untitled

Ann Clin Microbiol Vol. 19, No. 4, December, 2016 https://doi.org/10.5145/acm.2016.19.4.110 pissn 2288-0585 eissn 2288-6850 Taxonomic Identification of Bacillus Species Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry Won Seon Yu, Kyeong Min Lee, Kyu Jam Hwang Pathogen Resource TF, Center for Infectious Diseases, Korea National Institute of Health, Korea Centers for Disease Control and Prevention, Cheongju, Korea Background: In this study, we compared various methods of taxonomic identification of Bacillus strains: biochemical methods, 16S rrna gene sequencing, and matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). We also developed a pathogen- isolate resource database, thus increasing the identification rate when using MALDI-TOF MS. Methods: Thirty Bacillus strains were obtained from the NCCP (National Culture Collection for Pathogens) and were identified using the VITEK 2 system (bio- Mérieux, France), API kit (biomérieux, France), 16S rrna gene sequencing, and MALDI-TOF MS. The pathogenicity of Bacillus cereus was confirmed through the identification of virulent genes using a multiplex PCR, and both protein extraction for protein profiling in MALDI-TOF MS and repetitive-sequence fingerprinting were performed. Results: The identification rates at the species level were 40%, 80%, and 76.3% for the VITEK 2 system (biomérieux), 16S rrna gene sequencing, and MALDI- TOF MS, respectively. When the major spectrumprofiling dendrogram was compared with the phylogenetic tree, which was constructed based on the 16S rrna gene sequences and rep-pcr fingerprinting, the classifications were confirmed to be effective. Conclusion: Identification of Bacillus strains using MALDI-TOF MS was more effective than that using the VITEK 2 system (biomérieux), but was similar to that using 16S rrna gene sequencing. Continual addition to a proteome-based database can result in increased identification rates for MALDI-TOF MS. (Ann Clin Microbiol 2016;19:110-120) Key Words: Bacillus speciess, Identification, MALDI- TOF MS INTRODUCTION Bacillus 속은자연계에서주요부패원인균으로서물, 토양, 공기중에도부유하고자연계에널리존재한다 [1]. 이균속은포자를형성하기때문에음식을조리하는과정중에열처리에의해사멸되지않으므로우유, 인스턴트식품그리고가정에서조리하는음식에서도생존한다 [2]. Bacillus 속은카탈레이즈양성을나타내는막대균으로포자를형성하는절대산소성혹은조건무산소성균으로현재약 318개의종으로분류되고있다. 이속에는유전학적특성을통하여크게 B. cereus group과 B. subtilis group으로분류할수있으며기타 group으로는 B. pumilus, B. licheniformis 등이있다 [3]. B. cereus group에속하는종은분자유전학적으로아주밀접한 7종으로구성되어있는데 B. cereus sensu stricto, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. weihenstephanensis가포함된다 [4]. 대표적인식중독병원체인 B. cereus sensu stricto는인체에감염된후크게두가지증상을유발하게되는데, 설사증상을야기하는설사형과구토를유발하게하는구토형이있다 [5]. B. thuringiensis는해충의생물학적방제용으로널리사용되는독소를만들기때문에주로곤충병원체이다 [6]. B. subtilis와 B. licheniformis도흔하지는않지만인체감염사례가보고되고있는병원체이다 [7-9]. Received 8 November, 2016, Revised 14 December, 2016, Accepted 15 December, 2016 Correspondence: Kyu Jam Hwang, Pathogen Resource TF, Center for Infectious Diseases, Korea National Institute of Health, Korea Centers for Disease Control and Prevention, 187 Osongsaengmyeong 2-ro, Osong-eup, Heungdeok-gu, Cheongju 28159, Korea. (Tel) 82-43-719-6870, (Fax) 82-43-719-6680, (E-mail) kyuhwang61@korea.kr c The Korean Society of Clinical Microbiology. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 110

Won Seon Yu, et al. : Analysis of MALDI-TOF MS 111 세균병원체의전통적인동정방법실험에소요되는시간과실험자의숙련도에따라결과의판정에오류가포함될수있고업무의효율적인면에서도미생물자동화동정기기를활용한방식이현추세이다 [10]. 미생물의기질분해능을근거로하여동정하는 VITEK 2 system (biomérieux, Marcy l Eltoile, France) 방법은상대적으로 16S rrna 유전자염기서열분석보다신속하고간편하게분석할수있다는장점을가지고있으나기존에동정된미생물의결과를기초로구축된데이터베이스를이용하기때문에분석가능한미생물의범위에한계가있어 300 여종에불과하다. 또한일부균종은 2종이상을포함하는병원체그룹으로동정이되기도한다. 이러한자동화동정시스템의동정한계를보완하기위한병원체동정시스템이필요하다. 16S rrna 염기서열분석은세균의동정에서가장널리사용되고있지만일부균종에서는이부위의균종간유전자일치도가높아변별력이떨어지기때문에 16S rrna 유전자만으로는병원체의정확한분류및동정에한계가있다. 16S rrna 염기서열분석의경우 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guideline MM18-A에서동정시균종별로표적유전자를제시하고있다 [11]. Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) 는검체를이온화하여진공관에서검출기에도달하는시간을근거로구성물질의질량을측정하는방법이다. 최근개발된 MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) 는 MALDI-TOF MS 기법을이용하여얻은세균의단백질정보를이미구축된각균종의정보와비교분석하여균종을동정한다. MALDI-TOF MS는생체에서의단백발현에대한대표프로파일을만들수있기때문에바이오마커개발연구에다방면으로사용되고있다. MALDI- TOF MS는생체에서의단백발현에대한대표프로파일을만들수있기때문에바이오마커개발연구에널리사용되고있다. SARAMIS (biomérieux, Marcy l Eltoile, France) 나 Biotyper (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) 같은분석소프트웨어는속수준의세균동정에서매우뛰어난기능을보이지만, 혈청형또는종수준동정에는한계가있다. 이러한한계를극복하기위하여최근에는혈청형또는종수준에서의분류방법들이여러분야에서연구되고있다 [12-14]. 본연구는국가병원체자원은행 (NCCP) 에서보유중인자원중에서분양증가가예상되는식중독관련 Bacillus srain을대상으로 MALDI-TOF MS를이용한동정결과를 VITEK 2 system (biomérieux), 16S rrna 염기서열분석결과와비교하고 MALDI- TOF MS 동정률을높이기위한단백체기반국내임상분리주데이터베이스를제작하고자하였다. MATERIALS AND METHODS 1. 대상균주세균의동정및 MALDI-TOF MS 분석을위해이연구에사용된균주는 6종 30주 Bacillus 균주로구성되어있다. 각균주들은질병관리본부국립보건연구원내에있는국가병원체자원은행에 (NCCP) 수집된자원들로국내임상분리주 7주, ATCC (American Type Culture Collection) 및 DSMZ (German Collection of Microorganisms and Cell cultures) 도입균주 23주로이루어져있다. 각균주간의독소형, 혈청형, 유전형등의특징은 Table 1과같다. 2. 세균배양및유전자추출 Bacillus 균주들이보존된동결건조앰플또는동결튜브의재생은국가병원체자원은행 (NCCP) 업무지침서의병원체재생절차에따라수행하였다. 앰플재생의경우동결건조앰플에멸균된증류수 100 μl를넣고균체를현탁후그현탁액을 5% 면양혈액이포함된 trypticase soy agar ( 한일코메드, 성남, 대한민국 ), CHROMagar B. cereus ( 진성메디텍, 서울, 대한민국 ) 에도말하여 30 o C에 24시간배양하여단일집락을획득하였다. UltraClean Microbial DNA isolation kit (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA, USA) 를사용하여 chromosomal DNA를추출하였다. 3. 형태학적특성및생화학적특성확인 Bacillus 균주들은 5% 면양혈액이포함된 Trypticase soy agar에접종하고 30 o C에서 24시간 2회계대배양한후그람염색후막대균을확인하였고 B. cereus의경우단일집락을 CHROMagar B. cereus에계대배양하여특유의흰테두리를가지고있는 B. cereus 특유의푸른색집락을확인하여형태학적특성을확인하였다. 동정은 VITEK 2 system (biomérieux) 과 API 50CH/B (biomérieux, Marcy l Eltoile, France) 를이용하여생화학적특성을확인하였다. 생화학적동정법의종수준동정한계치 (cut off) 는 Jamal 등 [10] 의보고를참고하여 90% 로선택하였다. 4. 16S rrna 유전자염기서열분석및계통분석 16S rrna 유전자염기서열분석은 CLSI의 MM18A 지침 [11] 을참고하여수행하였다. UltraClean Microbial DNA isolation kit를사용하여 chromosomal DNA를추출한후 l 시발체 (primer) 27F (5'-AGA GTTTGATCMTGGCTCAG-3') 와 1492R (5'-TACGGYTACCT TGTTACGACTT-3') 를사용하여중합효소연쇄반응 (PCR) 을수행하였다 (DE/Master cycler pros, Eppendorf, Hamburg, Germany). 중합효소연쇄반응반응조건은 95 o C 5분으로 DNA를변성시키고, 95 o C 45초, 55 o C 45초, 72 o C 1분

112 Ann Clin Microbiol 2016;19(4):110-120 Table 1. Bacillus strains used in this study. Pathotypes and serotypes were determined by performing agglutination tests and PCR NCCP no. Identified Species Chracteristics Soruce 10084 Bacillus cereus ATCC 11778 ATCC 10190 Bacillus cereus ATCC 13061 ATCC 10623 Bacillus cereus ATCC 14893 ATCC 10624 Bacillus cereus ATCC 19637 ATCC 10634 Bacillus cereus ATCC 9818 ATCC 10715 Bacillus cereus ATCC 21928 ATCC 10821 Bacillus cereus ATCC 11950 ATCC 10841 Bacillus cereus ATCC 14579 (Type) DSMZ 10856 Bacillus cereus ATCC 9139 ATCC 10888 Bacillus cereus ATCC 27348 ATCC 14043 Bacillus cereus entfm nhea cytk Clinical isolate 14796 Bacillus cereus entfm CER Clinical isolate 15909 Bacillus cereus entfm nhea cytk Clinical isolate 15910 Bacillus cereus entfm nhea Clinical isolate 15938 Bacillus infantis N37281 Clinical isolate 11231 Bacillus licheniformis ATCC 14580 (Type) ATCC 12389 Bacillus licheniformis ATCC 9945A ATCC 10144 Bacillus pumilus ATCC 14884 ATCC 10192 Bacillus pumilus ATCC 27142 ATCC 10668 Bacillus subtilis subsp. subtilis ATCC 6051 (Type) ATCC 10736 Bacillus subtilis ATCC 7058 ATCC 10857 Bacillus subtilis ATCC 19659 ATCC 10866 Bacillus subtilis ATCC 11774 ATCC 10908 Bacillus subtilis ATCC 7058 ATCC 11101 Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC 6633 ATCC 11234 Bacillus thuringiensis ATCC 10792 (Type) ATCC 12836 Bacillus thuringiensis ATCC 39756 ATCC 12837 Bacillus thuringiensis ATCC 13366 ATCC 14741 Bacillus spp. 77073 Clinical isolate 15922 Bacillus spp. KBN06P03352 Clinical isolate 1회로하여 30회반응한후, 72 o C에서 10분간반응시켰다. 합성유전자는 Qiaquick PCR Purification Kit (QIAGEN, GmbH Hilden, Germany) 를사용하여정제한후염기서열분석업체 ( 제노텍, 대전, 대한민국 ) 에의뢰하여염기서열을해독하였다. CLSI 지침에따라 PHRED score 20 이상의염기해독결과만선별한후 EZBIOCLOUD (https://www.ezbiocloud.net) 를사용하여동정결과를확인하였다 [15]. 16S rrna 유전자염기서열데이터의계통분석은 Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Version 6.0 (https://www.megasoftware.net) 을이용하여수행하였다 [16,17]. 유전자들의거리는 Jukes-Cantor model 을사용하였고 Neighbor-Joining 방법으로계통수를작성하였다. 작성된계통수의신뢰도를부여하기위하여 1,000회 bootstrap을반복하여수행하였다 [18,19]. 5. 병원성 (Virulence) 유전자의확인 B. cereus의설사형과구토형독소유전자는 PowerChek Bacillus cereus Toxin 6-plex Detection Kit (CER, hblc, bcet, entfm, nhea, cytk) ( 코젠바이오텍, 서울, 대한민국 ) 를사용하여확인하였다. PCR 반응조건은 95 o C 12분으로 DNA를변성시키고, 95 o C 30초, 60 o C 30초, 72 o C 30초를 1회로하여 35회반응한후, 72 o C에서 10분간반응시켰다. 6. MALDI-TOF MS 분석 MALDI-TOF MS 장비를이용한균주동정의전처리과정은이전의 Haigh 등 [20] 의보고를참고하여수행하였다. 직접도말법의경우 MALDI target plate에배양된세균의집락을얇게도말하고 1 μl의 70% formic acid를넣어준후실온에서건조하였다. 건조된세균에 50% acetonitrile-2.5% trifluoroacetic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 에완전용해한 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matrix 를 1 μl 넣어준후실온에서건조하였다. Ethanol-formic acid 추출방법의경우세균집락을 300 μl의멸균증류수에 900 μl의 absolute ethanol 에현탁한후건조시켰다. 건조한 pellet에 20 μl의 formic acid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 를첨가하여 1분이상

Won Seon Yu, et al. : Analysis of MALDI-TOF MS 113 vortex하고, 다시 20 μl의 acetonitrile (Sigma-Aldrich, St, Louis, USA) 을첨가한후원심분리하였다. 상층액 1 μl를 MALDI target plate에옮기고완전히건조시킨후 matrix 용액 1 μl를첨가하고완전히건조시킨후 MALDI-TOF MS 장비로분석을실시하였다. 각균주에대하여 2회반복하여분석하였다. 동정은 Microflex LT mass spectrometer (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) 를사용하여수행하였다. 분석소프트웨어는 MALDI Biotyper version 3.1 (Bruker Daltonics) 로서 5,627 strains 세균데이터베이스가포함되어있다. Bacterial test standard (BTS, Bruker Daltonics, Bremen, Germany) 는제조사의지침에따라서 calibration 수행용으로사용하였다. 각균주별로 2회반복하여집락또는균체단백질을채취하여분석하였다. 동정을위한 Score 값은 Schulthess 등 [21] 의보고를참고하였다. Score 값 2.0 이상일경우그종에해당하고 Score 값이 1.7 이상 2.0 미만일경우속수준동정에해당하는것으로해석하였고, Score 값이 1.7 미만일경우믿을수없는것으로간주하였다. 7. Repetitive-sequence-based PCR (REP PCR) 을이용한 DNA fingerprinting 분석 REP PCR을이용한 DNA fingerprinting 분석의전체과정은 Healy 등 [22] 보고를참고하여 DiversiLab system (biomérieux, Marcy l Eltoile, France) 을사용하여수행하였다. REP PCR용주형 DNA의확보는 UltraClean Microbial DNA isolation kit를사용하였고각 DNA 농도는 35 ng/μl로표준화하였다. 추출된 DNA는 DiversiLab DNA Fingerprinting kit_bacillus (bio- Mérieux) 을사용하여 rep-pcr 을수행하였다. 전체 35 μl 기준으로 70 ng의 genomic DNA, 18 μl의 rep-pcr MM1, 2.5 μl 의 GeneAmp 10X PCR buffer, 2 μl의 primer mix, 0.5 μl의 AmpliTaq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 을 PCR 조성액으로사용하였다. PCR 반응조건은 94 o C 2분으로 DNA를변성시키고, 94 o C 30초, 55 o C 30초, 72 o C 1분 30초를 1회로하여 35회반응한후, 72 o C에서 3분간반응시켰다. 유전자증폭산물은 DiversiLab Chips에옮긴후 B 2100 bioanalyer (biomérieux) 장비를사용하였다. Data는 DiversiLab software version 3.6.14 (biomérieux) 를이용하여분석하였다 (https://nccp. diversilab.com). Dendrogram제작을위한알고리즘은짝짓기클러스터링 (Unweighted pair group method, UPGMA) 방법을사용하였다. RESULTS 1. VITEK 2 system, 16S rrna 유전자, MALDI-TOF MS를이용한세균의동정 Bacillus 균주 6종 30주의동정을위하여 MALDI-TOF MS 분석, 통상적인생화학적동정과, 16S rrna 유전자염기서열분석을수행하였고동정률을 Table 2와같이비교하여나타내었다. VITEK 2 system (biomérieux) 과 MALDI-TOF MS의동정결과가불일치한균주는 16S rrna 유전자염기서열기반계통분석을수행하여동정하고오동정사유를 Table 2에나타냈다. VITEK 2 system (biomérieux) 을이용한동정결과데이터베이스에동정정보가없어서미동정된경우는 B. subtilis 2주, 다른종으로동정된 B. infantis 1주였고동정은되었으나 90% 미만인경우는 B. cereus 9주였고다수의종을포함하는그룹으로동정된경우는 B. cereus/thuringiensis 4주, B. subtilis/amyloliquefaciens 4주로총 8주였다. 따라서전체 30주중통상적인생화학적동정방법인 VITEK 2 system (biomérieux) 의종수준동정확인은 12주 (12/30, 40%), 속수준동정확인은 27주 (27/30, 90%) 였다. 반면 MALDI-TOF MS를이용한동정결과미동정된경우는없었으며속수준동정한계치 (cut off) Score 값 2.0 미만 1.7 이상인균주는 B. cereus 2주, B. licheniformis 1주, Bacillus spp. 2주로총 5주였다. 다른종으로동정된경우는 B. thuringiensis 2주였다. 따라서전체 30주중 MALDI-TOF MS의종수준동정확인은 23주 (23/30, 76.7%), 속수준동정확인은 30주 (30/30, 100%) 였다. 16S rrna 유전자염기서열분석으로종동정이확인된균주는 24주 (24/30, 80.0%) 였다. 균종별로살펴보면 B. cereus의경우 14주중 VITEK 2 system (biomérieux) 으로는 11주가종동정률한계치인 90% 미만또는다수종을포함하는그룹으로동정되었고 MALDI-TOF MS 결과는 2주가종수준동정한계 Score 값 1.7 이상 2.0 미만이었다. 16S rrna 계통분석결과 NCCP 14043은같은계통군에속하는 B. cereus임을확인하였고 NCCP 10715는 B. pseudomycides와가장근연한종 (closed related species) 으로확인하였다. B. subtilis의경우 6주중 VITEK 2 system (biomérieux) 으로는 2주가미동정되었고 4주는다수종을포함하는그룹으로동정되었다. MALDI-TOF MS와 16S rrna 유전자염기서열분석은 6주모두 B. subtilis임을확인하였다. B. licheniformis 2주의경우 VITEK 2 system (biomérieux) 과 16S rrna 유전자염기서열분석으로는모두 B. licheniformis임을확인하였으나 MALDI- TOF MS는 NCCP 12389 1주가동정한계 Score 값 1.7 이상 2.0 미만이었다. B. infantis 1주는 VITEK 2 system (bio- Mérieux) 에서는다른종인 B. lentus로동정되었으나 MALDI- TOF MS와 16S rrna 유전자염기서열분석의경우 B. infantis 로확인되었다. B. pumilus 2주는 3가지동정방법모두동일한동정결과를나타냈다. Bacillus spp. NCCP 14741 과 Bacillus spp. NCCP 15922의 VITEK 2 system (biomérieux) 의동정결과는 B. licheniformis로확인되었으나 MALDI-TOF MS의동정결과는 B. sonorensis로확인되어불일치하였다. 다만 MALDI- TOF MS의 Score 값이 1.7 이상 2.0 미만이었다. 16S rrna 유전자기반계통분석결과로는 B. sornorensis와 B. licheniformis

114 Ann Clin Microbiol 2016;19(4):110-120 Table 2. Comparative identification rates of Bacillus strains by conventional method, 16S rrna gene and MALDI-TOF MS Organism No. No. (%) ID Conventional method No. (%) MALDI-TOF MS method No. (%) ID 16S rrna gene Species Genus Cause of No ID or Mis ID (No.) Species Genus Cause of No ID or Mis ID (No.) Species Cause of No ID or Mis ID (No.) Bacillus cereus 14 3 (10) 14 (46.6) ID <90% (9) B. cereus/ B. thuringiensis (2) Bacillus thuringiensis 3 1 (3.3) 3 (10) B. cereus/ B. thuringiensis (2) Bacillus subtilis 6 2 (6.6) 4 (13.3) Unidentification (2) B. subtilis/ B. amyloiquefaciens (4) 12 (40) 14 (46.6) Score 1.7 but <2.0 (2) 13 B. pseudomycoides (1) 1 (3.3) 3 (10) B. cereus (2) 0 B. cereus/ B. thuringiensis (3) 6 (20) 6 (20) 6 Bacillus infantis 1 0 (0) 0 (0) Bacillus lentus (1) 1 (3.3) 1 (3.3) 1 Bacillus licheniformis 2 2 (6.6) 2 (6.6) 1 (3.3) 2 (6.6) Score 1.7 but <2.0 (1) 2 Bacillus pumilus 2 2 (6.6) 2 (6.6) 2 (6.6) 2 (6.6) 2 Bacillus spp. NCCP 14741 1 1 (3.3) 1 (3.3) B. licheniformis 0 (0) 1 (3.3) Score 1.7 but <2.0 0 B. sonorensis/ B. sonorensis (1) B. licheniformis (1) Bacillus spp. NCCP 15922 1 1 (3.3) 1 (3.3) B. licheniformis 0 (0) 1 (3.3) Score 1.7 but <2.0 0 B. sonorensis/ B. sonorensis (1) B. licheniformis (1) Total 30 12 (40) 27 (90) 23 (76.7) 30 (100) 24 (80) Abbreviations: No ID, no identification in spite of its presence in database; Mis ID, misidentification.

Won Seon Yu, et al. : Analysis of MALDI-TOF MS 115 와진화적인거리가가깝지만다른계통군에속했다. 각균주들의상관관계를단백질과 DNA 수준에서상호비교하기위한 MALDI-TOF MS를단백체기반데이터베이스를제작하고자중합효소연쇄반응 (PCR) 방법을이용하여식중독병원성유전자를확인하였다. B. cereus group의설사형과구토형독소유전자의분석은 PowerChek Bacillus cereus Toxin 6-plex Detection Kit ( 코젠바이오텍 ) 를사용하여특성을확인하였다. 2. MALDI-TOF MS 분석 MALDI-TOF MS, 16S rrna 유전자염기서열, 생화학적특성, 면역학적특성및병원성확인이끝난 Bacillus 균주의상관관계를단백질수준에서분석하기위하여각각의단백체프로파일을추출하였다. 각균주들은최소 20개이상의 mass spectra를확보한후 Stanford 등 [23] 의보고를참고하여 processing 과정을거쳐단일의주스펙트럼 (major spectrum profile, MSP) 를제작하였다. 균종별로제작된 MSP의예시는 Fig. 1와같이 Fig. 1. Representative spectra from Bacillus strains supplemented in the database by MALDI-TOF MS. The intensity is shown as a percentage of the total intensity on the y-axis, and the mass to charge ration (m/z) is shown on the x-axis. (A) Bacillus cereus NCCP10841 DSMZ32. (B) B. cereus NCCP14796 entfm, CER. (C) B. cereus NCCP15909 entfm, nhea, cytk. (D) B. thuringiensis NCCP11234. (E) B. subtillis NCCP10908. (F) B. licheniformis NCCP11231.

116 Ann Clin Microbiol 2016;19(4):110-120 Fig. 1. Continued. 나타내었다. 이를이용하여국내임상분리병원체데이터베이스를제작하였고단백체프로파일기반 MSP dendrogram을 Fig. 2 과같이제작하였다. Bacillus strain 간의상관관계를확인결과각종별로단일계통군에속하는것을확인하였다. 제작된데이터베이스를단백체, 유전체수준의비교를위하여 DNA fingerprinting 방법과의비교실험을수행하였다. 3. Repetitive-sequence-based PCR을이용한 DNA fingerprinting 분석 Bacillus strain의경우 UPGMA 방법으로제작한 16S rrna 유전자기반계통수 (Fig. 3A), 유전자기반 rep-pcr fingerprinting 계통수 (Fig. 3B), 단백체기반 MALDI-TOF MS dendrogram (Fig. 3C) 를비교하여 Fig. 3과같이나타내었다. 16S rrna 유전자기반계통수와 MALDI-TOF MS dendrogram의결과는 rep-pcr fingerprinting 결과에비하여전체종별구분이

Won Seon Yu, et al. : Analysis of MALDI-TOF MS 117 Fig. 2. Major spectrum profile (MSP) dendrogram of Bacillus strains supplemented in the database. 가장효과적으로이루어졌음을확인할수있었다. 또한이결과를통하여 Bacillus spp. NCCP 15922과 Bacillus spp. NCCP 14741 2주의경우 B. licheniformis 와 B. pumilus와유연관계가가까운새로운계통군일가능성이확인되었다. DISCUSSION 본연구에서는국가병원체자원은행 (NCCP) 에서보유중인그람양성세균에서가장자원수가분양증가가예상되는식중독관련 Bacillus 균주를대상으로 MALDI-TOF MS를이용한동정결과를 VITEK 2 system (biomérieux), 16S rrna 염기서열분석결과와비교하고자하였다. 또한 MALDI-TOF MS 동정률을높이기위한단백체기반국내임상분리주데이터베이스를제작하고자하였다. MALDI-TOF MS 분석의가장큰장점은 16-20시간소요되는 VITEK 2 system (biomérieux) 을포함한생화학적동정방법에비하여 10분이내최소시간으로신속한동정이이루어진다는점이다. Dupont 등 [24], Jamal 등 [10] 의보고를참고하면 MALDI-TOF MS의동정결과가 VITEK2 (biomérieux) 보다오동정도낮고속및종수준의동정률도좋은것으로평가되었다. 이들 3가지방법을사용하여얻은동정결과를 Table 2에비 교하여나타내었고각동정방법의종동정률은 40% (VITEK 2 system), 76.7% (MALDI-TOF MS), 80% (16S rrna 유전자염기서열분석 ) 의순서였다. 따라서 Bacillus strain의경우 MALDI- TOF MS의동정결과가 VITEK 2 system (biomérieux) 동정결과보다매우높은동정률을나타내는것을확인할수있었다. 반면 16S rrna 유전자염기서열분석과비교시 MALDI-TOF MS 동정결과동정한계 Score 값인 1.7 이상 2.0 미만인 B. cereus NCCP 14043과 B. licheniformis NCCP 12389의 Score 값은각각 1.999와 1.980이었다. Schulthess 등 [21] 은그람양성막대균 (Gram positive rods) 들의동정결과를 MALDI-TOF MS의 Score 값을 0.1간격으로비교하여동정한계 Score 값을 2.0 이상으로정하였는데 Bacillus strain은포함되어있지않다. 따라서동정한계 Score 값과인접한값의동정결과가종동정이이루어지지않았다고판단하는것은문제가있다고생각되었다. 종동정이되었다고가정하면 MALDI-TOF MS의동정률 (83.3%) 이 16S rrna 염기서열분석의종동정률 (80%) 보다높다. 이것은 16S rrna 유전자기반계통분석결과 B. cereus와 B. thuringiensis가같은계통군에속하여서로구별할수없기때문이었다. 이와같이 16S rrna 유전자기반유전자일치도가매우높은 B. cereus와 B. thuringiensis 등의 B. cereus group, B. licheniformis group 등의분류를단백질수준에서확인해보고자

118 Ann Clin Microbiol 2016;19(4):110-120 Fig. 3. Comparison of 16S rrna gene, repetitive-sequence based PCR fingerprinting and MALDI-TOF MS analysis in Bacillus strains. Phylogenetic tree based by 16S rrna gene with UPGMA method (A), rep-pcr fingerprinting (B) and MALDI-TOF MS (C). 하였다. Benagli 등 [25] 과 Lista 등 [26] 은균주간의유전자적관계에근거하여균주를선정하고신뢰성이있는종수준동정용래퍼런스라이브러리를만들수있다는것을보고하였다. 이를참고하여 B. cereus와 B. licheniformis의낮은 Score 값의결과는등록되어있는병원체데이터베이스의수가적기때문에생길수있다고가정해보았다. 실제로 Bacillus strain의경우기존 Burker 사의데이터베이스는 B. cereus 3주, B. thuringiensis 1주, B. licheniformis 3주, B. pumilus 6주, B. infantis 1주, B. subtilis 9주가등록되어있었다. Bacillus 균주의동정방법을단백질수준에서분석하기위하여 MALDI-TOF MS를이용한 mass spectrum 추출및단백체기반데이터베이스제작을수행하였다. 제작된데이터베이스는 Fig. 3과같이 MSP dendrogram을제작하여 16S rrna 유전자기반계통수, 유전자기반 rep-pcr fingerprinting 계통수와비교하였을때종별구분이가장효과적으로이루어졌음을확인할수있었다. B. pseudomycides와가장근연한종으로확인된 B. cereus NCCP 10715의경우 16S rrna 유전자염기서열분석으로는동정이되지않았는데 MALDI-TOF MS dendrogram의경우도분류학적으로가장바깥쪽그룹에위치하고있다. Lasch 등 [27] 은기존의 B. cereus와계통학적거리가있는 B. cereus 균주가있음을보고하고있기 때문에 B. cereus NCCP 10715 경우기존의알려진 B. cereus와다른특성의균주일가능성이있다. Bacillus spp. NCCP 14741 과 Bacillus spp. NCCP 15922의 MALDI-TOF MS dendrogram 경우도 16S rrna 유전자계통수와마찬가지로다른기존의알려진 B. licheniformis와는다른계통군에속하는것을알수있었고향후신종의가능성을연구할필요가있었다. 이연구를통하여기존에알려진 MALDI-TOF MS 동정방법의신속성과함께 Bacillus 균주들의동정에서 VITEK 2 system (biomérieux) 보다효과적으로동정할수있다는것을확인하였고단백체기반국내임상분리주데이터베이스를지속적으로확보하면보다향상된동정률을얻을수있을것으로판단되었다. ACKNOWLEDGMENTS 이연구는질병관리본부 2016년도감염병표준실험실운영병원체연구자원관리사업 (4800-4837-301) 지원에의해수행되었음.

Won Seon Yu, et al. : Analysis of MALDI-TOF MS 119 REFERENCES 1. Oguntoyinbo FA. Monitoring of marine bacillus diversity among the bacteria community of sea water. Afr J Biotechnol 2007;6: 163-6. 2. Durak MZ, Fromm HI, Huck JR, Zadoks RN, Boor KJ. Development of molecular typing methods for Bacillus spp. and Paenibacillus spp. isolated from fluid milk products. J Food Sci 2006;71:M50-6. 3. Fritze D. Taxonomy of the genus bacillus and related genera: the aerobic endospore-forming bacteria. Phytopathology 2004;94: 1245-8. 4. Bavykin SG, Lysov YP, Zakhariev V, Kelly JJ, Jackman J, Stahl DA, et al. Use of 16S rrna, 23S rrna, and gyrb gene sequence analysis to determine phylogenetic relationships of Bacillus cereus group microorganisms. J Clin Microbiol 2004;42:3711-30. 5. Granum PE. Bacillus cereus. In: Doyle MP, ed. Food Microbiology: Fundamental and Frontiers. 2nd ed, Washington DC; ASM Press, 2001:373-81. 6. Schnepf E, Crickmore N, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Feitelson J, et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiol Mol Biol Rev 1998;62:775-806. 7. Salkinoja-Salonen M, Vuorio R, Andersson M, Kampfer P, Honkanen-Buzalski T. Toxigenic strains of Bacillus licheniformis related to food poisoning. Appl Environ Microbiol 1999;65: 4637-45. 8. Sorokulova IB, Reva ON, Smirnov VV, Pinchuk IV, Lapa SV, Urdaci MC. Genetic diversity and involvement in bread spoilage of Bacillus strains isolated from flour and ropy bread. Lett Appl Microbiol 2003;37:169-73. 9. Pavic S, Brett M, Petric I, Lastre D, Smoljanovic M, Atkinson M, et al. An outbreak of food poisoning in a kindergarten caused by milk powder containing toxigenic Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis. Archiv für Lebensmittelhygiene 2005;56:20-2. 10. Jamal W, Albert MJ, Rotimi VO. Real-time comparative evaluation of biomerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol 2014;14:289. 11. CLSI. Interpretative criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing; approved guideline. CLSI document MM18-A. Pennsylvania: Clinical and Laboratory Standards Institute; 2008:1-71. 12. Christner M, Trusch M, Rohde H, Kwiatkowski M, Schlüter H, Wolters M, et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-toxigenic Escherichia coli. PLoS One 2014;9:e101924. 13. Josten M, Reif M, Szekat C, Al-Sabti N, Roemer T, Sparbier K, et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionizationtime of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol 2013;51:1809-17. 14. Khot PD and Fisher MA. Novel approach for differentiating Shigella species and Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol 2013;51:3711-6. 15. Kim OS, Cho YJ, Lee K, Yoon SH, Kim M, Na H, et al. Introducing EzTaxone-e: a prokaryotic 16S rrna gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. Int J Syst Evol Microbiol 2012;62:716-21. 16. Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Mol Biol Evol 2013;30:2725-9. 17. Kumar S, Tamura K, Nei M. MEGA3: intergrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief Bioinform 2004;5:150-63. 18. Jukes TH and Cantor CR. Evolution of Protein Molecules. In: Munro HN, ed. Mammalian Protein Metabolism. New York; Academic Press, 1969:21-132. 19. Saitou N and Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol 1987;4: 406-25. 20. Haigh J, Degun A, Eydmann M, Millar M, Wilks M. Improved performance of bacterium and yeast identification by a commercial matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in the clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol 2011;49:3441. 21. Schulthess B, Bloemberg GV, Zbinden R, Böttger EC, Hombach M. Evaluation of the bruker MALDI biotyper for identification of gram-positive rods: development of a diagnostic algorithm for the clinical laboratory. J Clin Microbiol 2014;52:1089-97. 22. Healy M, Huong J, Bittner T, Lising M, Frye S, Raza S, et al. Microbial DNA typing by automated repetitive-sequence-based PCR. J Clin Microbiol 2005;4:199-207. 23. Stanford TE, Bagley CJ, Solomon PJ. Informed baseline subtraction of proteomic mass spectrometry data aided by a novel sliding window algorithm. Proteome Sci 2016;14:19. 24. Dupont C, Sivadon-Tardy V, Bille E, Dauphin B, Beretti JL, Alvarez AS, et al. Identification of clinical coagulase-negative staphylococci, isolated in microbiology laboratories, by matrixassisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry and two automated systems. Clin Microbiol Infect 2010;16:998-1004. 25. Benagli C, Demarta A, Caminada A, Ziegler D, Petrini O, Tonolla M. A rapid MALDI-TOF MS identification database at genospecies level for clinical and environmental Aeromonas strains. PLoS One 2012;7:e48441. 26. Lista F, Reubsaet FA, De Santis R, Parchen RR, de Jong AL, Kieboom J, et al. Reliable identification at the species level of Brucella isolates with MALDI-TOF-MS. BMC Microbiol 2011; 11:267. 27. Lasch P, Beyer W, Nattermann H, Stämmler M, Siegbrecht E, Grunow R, et al. Identification of Bacillus anthracis by using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and artificial neural networks. Appl Environ Microbiol 2009;75:7229-42.

120 Ann Clin Microbiol 2016;19(4):110-120 = 국문초록 = MALDI-TOF 질량분석기를이용한바실러스균의동정 질병관리본부국립보건연구원감염병센터병원체자원관리TF 유원선, 이경민, 황규잠 배경 : 본연구에서는그람양성세균식중독관련 Bacillus 균주를대상으로 MALDI-TOF MS를이용한동정결과를 VITEK 2 system (biomérieux, France), 16S rrna 염기서열분석결과와비교하고 MALDI-TOF MS 동정률을높이기위한단백체기반국내임상분리주데이터베이스를제작하고자하였다. 방법 : 세균의동정은 VITEK 2 system (biomérieux), API kit (biomérieux, France), 16S rrna 유전자염기서열, MALDI-TOF MS 분석을이용하였다. 병원성확인을위하여 multiplex PCR 방법을이용하여독성유전자를확인하였다. 세균의단백체프로파일의추출및데이터베이스는제작은 MALDI BioTyper 3.0 (Bruker Daltonics, Germany) 을이용하여수행하였고 16S rrna 유전자기반계통수, repetitive-sequence fingerprinting 계통분석결과와비교분석을수행하였다. 결과 : Bacillus 균주 30주에대한생화학적동정법, 16S rrna 유전자염기서열분석및 MALDI-TOF MS 방법에의한종수준동정률은 40%, 80%, 76.3% 였다. 제작된단백체기반 MSP dendrogram을 16S rrna 유전자기반계통수및 rep-pcr fingerprinting 계통수와비교하였을때종별구분이효과적으로이루어졌음을확인할수있었다. 결론 : Bacillus 균주들의동정에서 MALDI-TOF MS는 VITEK 2 system (biomérieux) 보다효과적인동정방법이었다. MALDI- TOF MS는 16S rrna 유전자기반동정법과도비슷한수준의동정률을나타냈으며단백체기반국내임상분리주데이터베이스를지속적으로확보한다면동정률이훨씬높아질것으로기대되었다. [Ann Clin Microbiol 2016;19:110-120] 교신저자 : 황규잠, 28159, 충북청주시오송읍오송생명 2 로 187 질병관리본부국립보건연구원감염병센터병원체자원관리 TF Tel: 043-719-6870, Fax: 043-719-6680 E-mail: kyuhwang61@korea.kr