중견연구자지원사업 ( 핵심연구 ) 최종보고서 양식 A101 1 부처사업명 ( 대 ) 기초연구사업보안등급 ( 보안, 일반 ) 일반 2 사업명 ( 중 ) 중견연구자지원사업공개가능여부 ( 공개, 비공개 ) 공개 3 세부사업명 ( 소 ) 핵심연구지원 ( 공동연구 ) 4 과제성격 ( 기초, 응용, 개발 ) 기초 4-1 실용화대상여부 ( 실용화, 비실용화 ) 비실용화고활성당화효소생산에탄올발효균주개발과다양한배양시스템의공정최적화를국문통한고효율수송용바이오에탄올생산공정에관한연구 5 과제명 Developing recombinant cellulase producing fermentative microbes for highly 영문 effective bioethanol production in novel microbial reactor 6 주관연구기관고려대학교 7 협동연구기관 8 주관연구책임자 년도 정부출연금 (A) 성명김승욱직급 ( 직위 ) 교수 소속부서화공생명공학과전공생물공정 현금 (C) 9 연구개발비및참여연구원수 ( 단위 : 천원, M Y) 기업체부담금 현물 (D) 소계 E=(C+D) 정부외출연금 (B) 상대국부담금 (F) 합계 G=(A+B+E) 참여연구원수 1 차년도 120,000 0 120,000 13 2 차년도 126,600 0 126,600 14 3 차년도 120,000 0 120,000 13 4 차년도 0 0 5 차년도 0 0 합계 366,600 0 0 0 0 0 366,600 40 10 총연구기간 2008. 09. 01-2011. 08.31 (36 개월 ) 11 다년도협약연구기간 2008. 09. 01-2011. 08. 31 (36 개월 ) 12 당해연도연구기간 2010. 09. 01-2011. 08. 31 (12 개월 ) 13 참여기업 14 국제공동연구 중소기업수대기업수기타계 상대국연구기관수상대국연구개발비상대국연구책임자수 0 관계규정과모든지시사항을준수하면서 2009 년도국가연구개발사업에따라수행중인연구개발과제의연차실적 계획서를붙임과같이제출합니다. 2011 년 08 월 25 일 주관연구책임자 : 김승욱 ( 인 ) 주관연구기관장 : 고려대학교산학협력단장 ( 인 ) 교육과학기술부장관귀하 - 1 -
주요항목작성요령 2 공개가능여부 : 기초연구사업은공개를기본으로함. 단불가피하게비공개 ( 평가용도이외에는연구보고서배포를제한하는경우 ) 로하는경우사유를양식중 < 연구내용및결과 > 의 10. 기타사항란에명확히기재함 3 세부사업명 ( 소 ) : 핵심연구 ( 공동연구 ) 5 과제명 : 당초연구과제 ( 과제명변경을재단에서승인받은경우는승인된과제명 ) 명을기재함 9 정부출연금 : 전체연구기간의총연구비를기재함 10 총연구기간 : 연구시작일부터연구종료일까지총연구기간을기재 참여연구원수는연구책임자를제외한본연구에참여하는모든연구인력 ( 연구보조원포함 ) 인원수를기재함 셀보호된내용수정방법 : 해당셀선택 > 마우스우측버튼클릭 > 표셀속성선택 > 셀선택 > 셀보호해제 중견연구자지원사업 ( 핵심연구 ) 협약연구기간적용안내 선정연도연구기간 연차 과제수 총연구기간 다년도협약기간 당해연도협약기간 비고 2007년 3년 4 3 2007.9.1~2011.8.31 2010.9.1~2011.8.31 2010.09.01~2011.08.31 2008년 2년 3 199 2008.9.1~2011.8.31 2008.9.1~2011.8.31 2010.09.01~2011.08.31 2009년 1년 2 5 2009.9.1~2011.8.31 2009.9.1~2011.8.31 2010.09.01~2011.08.31-2 -
목차 Ⅰ. 연구계획요약문 1. 국문요약문 4 Ⅱ. 연구결과요약문 1. 국문요약문 5 2. 영문요약문 6 Ⅲ. 연구내용 1. 연구개발과제의개요 1 2. 국내외기술개발현황 2 3. 연구수행내용및결과 3 4. 목표달성도및관련분야에의기여도 30 5. 연구결과의활용계획 30 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 31 7. 주관연구책임자대표적연구실적 32 8. 참고문헌 32 9. 연구성과 32 10. 기타성과 37-3 -
Ⅰ. 연구계획요약문 연구계획요약문 양식 A 201 연구목표 (500자내외) 연구내용 (1000자내외) 목질계유래혼합당을동시에이용가능한균주및공정을개발하여고효율의에탄올생산공정을확립 변형체고효율당화효소복합체 ( 셀룰로좀 ) 를효모기주에도입목질계바이오매스당화및발효과정을동시에수행하는경제적인에탄올생산융합공정을연구 균주에미치는알코올및부산물의영향을줄이며발효공정의시간을감소시키는신개념마이크로반응기를개발 Cellobiose dehydrogenase 생산능력이우수한균주선별및선별된균주로부터고활성의 cellobiose dehydrogenase 의유전자확보함. - Cellobiose dehydrogenase 생산균주의효소활성도분석및고농도효소발현을위한배지최적화 - 고활성균주의 cellobiose dehydrogenase 유전자확보 - 확보된유전자를 Pichia stipitis 에서고발현시스템구축하여바이오에탄올생산에응용함. 선행연구를통해검증된셀룰로오스분해능이높은 C. cellulovorans 미니셀룰로좀을 S. cerevisiae 에발현하여목질계바이오매스를주원료로한에탄올발효공정에응용함. - 고활성 C. cellulovorans 미니셀룰로좀구축및대장균발현유도 - 효모기주세포외 (in vivo) 발현용미니셀룰로좀 vector 구축 - 효모균주특이 promoter 및 secretion system 을분석세포내에서생성된단백질이세포밖으로단백질의침전및기타 protease 등에의한절단없이폴딩을해 intact protein 을생성하도록최적화함 - 각기다른조합의미니셀룰로좀을장착한변형체효모스크린및세포외생산효소활성도분석 ( 비 ) 결정질의셀룰로오스및헤미셀룰로오스를탄소에너지원으로하는변형체효모의에탄올생산최적화 연속적인바이오에탄올생산을위하여마이크로반응기를설계및제작함. 균주에미치는알코올의영향을줄이기위하여분리막을결합한새로운개념의복합반응기를설계함. 기대효과 (500 자내외 ) ( 응용분야및활용범위포함 ) 균주개발및발효공정은바이오에탄올생산에필수적인기술로이를기반으로핵심기술확보 가능성이높으며, 대체청정에너지개발을위한융 복합기술선점으로원천기술확보를통한 에너지경쟁력확보. 섬유질분해효소개량및재조합생산기술개발을통한원천기술획득 재조합효소도입효모균주를이용한경제적당화발효융합원천기술개발 농 / 산업폐기바이오매스를이용한환경개선및이산화탄소절감 바이오연료생산을통해탄소배출권 (CER) 을획득 바이오연료를포함한재생가능에너지는석탄천연가스의이용증대와함께원유의존도를낮추어유가안정화에기여 바이오에탄올생산공정뿐만아니라여타의바이오생산기술에광범위하게적용가능함. 중심어 균주개발 셀롤라아제 셀롤로좀 바이오에탄올생산 변형체효소 마이크로반응기 선택적투과 헤미셀롤로오스 목질계바이오매스 - 4 -
Ⅱ. 연구결과요약문 국문요약문 양식 A 202 연구의 목적및내용 고활성의 cellobiose dehydrogenase 의유전자확보및 Pichia stipitis 를이용한발현연구. 변형체고효율당화효소복합체 ( 셀룰로좀 ) 를효모기주에도입목질계바이오매스당화및발효과정을동시에수행하는경제적인에탄올생산융합공정을연구 균주에미치는알코올및부산물의영향을줄이며발효공정의시간을감소시키는신개념마이크로반응기를개발 연구결과 연구결과의활용계획 Cellobiose dehydrogenase 생산능력이우수한균주선별및선별된균주로부터고활성의 cellobiose dehydrogenase 의유전자확보함. - Cellobiose dehydrogenase 생산균주의효소활성도분석및고농도효소발현을위한배지최적화 - 고활성균주의 cellobiose dehydrogenase 유전자확보 - 확보된유전자를 Pichia stipitis 에서발현시스템구축. 셀룰로좀생산변형체효모의리그노셀룰로오스바이오매스당화시탄소성분과셀룰로좀소단위체효소조합의시너지분석 cellulase 활성및에탄올발효조건의최적화 - pesc Vector에 Promoter 가 GAPDH Promoter 로교체된 pgapa vector를구축함. - 섬유소분해효소복합체의세포표면고정화를위한유전자설계와발현및활성분석 - Cell Enzyme Substrate 의거대복합체를형성하여당화효율을극대화시킬수있게함. 복합분해효소셀룰로오좀의바이오매스원재료에따른유전자변형복합체의최적조건연구 - 섬유소분해효소가도입된재조합균주의실제섬유소당화및발효능분석 - 섬유소를직접분해하여당화액을만들어슈가플렛폼을구축함 발효시간을대폭단축시킨연속 immobilized cell channel reactor 를개발하여바이오에탄올을제조하였다. 이반응기는 cell 의 activity 측정, kinetics 도출등에도쉽게적용할수있다. 또한바이오에탄올을고농도로농축시킬수있는 silicalate membrane 장치를개발하였다. 지구상에서가장풍부하고고갈없이재생이가능한식물자원으로대표되는목질자원리그노셀룰로오스 (lignocelluloses) 을이용하여바이오에너지로의효율적인전환기술을개발함으로써폐기물처리효과를얻고더나아가바이오연료생산을통하여화석연료의존도를줄이고원유의수입량감소에일조를할수있음. 생명공학기술을이용하여저비용의기질을이용하여바이오에너지로의전환기술개발을통한수출시장확대및핵심기술을통한국내원료의자원부족의불리한조건을극복할수있음. 또한국내발효공업및화학소재산업의경쟁력을증대하는데기여할것으로기대함. Immobilized cell channel reactor 는기체를연속적으로분리하며항생물질및항암물질, 유기산, 아미노산발효생산등을할수있는복합반응기이며다양한연구에 Tool로서활용가능하다. cellobiose dehydrogenase 리그노셀룰로오스셀롤로좀 중심어 바이오에탄올생산 silicalate membrane 슈가플렛폼 선택적투과헤미셀롤로오스목질계바이오매스 표양식변경및삭제불가능하며이미지, 수식, 표의삽입을금지하고특수문자기호는전각기호만을이용하여작성함 본요약문은정보제공용으로활용되므로핵심적인내용을중심으로이해하기쉽도록기재하고한장이내로작성함 - 5 -
SUMMARY Purpose (500 자내외 ) 양식 A 202 Identification of the gene using RT-PCR and expression by P. stipitis Development of more efficient cellulase systems called ' mini Cellulosome' using Clostridium cellulovorans cellulosome for producing bioethanol in recombinant Saccharomyces cerevisiae strains Development of a novel microreactor to reduce the time of fermentation process and the contamination of microorganisms which is caused by alcohol and other side products. Contents (1000 자내외 ) Expected Contribution (500 자내외 ) ( 응용분야및활용범위포함 ) Keywords Screening of the cellulase dehydrogenase producing fungal strains - Optimization of media composition for high activity of cellulase dehydrogenase - Identification of the gene using RT-PCR and its expression by P. stipitis The optimization of cellulase activity and the fermenation condition in saccharification process of lignicellulosic biomass using recombinant yeast producing cellulosome - Construction of pgapa vector, modified pesc vector containing GAPDH promoter - Activity analysis and design of genes for cell surface display of minicellulosome - The formation of Cell-Enzyme-Substrate complex for increasing the saccharification efficiency of cellulsic materials Study of the optimization in minicellulosome complex to degrade raw cellulosoic biomass - Development of sugar platform by recombinant strains expressing minicellulosome The bioethanol was produced by the immobilized cell reactor which was developed to reduce the fermentation time significantly. This reactor can be easily applied to measure the activity of cell and the kinetics. Furthermore, silicalate membrane equipment was developed to produced highly-enriched bioethanol The use of renewable waste substrates is an environmentally friendly choice that also contributes to the reduction of waste treatment costs and increases the economic value of by-products. This bioconversion would directly benefit the environment by obtaining biodegradable polymers, promoting the use of biodieseland reducing petroleum dependency. The development of processes for converting inexpensive feedstock into higher value products is expected to make bioethanol production more economical and will thus help establish more biorefineries. The immobilized cell reactor is a combined reactor which can separate the gas phase continuously, produce a wide variety of products such as and be utilized as a tool in various studies cellobiose dehydrogenase lignocellulose cellulosome Bioethanol production silicalate membrane sugar platform 한글요약문과동일한내용을영문으로작성함 selective permeation Hemicellulase lignocellulosic biomass 양식변경 / 삭제는불가능하며이미지 / 수식 / 표의삽입을금지하고특수문자기호는전각기호만이용하여작성함 (1 페이지이내로작성 ) - 6 -
연구내용및결과 1. 연구개발과제의개요 ~ 10. 중요연구변경사항을항목에따라작성함 제목 14point, 소제목 12point, 본문내용은 10point 로작성하며, 줄간간격은조정가능함 연구내용및결과는 50 페이지이내로작성함 내용작성과관련한설명내용 ( 청색박스로표시된부분 ) 은내용작성시제거하고기술함 양식 A 301 1. 연구개발과제의개요 최근몇년간직속되는국제유가상승과석유자원의고갈에대한대중적인식으로새로운에너지원의필요성이대두되고있는이시점에서수송용연료인휘발유를대체할수있는바이오에탄올은현재구축된인프라와상용화에가장근접한에너지원임. 바이오에탄올은바이오매스를이용하여생산함. 바이오매스는사람이식량으로사용할수있는당질계, 전분질 ( 녹말 ) 계바이오매스 ( 사탕수수, 고구마, 옥수수, 콩등 ) 와식량으로사용할수없는리그노셀룰로오스계바이오매스 ( 나무, 볏짚, 고추대, 기타농임산부산물등 ) 로대별됨. 에탄올발효공정의경우여러가지공정이시도되어진행중인상황임. 그러나자연계에존재하는리그노셀롤로오스계바이오매스를효과적으로에탄올로전환하는데어려움이존재함. 리그노셀룰로오스는리그닌 15-25%, 셀룰로오스 38-50%, 헤미셀룰로오스 23-32% 등으로이루어진리그닌및탄수화물복합체임, 이는 5탄당 /6탄당을동시에발효기질로이용하는균주개발이요구됨. 특별히당화효소생산기술은선진국과의기술적인격차가심해, 효소연구기술의국내현실은세계주요국과비교할때매우열악한수준임. 바이오에탄올의고농도생산을위하여기질, 생산물 ( 에탄올 ) 및부산물에대한균주의저항성증진을위한여러형태의생물반응시스템및반응기의개발이절심함. 바이오에탄올산업화최적공정개발을위하여기질의당화공정부터생명공학적기술이도입된발효공정, 분리공정까지다양한형태의연속식공정을도입하여수율및생산성향상을유도해야함. 또한셀룰로오즈의전처리및당화공정시에발생하는다량의 cellobiose 를이용하기위한연구를수행함. 전통적인회분식반응기의문제점을인식, 균주에미치는알코올의영향을줄이면서발효공정의시간을감소할수있는방법을통하여생산성을증가시킬수있는방안을제안하고자함. 국내에서도효소를통한저비용의발효성당을생산할수있게되면이미세계일류수준의발효기술을보유한국내기술에의해연료용알콜을비롯해여러가지다양한바이오소재생산기술의실용화가앞당겨질수있음. 실제적으로바이오매스에 Cellulosome System 을적용하기위하여바이오매스를 Substrate 로하는배지에 Cellulase 의발현양상을 Cellulosomic 및 Biomarker 라는새로운기술을이용하여분석할수있음. 2. 국내외기술개발현황 현재리그노셀로오스계에탄올생산기술은미국, 독일, 일본등선진국을중심으로국가정책사업으로집중투자, 육성하고있으며이들국가의기술독주가심화되고있음. 바이오연료분야의 R&D 를선도하고미국에너지부에서도이러한상황을고려하여리그노셀룰로오스계바이오매스당화를위한효소개발연구사업을에너지부 (DOE) 산하 NREL 을중심으로 2002 년부터연간 3,000 만달러이상의연구비를투입하여실용화를목표로추진중이며이중고효율효소및발효균주개발에전력함. 발효균주개발영역은국내에서관련분야의연구중기초기술수준은높은편이나에탄올관련 - 1 -
균주에대한연구는미진함. 미래가능형바이오에탄올원재료 난방용고체연료화개발비용 수송용액체연료화개발비용 당질계전분질계목질계 < 그림 > 원료별용도대비기술발전추세 ( 출처 : NREL USA, 2000) < 표 > 국내 외의주요연구현황 연구수행기관연구개발의내용연구개발성과의활용현황 미국 National Renewable Energy Laboratory 캐나다 Iogen 미국 Genencor International; 덴마크 Novozymes 미국 Univ. of Florida (Ingram) VeraSun Energy, 미국 바이오매스전처리 바이오매스당화및발효공정 당화효소개발 바이오매스당화액발효균주 에탄올발효공정 미국에너지부의 sugarplatform 의핵심기술로서개발된약산전처리공정은 corn stover 등의 lignocellulose 에적용시셀룰라제에의한당화율이이론적수율의 90% 이상임. Trichoderma reesei 유래재조합당화요소는현재 wheat straw 에적용하여 cellulosic 에탄올을생산하는 demonstration plant 운용에사용중 2004 년 Genencor 는 20배, Novozymes 는 12배가격낮은셀룰라제개발성공하여논문발표및미국특허등록재조합 E. coli 를이용하여바이오매스당화액을 lactic acid로전환하는공정개발연간에탄올생산량 230 MGY로미국에서두번째의바이오에탄올생산능력을가짐. - 2 -
3. 연구수행내용및결과 1. Cellulase dehydrogenase (CDH) 생산을위한고활성의균주를선별 ;enzyme activity 측정후 KUC8004 phlebia radiata 와 phanerochaete chrysosporium 선정 ; 선별결과 phlebia radiata 균주가비교된 9 개균주에비해서높은활성을가짐 CDH activity (U/ml) 30 25 20 15 10 5 KUC8003 KUC8004 KUC8323 KUC8370 KUC8710 KUC8717 KUC8801 KUC8837 KUC8860 KUC8932 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Cultivation time (days) ( 그림 ) 다양한백색부후균에서의 CDH activity 측정 2. 배지조건에따른 CDH 활성도분석 - P. chrysosporium 의 CDH 발현을위해서 YMB를사용하였을때가장빨리 CDH가생산되어, TSB, PDB 배지를사용하였을때 12, 15일에비해보다 5-7일이전에 CDH가발현됨. - KUC8004 phlebia radiata 을이용하여 CDH 활성도를분석한결과 PDA 배지를사용하였을때 MA배지에비해 CDH 활성이높게나타남. - SDS-PAGE를이용하여배지에따른 P. chrysosporium 의 CDH 활성화및단백질발현량분석 35 30 YMB TSB PDB 30 25 PDA MA 25 CDH activity (U/ml) 20 15 10 5 CDH activity (U/ml) 20 15 10 0 5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Cutivation tima (days) 0 2 4 6 8 10 12 14 Cultivation time (days) ( 그림 ) 배지에따른 P.chrysosporium 및 KUC8004 phlebia radiata 의 CDH activity 측정 - 3 -
300 250 P.chrysosporium CDH activity (U/ml) 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Cultivation time (days) ( 그림 ) 배지에최적화따른 P. chrysosporium 의 activity 변화및효소발현 3. 고효율의 CDH 효소를생산하기위한배지최적화 - 배지최적화를위해탄소원과질소원을농도를조절하여 CDH 효소, β-glucosidase activity 관찰 - 8가지의탄소원중 1% Rice strew 를사용하였을때 CDH 및 β-glucosidase 의활성도가가장높음. - 8가지의질소원중 0.5% cotton seed flouer 와 CSL을사용하였을때가장높은 CDH 활성도를보였으며, 0.5% soy bean meal은 β-glucosidase 활성도증가와관련있는것으로확인됨. 5 0.10 P.chrysosporium β-glucosidase 4 0.08 CDH activity (U/L) 3 2 1 0 Xylan Wheat bran Rice strew Avicel Cellulose Saw dust CMC Soluble starch β-glucosidase (U/ml) 0.06 0.04 0.02 0.00 Xylan Wheat bran Rice strew Avicel Cellulose Saw dust CMC ( 그림 ) 탄소원에따른 CDH 및 β-glucosidase activity 변화 Soluble starch - 4 -
6 0.4 CDH activity (U/L) 5 4 3 2 1 CDH activity β-glucosidase (U/ml) 0.3 0.2 0.1 β-glucosidase 0 Soy bean meal Yeast extract Bacto-peptone Cotten seed flour CSL Ammonium sulfate Ammonium phosphate Ammonium Nitrate 0.0 Soy bean meal Yeast extract Bacto-peptone Cotten seed flour CSL Ammonium sulfate Ammonium phosphate Ammonium Nitrate ( 그림 ) 질소원에따른 CDH & β-glucosidase activity 변화 4. 양성자빔을이용한고활성 CDH 효소생산변이균주개발 - 양성자빔은세포에국부적으로많은에너지를부여하여유전자의변이를유도하는능력이우수함. 따라서, P. chrysosporium 변이균주를이용하여고활성의 CDH 생산을위하여균체의변이를유도함. - 양성자빔을이용하여빔조사후사멸율이약 99.9% 인 1.2 kgy에서 CDH 활성이증가된변이균주선별하였음. ( 그림 ) 양성자빔조사에따른 P. chrysosporium 의생존율분석 - 5 -
- 모균주와양성자빔에의한변이균주의 CDH 및 β-glucosidase 활성도를분석한결과, 변이균주의 CDH 활 성도는약 1.5 배, β-glucosidase 활성도는 20 배가증가되었음. ( 그림 ) P. chrysosporium 변이균주의 CDH 및 β-glucosidase 활성도분석 5. 고활성효소고정화를위한전처리방법및재사용 - 생물공정에서효소의재사용을위해생산된효소를담체에고정화시켜사용하기위해, 효소의활성유지와고정화하는방법을고안함. - CDH의활성부위와담체의결합을억제하기위하여, 기질로서 Cellobiose, Lactosee, Glucose, Maltose, Ceellulose, CMC, DCIP를사용하여효소고정화시전처리함. - 사용된전처리기질중 Lactose가가장우수한 CDH 활성도을나타냄. ( 그림 ) 사용된효소전처리기질과전저리후효소활성도비교 - 6 -
- 담체에고정화된 CDH 효소의량을 Broadford 방법을이용하여정량하여효소의활성을분석한결과, Lactose 를 CDH 고정화시전처리기질로사용한경우전처리하지않고고정화된 CDH에비해효소의활성이약 2배증가됨. - 본결과로부터 Lactose 가 CDH의고정화과정중에 CDH효소의활성부위와결합하여고정화단계동안활성부위의변형을억제하는것으로생각됨. ( 그림 ) 담체에고정화된 CDH 효소의활성비교 - 생물공정에서효소의반복적인재사용을위하여 Lactose 전처리방법을효소고정화에응용함. - Lactose 전처리효소가비전처리효소에비해 150% 의효소활성이유지됨. ( 그림 ) 전처리와비전처리방법을이용한 CDH 효소재사용 - 또한, 본연구를통한효소고정화전처리방법을이용하여, 상업적으로당화에사용되는 β-glucosidase 효소의전처리방법을함께연구하였음. - Cellubiose 전처리농도 (0.001-0.2 M), 전처리반응온도, 전처리교반속도최적화및효소활성반응조건 (ph, 온도 ) 을분석하였다. - Cellubiose 농도 0.02 M, 전처리온도및시간 40 에서 20분, 전처리교반속도 130 rpm에서고정화된효소의활성이최대임. - 7 -
Activity of immobilized β-glucosidase (U/g matrix)? 140 138 136 134 132 130 128 126 124 122 120 (A) 0.001 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 Activity of immobilized β-glucosidase (U/g matrix)? 160 140 120 100 80 60 40 20 (B) 0 0 10 20 30 40 50 60 4 20 30 40 50 60 65 Concentration of pretreating material (M) Pretreated time (min) Activity of immobilized β-glucosidase (U/g matrix)? 150 145 140 135 (C) 100 130 150 200 250 Agitation speed (rpm) ( 그림 ) β-glucosidase 의고정화최적화를위한전처리기질농도 (A), 전처리시간및농도 (B), 전처리 교반속도 (C). 6. P. chrysosporium 으로부터확보된 CDH 유전자발현 - 확보된 CDH 유전자서열과유전자은행에등록된유전서열을비교하여유전자서열확인. - 확보된 CDH 유전자발현을위해 ppicz-α 벡터에 CDH 유전자를삽입및확인. - Pichia stipitis 의염색체에 CDH를형질전환시키기위해 ppicz-α+cdh 를 PmeI 제한효소로벡터를절단하여형질전환함. PDA 배지에서 Zeocin 을이용하여형질전환된 P. stipitis를선별함. - 8 -
( 그림 ) 확보된유전자서열은 NCBI 에서 blast 프로그램을이용하여분석 ( 그림 ) ppicz-α 벡터와 CDH 유전자의클로닝확인 ( 그림 ) CDH 발현을위한 P. stipitis 의형질전환모식도 7. Pichia stipitis 에서 CDH 발현 - 형질전환된 P. stipitis를 zeocin 이첨가된 YPDA 배지배양하여선별하였음. 형질전환된 P. stipitis 에서 CDH 과발현을위해 250 ml baffled flask에 BMGH 배지 50 ml를넣고 12시간배양함. 배양시 CDH 유전자발현을위해 0.5% 메탄올을 24시간첨가함. - 형질전환체의 CDH 효소발현을확인하기위하여 Bradford assay를하였음. - P. stipitis 모균주에비해형질전환된 P. stipitis의단백질분비량이증가함을확인. - 9 -
( 그림 ) 형질전환된 P. stipitis 의단백질발현량측정 8. P. stipitis 의효소활성화측정 - DICP 방법을이용하여배지내에배출된 CDH 효소의활성도를측정한결과최대 200unit/L 의활성도를보임. CDH의활성의차이는 P. stipitis 염색체에삽입될때 Position effect 로판단됨. - 기존 P. chrysosporium 균체를배양하여 14일에최대의효소활성을보였으나, P. stipitis 형질전환체를이용한경우 2일후최대의 CDH 활성을보임. ( 그림 ) P. stipitis 형질전환체의 CDH activity 결과 - 10 -
9. 고활성의당화효소스크린및발효균주선정 : 혐기성세균중세포외부에서효소복합체인 cellulosome 을만들어내는균주 Clostridium cellulovorans, Clostridium thermocellum 및 Saccharomycosis fibuligera의고활성 cellulase 를본실험에이용 고활성의당화효소를생산하는균주및효소 - Clostridium cellulovorans 의 Endoglucanase D 발효생산균주 - Saccharomyces cerevisiae Clostridium thermocellum 의 Exoglucannase E Saccharomycosis fibuligera 의 β-glucosidase1 10. 선별되어진효소의고발현벡터시스템의구축및활성확인 : S. cerevisiae 에서의발현을위하여 EngD와 EgE를 yeast vector 인 pesc-trp에구축하였으며이를 YEASTMAKER yeast transformation kit2을이용하여형질전환후활성을확인하기위하여 CMC plate에서 halo를확인 ( 그림 ) : 형질전환되어진균주의발현을확인하기위하여 SDS-PAGE로확인하였으며 Zymogram 으로활성을확인 ( 그림 ) ( 그림 ) 형질전환체의 CM C plate 에서의활성확인 ( 그림 ) BGL1 유전자를포함한 EgE, EngD 의 pesc-trp 에의구축도 - 11 -
( 그림 ) EgE, EngD 와 BGL1 의 SDS-PAG E 및 Zymogram 11. 효모형질전환체를이용한바이오에탄올의생산 : 20g/l 의 CMC 를기질로첨가된발효배지에서 30,100rpm 으로배양한결과기존의 S. cerevisiae 와비교하여 높은 ethanol 생산량을나타냄 ( 그림 ) Symbols: closed circles, pαengdαbg1; closed squares, pesc-trp ( 그림 ) 형질전환된효모를이용한에탄올생산 : 본 1차년도연구는목질계자원인 cellulose 를이용하는효모의형질변환체를제조하는것으로, 혐기성세균인 Clostridium cellulovorans, Clostridium thermocellum 및 Saccharomycosis fibuligera 의 EngD, EgE, β -glucosidase 를이용하여형질전환체를제조하였고이를이용하여 CMC를기질로하여효모에서의에탄올생산의가능성을확인. 12. 섬유소분해효소복합체를형성하기위한소단위분해효소및복합체구축단백질의설계및고발현벡터시스템의구축및활성확인 : 섬유소분해효소복합체를형성하기위하여 EgE의 Catalytic domain 을 C. cellulovorans EngD의 Dockerin 과결합시킴 Chimeric Endoglucanase 와복합체구축단백질로 minicbpa 를설계하고효묘발현벡터에구축및형질전환시킴 - 12 -
( 그림 ) 섬유소분해효소복함체소단위체의설계 ( 그림 ) 섬유소분해효소복합체소단위체유전자를포함한벡터의구축도 : 형질전환되어진균주의발현을확인하기위하여 minicbpa 를 Cellulose Binding Domain (CBD) 를이용하여 정제후 SDS-PAGE 로확인하였으며효소는 Halo Test 로활성을확인 ( 그림 ) ( 그림 ) minicbpa 의 CBD 정제후 SDS-PAGE 와형질전환체의 CMC plate 에서의활성확인 [1,3] - 13 -
13. 섬유소분해효소복합체의형성및효모형질전환체를이용한바이오에탄올의생산 : Zymogram 을통한섬유소분해효소복합체의형성확인및 20g/l 의 CMC를기질로첨가된발효배지에서 30,100rpm 으로배양한결과기존의분해효소와비교하여분해효소복합체를형성하는균주가높은 ethanol 생산량을나타냄 ( 그림 ) ( 그림 ) 분해효소복합체의 Zymogram 과형질전환균주를이용한에탄올의생산 14. 섬유소분해효소복합체의세표표면고정화 : 섬유소분해효소복합체를형성하기위하여소단위체들을설계하고효모발현벡터에구축시킴 ( 그림 ) ( 그림 ) 세표표면고정화를위한단백질설계및그유전자들을포함한벡터의구축도 - 14 -
: 섬유소분해효소복합체의세표표면고정화를위한소단위체들의분비발현및세표표면단백질의 CBD 이용정제를통한복합체구축단백질의확인 ( 그림 ) Zymogram 과 CBD 정제후 SDS-PAGE 를통한복합체소단위체확인 : 섬유소분해효소복합체의세표표면고정화시스템의효과적인섬유소분해활성을 Halo Test 와 CMC 를 기질로하여분해후의 Reducing sugar 의 DNS Method 를이용한측정 ( 그림 ) ( 그림 ) Halo Test 와 Reducing Sugar Test 를통한세포표면고정화효소의활성측정 - 실제로이용가능한바이오매스의전처리및전처리된기질의당화공정을개발하기위하여창해연구소로 부터여러종류의바이오매스를제공받음. 창해에탄올에서는여러가지방식의전처리를통하여당화효소가 반응하기유리한구조로바이오매스를변형시킴. - 15 -
( 표 ) 바이오매스의종류및전처리조건과성분조성 - 구축한재조합균주를이용하여실제로전처리된바이오매스의당화효율을분석함. 여러바이오매스중에서보리짚을선택하여이것을기질로하는배지에서의당화효율을 DNA Method 를이용한환원당측정방식으로분석함. 그결과섬유소당화효소를분비하는균주가기존의균주보다더많은양의환원당을내는것을알수있으며, 이것을토대로실제바이오매스의이용에재조합균주를이용할수있을것으로보임 ( 그림 ) 보리짚을기질로한재조합균주의당화효율분석 - 지금까지의결과를종합하여, 섬유소분해효소가도입된재조합균주의실제섬유소당화및발효능을살펴봄. 이전실험에서재조합균주가전처리된보리짚으로부터당화액을생산할수있다는것을근거로전처리보리짚을유일한탄소원으로하여 Consolidated Bioprocessing 을진해함. 그결과효소가도입되지않은일반균주에비해더많은양의에탄올을생산하는것을확인할수있었음. 이결과는섬유소를직접분해하여당화액을만들고, 이를이용할수있는균주를이용해유용한물질을만들수있는슈가플렛폼을구축한것이라고결론을내릴수있음. - 16 -
( 그림 ) 보리짚을기질로한재조합균주의에탄올생산분석 ( 그림 ) 보리짚구성성분 - 위의표와같이 Barley Staraw 는 Cellulose(33.8%), Hemicellulose (21.9%), Lignin (13.8%) 을주성분으로함. 반응전과반응후의구성성분을비교해보면 Cellulose는재조합효모균주가발현하는 Cellulase에의해분해가되어당화액을생산한후효모에의해에탄올발효의기질로사용된것으로볼수있다. 이것은반응후에 Cellulose 의비율이감소하고 Gluocse 또한감소한점에서확인할수있다. 이결과는효모처리후효모의향산된당화능력으로인하여섬유소기질의바이오매스를이용할수있게된점을확인함 - 17 -
15. PEI 수용액 (0.1%, 0.2%) 을이용한 S.cerevisiae 고정화 ( 그림 2) Microscopic photograph of the yeast cells at 0.1% (left), 0.2%(right) PEI : 0.2% PEI 수용액에서 S.cerevisiae 가더고정화효율이좋음을확인할수있음. ( 그림 3) Microscopic photograph of yeast cells after pouring water for 10h : S.cerevisiae 가부착된유리판을 10 시간동안노출시킨뒤에광학현미경으로촬영하였다. 촬영결과고정 화된 S.cerevisiae 가강하게유리판과결합됨을확인함. ( 그림 4) Results for fermentation - 18 -
: S.cerevisiae을유리판에고정화시키고발효반응을수행하여시간당발생하는에탄올의농도, 당농도및균주의양을분석하였다. 고정화된균주를이용한바이오에탄올생성은 24.07 g/l로회분식반응기 20.12 g/l보다높은농도의에탄올을생성 : 테프론튜브를이용한연속적인에탄올생성실험은튜브의길이가 4m, 즉체류시간이 4시간인경우에에탄올농도가 0.16 g/l가나오는것을확인 16. S.cerevisiae 와 polyethyeneimine(pei) 의접착강화실험및에탄올생산량 : 1차년도수행된실험과달리균주와채널동시에 PEI를입혀균의부착여부를살펴보았으며이를이용한에탄올생산성실험을수행하였다. 약 0.4 % 의 PEI 수용액을사용할때고정화효율이극대화되는것을살펴볼수있었으며 PEI 농도가높아짐에따라서균주가에탄올생산에저해를받는것이확인되었다. 고정화된균주모습은그림과같으며이를이용하여에탄올생산성실험을해보았다. Feed 는 30g/L 의 YPD 용액을사용하였으며채널내체류시간을변화시키면서실험을진행하여보았다. ( 그림 ) 채널에균주가부착된모습 ( 그림 ) 마이크로반응기를이용한 Ethanol 생산실험 - 19 -
결과적으로약 4 시간만에이론수율인 15g/L 에근접하였으며종전 Batch 반응기 (48h) 에비해서 12 배정도 시간을단축시킬수있었으며최대 Qp 는약 20g/L h 정도로시간당약 20g/L 의에탄올을생산할수있 다. 17. Micro Reactor 내부 CO 2 제거를위한실험 : Fermentation 으로인한내부 CO 2 는채널내부에기공을만들어반응기의성능을저하시키는요인이다. 이를제거하기위해 Ethanol 과 CO 2 의 Hydrophobic/Hydrophilic 한성질을이용하였으며이를마이크로반응기의특성인 Laminar flow 와적용시켜 Parabolic 한 Flow Pattern을만들어채널의상판을통해제거하였다. ( 그림 ) 특성을적용한반응기내부모습 18. Micro Reactor 의확장성및안정성실험 : 제작된마이크로반응기의확장성을위해균주, 온도, 및 PH 를교체하여결과를살펴보았다. ( 그림 ) Zymomonas 의에탄올생산실험 - 20 -
결과적으로 Zymomonas 도제작된마이크로반응기에적용시킬수있었으며 30g/L 의 YPD 수용액을사용하 였을때 RT 4 시간에서약 15g/L 정도의높은 Ehanol 생산성을보여주었다. 이는본반응기의다향한활용 가능성을보여주었다. 19. 생산된에탄올을분리해내기위한분리막제작실험 : 5wt% 정도의 Ethanol 을제작된 silicate membrane 을통해분리해보았다. 위분리막은약 40wt% 정도의 분리성능을보여주었으나지속시간이짧아개선이필요할것으로보인다. ( 그림 ) 분리막실험 20. 균주 immobilized 를위한접착강화실험 발효조내에미생물이나효소를고정시켜연속적으로발효시킬수있는것을균주의고정화라고한다. 고정화방법은반응후균주를회수하여재사용이가능하고반응생성물의분리정제가용이하다는장점이있다. Polyethylenimine(PEI) 는물리적흡착이가능한고분자로서균주에코팅이가능한물질로알려져있다. 본실험에서는 ethanol 을최대로발생시키는 PEI의최적농도를알아보기위하여균주와 PEI 혼합시 PEI의농도에따른 Ethanol 발생량의차이를조사하였다. * Cell의전처리과정균주는 S. cerevisiae(0.275 g), Z. mobilis(0.275 g) 를사용하였고증류수와식염수로세척한후 PEI(pH 7.0)10 ml와섞어서현탁액을제조하였다. 제조된현탁액을 Rototorque 로상온에서 2 시간가량섞어준후원심분리한후잔여 PEI를제거후 cell 을확보하였다. * Immobilized cell channel reactor 전처리과정석영 plate를 Chromic acid에 24 시간전처리후증류수로씻고공기중에건조시킨후 PEI(pH 7.0) 용액중에 2 시간정도넣은후상온에서완전건조하였다. PEI 코팅된균주와증류수 2 ml를섞고시린지펌프를이용하여코팅된균주를전처리된반응기내부로투입하여채널내부를코팅하였다. - 21 -
PEI solution 의농도는 0.2 wt% 에서 10 wt% 로바꾸며실험하였고농도에따른 Ethnaol 발생량을측정하였다. ( 표 ) Ethanol 측정실험을위한 PEI 농도변화 Immobilized cell channel reactor 에서 PEI 의농도를달리한 Immobilized cells 의발효양상을알아보기위하여 Ethanol 분석을하였다. Table 1은 S. cerevisiae 와 Z. mobilis와코팅된 PEI를농도 0.2 wt% 에서 10 wt% 로높이면서 Ethanol 발생정도를나타낸표이다. Ethanol 생산은 PEI농도 0.4 wt% 이하일때감소하였고 0.4 wt% 이상일때역시감소하는양상을보였다. 이는 PEI농도 0.4 wt% 일때대부분의 Cells가코팅되었다는의미이며 PEI의농도가증가하면서 Ethanol 발생이낮아지는이유는 PEI의 cell 에대한독성때문인것으로생각된다. (Figure 1) Micro channel reactor 사진 (Figure 2-1) PEI 와 Yeast 가잘혼합되지않아 channel 위에 immobilized 된 SEM 사진 (Figure 2-2) PEI 와 Yeast 잘혼합되어 channel 위에 immobilized 된 SEM 사진 - 22 -
21. Immobilized cell channel reactor 를사용한 parent cell activity Batch 반응기에서는발효과정중 cell 의증식으로인해 parent cell 과 daughter cell 의구분이어렵기때문에 parent cell 의 activity 측정이사실상어렵다. Immobilized cell channel reactor 에서는 parent cell 에서파생된 daughter cells 이 feed 와함께흘러나가게되어 ethanol 생산에직접적인영향을끼치지못하게되고 parent cell은그대로 channel 위에부착되어있기때문에 cell activity 측정이용이하다는장점이있다. * Cell activity 측정 Cell의 activity측정을위해 glass channel 에고정화된 cell의 Ethanol productivity 를지속적으로측정하였다. 균주는 yeast를사용하였고 30일간 Ethanol을측정하였다. Feed는 30 g/l이함유되어있는 YPD media를사용했으며온도는 32 C 로유지하였고반응기내 feed 의체류시간은 2 h로고정하였다. 발효가시작된후 steady-state 상태로만들기위해 12h 반응기에 feed를실린지펌프를사용하여공급하였다. 발효가진행되면서발생하는 CO 2 는출구쪽 upper channel hole을통해지속적으로제거되었다. (Figure 3) Cell activity 측정을위한 Immobilized S. cerevisiae 와 30 g/l YPD media 의발효데이터 Immobilized yeast cell 은 23 일동안평균적으로 11.5 g/l의에탄올을발생시켰으며그이후엔 ethanol 생산이급격하게줄어드는결과를얻었다. Cell activity의감소는 ethanol productivity 에영향을끼치게된다. 결과적으로 immobilized cell channel reactor 는고정화된 parent cells 의 activity 를알수있게되었으며 channel 에다양한 cell을접목시켜 activity 측정을할수있다는결과를얻었다. 22. Pentose와 Hexose혼합물을원료로한 Batch 반응기에서의에탄올제조목질계바이오매스는그부존량이막대한재생산자원이므로, 경제적이고효율적인당화공정및발효공정을개발한다면중요한대체에너지원이될수있을것이다. 이러한목질계바이오매스의가수분해물은주로 Glucose, Xylose 및 Cellobiose 의혼합물을함유하는데 Z. mobilis는 Hexose 를 P. stipitis는 Pentose 분해를잘한다고알려져있다. 따라서본실험에서는 Z. mobilis와 P. stipitis를각각사용하여 Glucose/Xylose mixture 발효성능을비교분석하고자하였다. - 23 -
* Batch실험조건및방법 Feed 조건은 30 g/l glucose 와 20 g/l xylose와 3 g/l의 yeast extract 3 g/l 및 peptone 6 g/l를혼합하였고 Erlenmeyer flasks reaction volume 600 ml으로하였다. 온도 30 로유지하였으며 ph 5(HCl + Trisbuffer), Agitation 은 200 rpm으로하였고, 두균주는 1.2g 씩반응기에투입되었다. 10 h 간격으로 Sampling하였고 Cell mass분석은 UV-vis spectrophotometer(600nm) 을사용하였고 Feed 및 Ethanol 분석은 HPLC를사용하였다. (Figure 4) Z. mobilis 와 Glucose 30 g/l, Xylose 20 g/l 를발효시킨결과그래프 (Figure 5) P. stipitis 와 Glucose 30 g/l, Xylose 20 g/l 를발효시킨결과그래프 - 24 -
Table 2 실험결과 Zymomonas mobilis는 30 h 후 Glucose를전량분해하는반면에 Pichia stipitis는 Glucose분해까지 40 h 소요되었다. 그러나 Xylose 분해에서는 Zymomonas mobilis보다 Pichia stipitis는 80 h 소요되어약 20 h 단축이있었다. Glucose 와 Xylose 모두 100 % Conversion 을보였으며최대에탄올농도는 21.3 g/l, 21.8 g/l로각각 0.43, 0.44 의 Yield를보였다. 이로써 Glucose/Xylose 혼합물에대해서는 Glucose 분해를돕는 Zymomonas mobilis와동시에 Xylose분해가빠른 Pichia stipitis를하나의 Batch 발효기에사용한다면 Co-culture process 을구현하면서더욱효율적으로 2가지 Feed 를분해할수있을것이다. 23.. P. stipitis 를사용한 Immobilized cell channel reactor 에서의발효 식물체바이오매스는가수분해시 hexose( 포도당 ) 과 xylose 와같은 pentose 의혼합당이생성되는데그동안에탄올생산에많이사용된되어온 S. cerevsiae 는 hexose 을발효해에탄올을생산하지만, xylose 는발효하지못하는문제점이있었다. P. stiptis 균주는 hexose 뿐만아니라 xylose 를발효하여에탄올을생산하는균주이다. 본연구에서는 P. stiptis를사용하여 xylose 및 glucose 를원료로한발효공정에서 immobilized cell channel reactor 에서의경향성을파악하기위하여실험을수행하였다. Immobilized cell channel reactor 속에 P. stipitis를 PEI로고정시키고순수 Xylose 60 g/l 및 Glucose 60 g/l를 Feed 로사용하여발효를진행하였다. 온도는 30 로유지하였으며 ph는 6.3(HCl + Tris 1M) 로고정하였다. P. stipitis는 0.003 g을 channel 위에고정시켰다. (Figure 6) 석영 plate 위에 P. stipitis 가 PEI 와코팅된 SEM 사진 - 25 -
1) Hexose 를원료로사용한경우 70 Glucose, Ethanol concentration(g/l) 60 50 40 30 20 10 Glucose conc(g/l) Ethanol conc(g/l) 0 0 2 4 6 8 10 12 Residence time (h) (Figure 7) Glucose 60 g/l와 P.stipitis(0.003 g) 을 immobilized cell channel reactor 를사용하며발효시킨결과 2) Pentose 를원료로사용한경우 70 Xylose, Ethanol concentration (g/l) 60 50 40 30 20 10 Xylose conc(g/l) Ethanol conc(g/l) 0 0 2 4 6 8 10 12 14 Residence time (h) (Figure 8) Xylose 60 g/l 와 P.stipitis(0.003 g) 을 immobilized cell channel reactor 를사용하며발효시킨결과 Glucose(60 g/l) 는 immobilized cell channel reactor 안에서체류시간 10 h 정도에거의 100 % 에가까운 conversion 을보였고 xylose(60 g/l) 는그보다좀더늦은체류시간 12 h 정도에전량분해가가능하였다. P. stipitis는 xylose 분해에능한균주로알려져있지만 glucose를더선호한다고학계에알려져있으며본실험에서는 glucose 분해를조금더빨리한다는결과를얻을수있었다. - 26 -
24. Pentose 와 Hexose 의혼합물을원료로한 Immobilized cell channel reactor 에서의에탄올제조자연계에서존재하는 bioresources 들은그종류가다양하며 ethanol 생산을위해당화과정을거치게되면서생성되는 Pentose 와 Hexose 의비율역시다양하다. 본연구에서는 glucoes 만사용한 YPD media 대신 xylose 와함께혼합하여 hexose 및 pentose의분해를시도하였다. 또한 glucose 와 xylose mixture feed에서 cell이발효를할때 glucose inhibition이발생하는지알아보았다. Xylose 분해에능한 P. stipitis(0.003 g) 를사용하였고석영 plate 위에고정화하기위해 PEI(pH 7.0) 0.4 wt% 를사용하였다. 온도는 30 로유지하였으며 ph는 6.3(HCl + Tris 1 M) 로고정하였다. glucose 와 xylose mixture의혼합비율을달리하여 P.stipitis 를적용하여발효를하였으며체류시간을 0h 16h 로바꾸며실험하였다. Ethanol은 Agilient 7890A gas chromatograph 를사용하여분석하였고, Glucose 및 Xylose는 Aminex-87H 컬럼을쓰는 liquid chromatograph 를사용하여분석하였다. Glucose, Xylose, Ehthanol conc (g/l) 60 40 20 Glucose conc(g/l) Xylose conc(g/l) Ethanol conc(g/l) 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Residence time (h) (Figure 9) Glucose 20 g/l + Xylose 40 g/l mixture와 P.stipitis(0.003 g) 을 immobilized cell channel reactor 를사용하며발효시킨결과 (Figure 10) Glucose 50g/L + Xylose 10 g/l mixture 와 P.stipitis(0.003 g) 을 immobilized cell channel reactor 를사용하며발효시킨결과 - 27 -
Glucose 와 xylose mixture 는 immobilized cell channel reactor 안에서체류시간 16 h 정도면전량분해가가능하였고 P.stipitis 는 glucose inhibition 을받아 glucose 가전량분해된후 xylose 가분해되기시작하는양상을보였다. 혼합비율 glucose 50 g/l + xylose 10 g/l mixture에비해 glucose 20 g/l + xylose 40g/L mixture에서 P.stipitis가 glucose inhibition의영향을덜받는것으로보이며그이유는혼합비율에서 xylose 의비중이높아졌기때문으로판단된다. 25. Silicalite membrane을사용한 Bioethanol 분리에탄올을연료로사용하기위해서는순도가 99% 이상으로농축되어야한다. 높은농도의에탄올을정제하는공정은많이존재하지만최근에 membrane 을이용한에탄올분리가각광을받고있고많은연구가진행되고있다. 그중에서도 silicalite membrane 은 hydrophobic 한성질때문에물과의혼합물에서유기물질을분리해낼때많이사용되며특히 pervaporation 개념을이용한 membrane 은 Feed 와에탄올의분리에새로운방식으로떠오르고있다. 본실험에서는 silicalite membrane 을제작하여에탄올분리성능실험을진행하였다. 1)Silicalite membrane 제조 TPA-Br, NaOH, SiO2, distillate water 를혼합한용액을 10 * 10 mm 크기의 sintered element(stainless steel) 와 autoclave 에넣고 443 k에서 48 h 동안오븐에서가열한다. porous stainless steel 을꺼내어물로씻은후, 373 k에서 1h 동안건조후소성로에 Porous stainless steel 을넣고 773 k 에서 24 h 동안가열한다. 2) Silicalite membrane 의연속적인 Bioethanol 분리 아래의장치에 (5, 10, 15, 20, 25 wt%) 에탄올 + water + silica powder 혼합물을넣고 30 min 동안 Cold trap 에서에탄올을수집한다. Cold trap 으로수집된에탄올을 GC 로분석한다. (Figure 11) Ethanol 과 Water 혼합액에서의 Ethanol 분리과정모식도 - 28 -
(Figure 12) Ethanol 5, 10, 15, 20, 25 wt% 를 Silicalite membrane 을사용하여농축한결과그래프 (Figure 13) Ethanol 22.56, 32.29, 49.63, 78.22, 82.72 wt% 를 Silicalite membrane 을사용하여농축한결과그래프 에탄올농도가변화함에따른분리막의에탄올분리능력을확인하기위해 5 wt% 부터 25 wt% 까지농도를달리하여실험하였고, 그에따라 25 wt% 의에탄올이 2번의 cycle 을거치면 97.17 wt% 까지농축이되는것을확인하였다. silica의 hydrophobic 한성질과 pervaporation 의개념을도입한 silicalite membrane 은에탄올분리효율이기존의증류탑방식보다좋다는것을확인할수있었다. 또한 feed 와 silica powder 를함께분리막을통과시키는방법을사용하여기공의크기를더욱좁혀분리막의효율을더욱향상시키는결과를도출해냈다. - 29 -
4. 목표달성도및관련분야에의기여도 목표 셀룰로좀구조단백질과소단위분해효소 ( 셀룰라아제 / 헤미셀룰라아제 ) 를도입한변형체숙주의단백질세포외발현유 1차년도도및복합체형성변형체소단위섬유소분해효소및셀룰로좀형성구축단백질개발과섬유소분해복합체의세포표면고정화유도및활성측정 CDH 유전자확보및 단백질서열분석 2차년도고활성 CDH 발현시스템 구축 3차년도마이크로반응기를이용 달성도 (%) 100% 100% 내 형질전환을위한유전자의고발현벡터시스템의구축및숙주미생물에 적합한형질전환방법의개발형질전환된숙주미생물로부터미니셀룰로좀의세포외발현및효소복합체형성으로인한당화의 Synegic 효과확인 90% 최적조건으로부터효소복합체형성및에탄올발효조건확립 90% 변형체소단위섬유소분해효소설계및셀룰로좀의세포표면고정화 구축단백질개발 80% 구축된벡터의효모도입및발현단백질의정제 100% Dockerin Cohesin Interaction 을이용한 Cell surface Display System 의도입및효소의활성측정 100% CDH 유전자확보와단백질서열분석 90% ppicz-α vector 를이용하여발현시스템구축 CDH 생산공정최적화 90% CDH 발현을위한다양한탄소원과질소원을이용하여 CDH 활성도측정 한바이오에탄올생산 100% 균주고정화실험및에탄올생산량 100% Micro Reactor 내부 CO2 제거를위한실험 100% Micro Reactor 의확장성및안정성실험 90% 생산된에탄올을분리해내기위한분리막제작실험 용 5. 연구결과의활용계획 국내고효율의 Cellulase 생산기술및판매시장확보로연계하여활용 - 섬유소계에탄올수요상승및가격하락에따라 cellulose 를이용하여바이오에탄올을생산하는기술에대한연구가활발히진행되고있는상황 - 국내의경우는수입한 cellulase 를이용한 Lab 수준의당화및발효기술에머물러있음. - Cellulose 유래바이오연료시장자체가아직국내에형성되어있지않고, Novozyme, Iogen, Genencor 등의선진기업들의높은특허장벽때문에시장진입에어려움이있음. - 정부의정책적인지원아래바이오에탄올수요가증가할경우관련효소시장역시규모가확대될것으로예상됨. - 30 -
Immobilized cell channel reactor 의에탄올에적용 ( 그림 ) Numbering up method 모식도 Iimmobilized cell channel reactor 는 surface area/volume ratio가크기때문에물질전달이기존반응기에비해매우빠르다. 이로인해변수변화에따른공정 control 이매우효과적이지만발효를통해생산되는에탄올은소량이다. 그러나 numbering up method 를통하여생산량을쉽게증가시킬수있다. 60 g/l 의 glucose 를 feed 로사용하고 flask culture 발효를했을경우 ethanol production rate(g/l h) 는 0.24 이다총 reaction volume을 50 ml로했고총발효시간은 120h 이었다. 120h 이지난후생산되는에탄올은 1.125 g이나왔다. 하지만 micro channel reactor 를사용했을경우 120h 동안 0.119 g의에탄올이연속적으로생산된다. 즉 10개의 micro channel reactor 연결했을경우 50 ml 의 flask culture보다더좋은에탄올 yield와생산량을나타낸다. 또한반응부피대에탄올생산성을보면 0.85 ml의반응부피를가진 micro channel reactor 에서나오는에탄올이압도적으로많다. 하지만상업적으로이용할때는에탄올대량생산을요하며실질적으로 micro reactor 의개수를무한정늘려야하므로초기투자비용이많이들수있다는단점이있다. 이는후속연구를통해연속적으로생산되는에탄올량을늘리기위한노력이지속되어야함. 연속반응기의모사실험을위한 tool로서 immobilized cell channel reactor 의활용 Immobilized cell channel reactor 는투입되는 feed 와고정화에필요한cell 이미량이기때문에유지비용이저렴하다. 또한에탄올발효에필요한시간이짧고실시간분석이가능하다. 따라서공정 control 이용의하여 kinetic parameters 를쉽게얻을수있다. 기존의반응기에서는 parent cell 의 activity를측정할수없다. 이는발효가진행됨에따라 cell이발효조내부에서증식되므로 parent cell 과 daughter cell의구분이어렵기때문이다. 그러나 immobilized cell channel reactor 에서는 parent cell 만 channel 표면에고정화되어있고거기서파생되는 daughter cell 이 feed 와함께빠져나오기때문에 parent cell 만의연구가가능하다. 예를들어 glucose 와 xylose 의복합탄소원에서생육하는 cell 은한탄소원이다른탄소원들의이용을억제하는 diauxic 현상을나타낸다. Glucose/xylose mixtures 실험을통해 mother cell 의 glucose catabolite repression 을측정할수있었다. parent cell 은 batch와달리 glucose/xylose 혼합농도에따라 catabolite repression 영향에대한차이를보였다. 또한 parent cell만고정화되어있다는장점을활용하여 cell activity 측정실험을수행하였고본반응기에서 yeast 의 activity를측정할수있었다. 이를응용하여 immobilized cell channel reactor 는다양한 parent cell 의 profile 을얻을수있는 tool 로서의활용이가능함. - 31 -
Immobilized cell channel reactor 를이용한연속적인동시발효및불순물제거에활용 상부채널 (PP) 하부채널 ( 석영 ) ( 그림 ) 채널이산화탄소등의기체가 cellular metabolism 중생산되는데이가스는 channel 에고정화된셀과 feed 와의접촉을저해하기때문에연속적으로제거되어야한다. 이에본반응기에서는상부채널을 hydrophobic polypropylene 으로제작하였고하부채널은 hydrophilic quartz plate를사용하여제작하였다. 이를이용하여 hydrophobic 한성질을가진이산화탄소가연속적으로상부채널을통해서제거되어발효와불순물의분리가동시에이루어지는연속적인공정이가능하다. 이러한반응기특성을이용하여기체가발생하고그기체가 inhibitor 로작용되는화학및생물반응에다양하게활용할수있음. Silicalite membrane을사용한에탄올분리및농축에적용 Silicalite membrane을이용하여선택적으로생성물을기화시켜분리하는 pervaporation 기법은물-에탄올의분리등에서특히주목받고있다. 본연구에서제작된 silicalite membrane 은막을사이에두고압력차이를이용한 pervaporation 기법을사용하였으며 silica powder를유체에혼합시켜 silica membrane의공극을최소화시킴을통해에탄올분리성능을개선하였다. 또한연속적인에탄올분리가가능하며크기가작아이동성이뛰어나며이를활용하여부탄올생산등의다양한분야에분리막으로서활용이가능함. - 32 -
Immobilized cell channel reactor 를이용한공정단순화에적용 (a)2 step immobilized cell channel reactor (b) single step immobilized cell channel reactor ( 그림 ) 다당류를이용한 immobilized cell channel reactor 의에탄올제조과정 Sucrose, lactose, xylan등다당류는높은에너지저장량에도불구하고미생물이분해할수없어직접적인활용이어렵다. 이에 saccharification 등의전처리과정을통해다당류를단당류로바꾸는과정이필요하므로공정 step이늘어나게되어가격경쟁력이저하된다. 이는 immobilized cell channel reactor 를적용하여개선할수있다. 반응기하나는 saccharification 에다른하나는 fermentation 에사용하는 2 step 반응 system을구현하거나반응기채널의일부에 trichoderma reesei 및 phanerochaete chrysosporium 등을고정화하여다당류의 saccharification 에사용하고나머지채널일부를 glucose 및 xylose의발효에사용하는single step 반응 system을통해다당류의가수분해및발효를동시에할수있는복합반응기로서의활용이가능함. Immobilized cell channel reactor 에서의다양한제품의생산에적용 Cell과 enzyme 을이용한 fermentation 공법은알코올, 주류제조및효모, 치즈요구르트등과같은발효식품제조에이용된다. 더나아가항생물질및항암물질, 유기산, 아미노산발효등다양한제품생산도가능하다. 특히항생물질및항암물질등은제조되기힘들고그가치가높아시장에서높은가격에거래되고있다. 본연구에사용된 immobilized cell channel reactor 는 cell 의고정화방법을통해다양한 feed 의적용이가능하며고부가가치의다양한제품제조가가능함. - 33 -
Cellulase 당화기술의상용화에활용함. - 발효소재및식품생산에이용되는당의일부대체하는효과를기대할수있음. - 연구성과를이용하여 2020 년추정소요량의약 30% 를대체할수있을것으로예상되며이로인해년간약 200억정도의수입대체효과가발생할것으로예상됨. - 고효율의 Cellulase 생산기술은효소시장개척뿐만아니라당자원확보능력을갖게하여국제곡물가격변동및원료부족등의문제에좀더유연하게대처할수있게해주며수입대체효과및원가절감효과를얻을수있도록해줄것으로기대됨. 본연구개발로효소생산농도증가및활성증가로원가절감을달성하여시장가격경쟁력확보 - 규모가급격히성장할것으로예상되는중국, 인도등신흥개발시장에진출하기위해서는현지업체와협력및 joint venture 설립등을통한진입가능성을높이는전략이필요함. 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 7. 주관연구책임자 ( 공동연구원 ) 대표적연구실적 번호논문명 / 특허명 / 기타소속기관명역할 1 2 3 The processive endoglucanase EngZ is active in crystalline cellulose degradation as a cellulosomal subunit of Clostridium cellulovorans Enhanced production of cellobiose dehydrogenase and β-glucosidase by Phanerochaete chrysosporium Production of cellulosic ethanol in Saccharomyces cerevisiae heterologous expressing Clostridium thermocellum endoglucanase and Saccharomycopsis fibuligera beta-glucosidase genes 고려대학교 참여저자 고려대학교교신저자. 고려대학교참여저자 논문게재지 / 특허등 록국가 ENZYME AND MIiCROBIAL TECHNOLOGY KOREAN JOURNAL OF CHEMICAL ENGINEERING MOLECULES AND CELLS 논문게재 일 / 특허등 록일 2011.06 2011.05 2009. 10 특기사항 (SCI 여부 ) 대표연구실적은총연구기간중발표 ( 게재확정포함 ) 된대표적연구실적 ( 논문, 특허등 ) 을 5건이내로기재 소속기관명 : 연구성과발표시소속된기관명을기재 역할 : 논문의경우만작성하며제1저자, 교신저자, 참여저자중선택하여기재 특허등록국가 : 특허를등록한국가명을한글로기재 ( 예시, 대한민국, 미국, 일본등 ) 특기사항에는인용횟수나우수논문수상등과같이특별히기술할필요가있는사항을기재 - 34 -
상기의대표적논문및특허등록에대한내용은 ( 별첨 1: 대표연구업적 ) 서식에따라요약문을작성 8. 참고문헌 9. 연구성과 사업명 핵심연구지원사업 ( 협동 ) 연구책임자 김승욱 주관기관 고려대학교산학협력단 고활성당화효소생산에탄올발효균주개발과다양한배양시스템 과제번호 2008-0060893 과제명 의공정최적화를통한고효율수송용바이오 에탄올생산공정에 관한연구 과학기술 / 학술적연구성과 ( 단위 : 건 ) 학술대회전문학술지논문게재초청지식재산권출판실적논문발표수상강연국내논문국외논문출원등록실적저역보고실적국내국제 SCI 비SCI SCI 비SCI 국내국외국내국외서서 6 1 3 0 0 5 1 5 0 0 0 0 0 0 인력양성및연구시설 ( 단위 : 명, 건 ) 학위배출국내외연수지원장기단기산학강좌연구기자재박사석사국내국외국내국외 0 0 0 0 0 0 0 0 국내과학자해외파견 국제협력 ( 단위 : 명, 건 ) 과학자교류국제협력기반학술회의개최 외국과학자국내유치 MOU 체결국제공동연구국제사업참여국내국제 0 0 0 0 0 0 0 산업지원및연구성과활용 ( 단위 : 건 ) 기술확산연구성과활용 ( 사업화및후속연구과제등 ) 기술이전기술지도기술평가후속연구추진사업화추진중사업화완료 0 0 0 0 0 0 산업지원및연구성과활용 ( 단위 : 건 ) 기술확산연구성과활용 ( 사업화및후속연구과제등 ) 기술이전기술지도기술평가후속연구추진사업화추진중사업화완료 0 0 0 0 0 0-35 -
전문학술지논문게재성과정보 과제번호 2008-00 60893 게재연월 2009.12 논문제목총저자명출처학술지명 C e l l u l o s i c a l c o h o l i c fermentation using recombi nant Saccharo myces cerevisi iae engineered for the produc tion of Clostst ridium cellulov orans endoglu canasand Sac charomycopsis fibuligera beta -glucosidase Jeon,Eug enehyeon,jeongeu neun,lee SungPark, Byeoung- SooKim,S eungwoo Lee,Jinwo nhan,sun gok SCI F E M S MICROBIO L O G Y LETTERS 권 ( 호 ) 301 (1) 학술지구분 국외 SCI 여부 SCI 등재 IF 02.0 21(jc r200 8) 국제공동연구논문여부 기여도 아니오 40% 2008-00 60893 2011.04 Enhancement of glucose Is omerase activ ity by pretreat ment with sub stratesprior to immobilization Song,Yoo nseokkim,jieunpar k,chulhwa nkim,seu ngwook SCI K O R E A N JOURNAL OF CHEMICAL ENGINEER ING 28 (4) 국외 SCI 등재 0.74 8(jcr 2 0 1 0) 아니오 100% 2008-00 60893 2011.06 The processive endogluca nase EngZ is SangDuck active in cryst Jeon;Kyun alline cellulose gokyu;se e degradation ungwook as a celluloso Kim;Sung mal subunit of OkHan C l o s t r i d i u m cellulovorans 직접입력 E N Z Y M E A N D MICROBIA L TECHNOL OGY 0(0) 국외 SCI 등재 2.28 7(jcr 2 0 1 0) 아니오 100% 2008-00 60893 2009.10 Production of c e l l u l o s i c Jeon,Eug ethanol in Sa enehyeon ccharomyces,jeong-e cerevisia unsuh,do e eterologous ngjinsuh, e x p r e s s i n g Young-W C l o s t r i d i u m oongkim, thermocellum SeoungW endoglucanase ooksong, and Saccha KwangHo r o m y c o p s i s Han,Sung f i b u l i g e r a Ok beta-glucosida se genes SCI MOLECUL ES AND CELLS 28(4 ) 국내 SCI 등재 02.0 23(jc r200 8) 아니오 40% - 36 -
과제번호 2008-00 60893 2008-00 60893 2008-00 60893 게재연월 2010.08 2011. 06 2011.08 전문학술지논문게재성과정보 논문제목총저자명출처학술지명 Phanerochaete chrysosporium 김은지 ; 강변이주에서의성우 ; 송광 C e l l o b i o s e 호 ; 한성옥 ; Dehydrogenas 김재진 ; 김 e (CDH) 와 β 승욱 -glucosidase 활성향상 Enhancement of immobilized enzyme activity by pretreatment of β-glucosid ase with cellobiose and glucose E n h a n c e d Production of C e l l o b i o s e Dehydrogenas e and β -Glucosidase by Phanerochaete chrysosporium YouReeJu ng;hyuny ongshin,y oonseoks ong;sung BongKim; SeungWo okkim* EunjiKim; SeongWo okan;kwa nghoson g;sungok Han;Jae- JinKim;Se ungwook Kim 권 ( 호 ) 직접입력화학공학 00(0 0) 직접입력 직접입력 JOURNAL OF INDUSTRI AL AND ENGINEER - ING CHEMISTR Y The K o r e a n Journal of Chemical Engineerin g 학술지구분 국내 0(0) 국내 0(0) 국내 SCI 여부 SCI 미등재 SCI 등재 SCI 등재 IF 2.14 9(jcr 2 0 1 0) 국제공동연구논문여부 기여도 아니오 100% 아니오 100% 아니오 100% 2008-00 60893 2011.11 E f f i c i e n t Immobilization Technique for Enhancement of Cellobiose Dehydrogenas e Activity on Silica Gel EunjiKim; YoonSeok Song;You ReeJung; SeongWo okang;ha nsukchoi; KwangHo Song;Sun gokhan; SeungWo ok Kim 직접입력 BIOTECHN O L O G Y A N D BIOPROC E S S ENGINEER ING 0(0) 국내 SCI 등재 1.00 4(jcr 2 0 1 0) 아니오 100% - 37 -
과제번호게재연월논문제목총저자명출처 2008-00608 93 2008-00608 93 2011.11 2011.12 Production of cellulases and high-levels of β-glucosidase in Trichoderma reesei mutated by proton b e a m irradiation Production of Cephalosporin C Using Crude Glycerol in F e d - B a t c h Culture of A c r e m o n i u m chrysogenum M35 전문학술지논문게재성과정보 HyunYong Shin,Hah YoungYoo,Youngso onum HyunYong Shin;JinY ounglee; HanSukC hoi;jahyu nlee;seu ngwookki m 직접입력 직접입력 학술지명권 ( 호 ) K O R E A N J O U R N A L OF CHEMICAL ENGINEERI NG The Journal o f Microbiology 0(0) 49(6) 학술지구분 국내 국내 SCI 여부 SCI등재 IF 0.7 48( jcr2 0 1 0) 국제공동연구논문여부 기여도 아니오 100% SCI 등재아니오 50% - 38 -
학술대회논문발표성과정보 과제번호발표년월학술대회명저자논문제목학술대회구분개최국 2008-0060 893 2008-0060 893 2008-0060 893 2008-0060 893 2008-0060 893 2008-0060 893 200905 MSK's 50th Anniversary I n t e r n a t i o n a l Symposium on Microbiology 2009 200904 한국화학공학회 200906 한국미생물생명공학회 200910 한국화학공학회 201004 한국화학공학회 201005 한국공업회학회 E u g e n e J e o n *, J eong-eun Hyeon and S u n g - o k Han 진선철, 김신영, 송광호 *, 김승욱, 한성옥 Eunji KIM, Seong Woo KANG, Hyun Yong SHIN, Jin Young L EE,Seung Wook KIM 진선철, 김신영, 엄기원, 송광호, 김승욱, 한성옥엄기원, 서태영, 이희준, 송광호, 김승욱, 한성옥엄기원, 서태영, 이희준, 송광호, 김승욱, 한성옥 E t h a n o l Production from cellulosic biomass by recombinant yeast expressing b a c t e r i a l e n d o g l u c a n a s e and fungal b-glucosidase 균주의고정화를이용한바이오에탄올제조반응연구 Production of C e l l o b i o s e Dehydrogenase (CDH) by White-Rot Fungi 바이오에탄올생산을위한소형연속반응기설계 당밀을원료로적용한바이오에탄올제조연구 당밀을이용한연속반응기에서의바이오에탄올제조연구 국제학술대회 국내학술대회 국내학술대회 국내학술대회 국내학술대회 국내학술대회 대한민국 대한민국 대한민국 대한민국 대한민국 대한민국 - 39 -
지식재산권성과정보 과제번호 출원등록연월 재산권구분 출원등록구분 발명제목 출원등록인 출원등록국 발명자명 출원등록번호 활용형태 기여도 2008-00608 93 2009.06. 05 특허 출원 바이오에탄올생산능이향상된재조합벡터및그형질전환체 대한민국 한성옥, 전유진, 현정은 10-2009-00 49985 100 % 2008-00608 93 2009.09. 10 특허 출원 글리세롤을이용한세팔로스포린 C의제조방법 기관 대한민국 김승욱, 신현용, 이진영. 김은지 10-2009-00 85411 미활용 50% 2008-00608 93 2010.07. 05 특허 출원 셀로비오스디하이드로게나제를담체에고정화시키기전에전처리하는방법 기관 대한민국 김승욱, 송광호, 한성옥, 송윤석, 김은지 10-2010-00 64542 유상이전 100 % 2008-00608 93 2011.01. 13 특허 출원 바이오에탄올생산향상용 TAT A 결합단백질 SPT3 와 15 가유전자삽입된형질전환체및그균주를이용한에탄올생성방법 기관 대한민국 한성옥, 유경옥, 김승욱 10-2011-00 03476 미활용 100 % 2008-00608 93 2011.07. 08 특허 출원 발효장치및이를이용한발효방법 기관 대한민국 송광호, 엄기원, 서태영, 김승욱, 한성옥 10-2011-00 68060 미활용 100 % 10. 기타사항 기타필요한사항을기술 - 40 -
[ 별첨 1] 연구업적제목 대표연구성과 대표연구성과요약문 Production of Cellulosic ethanol in Saccharomyces cerevisiae heterologous expressing clostridium thermocellum endoglucanase and Saccharomycopsis fubuligera beta-glucosidase genes 연구업적유형학술지게재논문 ( ) 특허 ( ) 저서 ( ) 역서 ( ) 기타 ( ) 주관연구책임자또는한성옥, 김승욱, 송광호참여자수 7명공동연구원성명 Heterologous secretory expression of endoglucanase E (Clostridium thermocellum) and β-glucosidase 1 (Saccharomycopsis fibuligera) was achieved in Saccharomyces cerevisiae fermentation cultures as an α-mating factor signal peptide fusion, based on the native enzyme coding sequence. Ethanol production depends on simultaneous saccharification of cellulose to glucose and fermentation of glucose to ethanol by a recombinant yeast strain as a microbial biocatalyst. Recombinant yeast strain expressing endoglucanase and β-glucosidase was able to produce ethanol from β-glucan, CMC and acid swollen cellulose. This indicates that the resultant yeast strain of this study acts efficiently as a whole cell biocatalyst. 연구업적제목 대표연구성과요약문 Enhanced Production of Cellobiose Dehydrogenase and β-glucosidase by Phanerochaete chrysosporium 연구업적유형학술지게재논문 (O) 특허 ( ) 저서 ( ) 역서 ( ) 기타 ( ) 주관연구책임자또는공동연구원성명 김승욱, 송광호, 한성옥참여자수 7 The production of cellobiose dehydrogenase (CDH) and β glucosidase by Phanerochaete chrysosporium ATCC 32629 was assessed during submerged fermentation. The maximum concentrations of CDH and β glucosidase were obtained using rice straw as the carbon source. Organic nitrogen sources were shown to be more effective in enzyme production than inorganic nitrogen sources. Corn steep liquor (CSL) for CDH production and soy bean meal (SBM) for β -glucosidase production were the most appropriate organic nitrogen sources. Using optimum medium obtained by response surface methodology (RSM), the maximum concentrations of CDH and β glucosidase achieved in the stirred-tank reactor (STR) were 204 U/L and 140 U/L, respectively. CDH productivity (22.7 U/L day) was the highest at 9 days. - 41 -
대표연구성과요약문 연구업적제목 The processive endoglucanase EngZ is active in crystalline cellulose degradation as a cellulosomal subunit of Clostridium cellulovorans 연구업적유형학술지게재논문 ( ) 특허 ( ) 저서 ( ) 역서 ( ) 기타 ( ) 주관연구책임자또는한성옥, 김승욱, 송광호참여자수 5명공동연구원성명 Clostridium cellulovorans produces an efficient enzyme complex for the degradation of lignocellulosic biomass. In our previous study, we detected and identified protein spots that interacted with a fluorescently labeled cohesin biomarker via two-dimensional gel electrophoresis. One novel, putative cellulosomal protein (referred to as endoglucanase Z) contains a catalytic module from the glycosyl hydrolase family (GH9) and demonstrated higher levels of expression than other cellulosomal cellulases in Avicel-containing cultures. Purified EngZ had optimal activity at ph 7.0, 40 C, and the major hydrolysis product from the cellooligosaccharides was cellobiose. EngZ's specific activity toward crystalline cellulose (Avicel and acid-swollen cellulose) was 10-20-fold higher than other cellulosomal cellulase activities. A large percentage of the reducing ends that were produced by this enzyme from acid-swollen cellulose were released as soluble sugar. EngZ has the capability of reducing the viscosity of Avicel at an intermediate-level between exo- and endo-typing cellulases, suggesting that it is a processive endoglucanase. In conclusion, EngZ was highly expressed in cellulolytic systems and demonstrated processive endoglucanase activity, suggesting that it plays a major role in the hydrolysis of crystalline cellulose and acts as a cellulosomal enzyme in C. cellulovorans. - 42 -
양식 1. 과제현황 자체평가의견서 과제번호 2008-0060893 사업구분 기초연구사업 연구분야생명공학단위 ( ) 과제구분사업명중견연구자지원사업 ( 핵심연구 ) 주관 총괄과제 기재하지않음 총괄책임자 기재하지않음 과제명 고활성당화효소생산에탄올발효균주개발과다양한 ( 기초, 응용, 배양시스템의공정최적화를통한고효율수송용바이오과제유형개발 ) 에탄올생산공정에관한연구 연구기관 고려대학교산학협력단 연구책임자 김승욱 연차 기간 (yyyy.mm ~ yyyy.mm) 정부 민간 계 1차년도 2008. 08-2009. 08 0 연구기간연구비 ( 천원 ) 2 차년도 2009. 09-2011. 08 0 3 차년도 2010. 09-2011. 08 0 4 차년도 5차년도계 ( 총연구기간 ) 참여기업상대국 2. 평가일 : 2011.8.26 상대국연구기관 0 0 3. 평가자 ( 연구책임자 ) 소속직위성명 화공생명공학과교수김승욱 4. 평가자 ( 연구책임자 ) 확인본인은평가대상과제에대한연구결과에대하여객관적으로기술하였으며, 공정하게평가하였음을확약하며, 본자료가전문가및전문기관평가시에기초자료로활용되기를바랍니다. 확약 - 43 -
Ⅰ. 연구개발실적 다음각평가항목에따라자체평가한등급및실적을간략하게기술 (200 자이내 ) 1. 연구개발결과의우수성및창의성 등급 : 아주우수본연구개발에이용되는 Cellulosome 시스템의경우혐기성미생물만이생산하는효소복합체로당화효소개발에산업적으로이용되기에매우우수하다. Cellulosome 시스템을응용하여 Minicellulosome 형성유전자를설계하고, 이유전자의효모에서의이종발현을유도하여섬유소를직접이용하여바이오에탄올을생산하는연구는새로운개념의바이오프로세스 (Consolidated Bioprocess) 의개발을가능하게한다. 본연구개발에이용되는 Cellulosome 시스템의경우혐기성미생물만이생산하는효소복합체로당화효소개발에산업적으로이용되기에매우우수하다. Cellulosome 시스템을응용하여 Minicellulosome 형성유전자를설계하고, 이유전자의효모에서의이종발현을유도하여섬유소를직접이용하여바이오에탄올을생산하는연구는새로운개념의바이오프로세스 (Consolidated Bioprocess) 의개발을가능하게한다. 2. 연구개발결과의파급효과 등급 : 아주우수본연구개발결과 Dockerin 과 Cohesin 모듈사이의상호작용을이용하여당화효소복합체를형성할수있는기초적인원리를밝혀효소복합체에관한새로운접근을가능하게하였으며, 기존효모균주의당화능을부여하여슈퍼균주의개발에기여하였고, 당화효소복합체의세포포면고정화연구를통하여당화효율의증가는물론, 고정화를통한효소의 Purification 공정에가능성을제시해준다. 본연구에서개발된복합반응기는연속식에탄올생산공정의가능성을보여주었으며다양한종류의 cell 및 enzyme 을고정화하여유기산, 아미노산, 항생물질등다양한제품생산에있어서도활용가능성을보여주었다. 이에본연구가미치게될파급효과는우수하다고평가한다 - 44 -
3. 연구개발결과에대한활용가능성 등급 : 아주우수본연구개발에서얻게되는섬유소당화효소복합체형성원리를이용하여시스템생물학을바탕으로하는물질대사의설계및발효공정의설계가가능해지며, 당화효소복합체에세포표면고정화를통하여발효후의효소의재활용을통해생산성을향상시키는것이가능할뿐만아니라, 발효공정에서미생물의저비용영양소를이용한발효공정기술을구축하는데기여할수있다. 본연구에서개발된복합반응기는 cell 을채널위에고정화시킨최초의연속식에탄올공정으로, 향후다양한 cell 의고정화를통한고부가가치제품을생산할수있는반응기로활용가능할뿐아니라다양한연구에 tool 로서사용가능하므로그활용가능성이아주우수하다고평가한다 4. 연구개발수행노력의성실도 등급 : 아주우수본연구의수행에성실하게임하여 Clostidium 계열의혐기성미생물균주의유용한유전자원을탐색하고이를효모에서발현하기위해노력하였으며, 단백질간의상호작용의원리를이용하여복합체를형성하였고, 그원리를연구하여조금더활용성이높은세포표면고정화연구를가능하게하는등고효율적이며실용적인바이오프로세스연구를위해최선을다했다. 연구개발목표를모두달성하였으며연차별연구개선안을토대로이를모두달성하였다. 최종적으로완성된 cell 고정연속식에탄올발효장치및분리장치를개발하였기에연구개발수행능력이아주우수하다고평가한다. - 45 -
5. 공개발표된연구개발성과 ( 논문, 지식재산권, 발표회개최등 ) 등급 : 아주우수현재 New Biotechnology 저널에 The processive endoglucanase EngZ is active in crystalline cellulose degradation as a cellulosomal subunit of Clostridium cellulovorans 이라는제목으로발표되었다. 또한 Process Biochemistry 저널에 Production of Functional Agarolytic Nano-Complex for the Synergistic Hydrolysis of Marine Biomass and Its Potential Application in Carbohydrate Binding Module-Utilizing One-step Purification 이라는제목으로 Submssion 되어있다. 특허로는바이오에탄올생산향상용 TATA 결합단백질 SPT3와 15가유전자삽입된형질전환체및그균주를이용한에탄올생성방법이라는명칭으로국내출원되어있다. 뛰어난연구성과에도불구하고논문및특허목표달성에미치지못하여공개발표된연구개발성과는보통이라고평가한다. 현재논문을작성중에있으므로연말까지는당초목표를달성할수있을것으로판단된다 Ⅱ. 연구목표달성도 세부연구목표 ( 연구계획서상의목표 ) 비중 (%) 달성도 (%) CDH 유전자클로닝 30 30 P. stipitis 형질전환체로부터 CDH 유전자발현 형질전환체로부터발현된 CDH 의활성도 30 30 40 35 자체평가 P. chrysporium 의 CDH 유전자를 RT-PCR 을이용하여클로닝함 클로닝된 CDH 유전자를 ppicz-α 에삽입후 P. stipitis 형질전환체유도 형질전환된 P. stipitis 균주로부터 CDH 활성도를갖는효소를생산함. 합계 100 95-46 -
세부연구목표 ( 연구계획서상의목표 ) 섬유소분해효소의세포표면고정화를위한 Subunit 의유전자설계 세포표면고정화소단위체발현및복합체형성을위한 Assembly 연구 실제바이오매스이용가능성의확인을위한전처리바이오매스확보 전처리된바이오매스의 Consolidated Bioprocess 를통한에탄올의생산 비중 (%) 달성도 (%) 20 20 30 30 20 15 30 30 자체평가 Anchoring Protein인 miniolpb-aga1, Scaffolding Protein으로 minicbpa-docii, Cellulosomal Enzyme을만들기위하여각당화효소에 Dockerin I Domain을연결하여 Scaffolding Protein에결합시킴설계한세포표면고정유전자들의발현및발현된단백질들의복합체형성을파악하고실제당화효율을분석함여러전처리방법을이용하여최적조건으로전처리가된바이오매스들을확보하고이들의성분분석을통해이용가능한바이오매스선별전처리된바비오매스중보리짚을대상으로하여섬유소분해효소를발현하는재조합균주를이용하여바이오에탄올을생산하였음 합계 100 95 세부연구목표 ( 연구계획서상의목표 ) 비중 (%) 달성도 (%) 자체평가 복합반응기설계및제작 40 40 CFD를이용하여반응기를설계한후서로다른재질의 plate를사용및제작하여 CO2 제거와발효가동시에이루어지게함 실험결과를토대로복합반응기개선 에탄올생산공정에서최적조건연구 합계 100 만점 100 30 30 기액분리및 leak 등여러문제점을확인하고반응기재질및 structure 변경하여반응기를개선함 30 30 다양한변수변화를통해반응기 내최적의에탄올생산조건을 확인하고도출함 - 47 -
Ⅲ. 종합의견 1. 연구개발결과에대한종합의견 높은활성을가진 CDH의유전자를확보함으로써목질계바이오매스의전처리방법으로서고농도의 CDH효소를이용하여전처리및당화효율을증가시킴으로써목질계를이용한바이오에탄올생산의상업적연구가탄력을받을수있을것으로생각되며, 또한, 현재바이오매스전처리에사용되는화학적처리방법과병행하여효소를이용한친환경적바이오매스전처리방법을개발할수있을것으로예상된다. 이번연구결과의목표인셀룰로좀생산변형체효모의리그노셀룰로오스바이오매스당화시탄소성분과셀룰로좀소단위체효소조합의시너지분석 cellulase 활성및에탄올발효조건의최적화를달성하기위한연구가성실하게진행되어, 셀룰로좀의세포표면고정화를통해최적화실험을진행하였으며, 실제적인바이오매스들을확보하고이를이용하여에탄올을생산하는연구까지진행되어있으며, 이연구를통해신규고효율바이오프로세를가능하게한다는점이높이평가되며섬유소분해효소복합체에대한다양한연구가가능할것이라고예상된다. 본연구에서는 cell 을마이크로채널에고정화시켜에탄올발효에성공한최초의장치를개발하였으며, 에탄올의연속식분리장치또한개발하였다. 이에따른새로운에탄올발효공법을제시하였기에연구개발성과가매우우수하다고평가한다. 2. 평가시고려할사항또는요구사항 CDH 유전자클로닝과발현의의미뿐만아니라, 바이오매스전처리부터바이오에탄올생산에이르는전체적인생물공정및생물공정에서의효소의재사용을위해효소고정화기술등을활용한복합연구로서향후생물공정을이용한바이오에탄올생산연구에응용할수있을것으로기대할수있다. 일반적으로단순히당화효소의단일발현에그치는것이아니라혐기성미생물의바이오매스당화원리를분석하고그원리인단백질간의상호작용을이용하여당화효소복합체를형성하였을뿐만아니라혐기성미생물의셀룰로좀이세포표면에고정화되는원리를파악하고이를응용하여효모의세포표면에부착시켜당화효율증대및효소의재활용에대한가능성을연것은높이평가될부분이며, 실제적인바이오매스를이용하여재조합균주로부터에탄올을생산한결과는다른바이오매스의이용및다양한바이오화학물질의생산분야의연구에도응용할수있을만큼유용하며, 고효율의바이오프로세스에관한연구로확장될수있다는점을고려해볼수있다. 또한, 개발된복합반응기는향후 saccharification, 공정집적화등의연구개발을통해연속적인에탄올생산및분리뿐만아니라전처리과정까지포함한하나의완성된장치로서의발전가능성이높다. - 48 -
3. 연구결과의활용방안및향후조치에대한의견 P. stipitis 형질전환체로부터생산되는 CDH를이용하여, 비식용작물의생물학적전처리를통해서생성되는 5탄당, 6탄당을이용한바이오에탄올생산이가능할것이다. 본연구에이용된단백질간의상호작용을이용한복합체의생성및세포표면에의고정화연구결과는섬유소분해에만제한되지않고, 해양바이오매스및폐기물의이용에도활용될수있으며, 이러한값싼기질을이용하여에탄올의생산뿐만이아니라, 탄소계연료, 바이오플라스틱등다양한바이오화학물질의생산연구와연계되어다양하게활용될수있을것으로보인다. 이를위한물질대사공학개념의슈퍼균주의개발조치를통하여바이오융합바이오리파이너리연구가가능할것이다. 본연구에서개발된복합반응기는다양한 cell 의부착이용이하며상부채널을통해생성된불순물인기체의연속적인제거가가능하다. 이에유기산, 아미노산, 항생물질등고부가가치제품생산에있어서활용가능성이매우높다고평가한다 Ⅳ. 보안성검토 o 연구책임자의보안성검토의견, 연구기관자체의보안성검토결과를기재함 보안성이필요하다고판단되는경우작성함. 1. 연구책임자의의견 2. 연구기관자체의검토결과 - 49 -
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