(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 39/395 (2006.01) A61K 47/06 (2006.01) A61K 47/18 (2006.01) (21) 출원번호 10-2005-7018843 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2004 년 03 월 29 일 심사청구일자 2009 년 03 월 27 일 (85) 번역문제출일자 2005 년 10 월 04 일 (65) 공개번호 10-2006-0017583 (43) 공개일자 2006 년 02 월 24 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2004/009613 (87) 국제공개번호 WO 2004/091658 국제공개일자 (30) 우선권주장 2004 년 10 월 28 일 60/460659 2003 년 04 월 04 일미국 (US) (56) 선행기술조사문헌 WO2002030463 A2* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2012년10월29일 (11) 등록번호 10-1195295 (24) 등록일자 2012년10월22일 (73) 특허권자 노파르티스아게 스위스체하 -4056 바젤리히트스트라쎄 35 제넨테크, 인크. 미합중국캘리포니아 ( 우편번호 94080-4990) 사우쓰샌프란시스코디엔에이웨이 1 (72) 발명자 리우, 준 미국 94044 캘리포니아주파시피카글래시어애비뉴 1108 셔, 스티븐 미국 94062 캘리포니아주에메랄드힐스실반웨이 210 (74) 대리인 김영, 장수길 전체청구항수 : 총 26 항심사관 : 김정태 (54) 발명의명칭고농도항체및단백질제형 (57) 요약 본발명은안정하고비교적등장성이며저탁도인, 감소된점도를갖는고농도의항체및단백질제형에관한것이다. 상기제형은피하투여에특히적합하다. 본발명은추가로제형화된항체또는단백질로치료가능한장애를치료하기위한상기제형을함유하는제품및그의사용방법을기술한다. 상기제형은아르기닌 -HCl, 히스티딘및폴리소르베이트를포함한다. 대표도 - 도 6-1 -
특허청구의범위청구항 1 삭제청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 삭제청구항 8 삭제청구항 9 삭제청구항 10 삭제청구항 11 삭제청구항 12 삭제청구항 13 삭제청구항 14 삭제청구항 15 삭제청구항 16-2 -
삭제청구항 17 삭제청구항 18 삭제청구항 19 삭제청구항 20 (a) 서열 4의중쇄아미노산서열및서열 1의경쇄아미노산서열을포함하는, 150 mg/ml 양의항-IgE 항체, (b) 200 mm 양의아르기닌-HCl, (c) 20 mm 양의히스티딘, 및 (d) 0.01 내지 0.1% 양의폴리소르베이트를포함하고, ph가 6.0인, 저탁도의안정한액체제형. 청구항 21 삭제청구항 22 제20항의제형이동봉된용기를포함하는제품. 청구항 23 제22항에있어서, 용기가주사기인제품. 청구항 24 제23항에있어서, 주사기가추가로주입장치내에포함된것인제품. 청구항 25 제24항에있어서, 주입장치가자동-주입기인제품. 청구항 26 삭제청구항 27 삭제청구항 28 제20항에있어서, IgE-매개장애의치료에사용되는것인제형. 청구항 29 제28항에있어서, IgE-매개장애가알레르기성비염, 천식, 알레르기성천식, 비-알레르기성천식, 아토피성피부염및위장관병증으로이루어진군으로부터선택된것인제형. 청구항 30 제28항에있어서, IgE-매개장애가알레르기성비염인제형. 청구항 31 제28항에있어서, IgE-매개장애가알레르기성천식인제형. - 3 -
청구항 32 제28항에있어서, IgE-매개장애가천식인제형. 청구항 33 제28항에있어서, IgE-매개장애가아토피성피부염인제형. 청구항 34 제28항에있어서, IgE-매개장애가과민증, 알레르기성기관지-폐아스페길루스증, 기생충성질환, 간질성방광염, 과-IgE 증후군, 모세혈관확장성운동실조증, 위스코트-알드리치증후군 (Wiskott-Aldrich syndrome), 흉선성림프형성부전증, IgE 골수종및이식편-대-숙주반응으로이루어진군으로부터선택된것인제형. 청구항 35 제28항에있어서, IgE-매개장애가과민증인제형. 청구항 36 제35항에있어서, 과민증장애가아나필락시스, 담마진및식품알레르기로이루어진군으로부터선택된것인제형. 청구항 37 제36항에있어서, 과민증장애가식품알레르기인제형. 청구항 38 제37항에있어서, 식품알레르기가콩과식물에의노출에기인한것인제형. 청구항 39 제38항에있어서, 콩과식물이땅콩인제형. 청구항 40 제20항에있어서, IgE-매개장애의치료에있어서항히스타민제와병행하여사용되는것인제형. 청구항 41 제20항에있어서, 항히스타민제투여와병행하여 IgE-매개장애의치료에사용되는것인제형. 청구항 42 제20항에있어서, IgE-매개장애의치료에있어서기관지확장제와병행하여사용되는것인제형. 청구항 43 제20항에있어서, 기관지확장제투여와병행하여 IgE-매개장애의치료에사용되는것인제형. 청구항 44 제20항에있어서, IgE-매개장애의치료에있어서당질코르티코이드와병행하여사용되는것인제형. 청구항 45 제20항에있어서, 당질코르티코이드투여와병행하여 IgE-매개장애의치료에사용되는것인제형. 청구항 46 삭제 - 4 -
청구항 47 삭제청구항 48 제20항에있어서, 알레르겐탈감작제투여와병행하여 IgE-매개장애의치료에사용되는것인제형. 청구항 49 제20항에있어서, IgE-매개장애의치료에있어서 NSAID(non-steroidal anti-inflammatory drug) 와병행하여사용되는것인제형. 청구항 50 제20항에있어서, NSAID 투여와병행하여 IgE-매개장애의치료에사용되는것인제형. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은특히피하투여에적합한고도로농축된항체제형에관한것이다. 본발명은또한, 안정하고고도 로농축된 ( 예를들어, 100 mg/ml 단백질 ) 액체제형을제공한다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] 배경기술고도로농축된액체항체제형이상당히요구되고있다. 그러나, 고도로농축된단백질제형은여러가지문제점이있다. 하나의문제점은입자의형성으로인한불안정성이다. 액체제형을만들기위해재구성된동결건조제제에있어서는계면활성제 ( 예를들어, 폴리소르베이트 ) 를사용함으로써이러한문제점을해결했지만, 계면활성제는추가의공정들을어렵게만들기때문에액체제형에는부적합하다. 나아가, 계면활성제는또한항체의거대분자적성질로부터기인하는수많은분자간상호작용으로인한점도증가를감소시키지않는다. 계면활성제는단백질의입자형성정도를현저히감소시키는것으로나타났지만, 농축항체제형의조작및투여를어렵게만드는점도증가의문제점을해결하지는못한다. 항체는거대분자적성질및분자간상호작용에대한가능성때문에고농도에서는점성용액을형성하는경향이있다. 또한, 흔히제약학상허용되는당이안정화제로서다량사용된다. 이러한당은분자간상호작용을증강시켜제형의점도를증가시킬수있다. 고점도의제형은제조하고, 주사기로주입하며피하로주사하기에어려움이있다. 점성제형을다루는데힘을주면거품이과도하게생기는데, 이는활성생물질의변성및불활성화를야기할수있다. 이러한문제점에대한만족스러운해결책은현재없다. 선행기술들은제약제형을생산하는데적절하게사용될수있는부형제를다수예시하고있지만, 100 mg/ml를초과하여성공적으로제형화된단백질, 또는그렇게하기위한기술로서개시된것은극히소수였다. 본출원자들은아르기닌, 구체적으로아르기닌-HCl이고도로농축된액체단백질또는항체제형에특히적합하다는사실을발견했다. 안정한등장성동결건조단백질제형은 1997년 2월 13일에공개된 PCT 공개 WO 97/04801에개시되어있고, 그전체개시내용은명백히본원에서참조한다. 개시된동결건조제형은안정성의명백한소실없이재구성하여고농도의단백질액체제형을생성할수있다. 그러나, 재구성된제형의높은점도와관련된잠재적인문제점들은해결되지않았다. 단백질응집은당을첨가함으로써미리감소시켰지만, 그렇게함으로써점도및몰삼투압농도가현저하게증가되어처리하고사용하기에비실용적이될수있다. 본출원자들은 2002년 4월 18일에공개된 PCT 출원, 공개 W002/30463에서 1) 낮은 ph ( 약 4.0 내지 5.3) 로써, 2) 높은 ph ( 약 6.5 내지 12.0) 로써, 또는 3) 염또는완충액을첨가하여제형의총이온세기를증가시킴으로써단백질농도는높지만점도는낮은제형을달성하여이를개시했다. 그러나, 이온세기가증가하면 (NaCl에의해서와같이 ) 제형의점도는감소하는반면, 용액의탁도가증가할수도있는데, 이는흔히단백질입자의형성 ( 예를들어, 응집 ) 과관련된다. 따라서, 최적의고농도단백질제형은안정성, 점도, 몰삼투압농도및탁도의난제를극복해야만한다. - 5 -
[0008] 발명의상세한설명 발명의요약 [0009] [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] 본발명은안정하고점도및탁도는낮은고도로농축된단백질또는항체제형에관한것이다. 특히, 본발명은단백질또는항체 (100-260 mg/ml), 히스티딘 (10-100 mm), 아르기닌-HCl (50-200 mm) 및폴리소르베이트 (0.01%-0.1%) 을포함하고, 5.5-7.0의 ph, 50 cs 이하의점도, 및 200 mosm/kg-450 mosm/kg의몰삼투압농도를갖는, 저탁도의고도로농축된항체제형에관한것이다. 다르게는, 제형내의단백질또는항체는 120-260mg/ml, 다르게는 150-260 mg/ml, 다르게는 180-260mg/ml, 다르게는 200-260mg/ml의단백질또는항체의범위일수있다. 대안으로서, 몰삼투압농도는 250 mosm/kg-350 mosm/kg의범위이다. 대안으로서, 아르기닌-HCl의농도는 100-200 mm, 다르게는 150-200 mm, 다르게는 180-200 mm의범위이다. 다르게는, 본발명은항체 (40-150 mg/ml), 히스티딘 (10-100 mm), 당 ( 예를들어, 트레할로스또는수크로스, 20-350 mm) 및폴리소르베이트 (0.01%-0.1%) 을포함하는고도로농축된저탁도항체제형에관한것이다. 특정실시태양에서, 본발명은분자량이큰단백질, 예를들어항체또는면역글로불린을고농도로함유하는제형을제공한다. 항체는예를들어, 특정소정의항원에대한항체일수있다. 특정면에서, 항원은 IgE이다 ( 예를들어, 미국특허 6,329,509 및 WO 99/01556에기술된 rhumabe-25 및 rhumabe-26). 다르게는, 항-IgE 항체는콘 (Corne) 등의문헌 [J. Clin. Invest. 99(5):879-887(1997)], W092/17207에기술된 CGP-5101 (Hu- 901), 및 ATTC 기탁번호 BRL-10706 및 11130, 11131, 11132, 11133일수있다. 다르게는, 항원은 CD 단백질 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 및 CD40; HER 수용체패밀리의구성원, 예를들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체 ; 2C4, 4D5, PSCA, LDP-2, 세포부착분자, 예를들어 LFA-1, Mac1, p150, 95, VLA-4, ICAM- 1, VCAM, 및 α- 및 β-서브유닛을포함하는 αv/β3 인테그린 ( 예를들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는항-CD11b 항체 ); 성장인자, 예를들어 VEGF; 혈액군항원 ; flk2/flt3 수용체 ; 비만 (OB) 수용체 ; mpl 수용체, CTLA-4, 및단백질 C를포함할수있다. 본발명의제형은제약제형일수있다. 특정면에서, 제형은피하로전달된다. 또다른실시태양에서, 본발명은치료적유효량의단백질또는항체를포함하는본원에개시된제형을투여하는것을포함하는, 제형화된단백질또는항체로치료할수있는장애의처치, 예방또는치료방법을제공한다. 상기제형은특히피하투여에유용하다. 특정면에서, 장애는 IgE-매개장애이다. 또한추가의면에서, IgE-매개장애는알레르기성비염, 천식 ( 예를들어, 알레르기성천식및비-알레르기성천식 ), 아토피성피부염, 알레르기성위장관병증, 과민증 ( 예를들어, 아나필락시스, 담마진, 음식알레르기등 ), 알레르기성기관지-폐아스페길루스증, 기생충성질환, 간질성방광염, 과-IgE 증후군, 모세혈관확장성운동실조증, 위스코트-알드리치증후군 (Wiskott-Aldrich syndrome), 흉선성림프형성부전증, IgE 골수종및이식편-대-숙주반응이다. 또다른실시태양에서, 본발명은본원에개시된제형이들어있는용기를포함하는제품을제공한다. 한면에서, 제품은미리채워진 (pre-filled) 주사기이다. 또다른특정면에서, 미리채워진주사제는또한주입장치내에포함되어있다. 또다른특정면에서, 주입장치는자동주입기이다. 도면의간단한설명도 1. 펩신분해된항-IgE 모노클로날항체의소수성상호작용크로마토그래피. 샘플을상이한 ph 및완충액에서제형화했다 : ( ) 20 mm 아세테이트, ( ) 20 mm 숙시네이트, ( ) 20 mm Na 2 HPO 4, ( ) 20 mm K 2 PO 4 및 (*) 20 mm 트리스완충액. 샘플을 30 에서 6 개월동안보관했다. [0018] [0019] 도 2. 40 에서 6개월동안보관한항-IgE 모노클로날항체의크기배제크로마토그래피. 샘플을상이한 ph 및완충액에서제형화했다 : ( ) 20 mm 글루타메이트, ( ) 20 mm 아세테이트, ( ) 20 mm 숙시네이트, ( ) 20 mm 히스티딘, ( ) 20 mm Na 2 HP0 4, ( ) 20 mm K 2 P0 4 및 (*) 20 mm 트리스완충액. 도 3. 30 에서 6개월동안보관한항-IgE 모노클로날항체의활성. 샘플을상이한 ph 및완충액에서제형화했다 : ( ) 20 mm 아세테이트, ( ) 20 mm 숙시네이트, ( ) 20 mm 히스티딘, ( ) 20 mm Na 2 HP0 4, ( ) 20 mm K 2 P0 4 및 (*) 20 mm 트리스완충액. [0020] 도 4. 스트레스조건하의항 -IgE 모노클로날항체의탁도에대한폴리소르베이트 20 의효과. 샘플은 ph 6.0 에 - 6 -
서 100 mg/ml 의항체, 20 mm 의숙시네이트, 192 mm 의트레할로스, 및다양한양의폴리소르베이트 20 을함유한 다. 폴리소르베이트농도는 ( ) 0, ( ) 0.01%, ( ) 0.02% 및 ( ) 0.05% 이다. [0021] 도 5. ~150 mg/ml 에서상이한부형제 ( ) CaCl 2, ( ) MgCl 2 및 ( ) 아르기닌 -HCl 을갖는항 -IgE 모노클로날 항체의탁도. [0022] [0023] [0024] 도 6. ~150 mg/ml에서여러가지의부형제를갖는항-ige 모노클로날항체의탁도. 샘플을 ( ) -70, ( ) 2-8, ( ) 15, ( ) 30 및 ( ) 40 에서보관했다. 도 7. 파파인분해된항-IgE 모노클로날항체의소수성상호작용크로마토그래피분석. 샘플을 ~150 mg/ml에서다양한부형제와제형화하고 ( ) -70, ( ) 2-8, ( ) 15, ( ) 30 및 ( ) 40 에서보관했다. 도 8. ( ) 200 mm의아르기닌-hcl, 23 mm의히스티딘, ph 6.0, ( ) 182 mm의아르기닌-hcl, 20 mm의히스티딘, ph 6.0, ( ) 182 mm의아르기닌-hcl, 20 mm의히스티딘, 91 mm의수크로스, ph 6.0, ( ) 50 mm의 MgCl 2, 27 mg/ml 의트레할로스, 0.01% 아세테이트, ( ) 50 mm 의 MgCl 2, 30 mm 의 MgAc 2, 0.01% 아세테이트, 및 ( ) 50 mm 의 MgCl 2, 45 mm 의 MgAc 2, 0.01% 아세테이트중의 ~150 mg/ml 항 -IgE 모노클로날항체의크기배제크로마토 그래피. 샘플을 30 에서 6 개월동안보관했다. [0025] 도 9. 파파인분해된항 -IgE 모노클로날항체의소수성상호작용크로마토그래피분석. 나타낸샘플은 ( ) 200 mm 의아르기닌 -HCl, 23 mm 히스티딘, ( ) 182 mm 의아르기닌 -HCl, 20 mm 의히스티딘, ( ) 182 mm 의아르 기닌 -HCl, 20 mm 의히스티딘, 91 mm 의수크로스, ( ) 50 mm 의 MgCl 2, 27 mg/ml 의트레할로스, 0.01% 아세테이 트, ( ) 50 mm 의 MgCl 2, 30 mm 의 MgAc 2, 0.01% 아세테이트, 및 ( ) 50 mm 의 MgCl 2, 45 mm 의 MgAc 2, 0.01% 아 세테이트에서제형화했다. 샘플을 30 에서 6 개월동안보관했다. [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] 도 10. 항-IgE 항체 E25, E26 및 Hu-901의가변및불변쇄모두의전장서열을비교해보여준다. Hu-901의 CDR 영역은밑줄로나타냈다. E25 및 E26에대해, 초티아 (Chothia) 에의해정의된 CDR 영역은굵게나타냈지만, 카밧 (Kabat) 에의해정의된 CDR 영역은괄호로나타냈다. 도 10A는 E25, E26 및 Hu-901의경쇄서열을나타내는반면 ( 서열 1-3), 도 10B는 E25, E26 및 Hu-901의중쇄서열을나타낸다 ( 서열 4-6). 바람직한실시태양의상세한설명 I. 정의 " 단백질 " 은사슬길이가보다높은수준의 3차및 ( 또는 ) 4차구조를생성하기에충분한아미노산서열을의미한다. 따라서, 단백질은상기구조를갖지않는역시아미노산계분자인 " 펩티드 " 와구별된다. 전형적으로, 본원에사용하기위한단백질은약 15-20 kd 이상, 바람직하게는약 20 kd 이상의분자량을가질것이다. 본원의정의에포함되는예시적인단백질은포유동물단백질, 예를들어인간성장호르몬및소성장호르몬을비롯한성장호르몬 ; 성장호르몬방출인자 ; 부갑상선호르몬 ; 갑상선자극호르몬 ; 지단백질 ; α-1-안티트립신 ; 인슐린 A-쇄 ; 인슐린 B-쇄 ; 프로인슐린 ; 여포자극호르몬 ; 칼시토닌 ; 황체호르몬 ; 글루카곤 ; 응고인자, 예를들어인자 VIIIC, 인자 IX, 조직인자, 및폰빌레브란트 (von Willebrands) 인자 ; 항-응고인자, 예를들어단백질 C; 심방성나트륨이뇨인자 ; 폐계면활성제 ; 플라스미노겐활성제, 예를들어유로키나제또는조직형플라스미노겐활성제 (t-pa, 예를들어 Activase, TNKase, Retevase ); 봄바진 ; 트롬빈 ; 종양괴사인자-α 및 -β; 엔케팔리나제 ; RANTES (Regulated on Activation Normally T-cell Expressed and Secreted); 인간대식세포염증성단백질 (MIP-1-α); 혈청알부민, 예를들어인간혈청알부민 ; 뮐러-억제물질 ; 릴랙신 A-쇄 ; 릴랙신 B-쇄 ; 프로릴랙신 ; 마우스고나도트로핀-관련펩티드 ; DNase; 인히빈 ; 액티빈 ; 혈관내피세포성장인자 (VEGF); 호르몬또는성장인자에대한수용체 ; 인테그린 ; 단백질 A 또는 D; 류마티스인자 ; 향신경성인자, 예를들어뼈-유래향신경성인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT- 6), 또는신경성장인자, 예를들어 NGF-β; 혈소판-유래성장인자 (PDGF); 섬유모세포성장인자, 예를들어 afgf 및 bfgf; 표피성장인자 (EGF); 전환성장인자 (TGF), 예를들어 TGF-α, 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β 3, TGF-β4 또는 TGF-β5를비롯한 TGF-β; 인슐린-유사성장인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)- IGF-I ( 뇌 IGF-1); 인슐린-유사성장인자결합단백질 ; CD 단백질, 예를들어 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴 (EPO); 트롬보포이에틴 (TPO); 골유도성인자 ; 면역독소 ; 뼈형태형성단백질 (BMP); 인터페론, 예를들어인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니촉진인자 (CSFs), 예를들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터류킨 (ILs), 예를들어 IL-1 내지 IL-10; 슈퍼옥사이드디스뮤타제 ; T-세포수용체 ; 표면막단백질 ; 붕괴가속 - 7 -
인자 (DAF); 바이러스항원, 예를들어 AIDS 외막의부분 ; 운반단백질 ; 귀환 (homing) 수용체 ; 어드레신 ; 조절 단백질 ; 면역어드헤신 (immunoadhesin); 항체 ; 및상기열거한임의의폴리펩티드의생물학적활성단편또는 변이체를포함한다. [0031] [0032] [0033] 제형화된단백질은바람직하게는본질적으로순수하고, 바람직하게는본질적으로균질하다 ( 즉, 오염성단백질이없음 ). " 본질적으로순수한 " 단백질은조성물의총중량을기초로약 90 중량 % 이상, 바람직하게는약 95 중량 % 이상의단백질을포함하는조성물을의미한다. " 본질적으로균질한 " 단백질은조성물의총중량을기초로약 99 중량 % 이상의단백질을포함하는조성물을의미한다. 특정실시태양에서, 단백질은항체이다. 항체는예를들어, 상기언급한임의의분자에결합할수있다. 본발명에포함되는항체에대한예시적인분자표적은 IgE, CD 단백질 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 및 CD40; HER 수용체패밀리의구성원, 예를들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체 ; 2c4, 4D5, PSCA, LDP-2, 세포부착분자, 예를들어 LFA-1, Mac1, pl50, 95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 및 α- 및 β-서브유닛을포함하는 αv/β3 인테그린 ( 예를들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는항-CD11b 항체 ); 성장인자, 예를들어 VEGF; 혈액군항원 ; flk2/flt3 수용체 ; 비만 (OB) 수용체 ; mpl 수용체, CTLA-4, 및단백질 C를포함한다. 본원에사용된용어 " 항체 " 는모노클로날항체 ( 면역글로불린 Fc 영역을갖는전장항체를포함 ), 폴리에피토프특이성을갖는항체조성물, 다중특이성항체 ( 예를들어, 이중특이성항체, 디아바디및단쇄분자, 및항체단편 ( 예를들어, Fab, F(ab') 2 및 Fv) 을포함한다. 용어 " 면역글로불린 " (Ig) 은본원에서 " 항체 " 와상호교환 적으로사용된다. [0034] 기본적인 4-쇄항체유닛은 2개의동일한경쇄 (L) 및 2개의동일한중쇄 (H) 로구성되는헤테로테트라머의당단백질이다. IgM 항체는 J 쇄라불리는추가의폴리펩티드와함께 5개의기본적인헤테로테트라머유닛으로구성되고 10개의항원결합부위를포함하는반면, IgA 항체는중합화하여 J 쇄와함께다가의집합을형성할수있는 2-5개의기본적인 4-쇄유닛을포함한다. IgG의경우, 4-쇄유닛은일반적으로약 150,000 달톤이다. 각각의 L 쇄는하나의공유디술피드결합에의해 H 쇄에연결되는반면, 2개의 H 쇄는 H 쇄의이소타입에따라하나이상의디술피드결합으로서로연결된다. 또한, 각각의 H 및 L 쇄는규칙적으로이격된쇄내디술피드결합을갖는다. 각각의 H 쇄는 N-말단에가변도메인 (V H ), 및 α 및 γ 쇄각각에대해서는이에후속하는 3 개의불변도메인 (C H ) 을, 그리고 μ 및 ε 이소타입에대해서는 4 개의 C H 도메인을갖는다. 각각의 L 쇄는 N- 말단에가변도메인 (V L ) 을, 그리고다른말단에서는이에후속하는불변도메인을갖는다. V L 은 V H 와 정렬되고, C L 은중쇄의제1 불변도메인 (C H 1) 과정렬된다. 특정아미노산잔기들이경쇄와중쇄가변도메인사이의계면을형성하는것으로생각된다. V H 와 V L 이함께쌍을이루어단일항원-결합부위를형성한다. 상이한클래스의항체의구조및성질에대해서는, 예를들어문헌 [Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6] 을참조한다. [0035] [0036] 임의의척추동물종으로부터유래한 L 쇄는그의불변도메인의아미노산서열을기초로하여, 카파및람다로불리는 2개의명백히상이한타입중의하나로분류될수있다. 면역글로불린은그의중쇄불변도메인 (CH) 의아미노산서열에따라상이한클래스또는이소타입으로분류될수있다. 면역글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지클래스가있고, 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로지칭되는중쇄를갖는다. γ 및 μ 클래스는 CH 서열및기능에있어서의상대적으로미미한차이점을기초로하여인간이발현하는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로더분류된다. 용어 " 가변 " 이란가변도메인의특정분절이서열에있어서항체들간에크게상이하다는사실을나타낸다. V 도메인은항원결합을매개하고, 그의특정항원에대한특정항체의특이성을정의한다. 그러나, 가변성은가변도메인의전체에걸쳐균일하게분포되지는않는다. 대신, V 영역은 " 초가변영역 ", 또는때로는 " 상보성결정영역 " (CDRs) 이라불리는각각약 9-12 아미노산잔기길이의극가변성의짧은영역에의해분리된, 약 15-30 아미노산잔기의프레임워크영역 (FRs) 이라불리는상대적으로불변인스트레치로구성된다. 천연중쇄및경쇄의가변도메인은, 루프연결을형성하며어떤경우에는 β-시트구조의일부를형성하는 3개의초가변영역에의해연결된, 주로 β-시트의입체형태인 4개의 FR을각각포함한다. 각쇄내의초가변영역은 FR에의해서로매우근접하게유지되고, 다른쇄의초가변영역과함께항체의항원결합부위의형성에기여한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) 참조 ). 불변도메인은항체의항원결합시에직접관여 - 8 -
하지않지만, 항체의존적세포독성 (ADCC) 에서항체의참가와같은다양한이펙터기능을보인다. [0037] [0038] [0039] [0040] 본원에사용된용어 " 초가변영역 " (" 상보성결정영역 " 또는 CDR로도알려져있음 ) 이란, 항원-결합부위를형성하고항원특이성의주요결정요소인면역글로불린의 V-영역도메인내에존재하는 ( 통상적으로극도의서열가변성을갖는 3 또는 4개의짧은영역 ) 항체의아미노산잔기를나타낸다. CDR 잔기를동정하는데에는 2가지이상의방법이있다 : (1) 종간 (cross-species) 서열가변성에기초한접근법 ( 즉, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, MS 1991)); 및 (2) 항원- 항체복합체의결정학적연구에기초한접근법 (Chothia, C. et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 그러나, 2가지의잔기동정기술은동일한영역이아닌중첩되는영역을규정하므로, 이들을조합하여하이브리드 CDR을규정할수있다. 본원에서사용된용어 " 모노클로날항체 " 는실질적으로동종인항체들의집단으로부터얻은항체, 즉소량으로존재할수있는가능한자연발생적돌연변이및 ( 또는 ) 번역후변형 ( 예를들어, 이성체화, 아미드화 ) 을제외하고한집단을이루는동일한개별항체를의미한다. 모노클로날항체는단일항원부위에관한것이므로매우특이적이다. 또한, 전형적으로상이한결정군 ( 에피토프 ) 에대한상이한항체를포함하는통상의 ( 폴리클로날 ) 항체제제와달리, 각모노클로날항체는항원상의단일결정군에대한것이다. 모노클로날항체는그특이성이외에도다른면역글로불린에의해오염되지않은하이브리도마배양물로합성할수있다는장점이있다. 수식어 " 모노클로날 " 은실질적으로동종인항체집단으로부터얻어진항체의특성을가리키는것이며, 임의의특별한방법으로항체를제조하는데요구되는것으로해석되어서는안된다. 예를들어, 본발명에따라사용될모노클로날항체는먼저문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495(1975)) 에기재된하이브리도마방법으로제조할수있거나, 또는재조합 DNA 방법 ( 예를들어, 미국특허제4,816,567호참조 ) 으로제조할수있다. " 모노클로날항체 " 는또한예를들어, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)] 에기재된기술을이용하여파지항체라이브러리로부터단리할수있다. 본원에서의모노클로날항체는구체적으로, 목적하는생물학적활성을발휘하는한중쇄및 ( 또는 ) 경쇄의일부분이특정종으로부터유래된항체또는특별한항체클래스또는서브클래스에속하는항체의상응하는서열과동일하거나상동성이있지만, 쇄 ( 들 ) 의나머지는다른종으로부터유래된항체또는다른항체클래스또는서브클래스에속하는항체또는그러한항체의단편의상응하는서열과동일하거나상동성있는 " 키메라 " 항체 ( 면역글로불린 ) 를포함한다 ( 미국특허제4,816,567호 ; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984)). 본원에서관심대상인키메라항체는비-인간영장류 ( 예를들어, 올드월드멍키 (Old World Monkey), 에이프 (Ape) 등 ) 로부터유래된가변도메인항원-결합서열및인간불변영역서열을포함하는 "1차화된 (primitized)" 항체를포함한다. " 온전한 (intact)" 항체는항원-결합부위, 뿐만아니라 CL 및적어도중쇄도메인, C H 1, C H 2 및 C H 3을포함하는 것이다. 불변도메인은천연서열불변도메인 ( 예를들어, 인간천연서열불변도메인 ) 또는그의아미노산 서열변이체일수있다. 바람직하게는, 온전한항체는하나이상의이펙터기능을갖는다. [0041] " 항체단편 " 은온전한항체의일부, 바람직하게는온전한항체의항원결합영역및 ( 또는 ) 가변영역을포함한 다. 항체단편의예로는 Fab, Fab', F(ab') 2 및 Fv 단편 ; 디아바디 ; 선형항체 ( 미국특허제 5,641,870 호, 실 시예 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995) 참조 ); 단쇄항체분자 ; 및항체단편으로부터 형성된다중특이성항체등을포함한다. [0042] 항체를파파인 (Papain) 절단하면 2 개의동일한항원 - 결합단편, 소위 "Fab" 단편, 및나머지 "Fc" 단편이생성 되는데, "Fc" 라는명칭은쉽게결정화되는능력을반영한것이다. Fab 단편은 H 쇄의가변영역도메인 (V H ) 과 함께전체 L 쇄, 및하나의중쇄의제1 불변도메인 (C H 1) 으로구성된다. 각각의 Fab 단편은항원결합에대해 1가인데, 즉단일항원-결합부위를갖는다. 항체를펩신으로처리하면, 상이한항원-결합활성을갖고여전히항원에가교결합할수있는, 2개의디술피드결합으로연결된 Fab 단편에거의상응하는하나의큰 F(ab') 2 단편이생성된다. Fab' 단편은항체힌지 (hinge) 영역으로부터유래한하나이상의시스테인을포함하는 C H 1 도메인의카르복시말단에몇개의잔기가첨가되었다는점에서 Fab 단편과상이하다. 본원에서 Fab'-SH는불변도메인의시스테인잔기 ( 들 ) 이유리티올기를보유하는 Fab' 를지칭한다. F(ab') 2 항체단편은본래그들사이에힌지시스테인이있는 Fab' 단편의쌍으로제조되었다. 항체단편의다른화학적커플링도공지되었다. [0043] Fc 단편은두 H 쇄가디술피드로함께연결된카르복시 - 말단부분을포함한다. 항체의이펙터기능은특정형 - 9 -
태의세포상에서발견되는 Fc 수용체 (FcR) 에의해서도인식되는영역인 Fc 영역의서열에의해결정된다. [0044] [0045] "Fv" 는완전한항원-인식및항원-결합부위를함유하는최소항체단편이다. 이단편은단단하게비공유결합된하나의중쇄- 및하나의경쇄가변영역도메인으로이루어진다이머로구성된다. 이두도메인의폴딩으로부터항원결합을위한아미노산잔기에기여하고항체에항원결합특이성을부여하는 6개의초가변성루프 (H 및 L쇄로부터각각 3개의루프 ) 가형성된다. 그러나, 단일가변도메인 ( 또는항원에특이적인 3개의 CDR만을포함하는 Fv의절반 ) 조차도전체결합부위보다친화도는낮지만항원을인식하여결합하는능력을갖는다. "sfv" 또는 "scfv" 로도약칭되는 " 단쇄 Fv" 는단일폴리펩티드쇄내에서연결된 V H 및 V L 항체도메인을포함하 는항체단편이다. 바람직하게는, scfv 폴리펩티드는 sfv가항원결합에필요한구조를형성하도록하는 V H 및 V L 도메인간의폴리펩티드링커를추가로포함한다. sfv에관해서는문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 및 Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)] 참조. [0046] 용어 " 디아바디 " 는 V 도메인이쇄간에는쌍을이루지만쇄내에서는쌍을이루지않아서 2 가의단편, 즉 2 개의 항원 - 결합부위를갖는단편을형성하도록 V H 와 V L 도메인간에짧은링커 ( 약 5-10 잔기 ) 를갖는 sfv 단편 ( 상 기단락참조 ) 을제작함으로써제조된, 작은항체단편을지칭한다. 이중특이성디아바디는두항체의 V H 및 V L 도메인이상이한폴리펩티드쇄상에존재하는 2개의 " 크로스오버 " sfv 단편의헤테로다이머이다. 디아바디는예를들어, 유럽특허제404,097호, 국제공개제93/11161호및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 에보다상세하게기재되어있다. [0047] [0048] [0049] " 특이적으로결합하는 ", 또는특정폴리펩티드또는특정폴리펩티드상의에피토프에대해 " 특이적인 " 항체는, 임의의다른폴리펩티드또는폴리펩티드에피토프에실질적으로결합하지않고특정폴리펩티드또는특정폴리펩티드상의에피토프에결합하는항체이다. " 고상 (solid phase)" 은본발명의항체가부착될수있는비수성매트릭스를의미한다. 고상의예는본원에서유리 ( 예를들어, 세공조절된유리 ), 다당류 ( 예를들어, 아가로스 ), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐알코올및실리콘으로부분적으로또는전체적으로형성된것들을포함한다. 특정실시태양에서, 내용에따라고상은분석플레이트의웰을포함할수있으며, 다른실시태양에서고상은정제칼럼 ( 예를들어, 친화도크로마토그래피칼럼 ) 이다. 이용어는또한미국특허제4,275,149호에기재된것과같은별개입자의비연속적고상도포함한다. 비-인간 ( 예를들어, 마우스 ) 항체의 " 인간화 " 형태는비-인간면역글로불린으로부터유래된최소서열을함유하는, 대부분이인간서열인키메라면역글로불린, 면역글로불린쇄또는그의단편 ( 예를들어, Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 또는항체의다른항원-결합하위서열 ) 이다. 대부분, 인간화항체는수용자의초가변영역 ( 또 한 CDR) 의잔기를목적하는특이성, 친화도및능력을갖는마우스, 래트또는토끼와같은비-인간종의초가변영역 ( 공여자항체 ) 의잔기로치환시킨인간면역글로불린 ( 수용자항체 ) 이다. 몇몇경우에, 인간면역글로불린의소정 Fv 프레임워크영역 (FR) 잔기는대응하는비-인간잔기로치환된다. 또한, 본발명에서사용된 " 인간화항체 " 는수용자항체에서도또는공여자항체에서도발견되지않는잔기를포함할수있다. 이들변경은항체의성능을보다정밀화시키거나최대화하기위해이루어진다. 인간화항체는면역글로불린불변영역 (Fc) 의적어도일부, 전형적으로인간면역글로불린영역의적어도일부를포함할것이다. 추가의상세한사항은문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)] 을참조. [0050] " 종 - 의존성항체 ", 예를들어포유동물항 - 인간 IgE 항체는제 1 포유동물종의항원에대하여, 제 2 포유동물종 으로부터의항원의상동체에대해서보다강한결합친화도를갖는항체이다. 일반적으로, 종 - 의존성항체는인 간항원에 " 특이적으로결합 " 하지만 ( 즉, 약 1 x 10-7 M 이하, 다르게는약 1 x 10-8 M 이하, 다르게는약 1 x 10-9 M 이하의결합친화도 (Kd) 값을가짐 ), 제2 비-인간포유동물종으로부터의항원의상동체에대한결합친화도는비-인간항원에대한결합친화도보다약 50배이상, 약 500배이상, 또는약 1000배이상약하다. 종- 의존성항체는상기정의된바와같은임의의다양한형태의항체일수있지만, 바람직하게는인간화또는인간항체이다. [0051] 항체 " 이펙터기능 " 은항체의 Fc 영역 ( 천연서열 Fc 영역또는아미노산서열변이체 Fc 영역 ) 에의한생물학 - 10 -
적활성을지칭하고, 항체이소타입에따라다를수있다. 항체이펙터기능은예를들어, C1q 결합및보체 의존성세포독성 ; Fc 수용체결합 ; 항체 - 의존성세포 - 매개세포독성 (ADCC); 식세포작용 (phagocytosis); 세포 표면수용체 ( 예를들어, B 세포수용체 ) 의하향조절 ; 및 B 세포활성화를포함한다. [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] " 항체-의존성세포-매개세포독성 " 또는 ADCC는특정세포독성세포 ( 예를들어, 자연살해 (NK) 세포, 호중구및대식세포 ) 상에존재하는 Fc 수용체 (FcRs) 에결합된분비 Ig가상기세포독성이펙터세포를항원-보유표적세포에특이적으로결합하도록하여, 후속적으로표적세포를세포독소로죽일수있는형태의세포독성을지칭한다. 항체는세포독성세포를 " 무장 (arm)" 시키고상기메커니즘으로표적세포를죽이는데필요하다. ADCC를 1차적으로매개하는세포인 NK 세포는 FcγRIII만을발현하는반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 Fcγ RIII를발현한다. 조혈세포상에서의 Fc 발현은라베취및키넷의문헌의 464 페이지, 표 3에요약되어있다 (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991)). 관심대상인분자의 ADCC 활성을평가하기위해, 미국특허제5,500,362호또는제5,821,337호에기술된것과같은시험관내 ACDD 분석을수행할수있다. 상기분석법에대해유용한이펙터세포는말초혈액단핵세포 (PBMC) 및자연살해 (NK) 세포를포함한다. 별법으로, 또는추가로, 관심대상인분자의 ADCC 활성은생체내에서, 예를들어문헌 [Clynes et al., PNAS USA 95:652-656(1998)] 에개시된것과같은동물모델에서평가할수있다. "Fc 수용체 " 또는 "FcR" 은항체의 Fc 영역에결합하는수용체를나타낸다. 바람직한 FcR은천연서열인간 FcR 이다. 또한, 바람직한 FcR은 IgG 항체 ( 감마수용체 ) 에결합하는것이며, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의수용체 ( 상기수용체의대립유전자 (allelic) 변이체및얼터너티브스플라이싱된 (alternatively spliced) 형태를포함 ) 를포함하고, FcγRII 수용체는주로세포질도메인이상이한유사아미노산서열을갖는 FcγRIIA (" 활성화수용체 ") 및 FcγRIIB (" 억제수용체 ") 를포함한다. 활성화수용체 FcγRIIA는그세포질도메인에면역수용체티로신계활성화모티프 (ITAM) 를포함한다. 억제수용체 FcγRIIB는그의세포질도메인에면역수용체티로신계억제모티프 (ITIM) 를포함한다. (M. Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) 참조 ). FcRs는문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92(1991); Capel et al., ImmunoMethods 4:25-34(1994); de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)] 에서검토하고있다. 앞으로동정될것들을비롯한기타 FcRs는본원의용어 "FcR" 에포함된다. 이용어는또한, 모체의 IgG를태아에게전달하는신생수용체, FcRn을포함한다. Guyer et al., J. Immunol. 117:587(1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994). " 인간이펙터세포 " 는하나이상의 FcRs를발현하고이펙터기능을수행하는백혈구이다. 바람직하게는, 세포는적어도 FcγRIII를발현하고 ADCC 이펙터기능을수행한다. ADCC를매개하는인간백혈구는예를들어, 말초혈액단핵세포 (PBMC), 자연살해 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포및호중구를포함하며, PBMC 및 MNK 세포가바람직하다. 이펙터세포는천연원, 예를들어혈액으로부터단리될수있다. "CDC" 의 " 보체의존성세포독성 " 은보체존재하에서표적세포의용해를지칭한다. 고전적인보체경로의활성화는보체시스템제1 보체 (C1q) 가인지 (cognate) 항원에결합된항체 ( 적절한서브클래스의 ) 에결합함으로써개시된다. 보체활성화를평가하기위해, 예를들어문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996)] 에기술된바와같은 CDC 검정법을수행할수있다. 본원에개시된다양한폴리펩티드및항체를기술함에있어사용된 " 단리된 " 이란, 확인되었고그생산환경의성분들로부터분리및 ( 또는 ) 회수된폴리펩티드또는항체를의미한다. 바람직하게는, 단리된폴리펩티드는그생산환경으로부터유래한모든다른성분과결합되어있지않다. 재조합트랜스펙션된세포로부터야기된것과같은생산환경의오염원성분은, 통상적으로폴리펩티드의진단또는치료적사용을방해할수있는물질이며효소, 호르몬, 및기타단백질성또는비-단백질성용질을포함할수있다. 바람직한실시태양에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵서열분석기를사용하여 N-말단또는내부아미노산서열중 15개이상의잔기를수득하기에충분한정도로, 또는 (2) 비환원또는또는환원조건하에서쿠마씨블루, 또는바람직하게는은염색을사용하여 SDS-PAGE로균질하게정제될수있다. 그러나, 통상적으로단리된폴리펩티드또는항체는하나이상의정제단계로제조될것이다. 본원의폴리펩티드및항체를코딩하는 " 단리된 " 핵산분자는, 통상적으로그핵산이생산된환경에서일반적으로관련되는하나이상의오염원핵산분자로부터분리되고확인된핵산분자이다. 바람직하게는, 단리된핵산에는생산환경과관련된모든성분들이없다. 본발명의폴리펩티드및항체를코딩하는단리된핵산분자는자연상태에서발견되는형태또는세팅이아니다. 따라서, 단리된핵산분자는세포에서천연으로존재하는폴리펩티드및항체를코딩하는핵산과는구별된다. - 11 -
[0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] 용어 " 조절서열 " 은특정한숙주유기체에서작동적으로연결된 (operably linked) 코딩서열의발현에필요한 DNA 서열을지칭한다. 원핵생물에대하여적합한조절서열은, 예를들면프로모터, 임의로오퍼레이터서열, 및리보솜결합부위를포함한다. 진핵세포는프로모터, 폴리아데닐화신호및인핸서를사용하는것으로알려져있다. 핵산은, 다른핵산서열과기능적인관계에놓일때 " 작동적으로연결 " 된것이다. 예를들면, 전구서열또는분비성리더에대한 DNA가, 만일폴리펩티드의분비에참여하는전구단백질로서발현된다면폴리펩티드에대한 DNA에작동적으로연결된것이며 ; 프로모터또는인핸서는만일서열의전사에영향을미친다면코딩서열에작동적으로연결된것이고 ; 또는리보솜결합부위는번역을촉진시키도록위치하면코딩서열에작동적으로연결된것이다. 일반적으로, " 작동적으로연결된 " 이란연결되어있는 DNA 서열이인접하고, 분비성리더의경우에는인접하고리딩페이즈내에있는것을의미한다. 그러나, 인핸서는인접할필요는없다. 연결은편리한제한부위에서결찰에의해달성된다. 만일그러한부위가존재하지않으면, 합성올리고뉴클레오티드어댑터또는링커를종래의방식에따라사용한다. 본원에사용된 " 에피토프태그된 (tagged)" 이란 " 태그폴리펩티드 " 에융합된본발명의폴리펩티드또는항체를포함하는키메라폴리펩티드를지칭한다. 태그폴리펩티드는항체가만들어질수있을정도의에피토프를제공하기에충분한잔기를갖지만, 융합되는폴리펩티드의활성을방해하지않을정도로충분히짧다. 태그폴리펩티드는또한, 매우독특해서그항체가다른에피토프와는실질적으로교차-반응하지않는것이바람직하다. 적절한태그폴리펩티드는일반적으로 6개이상의아미노산잔기를가지며, 통상약 8 내지 50개의아미노산잔기를갖는다 ( 약 10 내지 20개의아미노산잔기가바람직함 ). 본원에사용된용어 " 면역어드헤신 " 이란, 면역글로불린불변도메인의이펙터기능과이종단백질 ( 어드헤신 ) 의결합특이성을겸비한항체유사분자를지칭한다. 구조적으로보면, 면역어드헤신은항체의항원인식및결합부위가아닌 ( 즉, " 이종 " 인 ) 목적결합특이성을갖는아미노산서열과, 면역글로불린불변도메인서열의융합물을포함한다. 면역어드헤신분자의어드헤신부분은전형적으로, 적어도수용체또는리간드의결합부위를포함하는인접한아미노산서열이다. 면역어드헤신중면역글로불린불변도메인서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함 ), IgE, IgD 또는 IgM과같은임의의면역글로불린으로부터얻을수있다. Ig 융합물은바람직하게는, Ig 분자내의하나이상의가변영역대신본원에기술된폴리펩티드또는항체도메인의치환을포함한다. 특히바람직한실시태양에서, 면역글로불린융합물은 IgG1 분자의힌지, CH2 및 CH3, 또는힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을포함한다. 면역글로불린융합물의생산에대해서는 1995년 6월 27에발행된미국특허제5,428,130호도참조한다. " 안정한 " 제형이란보관시그안의단백질이그의물리적및화학적안정성, 및일체성을본질적으로유지하는것이다. 단백질안정성을측정하기위한다양한분석기술들이당분야에서사용될수있고, 문헌 [Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs.(1991) 및 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90(1993)] 에검토되어있다. 안정성은선택된시간주기동안선택된온도에서측정될수있다. 신속한스크리닝을위해제형을 40 에서 2주내지 1개월동안보관할수있고, 그때안정성을측정한다. 제형을 2-8 에서보관할경우에는, 통상적으로제형은 30 또는 40 에서 1개월이상보관시안정해야하고 ( 하거나 ), 2-8 에서 2년이상보관시안정해야한다. 제형을 30 에서보관할경우에는, 통상적으로제형은 30 에서 2년이상안정해야하고 ( 하거나 ) 40 에서 6개월이상안정해야한다. 예를들어, 보관동안의응집정도는단백질안정성의표지로서사용될수있다. 따라서, " 안정한 " 제형은제형에서약 10% 미만, 바람직하게는약 5% 미만의단백질이제형내에응집체로서존재하는것일수있다. 기타실시태양에서, 제형을보관하는동안응집체형성이증가하는지를측정할수있다. " 재구성된 " 제형은동결건조된단백질또는항체제형을단백질이희석되도록희석액에용해하여제조된것이다. 재구성된제형은관심대상인단백질로치료될대상체에게투여 ( 예를들어, 비경구투여 ) 하기에적합하고, 본발명의특정실시태양에서는피하투여에적합한것일수있다. " 등장성 " 제형은본질적으로인간혈액과동일한삼투압을갖는것이다. 등장성제형은일반적으로약 250 내지 350 mosm의삼투압을가질것이다. 용어 " 저장성 (hypotonic)" 이란인간혈액미만의삼투압을갖는제형을나타낸다. 따라서, 용어 " 고장성 (hypertonic)" 은인간혈액의삼투압을초과하는삼투압을갖는제형을기술하는데사용된다. 등장성은예를들어, 증기압또는제빙형삼투압계를사용하여측정될수있다. 본발명의제형은염및 ( 또는 ) 완충액을첨가한결과로써고장성이다. " 재구성된 " 제형은단백질이재구성된제형내에분산되도록동결건조된단백질제형을희석액에용해하여제조 - 12 -
한것이다. 재구성된제형은관심대상인단백질로치료될대상체에게투여 ( 예를들어, 비경구투여 ) 하기에적 합하고, 본발명의특정실시태양에서는피하투여에적합한것일수있다. [0066] [0067] " 제약학상허용되는산 " 은제형화된농도및방식에서무독성인무기산및유기산을포함한다. 예를들어, 적합한무기산은염산, 과염소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 황산, 술폰산, 술핀산, 술파닐산, 인산, 카르본산등을포함한다. 적합한유기산은직쇄및분지쇄알킬산, 방향족산, 시클릭산, 시클로지방족산, 아릴지방족산, 헤테로시클릭산, 포화, 불포화, 모노, 디- 및트리-카르복실산을포함하고, 예를들어포름산, 아세트산, 2-히드록시아세트산, 트리플루오로아세트산, 페닐아세트산, 트리메틸아세트산, t-부틸아세트산, 안트라닐산, 프로파논산, 2-히드록시프로파논산, 2-옥소프로파논산, 프로판디온산 (propandioic acid), 시클로펜탄프로피온산, 시클로펜탄프로피온산, 3-페닐프로피온산, 부타논산, 부탄디온산, 벤조산, 3-(4-히드록시벤조일 ) 벤조산, 2-아세톡시-벤조산, 아스코르브산, 신남산, 라우릴황산, 스테아르산, 뮤콘산, 만델산, 숙신산, 엠본산, 푸마르산, 말산, 말레산, 히드록시말레산, 말론산, 락트산, 시트르산, 타르타르산, 글리콜산, 글리콘산, 글루콘산, 피루브산, 글리옥살산, 옥살산, 메실산, 숙신산, 살리실산, 프탈산, 팔모산, 팔메산, 티오시안산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 1,2-에탄디술폰산, 2-히드록시에탄술폰산, 벤젠술폰산, 4-클로로벤젠술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, p-톨루엔술폰산, 캄포르술폰산, 4-메틸비시클로 [2.2.2]-옥트-2-엔-1-카르복실산, 글루코헵톤산, 4,4'-메틸렌비스-3-( 히드록시-2-엔-1-카르복실산 ), 히드록시나프토산이포함된다. " 제약학상허용되는염기 " 는제형화된농도및방식에서무독성인무기염기및유기염기를포함한다. 예를들어, 적합한염기는무기염기형성금속, 예를들어리튬, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘, 암모늄, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄, N-메틸글루카민, 모르폴린, 피페리딘, 및 1차, 2차및 3차아민, 치환된아민, 시클릭 + 아민및염기성이온교환수지 [ 예를들어, N(R') 4 ( 여기서, R' 은독립적으로 H 또는 C1-4 알킬, 예를들어암모 늄, 트리스임 )] 를비롯한유기무독성염기, 예를들어이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민, 2-디에틸아미노에탄올, 트리메타민, 디시클로헥실아민, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 푸린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민수지등으로부터형성된것을포함한다. 특히바람직한유기무독성염기는이소프로필아민, 디에틸아민, 에탄올아민, 트리메타민, 디시클로헥실아민, 콜린및카페인이다. [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] 본발명에서사용할수있는추가의제약학상허용되는산및염기는아미노산, 예를들어히스티딘, 글리신, 페닐알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 리신및아스파라긴으로부터유래된것을포함한다. " 제약학상허용되는 " 완충액및염은상기기재한산및염기의산및염기부가염으로부터유래된것을포함한다. 구체적인완충액및 ( 또는 ) 염은히스티딘, 숙시네이트및아세테이트를포함한다. " 동결보호제 (lyoprotectant)" 는관심대상인단백질과함께조합했을때동결건조및후속적인보관시단백질의화학적및 ( 또는 ) 물리적불안정성을현저하게예방하거나감소시키는분자이다. 예시적인동결보호제는당및그의상응하는당알코올 ; 아미노산, 예를들어모노소듐글루타메이트또는히스티딘 ; 메틸아민, 예를들어베타인 ; 이액성 (lyotropic) 염, 예를들어황산마그네슘 ; 폴리올, 예를들어 3가또는그보다분자량이높은당알코올, 예를들어글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨및만니톨 ; 프로필렌글리콜 ; 폴리에틸렌글리콜 ; 플루로닉스 (Pluronics ); 및그의조합을포함한다. 추가의예시적인동결보호제는글리세린및젤라틴, 및당멜리비오스 (sugar mellibiose), 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스및스타키오스를포함한다. 환원당은예를들어, 글루코스, 말토스, 락토스, 말투로스, 이소-말투로스및락투로스를포함한다. 비-환원당은예를들어, 당알코올및기타직쇄폴리알코올로부터선택된폴리히드록시화합물의비-환원글리코시드를포함한다. 바람직한당알코올은모노글리코시드, 특히락토스, 말토스, 락투로스및말투로스와같은이당류의환원에의해수득되는화합물이다. 글리코시드측쇄기는글루코시드또는갈락토시드일수있다. 당알코올의추가적인예는글루시톨, 말티톨, 락티톨및이소-말투로스이다. 바람직한동결보호제는비-환원당트레할로스또는수크로스이다. 동결보호제는동결보호량의동결보호제존재하에단백질의동결건조후, 단백질이동결건조및보관시그의물리적및화학적안정성및일체성을본질적으로유지하는것을의미하는 " 동결보호량 " 으로동결건조전의제형에첨가된다. 본발명의점도가감소된제형을제조함에있어서상기언급한부형제및기타첨가제를사용할때에는, 특히고농도로첨가되는경우제형의점도를증가시키기않도록주의를기울여야한다. - 13 -
[0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] " 제약학상허용되는당 " 은관심대상인단백질과조합된경우, 보관시단백질의화학적및 ( 또는 ) 물리적불안정성을현저하게예방하거나감소시키는분자이다. 제형이동결건조된다음재구성되는경우에는, " 제약학상허용되는당 " 을 " 동결보호제 " 로이해할수도있다. 예시적인당및그의상응하는당알코올은아미노산, 예를들어모노소듐글루타메이트또는히스티딘 ; 메틸아민, 예를들어베타인 ; 이액성염, 예를들어황산마그네슘 ; 폴리올, 예를들어 3가또는그보다분자량이높은당알코올, 예를들어글리세린, 덱스트란, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨및만니톨 ; 프로필렌글리콜 ; 폴리에틸렌글리콜 ; 플루로닉스 ; 및그의조합을포함한다. 추가의예시적인동결보호제는글리세린및젤라틴, 및당멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스및스타키오스를포함한다. 환원당은예를들어, 글루코스, 말토스, 락토스, 말투로스, 이소-말투로스및락투로스를포함한다. 비-환원당은예를들어, 당알코올및기타직쇄폴리알코올로부터선택된폴리히드록시화합물의비-환원글리코시드를포함한다. 바람직한당알코올은모노글리코시드, 특히락토스, 말토스, 락투로스및말투로스와같은이당류의환원으로수득되는화합물이다. 글리코시드측쇄기는글루코시드또는갈락토시드일수있다. 당알코올의추가적인예는글루시톨, 말티톨, 락티톨및이소-말투로스이다. 바람직한제약학상허용되는당은비-환원당트레할로스또는수크로스이다. 제약학상허용되는당은단백질이보관동안 ( 예를들어, 재구성및보관후 ) 본질적으로그물리적및화학적안정성및일체성을유지하는양을의미하는 " 보호량 " 으로 ( 예를들어, 동결건조전에 ) 제형에첨가된다. 본원에서관심대상인 " 희석액 " 은제약학상허용되고 ( 인간투여에안전하고무독성임 ) 액체제형, 예를들어동결건조후재구성된제형의제조에유용한것이다. 예시적인희석액은무균수, 주사용정균수 (BWFI), ph 완충용액 ( 예를들어, 인산염-완충식염수 ), 무균식염용액, 링거액또는덱스트로스용액을포함한다. 별도의실시태양에서, 희석액은염및 ( 또는 ) 완충액의수용액을포함할수있다. " 보존제 " 는박테리아활성을감소시키기위해본원의제형에첨가될수있는화합물이다. 보존제의첨가는예를들어, 다용도 ( 다용량 ) 제형의생산을촉진할수있다. 잠재적인보존제는예를들어, 옥타데실디메틸벤질암모늄클로라이드, 헥사메토늄클로라이드, 벤즈알코늄클로라이드 ( 알킬기가장쇄화합물인알킬벤질디메틸암모늄클로라이드의혼합물 ), 및벤즈에토늄클로라이드를포함한다. 기타형태의보존제는방향족알코올, 예를들어페놀, 부틸및벤질알코올, 알킬파라벤, 예를들어메틸또는프로필파라벤, 카테콜, 레솔시놀 ; 시클로헥산올 ; 3-펜탄올 ; 및 m-크레졸을포함한다. 본원에서가장바람직한보존제는벤질알코올이다. " 치료 " 는치료적처치및예방적또는억제조치를모두지칭한다. 치료가필요한대상은이미질병에걸린경우뿐만아니라질병을예방하려는경우도포함된다. 치료하기위한 " 포유동물 " 은인간, 가축및사육동물, 동물원용, 경기용또는애완동물, 예컨대개, 말, 토끼, 소, 돼지, 햄스터, 저빌쥐, 마우스, 페릿, 래트, 고양이등을비롯하여포유동물로서분류되는임의의동물을지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은인간이다. " 장애 " 는단백질로의치료가도움이되는임의의증상이다. 이는포유동물이문제의장애에걸리기쉽게하는병리학적조건을비롯한만성및급성장애또는질환을포함한다. 본발명에서치료되는장애의비제한적인예는암및알레르기를포함한다. " 치료적유효량 " 은적어도특정장애를측정가능한정도로개선또는예방하는데필요한최소농도이다. 공지된단백질의치료적유효량은당분야에잘알려져있지만, 이하발견된단백질의유효량은당업자, 예를들어일반내과의사에게잘알려진표준기술로측정될수있다. 본원에사용된 " 점도 " 는 " 동적점도 " 또는 " 절대점도 " 일수있다. " 동적점도 " 는중력영향하에유체의저항성유동을측정한것이다. 동일한부피의두유체가동일한모세관점도계내에위치하여중력에의해흐를경우, 점성유체는모세관을통해흐르는데점성이보다낮은유체보다시간이더많이걸린다. 만일한유체가완전히흐르는데 200초가걸리고다른유체는 400초걸린다면, 동적점도스케일에서두번째유체는첫번째보다점성이 2배인것이된다. 가끔동적또는단순점도라고도불리는 " 절대점도 " 는동적점도와유체밀도의곱이다 : 절대점도 = 동적점도 x 밀도동적점도의치수는 L 2 /T ( 여기서, L은길이이고 T는시간임 ) 이다. 일반적으로, 동적점도는센티스토크 (cs t) 로표현된다. 동적점도의 SI 유닛은 mm 2 /s 이고, 이는 1 cst 이다. 절대점도는센티포이즈 (cp) 단위로표 - 14 -
현된다. 절대점도의 SI 유닛은밀리파스칼 - 초 (mpa-s) 이고, 여기서 1 cp = 1mPa-s 이다. [0084] 본원에사용된 " 항히스타민 " 은히스타민의생리학적효과를길항하는약제이다. 히스타민이그의수용체, H 1 및 H 2 에결합하면특징적인알레르기성증상과효과또는가려움, 발적, 부종등을일으킨다. 다수의항히스타민은히스타민이수용체, H1, H2에결합하는것을차단함으로써작용하지만, 다른것은히스타민분비를억제함으로써작용하는것으로생각된다. 예시적인항히스타민은클로르페니라민, 디펜히드라민, 프로메타진, 크로몰린소듐, 아스테미졸, 아자타딘말레에이트, 브로페니라민말레에이트, 카르비녹사민말레에이트, 세티리진히드로클로라이드, 클레마스틴푸마레이트, 사이프로헵타딘히드로클로라이드, 덱스브롬페니라민말레에이트, 덱스클로르페니라민말레에이트, 디멘히드리네이트, 디펜히드라민히드로클로라이드, 독실아민숙시네이트, 펙소펜다딘히드로클로라이드, 테르페나딘히드로클로라이드, 히드록시진히드로클로라이드, 로라티딘, 메클리진히드로클로라이드, 트리펠란나민시트레이트, 트리펠렌나민히드로클로라이드, 트리프롤리딘히드로클로라이드이다. [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] 본원에사용된 " 기관지확장제 " 는통상적으로폐용량의감소및숨이차는증상을야기하는조기 (early phase) 천식반응에서발생하는생리학적현상인기관지수축을길항또는역전시키는약제이다. 예시적인기관지확장제는에피네프린, 광범위하게작용하는알파및베타-아드레날린성, 및베타-아드레날린성알부테롤, 피르부테롤, 메타프로테레놀, 살메테롤, 및이소에타린을포함한다. 기관지확장은또한, 아미노필린및테오필린을비롯한크산틴의투여를통해달성될수있다. 본원에사용된 " 당질코르티코이드 " 는항-염증활성을갖는스테로이드계약제를나타낸다. 당질코르티코이드는일반적으로후기 (late phase) 천식반응을감쇠시키는데사용된다. 예시적인당질코르티코이드는프레드니손, 베클로메타손디프로피오네이트, 트리암시놀론아세토나이드, 플루니솔리드, 베타메타손, 부데소나이드, 덱사메타손, 플루드로코티손아세테이트, 플루니솔리드, 플루티카손프로피오네이트, 히드로코티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손및트리암시놀론을포함한다. 본원에사용된 " 비-스테로이드성항-염증성약물 " 또는 "NSAID" 는항-염증성활성을갖는스테로이드계가아닌약제를나타낸다. 예시적인 NSAID는아세트아미노펜, 아스피린, 브롬페낙소듐, 디클로페낙소듐, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜칼슘, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페나메이트소듐, 메페남산, 나부메톤, 나프록센, 나프록센소듐, 옥시펜부타존, 페닐부트존, 피록시캄, 술린닥, 톨메틴소듐을포함한다. II. 본발명을수행하는방식 A. 폴리펩티드및항체제조이하기재는주로본원에기술된폴리펩티드또는항체를코딩하는핵산을포함하는벡터로형질전환또는트랜스펙션된세포의배양에의한상기폴리펩티드또는항체의생산, 및결과단백질또는항체의정제에관한것이다. 물론, 상기폴리펩티드또는항체를제조하는데당분야에공지된별법이사용될수있음도고려된다. 예를들어, 상기서열또는그의부분은고상기술을사용하는직접펩티드합성에의해제조할수있다 ( 예를들어, 문헌 [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)] 참조 ). 시험관내단백질합성은수동기술또는자동방법에의해수행될수있다. 자동합성법은예를들어, 어플라이드바이오시스템즈펩티드합성기 ( 캘리포니아주포스터시티 ) 를제조사의지시에따라사용하여수행할수있다. 본원에기술된단백질또는항체의다양한부분을화학적으로별도로합성하고, 화학적또는효소적방법을사용하여조합할수있다. 1. 본원에기술된단백질을코딩하는 DNA의단리본원에기술된단백질을코딩하는 DNA는상응하는 mrna를보유하고이를검출가능한수준으로발현할것으로생각되는조직으로부터제조한 cdna 라이브러리로부터수득할수있다. 따라서, 상기인간단백질-코딩 DNA는실시예에서설명되는바와같이, 인간조직으로부터제조된 cdna 라이브러리로부터편리하게수득할수있다. 단백질-코딩유전자는또한, 게놈라이브러리로부터수득하거나공지된합성법 ( 예를들어, 자동화핵산합성 ) 으로수득할수있다. 라이브러리는관심대상인유전자를동정하기위해설계된프로브 ( 예를들어, 약 20-80 염기이상의올리고뉴클레오티드 ) 로스크리닝할수있다. 선택된프로브를사용한 cdna 또는게놈라이브러리의스크리닝은예를들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)] 에기재된바와같은표준방법을사용하여수행할수있다. 목적유전자를코딩하는 - 15 -
유전자를단리하는다른수단은 PCR 방법을사용하는것이다 [Sambrook et al., 상기문헌 ; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)]. [0094] 하기실시예는 cdna 라이브러리를스크리닝하는기술을설명한다. 프로브로서선택된올리고뉴클레오티드서열 은가양성결과를최소화하기위해서충분한길이를갖고충분히분명한서열이어야한다. 올리고뉴클레오티드 는스크리닝되는라이브러리에서 DNA 에혼성화시에검출될수있도록표지되는것이바람직하다. 표지방법은 당업계에공지되어있고, 32 P- 표지된 ATP 와같은방사성표지, 바이오티닐화또는효소표지의사용을포함한다. 중간정도엄격성및고도엄격성을비롯한혼성화조건은문헌 (Sambrook et al., 상기문헌 ) 에서제공된다. [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] 상기라이브러리스크리닝방법에서동정된서열은 GenBank와같은공용데이터베이스또는다른독점서열데이터베이스에기탁되고입수될수있는다른공지의서열과비교하고정렬시킬수있다. 분자의한정된영역내또는전장서열에걸친서열동일성 ( 아미노산또는뉴클레오티드수준에서 ) 은, 당분야에공지된방법및본원에기술된방법을사용하여결정할수있다. 단백질코딩서열을갖는핵산은먼저본원에서개시된추정아미노산서열을사용하고, 필요하다면 cdna로역전사되지않았을수있는 mrna의전구체및프로세싱중간체를검출하기위해문헌 [Sambrook et al., 상기문헌 ] 에기재된통상의프라이머신장방법을사용하여선택된 cdna 또는게놈라이브러리를스크리닝함으로써수득할수있다. 2. 숙주세포의선별및형질전환숙주세포는생산을위해본발명에기술된단백질또는항체를함유하는발현또는클로닝벡터로트랜스펙션또는형질전환되고, 프로모터유도, 형질전환체선택, 또는목적서열을코딩하는유전자의증폭에적합하게끔변형된통상의영양배지중에서배양된다. 당업자라면불필요한실험을수행하지않고서도배지, 온도, ph 등과같은배양조건을선택할수있다. 일반적으로, 세포배양물의생산성을최대화하기위한원칙, 프로토콜및실시되는기술은문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기문헌 ] 에서찾을수있다. 진핵세포의트랜스펙션방법및원핵세포의형질전환방법, 예를들어 CaCl 2, CaPO 4, 리포좀-매개및일렉트로 포레이션은당업계의숙련가에게공지되어있다. 사용되는숙주세포에따라, 형질전환은상기세포에적합한표준기술을사용하여수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기문헌 ] 에기재된염화칼슘을이용하는칼슘처리, 또는일렉트로포레이션은일반적으로원핵세포에사용된다. 아그로박테리움투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 로의감염은문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315(1983) 및 1989년 6월 29일공개된 WO 89/05859] 에기재된바와같이특정식물세포의형질전환에사용된다. 이러한세포벽이없는포유동물세포의경우, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457(1978)] 의인산칼슘침전법을사용할수있다. 포유동물세포숙주시스템트랜스펙션의일반적인측면은미국특허제4,399,216호에기재되어있다. 효모내로의형질전환은일반적으로문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:946(1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829(1979)] 의방법에따라수행된다. 그러나, 세포내로 DNA를도입하는다른방법, 예를들어핵내미세주입, 일렉트로포레이션, 온전한세포와의박테리아원형질융합, 또는다원양이온 (polycation), 예를들어폴리브렌, 폴리오르니틴도사용할수있다. 포유동물세포를형질전환하기위한여러기술에대해서는문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537(1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352(1988)] 을참조한다. [0100] 본원에서벡터내의 DNA를클로닝또는발현하기에적합한숙주세포에는원핵세포, 효모또는고등진핵세포가포함된다. 적합한원핵세포는유박테리아 (eubacteria), 예를들어그람-음성또는그람-양성유기체, 예컨대이. 콜라이 (E. coli) 와같은엔테로박테리아시에 (Enterobacteriaceae) 를포함하나, 이에한정되지않는다. 다양한이. 콜라이균주, 예를들어이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635) 는용이하게입수할수있다. 기타적합한원핵숙주세포는엔테로박테리아시에, 예컨대에스케리키아 (Escherichia), 예를들어이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 어위니아 (Erwinia), 클레브시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를들어살모넬라타이피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를들어세라티아마르세칸스 (Serratia marcescans), 및쉬젤라 (Shigella), 뿐만아니라바실리 (Bacilli), 예를들어비. 서브틸리스 (B. subtilis) 및비. 리체니포르미스 (B. licheniformis)( 예를들어, 1989년 4월 12일에공개된 DD 266,710에개시된비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를들어피. 에어루지노사 - 16 -
(P. aeruginosa) 및스트렙토마이세스 (Streptomyces) 를포함한다. 이러한예들은한정적인것이라기보다는예시적인것이다. 균주 W3110은재조합 DNA 생성물의발효에대한일반적인숙주균주이므로특히바람직한숙주또는모숙주이다. 바람직하게는, 숙주세포는최소량의단백분해효소를분비한다. 예컨대, 균주 W3110은숙주에내인성인단백질을코딩하는유전자에유전적돌연변이가일어나도록변형될수있는데, 이는예를들어완전한유전자형 tona를갖는이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한유전자형 tona ptr3를갖는이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한유전자형 tona ptr3 phoa E15(argF-lac)169 degp ompt kan r 를갖는이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한유전자형 tona ptr3 phoa E15(argF-lac)169 degp ompt rbs7 ilvg kan r 을갖는이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신내성 degp 결실돌연변이를갖는 37D6 균주인이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 1990년 8월 7일에발행된미국특허제4,946,783호에개시된돌연변이주변세포질 (periplasmic) 프로테아제를갖는이. 콜라이균주를포함하는상기숙주이다. 별법으로, 시험관내클로닝방법에서는예를들어, PCR 또는기타핵산중합효소반응이적합하다. [0101] [0102] [0103] [0104] 원핵세포이외에, 섬유상진균또는효모와같은진핵미생물이본원에기술된단백질또는항체를코딩하는벡터에대해적합한클로닝또는발현숙주이다. 사카로마이세스세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 가일반적으로사용되는하등진핵숙주미생물이다. 기타스키조사카로마이세스폼베 (Schizosaccharomyces pombe)(beach and Nurse, Nature, 290:140[1981]; 1985년 5월 2일에공개된 EP 139,383); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 ( 미국특허제4,943,529호 ; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를들어케이. 락티스 (K. lactis)(mw98-8c, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol, 154(2):737-42[1983]), 케이. 프라질리스 (K. fragilis)(atcc 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus)(atcc 16,045), 케이. 윅케라미 (K. Wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii)(atcc 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum)(atcc 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 써모톨레란스 (K. thermotolerans), 및케이. 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia, EP 402,226); 피치아파스토리스 (Pichia pastoris, EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol, 28:265-278 [1988]); 칸디다 ; 트리코더마리이시아 (Trichoderma reesia, EP 244,234); 뉴로스포라크라싸 (Neurospora crassa, Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 슈반니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를들어슈반니오마이세스옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis)(1990년 10월 31일에공개된 EP 394,538); 및섬유상진균, 예를들어뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라디움 (Tolypocladium, 1991년 1월 10에공개된 WO 91/00357), 및아스퍼질루스숙주 ( 예를들어에이. 니둘란스 (A. nidulans)(ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289[1983]; Tilburn et al., Gene, 26: 205-221[1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474(1984)) 및에이. 나이저 (A. niger)(kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479[1985]) 를포함한다. 향메틸성효모가본원에적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다, 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스, 및로도토룰라로구성된속으로부터선택된메탄올상에서성장할수있는효모를포함하지만이에한정되는것은아니다. 이러한호모군의예인구체적인종목록은문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269(1982)] 에서찾을수있다. 본원에기술된폴리펩티드및항체의글리코실화형태의발현에적합한숙주세포는다세포유기체로부터유래한다. 무척추동물세포의예에는드로소필라 (Drosophila) S2 및스포도프테라 (Spodoptera) Sf9와같은곤충세포, 및식물세포가포함된다. 유용한포유동물숙주세포주의예에는차이니즈햄스터난소 (CHO) 세포및 COS 세포가포함된다. 보다구체적인예에는 SV40에의해형질전환된원숭이신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간배아신장세포 (293 세포또는현탁배양물중에서의성장을위해서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1977)); 차이니즈햄스터난소세포 /-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)); 마우스세르톨리세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980)); 인간폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간간세포 (Hep G2, HB 8065) 및마우스유방종양세포 (MMT 060562, ATCC CCL51) 가포함된다. 당업계의숙련가라면적합한숙주세포를선택할수있다. 3. 복제가능벡터의선별및사용본원에기술된폴리펩티드및항체를코딩하는핵산 ( 예를들어, cdna 또는게놈 DNA) 은클로닝 (DNA의증폭 ) 또는발현을위한복제가능벡터에삽입될수있다. 다양한벡터를용이하게구할수있다. 예를들어, 벡터는플라스미드, 코스미드, 바이러스입자또는파지의형태일수있다. 적합한핵산서열은다양한방법에의해벡터내에삽입될수있다. 일반적으로, 당업계에공지된기술을사용하여 DNA를적합한제한엔도뉴클레아제부위 ( 들 ) 내에삽입한다. 벡터성분은일반적으로신호서열, 복제기점, 하나이상의마커유전자, 인핸서 - 17 -
요소, 프로모터및전사종결서열을포함하나, 이에한정되지않는다. 상기성분을하나이상포함하는적합 한벡터의제조는당업계의숙련가에게공지된표준결찰기술을사용한다. [0105] [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] 폴리펩티드또는항체의재조합생산은직접적으로달성될수있을뿐만아니라, 이종폴리펩티드와의융합폴리펩티드로서도제조될수있다. 이종부분은성숙단백질또는폴리펩티드의 N-말단에특이적인절단부위를갖는신호서열또는기타폴리펩티드일수있다. 일반적으로, 신호서열은벡터의성분일수있거나벡터내로삽입된폴리펩티드또는항체를코딩하는 DNA의일부일수있다. 신호서열은예를들어알칼리포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는열안정성장독소 (enterotoxin) II 리더군으로부터선택된원핵생물신호서열일수있다. 효모분비를위해, 신호서열은예를들어효모인버타제리더, 알파인자리더 ( 사카로마이세스및클루이베로마이세스 α-인자리더 ( 미국특허제5,010,182호 ) 를포함함 ) 또는산포스파타제리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제리더 (1990년 4월 4일공개된 EP 362,179), 또는 1990년 11월 15일공개된 WO 90/13646에기재된신호서열일수있다. 포유동물세포발현에서포유동물신호서열, 예를들어동일하거나관련된종의분비폴리펩티드로부터의신호서열, 및바이러스분비리더를사용하여단백질이분비되도록할수있다. 발현및클로닝벡터모두는선택된 1종이상의숙주세포에서벡터가복제될수있도록만드는핵산서열을함유한다. 이러한서열은다양한박테리아, 효모및바이러스에대해공지되어있다. 플라스미드 pbr322의복제기점은대부분의그람-음성박테리아에적합하고, 2μ 플라스미드기점은효모에적합하며, 다양한바이러스의기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV) 은포유동물세포에벡터를클로닝하는데유용하다. 발현및클로닝벡터는통상적으로선택가능한마커로도불리우는선택유전자를함유할것이다. 통상적인선택유전자, 예를들어바실러스 (Bacillus) 의경우 D-알라닌라세마제를코딩하는유전자는 (a) 항생제또는기타독소, 예를들어암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트또는테트라사이클린에내성을부여하는단백질, (b) 영양요구성결함을보완하는단백질, 또는 (c) 복합배지로부터이용할수없는중요한영양물질을공급하는단백질을코딩한다. 포유동물세포에적합한선택가능한마커의예는본발명에기술된폴리펩티드또는항체를코딩하는 DNA 서열을수용할수있는 (competent) 세포의동정을가능하게하는것, 예를들어 DHFR 또는티미딘키나제이다. 야생형 DHFR이이용될경우적합한숙주세포는 DHFR 활성이결여된 CHO 세포주이며, 문헌 [Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)] 에기재된바와같이제조및증식된다. 효모에사용하는데적합한선택유전자는효모플라스미드 YRp7에존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141(1979); Tschemper et al., Gene, 10:157(1980)]. trp1 유전자는트립토판에서성장능이결여된효모의돌연변이주, 예를들어 ATCC 44076 또는 PEP4-1에대한선택마커를제공한다 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. 발현및클로닝벡터는일반적으로 mrna 합성을지시하는 DNA 서열에작동적으로연결된프로모터를포함한다. 다양한잠재적인숙주세포에의해인식되는프로모터는공지되어있다. 원핵생물숙주에사용하기에적합한프로모터에는 β-락타마제및락토스프로모터시스템 [Chang et al., Nature, 275:615(1978); Goeddel et al., Nature, 281:544(1979)], 알칼리포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터계 [Goeddel, Nucleic acids Res., 8:4057(1980); EP 36,776] 및하이브리드프로모터, 예를들어 tac 프로모터 [deboer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25(1983)] 를포함한다. 또한, 박테리아계에서사용하기위한프로모터는상기 DNA 서열에작동적으로연결된샤인-달가노 (S.D.) 서열을함유할것이다. 효모숙주에사용하기적합한프로모터서열의예는 3-포스포글리세레이트키나제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073(1980)] 또는다른당분해효소 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149(1968); Holland, Biochemistry, 17:4900(1978)], 예를들어에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트이소머라제, 3-포스포글리세레이트뮤타제, 피루베이트키나제, 트리오스포스페이트이소머라제, 포스포글루코스이소머라제및글루코키나제에대한프로모터를포함한다. 성장조건에의해조절되는전사의추가적인이점을갖는유도성프로모터인기타효모프로모터는알코올데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산포스파타제, 질소대사와관련된분해효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트데히드로게나제, 및말토스및갈락토스이용에작용하는효소에대한프로모터영역이다. 효모발현에사용하기에적합한벡터및프로모터는추가로 EP 제73,657호에기재되어있다. - 18 -
[0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] 포유동물숙주세포내벡터로부터의전사는바이러스, 예를들어폴리오마바이러스, 계두바이러스 (1989년 7 월 5일공개된 UK 2,211,504호 ), 아데노바이러스 ( 예를들어, 아데노바이러스 2), 소유두종바이러스, 조류육종바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형간염바이러스및원숭이바이러스 40 (SV40) 의게놈으로부터얻어진프로모터, 이종포유동물프로모터, 예를들어액틴프로모터또는면역글로불린프로모터, 및열-충격프로모터로부터얻어진, 숙주세포계에상용성인프로모터에의해조절될수있다. 고등진핵세포에의한본원의폴리펩티드또는항체를코딩하는핵산의전사는인핸서서열을벡터에삽입함으로써증가될수있다. 인핸서는일반적으로전사를증가시키기위해프로모터에대해작용하는, 약 10 내지 300 bp의시스-액팅 DNA 요소이다. 많은인핸서서열은포유동물유전자 ( 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질및인슐린 ) 로부터유래하는것으로알려져있다. 그러나, 통상적으로진핵세포바이러스로부터유래한인핸서를사용할것이다. 그예는복제기점의뒷부분상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스초기프로모터인핸서, 복제기점의뒷부분상의폴리오마인핸서, 및아데노바이러스인핸서를포함한다. 인핸서는코딩서열의 5' 또는 3' 위치에서벡터내로스플라이싱될수있지만, 프로모터로부터 5' 부위에위치하는것이바람직하다. 또한, 진핵생물숙주세포 ( 효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간또는다른다세포유기체로부터유래한유핵세포 ) 에사용되는발현벡터는전사종결및 mrna 안정화에필요한서열을포함할것이다. 그러한서열은통상적으로진핵세포또는바이러스 DNA 또는 cdna의 5', 때로는 3' 비번역영역으로부터확보된다. 이들영역은본원에기술된폴리펩티드또는항체를코딩하는 mrna의비번역부분에서폴리아데닐화단편으로서전사되는뉴클레오티드분절을함유한다. 재조합척추동물세포배양에서본원에기술된폴리펩티드또는항체의합성에적용하는데적합한다른방법, 벡터및숙주세포는문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625(1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46(1979); EP 117,060 및 EP 117,058] 에기재되어있다. 4. 유전자증폭 / 발현의검출유전자증폭및 ( 또는 ) 발현은예를들어본원에서제공된서열을기초로하여적절하게표지된프로브를사용하여통상의서던블로팅, mrna의전사를정량하기위한노던블로팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205(1980)], 도트블로팅 (DNA 분석 ), 또는제자리혼성화 (in situ hybridization) 에의해샘플에서직접측정할수있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄및 DNA-RNA 하이브리드이중쇄또는 DNA-단백질이중쇄를비롯한특정이중쇄를인식할수있는항체를사용할수있다. 바꾸어말하면, 항체를표지하고, 상기이중쇄를표면에결합시켜, 표면상에이중쇄가형성될때이중쇄에결합한항체의존재를검출할수있는검정법을수행할수있다. 별법으로, 유전자발현은유전자생성물의발현을직접정량하기위해세포또는조직단편의면역조직화학적염색및세포배양물또는체액의검정과같은면역학적방법에의해측정할수있다. 샘플유체의면역조직화학적염색및 ( 또는 ) 검정에유용한항체는모노클로날또는폴리클로날항체일수있고, 임의의포유동물에서제조할수있다. 편리하게는, 본원에기술된폴리펩티드에대해, 본원에서제공되는 DNA 서열에기초한합성펩티드에대해, 또는상기폴리펩티드및항체를코딩하고특정항체에피토프를코딩하는외인성서열에대한항체를제조할수있다. 5. 폴리펩티드의정제형태들은배양배지또는숙주세포용해물로부터회수될수있다. 막에결합된경우, 이는적합한세제용액 ( 예를들어, 트리톤 (Triton)-X 100) 을사용하거나효소의절단에의해막으로부터방출될수있다. 본원에기술된폴리펩티드또는항체의발현에사용된세포는동결-해동주기, 초음파처리, 기계적붕괴또는세포용해제와같은다양한물리적또는화학적수단에의해붕괴시킬수있다. 재조합세포단백질또는기타폴리펩티드로부터본원에기술된폴리펩티드또는항체를정제하는것이바람직할수있다. 적합한정제방법의예는이온교환칼럼상에서의분획화, 에탄올침전, 역상 HPLC, 실리카또는양이온교환수지, 예를들어 DEAE 상에서의크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄침전, 예를들어세파덱스 G-75를사용한겔여과, IgG와같은오염물질을제거하기위한단백질 A 세파로스칼럼, 및에피토프-태그된형태의폴리펩티드또는항체를결합시키기위한금속킬레이팅칼럼이다. 다양한단백질정제방법을사용할수있고, 이러한방법은당업계에공지되어있으며, 예를들어문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New - 19 -
York(1982)] 에기재되어있다. 선택된정제단계 ( 들 ) 은예를들어, 사용되는생산방법및생산되는특정폴리 펩티드또는항체의특성에따라좌우될것이다. [0122] [0123] [0124] [0125] B. 항체제조본발명의특정실시태양에서, 선택된단백질은항체이다. 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이성및헤테로컨쥬게이트항체를비롯한항체를생산하기위한기술을이하개시한다. 1) 폴리클로날항체. 폴리클로날항체는통상적으로동물에게관련되는항원및애주번트를피하 (sc) 또는복강내 (ip) 로다중주사하여생성된다. 관련항원은이작용기성또는유도화제, 예를들어말레이미도벤조일술포숙신이미드에스테르 ( 시스테인잔기에의한컨쥬게이션 ), N-히드록시숙신이미드 ( 리신잔기에의한컨쥬게이션 ), 글루타르알데히드, 숙신산무수물, SOCl 2, 또는 R 1 N=C=NR ( 여기서, R 및 R 1 은독립적으로저급알킬기임 ) 을사용하여, 면역처리되는종에서면역원성인단백질, 예를들어키홀림펫헤모시아닌 (KLH), 혈청알부민, 소티로글로불린또는대두트립신억제제에컨쥬게이션시키는것이유용할수있다. 사용될수있는애주번트의예로는프로인트완전애주번트및 MPL-TDM 애주번트 ( 모노포스포릴지질 A, 합성트레할로스디코리노미콜레이트 ) 가포함된다. 당업자라면과도한시행착오없이면역화프로토콜을선택할수있다. [0126] [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] 동물은예를들어, 100 μg또는 5 μg의단백질또는컨쥬게이트 ( 각각토끼또는마우스에대해 ) 를 3부피의프로인트완전애주번트와합하고, 이용액을여러부위에진피내주사함으로써, 항원, 면역원성컨쥬게이트또는유도체에대해면역화한다. 1개월후, 동물에게프로인트완전애주번트중의펩티드또는컨쥬게이트를원래양의 1/5 내지 1/10로여러부위에피하주사하여부스팅했다. 7 내지 14일후, 동물의피를뽑아항체역가에대해혈청을검정했다. 역가가정체기에도달할때까지동물을부스팅했다. 컨쥬게이트는단백질융합체로서재조합세포배양물내에서제조될수도있다. 또한, 백반과같은응집약제는면역반응을증강시키기위해적합하게사용된다. 2) 모노클로날항체. 모노클로날항체는실질적으로동종항체들, 즉한집단을이루는개별항체가소량으로존재할수있는가능한자연발생적돌연변이및 ( 또는 ) 번역후변형 ( 예를들어, 이성체화, 아미드화 ) 을제외하고는동일한항체의집단으로부터얻어진다. 따라서, 수식어 " 모노클로날 " 은별개항체의혼합물이아니라항체의성질을나타낸다. 예를들어, 모노클로날항체는먼저문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495[1975]) 에기재된하이브리도마방법으로제조할수있고, 또는재조합 DNA 방법 ( 미국특허제4,816,567호 ) 으로제조할수있다. 하이브리도마방법에서는, 마우스또는기타적절한숙주동물, 예를들어햄스터를상기기술한바와같이면역화하여, 면역화에사용되는단백질에특이적으로결합할항체를생산하거나생산할수있는림프구를유발한다. 별법으로, 림프구는시험관내로면역화될수있다. 그다음, 림프구를적합한융합제, 예를들어폴리에틸렌글리콜로골수종세포와융합하여하이브리도마세포를형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103, Academic Press, 1986) 면역화제는통상적으로항원성단백질또는그의융합변이체를포함할것이다. 통상적으로, 인간기원의세포를원할경우말초혈액림프구 ("PBL") 를사용하고, 또는비인간포유동물공급원을원할경우에는비장세포또는림프절세포를사용한다. 이어서, 폴리에틸렌글리콜과같은적합한융합제를사용하여림프구와불멸화된세포주를융합시켜하이브리도마세포를형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 불멸화된세포주는보통형질전환된포유동물세포, 특히설치류, 소및인간기원의골수종세포이다. 통상적으로래트또는마우스골수종세포주가사용된다. 이렇게제조된하이브리도마세포는바람직하게는융합되지않은모골수종세포의성장또는생존을저해하는 1종이상의물질을함유하는적합한배양배지에접종되어배양될수있다. 예를들면, 모골수종세포에히포크잔틴구아닌포스포리보실트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가결핍된경우, 하이브리도마용배양배지는통상적으로히포크잔틴, 아미노프테린및티미딘을포함할것이며 (HAT 배지 ), 이들물질은 HGPRT-결핍세포의성장을억제시킨다. 바람직한불멸화골수종세포는효율적으로융합되고, 선택된항체-생산세포에의한높은수준의안정적인항체생산을지지하며, HAT 배지와같은배지에감수성이있는것이다. 이중에서, 바람직한것은솔크인스티튜 - 20 -
트셀디스트리뷰션센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국캘리포니아주샌디에고 ) 로부터입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스종양으로부터유래된것과같은마우스골수종세포주, 및아메리칸타입컬쳐컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국버지니아주마나싸스 ) 으로부터입수가능한 SP-2 세포 ( 및그의유도체, 예를들어 X63-Ag8-653) 이다. 또한, 인간모노클로날항체의생산을위한인간골수종세포주및마우스-인간헤테로골수종세포주도기술되어있다 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63 ( 마르셀덱커, 미국뉴욕 1987). [0134] [0135] [0136] [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] 하이브리도마세포가자라고있는배양배지를목적항원에대한모노클로날항체의생산에대해검정한다. 바람직하게는, 모노클로날항체의결합친화도를면역침전또는시험관내결합분석법, 예를들어방사선면역분석법 (RIA) 또는효소-결합면역흡착분석법 (ELISA) 으로측정한다. 하이브리도마세포가배양된배양배지는항원에대한모노클로날항체의존재에대해검정할수있다. 바람직하게는, 모노클로날항체의결합친화도및특이성을면역침전또는시험관내결합검정법, 예를들어방사선면역검정법 (RIA) 또는효소-결합면역흡착검정법 (ELISA) 으로측정할수있다. 이러한기술및검정법은당업계에공지되어있다. 결합친화도는예를들어, 스캐차드 (Scatchard) 분석법 (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)) 으로결정될수있다. 하이브리도마세포가원하는특이성, 친화도및 ( 또는 ) 활성을갖는항체를생산하는지확인한후, 클론을한계희석법으로서브클로닝하고표준방법 (Goding, 상기문헌 ) 으로배양할수있다. 이러한목적에적합한배양배지는예를들어, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를포함한다. 또한, 하이브리도마세포를포유동물의생체내에서복수 (ascite) 종양으로배양할수있다. 서브클론에의해분비된모노클로날항체는예를들면, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트크로마토그래피, 겔전기영동, 투석또는친화도크로마토그래피와같은통상적인면역글로불린정제법에의해배양배지, 복수액또는혈청으로부터적절하게분리된다. 모노클로날항체는미국특허제4,816,567호에기재된것과같은재조합 DNA 방법에의해, 그리고상기기술한바와같이제조할수도있다. 상기모노클로날항체를코딩하는 DNA는통상적인방법을이용 ( 예를들면, 마우스항체의중쇄및경쇄를코딩하는유전자에특이적으로결합할수있는올리고뉴클레오티드프로브를이용 ) 하여쉽게단리되고서열화된다. 하이브리도마세포는상기 DNA의바람직한공급원으로기능한다. 일단단리하면, DNA를발현백터내로넣을수있고, 그다음에이를면역글로불린단백질을생산하지않는이. 콜라이세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈햄스터난소 (CHO) 세포또는골수종세포와같은숙주세포로트랜스펙션시켜, 상기재조합숙주세포에서모노클로날항체를합성할수있다. 항체를코딩하는 DNA의박테리아에서의재조합발현에대한리뷰논문은 Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993) 및 Plueckthun, Immunol. Revs. 130:151-188(1992) 을포함한다. 추가의실시태양에서, 항체는문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)] 에기재된기술을사용하여항체파지라이브러리로부터단리될수있다. 클락손등 [Clackson et al., Nature, 352:624-628(1991)] 과마크스등 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)] 은파지라이브러리를사용한마우스및인간항체의단리에대해각각기술하고있다. 후속적인문헌들은매우큰파지라이브러리를제작하기위한방법으로서쇄셔플링 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783(1992)), 뿐만아니라재조합감염및생체내재조합 (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res., 21:2265-2266(1993)) 에의한고친화도 (nm 범위 ) 의인간항체생산을기술하고있다. 따라서, 이러한기술들은모노클로날항체를단리하기위한종래의모노클로날항체하이브리도마기술에대한실행가능한대안이다. 또한, DNA는예를들어상동성인마우스서열대신에인간중쇄및경쇄불변도메인에대한코딩서열을치환하거나 ( 미국특허제4,816,567호 ; Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 또는비- 면역글로불린폴리펩티드에대한코딩서열전체또는일부를면역글로불린코딩서열에공유결합시켜변형시킬수있다. 통상적으로, 이러한비-면역글로불린폴리펩티드로항체의불변도메인을치환하거나, 항체의하나의항원-결합부위의가변도메인을치환하여, 항원에대한특이성을갖는하나의항원-결합부위및다른항원에대해특이성을갖는다른항원-결합부위를포함하는키메라 2가항체를생성할수있다. 본원에기술된모노클로날항체는 1가일수있고, 이를제조하는방법은당업계에공지되어있다. 예를들어, 한방법은면역글로불린경쇄및변형된중쇄의재조합발현을포함한다. 중쇄는중쇄가교결합을방지하기위 - 21 -
해일반적으로 Fc 영역중임의의지점에서절단된다. 별법으로, 관련시스테인잔기는가교결합을방지하기위해서다른아미노산잔기로치환되거나결실될수있다. 시험관내방법도 1가항체의제조에적합하다. 항체를절단하여그의단편, 특히 Fab 단편을제조하는것은당업계에공지된통상적인기술을사용하여수행될수있다. [0142] [0143] [0144] 키메라또는하이브리드항체는가교결합제를사용하는방법을비롯한합성단백질화학에서공지된방법을이용하여시험관내에서도제조될수있다. 예를들어, 면역독소는디술피드-교환반응을사용하거나티오에테르결합을형성시킴으로써제조될수있다. 상기목적에적합한시약의예로는이미노티올레이트및메틸-4-머캅토부티르이미데이트가포함된다. 3) 인간화항체. 본발명의항체는인간화항체또는인간항체를추가로포함할수있다. 비인간 ( 예를들어, 마우스 ) 항체의인간화형태는키메라면역글로불린, 비인간면역글로불린으로부터유래한최소서열을함유하는면역글로불린쇄또는그의단편 ( 예를들어, Fv, Fab, Fab', F(ab') 2 또는항체의다른항원-결합하위서열 ) 이다. 인간화 항체는수용자의상보성결정영역 (CDR) 의잔기를원하는특이성, 친화도및능력을갖는마우스, 래트또는토끼와같은비인간종 ( 공여자항체 ) 의 CDR 잔기로치환시킨인간면역글로불린 ( 수용자항체 ) 을포함한다. 몇몇경우에, 인간면역글로불린의 Fv 프레임워크잔기는대응하는비인간잔기로치환된다. 또한, 인간화항체는수용자항체또는도입되는 CDR 또는프레임워크서열중어느것에서도발견되지않는잔기를포함할수도있다. 일반적으로, 인간화항체는하나이상, 일반적으로는두개의가변도메인을실질적으로모두포함할것이며, 여기서모든또는실질적으로모든 CDR 영역이비인간면역글로불린의영역에대응하고, 모든또는실질적으로모든 FR 영역이인간면역글로불린컨센서스서열의영역에대응한다. 또한, 인간화항체는최적으로는면역글로불린불변영역 (Fc), 일반적으로인간면역글로불린불변영역의적어도일부를포함할것이다 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)). [0145] [0146] [0147] 비인간항체를인간화하는방법은당업계에잘알려져있다. 일반적으로, 인간화항체는비인간기원으로부터도입된하나이상의아미노산잔기를갖는다. 이들비인간아미노산잔기는흔히 " 임포트 (import)" 잔기라고불리며, 통상적으로 " 임포트 " 가변도메인으로부터얻어진다. 인간화는본질적으로윈터 (Winter) 및그의공동연구자들의방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327(1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)) 에따라, 또는설치류 CDR 또는 CDR 서열로인간항체의대응하는서열을치환함으로써수행될수있다. 따라서, 이러한 " 인간화 " 항체는실질적으로온전한인간가변도메인보다적은서열이비인간종의대응하는서열로치환된키메라항체 ( 미국특허제4,816,567호 ) 이다. 실제로, 인간화항체는통상적으로일부 CDR 잔기및아마도일부 FR 잔기가설치류항체의유사부위의잔기로치환된인간항체이다. 인간화항체를제조하기위해사용될인간가변도메인 ( 경쇄및중쇄도메인모두 ) 의선택은항원성을감소시키기위해매우중요하다. 소위 " 베스트핏 (best-fit)" 방법에따라, 설치류항체의가변도메인서열을공지된인간가변-도메인서열의전체라이브러리에대해스크리닝한다. 이어서, 설치류의서열에가장근접한인간서열을인간화항체에대한인간프레임워크 (FR) 로서수용한다 [Sims et al., J. Immunol, 151:2296(1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901(1987)]. 다른방법은경쇄또는중쇄의특정하위군의모든인간항체의컨센서스서열로부터유래된특정프레임워크를사용한다. 다수의상이한인간화항체에대해동일한프레임워크를사용할수있다 [Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623(1993)]. 항원에대한높은친화도와다른이로운생물학적특성을보유하면서항체를인간화시키는것또한중요하다. 이러한목적을이루기위해, 바람직한방법에따라, 인간화항체는모서열및인간화서열의 3차원모델을사용하여모서열및다양한개념적인간화생성물을분석하는과정에의해제조한다. 3차원면역글로불린모델은일반적으로당업계의기술자가이용가능하고, 이들에게친숙하다. 선택된후보면역글로불린서열의가능한 3 차원배위구조를예시하고디스플레이하는컴퓨터프로그램을이용할수있다. 이들디스플레이를점검하면후보면역글로불린서열의기능에서잔기들의가능한역할을분석할수있으며, 즉, 항원에결합하는후보면역글로불린의능력에영향을끼치는잔기를분석할수있다. 이러한방식으로표적항원 ( 들 ) 에대한친화도증가와같은목적하는항체의특성을성취하도록, 수용자및임포트서열로부터 FR 잔기를선택하고결합시킬수있다. 일반적으로, CDR 잔기는항원결합에영향을끼치는데직접적으로및가장실질적으로관여한다. - 22 -
[0148] [0149] [0150] 다양한형태의인간화항체가고려된다. 예를들어, 인간화항체는항체단편, 예를들어 Fab일수있고, 이는임의로하나이상의세포독성제 ( 들 ) 와컨쥬게이션되어면역컨쥬게이트를생성한다. 별법으로, 인간화항체는온전한항체, 예를들어온전한 IgG1 항체일수있다. 4) 인간항체인간화의대안으로서인간항체를생성할수있다. 예를들어, 면역화시키면내인성면역글로불린을생산하지않고완전한인간항체레파토리를생산할수있는트랜스제닉동물 ( 예를들어, 마우스 ) 을현재생산가능하다. 예를들어, 키메라및생식계열돌연변이마우스에서항체중쇄결합 (joining) 영역 (J H ) 유전자를 동형접합결실시키면내인성항체의생산이완전히억제되는것으로개시되었다. 인간생식계열면역글로불린유전자어레이를상기생식계열돌연변이마우스에게전달하면, 항원접종시인간항체가생산될것이다. 예를들어, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551(1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258(1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33(1993); 미국특허제5,591,669호및 WO97/17852 참조. [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] [0156] 별법으로, 파지디스플레이기술을이용하여비면역화공여체로부터의면역글로불린가변 (V) 도메인유전자레퍼토리로부터인간항체및인간항체단편을시험관내에서제조할수있다. 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]; 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol.Biol. 227:381 (1991)]. 상기기술에따라서, 항체 V 도메인유전자는 M13 또는 fd와같은섬유상박테리오파지의주요또는소수코팅단백질유전자로인-프레임 (in-frame) 클로닝되고, 파지입자의표면상에기능적항체단편으로디스플레이된다. 섬유상입자가파지게놈의단일-가닥 DNA 카피를함유하기때문에, 항체의기능적성질에기초한선택은또한상기입자를나타내는항체를코딩하는유전자의선택을가져온다. 따라서, 파지는 B-세포의성질을일부모방한다. 파지디스플레이는다양한형식으로수행될수있으며, 예를들면, 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993)] 에서검토된바와같다. 다양한원천의 V-유전자분절을파지디스플레이에이용할수있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)] 는면역화된마우스의비장으로부터유래하는 V 유전자의작은무작위조합라이브러리로부터의항-옥사졸론항체의다양한어레이를단리하였다. 비면역화된인간공여체로부터 V 유전자의레퍼토리가구성될수있고, 다양한어레이의항원 ( 자가-항원을포함함 ) 에대한항체를본질적으로문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)], 또는문헌 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)] 에기술된기술에따라서단리할수있다. 또한, 미국특허제 5,565,332호및제5,573,905호참조. 콜 (Cole) 등및보에르너 (Boerner) 등의기술이또한인간모노클로날항체의제조에이용가능하다 ([Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985)] 및 [Boerner et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991)]). 유사하게, 인간항체는인간면역글로불린좌위를내재면역글로불린유전자가부분적으로또는완전히불활성화된트랜스제닉동물 ( 예 : 마우스 ) 로도입하는것에의해제조될수있다. 시도하면, 유전자재배열, 조합및항체레퍼토리를비롯한모든측면에서인간에서나타나는것과밀접하게닮은인간항체생산이관찰된다. 상기방법은예를들면, 미국특허제5,545,807호 ; 제5,545,806호, 제 5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호및하기과학논문에기재되어있다 : 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]; 문헌 [Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)]; 문헌 [Morrison, Nature 368:812-13 (1994)], 문헌 [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)], 문헌 [Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)] 및문헌 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]. 마지막으로, 인간항체는또한활성화된 B 세포에의해시험관내에서생성될수있다 ( 미국특허제5,567,610호및제5,229,275호참조 ). 5) 항체단편특정환경에서, 전체항체보다항체단편을이용하는것이유익하다. 더작은단편크기는신속한소실을가능하게하고, 고형종양에대한접근이개선될수있다. 항체단편의제조를위하여다양한기술이개발되어왔다. 전통적으로, 이들단편은온전한항체의단백분해성분해를통하여유도되었다 ( 예를들면, 문헌 [Morimoto et al.,j Biochem Biophys. Method. 24: 107-117 (1992)]; 및문헌 [Brennan et al., Science 229: 81 (1985)] 참조 ). 그러나, 이들단편은현재재조합숙주세포에의해직접생산될수있다. Fab, Fv 및 scfv 항체단편은모두이. 콜라이에서발현되고분비될수있 - 23 -