1200Ω/cm 2 이될때까지 DMEM/F12 배지 (5% 우태반혈청을포함함, 기브코사제품 ) 에서배양하여 T84 세포주의 polarization 을유도하였다. Polarization 이란세포가소장상피세포와같이 apical side 나 basolateral side 로수용체나효소, 다른단백질의분포가편중되어 in vivo 에존재하는세포와기능이유사하게되는과정을말하는데, polarization 된정도는전기적저항을측정하여판단하였다. 트랜스사이토시스능을측정하기위해서는보통 OVM electrometer 를이용하여측정된전기적저항이 800-1200Ω/cm 2 인 T84 단세포층을사용하였으며, 상기세포를 HBSS(pH6.5) 에서용해시키고, 1 μg의융합단백질 (H6, C2, hgh) 을윗쪽웰 (apical reservoir) 에로딩하였다. nonspecific blocker 로서 0.5% 젤라틴 ( 시그마케미칼주식회사 ) 을리간드에포함시켰다. 단세포층을 37 또는 4 에서리간드와함께 1 시간동안배양시킨후, 반대쪽웰의완충액을수집하여머캅토에탄올로환원시킨후웨스턴블랏팅과 ELISA 방법을통해분석하였다. 도 8a 의웨스턴블랏팅결과, H6 융합단백질 hgh-fc 는 37 에서 T84 단세포층을통과하여이동하였으나 ( 레인 3), 4 에서는검출되지않았다 ( 레인 2). 도 8b(ELISA 결과 ) 에서는, H6(hGH-Fc), C2(hGH-Fc without hinge) 융합단백질은 37 에서 1 시간배양후각각 hgh 대조군 ( 컬럼 6) 보다유의한트랜스사이토시스활성을나타내었다 ( 짙은회색바 ). 반면, 4 에서 1 시간배양후에는오히려더낮았다. 다음으로, 융합단백질의인간성장호르몬의역가를시험하기위해, 인간의성장호르몬수용체를가지고있으며 IGF1 의 생산을증진시킬수있는인간의간암세포주인 HepG2(ATCC 에서구입 ) 를표면적이 1.9cm 2 인 24 웰플레이트에접종하여 37, 5% CO 2 조건하에서배양하였다. 배양배지는페놀레드를첨가하지않은 Dulbecco's modified Eagle's Medium(10% heat-inactivated fetal calf serum, 2mM L-glutamine, 1mM non-essential amino acids 및 100 U/mL streptomycin 으로구성됨, 기브코사제품 ) 를사용하였다. HepG2 세포를 3 일동안배양하고서브컨플루언스상태 (susconfluency) 의세포층을 phosphate-buffered saline(pbs, 기브코사제품 ) 으로두번세척하고, 혈청을제거한배지에서하루동안배양한후다시새로운무혈청배지로교환한다음융합단백질을첨가하거나혹은그렇지않은상태에서 2 일동안추가로배양하였다. 상기로부터얻은융합단백질과인간성장호르몬은한번만주입하였다. 대조군웰에는배양배지만첨가하여함께배양하였다. IGF1 측정을위한실험은 5 회반복하였으며, 배양말기에배지를수거하여 -70 에저장하였다. - 5 -
도 9 에나타난바와같이, 인간성장호르몬및인간성장호르몬과 IgG 가융합되어있는융합단백질모두 1 pm/ml 의농도로 HepG2 세포에서 IGF1 의방출을촉진하였다. 이들농도는대조군웰의 IGF1 농도에비해 2-3 배정도높았다. 실험말기에세포생존능을조사한결과대조군세포와차이가없었다. 상기로부터, 본발명자는효모형질전환체에서트랜스사이토시스능을확인하였을뿐만아니라성장호르몬의분비에따른 IGF1 의방출을촉진함으로써재조합융합단백질의성장호르몬의활성을확인하였다. 따라서, 본발명자는인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 C2-C3 도메인의융합단백질을발현하는효모형질전환체를효모 (Pichia pastoris) C2 로명명하고, 상기균주를농용미생물보존센터에 2004 년 9 월 20 일자로 KACC 93017 의기탁번호로기탁하였다. 또한, 인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 hinge-c2-c3 도메인의융합단백질을발현하는효모형질전환체는효모 (Pichia pastoris) H6 로명명하고, 상기균주는농용미생물보존센터에 2004 년 9 월 20 일자로 KACC 93018 의기탁번호로기탁하였다. 실시예 2: 유산균에서발현된융합단백질의트랜스사이토시스활성과인간성장호르몬의역가측정 상기에서밝혀진바와같이융합단백질 H6 는인간간암세포주에서 IGF1 의생산을촉진하는성장호르몬활성과유의한트랜스사이토시스활성을나타내었다. 따라서, H6 융합단백질을발현하는유산균을준비하고, 트랜스웰시스템을이용하여인간의장내세포주인 T84 에서형질전환체로부터생산된융합단백질 H6 의트랜스사이토시스활성을시험하였다. 이를위해, T84 단세포층을 3.0 μm크기의트랜스웰 ( 코스타제품 ) 에서전기적저항이 800-1200Ω/cm 2 이될때까지 DMEM/F12 배지 (5% 우태반혈청을포함함, 기브코사제품 ) 에서배양하였다. T84 세포를서브컨플루언스상태까지배양 하고 1 10 6 cell/ml 의유산균 H6 와함께배양하고대조군으로유산균을하루동안배양하였다. 반대쪽웰의배지를수집하여 ELISA 방법에따라분석하고 5 ng/ml 의클로람페니콜이첨가되어있는 MRS 아가플레이트에분배시켜유산균균주의통과여부를조사하였다. 도 10a 에나타난바와같이, 유산균 H6 에서생산되는 hgh-fc 단백질은인간의장세포층을효과적으로통과할수있었으며, 유산균균주는 T84 단세포층을통과하지는않았으며이때 T84 단세포층은높은전기적저항을나타내었다 (800-1200Ω/cm 2 ). 다음으로, 유산균 H6 에서생산되는융합단백질의 IGF1 생산반응을시험하기위해, HepG2 세포와유산균 H6 균주및 유산균을함께배양하였다. IGF1 을측정하기위해, HepG2(ATCC 에서구입 ) 세포를표면적이 1.9cm 2 인 24 웰플레이트에접종하여 37, 5% CO 2 조건하에서배양하였다. 배양배지는페놀레드를첨가하지않은 Dulbecco's modified Eagle's Medium(10% heat-inactivated fetal calf serum, 2mM L-glutamine, 1mM non-essential amino acids 및 100 U/mL streptomycin 으로구성, 기브코사제품 ) 를사용하였다. 배양말기에배지를수거하여 -70 에저장하였다. 도 10b 에나타난바와같이, 유산균 H6 에서생산되는융합단백질은 HepG2 세포에서 IGF1 의방출을촉진하였다. 이들농도는유산균균주와공동배양된대조군에비해 2 배정도높았다. 실험말기에세포생존능을조사한결과대조군과차이가없었다. 실험예 1: 흰쥐를이용한경구투여용인간성장호르몬분비유산균제제의효과 (in vivo 분석 ) 상기실시예 1 과 2 에따라 in vitro 실험을통해유산균 H6(Lb. H6) 에서생산되는융합단백질의기능을확인하였다. 이를 in vivo 에서확인하기위해, 4 주령된수컷흰쥐 (Sprague-Dawley, 평균체중 32g) 각 20 마리를공시하여배지만급여한대조군 (M), 유산균만급여한군 (Lb) 및형질전환된 H6 발현유산균 (Lb. H6) 를각시험군당 5 마리씩 3 회경구투여하고, 인간성장호르몬 -hinge-fc 융합단백질 (H6) 을측정하였다. 사료급여는완전자유급여로하였으며, 공시후 1 주간적응기간을거친뒤 3 주간증체율변화를조사하였다. 사료급여는오전 10 시와오후 5 시로 1 일 2 회실시하였으며, 명암은 12 시간간격으로설정하여사육하였다. 배지, 유산균및형질전환유산균의구강투여는시험개시일오전사료급여전체중측정과동시에구강투여기를통하여 5 ml 씩개체별로실시하였다. 체중측정은 21 일동안매일오전사료급여전실시하였다. 혈중호르몬분석을위하여시험종료일오전구강투여후심장으로부터채혈하여 3000g 로 20 분간원심분리후혈장을분리하여분석전까지 -80 에보관해두었다. 혈중 hgh 및 IGF1 농도는 RIA(Radio Immuoassay) 방법을통하여분석하였다. - 6 -
도 11 에나타난바와같이, Lb. H6 가투여된쥐의혈중인간성장호르몬의농도는대조군과비교하여유의한차이는없었다. 그러나, Lb. H6 를투여한쥐의증체율은유의한정도는아니었지만대조군에비해더높았다. 체중 (g) 초기말기 [ 표 1] 성장호르몬분비유산균의경구투여에따른흰쥐의체중변화 대조군유산균 (Lb) 형질전환유산균 (Lb. H6) 64.08 161.18 64.357 164.31 65.41 165.2 상기결과로부터, 본발명인간성장호르몬과 IgG1 의 Fc 프래그먼트가결합되어있는융합단백질을발현하는유산균제제및효모제제는 37 에서배양될경우트랜스사이토시스활성을나타내었고, IGF1 의생산을촉진시켰다. 즉, 이들미생물제제는경구투여를통해장내에안전하게융합단백질을전달하여성장호르몬을발현시킴으로써성장호르몬결핍증후군을앓고있는환자들을치료하는데이용될수있다. 상기결과로부터, 본발명자는본발명유산균형질전환체에서트랜스사이토시스능이확인되고 IGF1 의방출을촉진할뿐아니라흰쥐의증체율을증가시키는인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 hinge-c2-c3 도메인의융합단백질을발현하는유산균형질전환체를유산균 (Lactobacillus brevis) H6 로명명하고, 상기균주를농용미생물보존센터에 2004 년 9 월 20 일자로 KACC 91137 의기탁번호로기탁하였다. 발명의효과 상기실시예및실험예를통해살펴본바와같이, 본발명은신규한경구투여용재조합인간성장호르몬분비미생물제제및그제조방법에관한것으로, 경구투여를통해장내에안전하게전달되어인간성장호르몬과 IgG1 의 Fc 프래그먼트가결합되어있는융합단백질을발현할수있는미생물제제를제공하는뛰어난효과가있다. 또한, 본발명은장상피세포에서트랜스사이토시스를유발할수있는융합단백질을발현하는발현벡터를제공하는뛰어난효과가있다. 따라서, 본발명은경구투여용단백질이장내에서흡수가능함을증명하고, 또한유산균을이용한경구투여용단백질의전달방법은흰쥐실험을통해매우우수한효율이있음을보여줌으로써단백질계약물의전달체로서유산균의우수성을입증한바, 이로인해경제적인측면이나이용의편리성측면에서상당한기여를할것으로기대되므로의약학산업을비롯하여미생물산업상매우유용한발명인것이다. (57) 청구의범위 청구항 1. 유산균 (Lactobacillus brevis) ATCC 8287 로부터분리한플라스미드 pnz123 에서유래하고, 인간성장호르몬및인간면역글로불린의 Fc 프래그먼트의 hinge-c2-c3 유전자를포함하는도 2 에도시된개열지도를갖는재조합유산균발현벡터 pnz123(1-5n). 청구항 2. 인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 hinge-c2-c3 도메인의융합단백질을발현함을특징으로하는유산균 (Lactobacillus brevis) H6 KACC 91137. 청구항 3. - 7 -
인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 hinge-c2-c3 도메인의융합단백질을발현함을특징으로하는효모 (Pichia pastoris) H6 KACC 93018. 청구항 4. 인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 C2-C3 도메인의융합단백질을발현함을특징으로하는효모 (Pichia pastoris) C2 KACC 93017. 청구항 5. 인간성장호르몬및인간면역글로불린 Fc 프래그먼트의 hinge-c2-c3 도메인을포함하는재조합유전자로부터발현됨을특징으로하는트랜스사이토시스능이있는융합단백질 H6. 도면 도면 1-8 -
도면 2 도면 3-9 -
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도면 8 도면 9-12 -
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