(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2015년10월27일 (11) 등록번호 10-1563315 (24) 등록일자 2015년10월20일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/48 (2006.01) A61P 3/00 (2006.01) A61P 3/04 (2006.01) (21) 출원번호 10-2014-0013074 (22) 출원일자 2014 년 02 월 05 일 심사청구일자 2014 년 02 월 05 일 (65) 공개번호 10-2015-0092789 (43) 공개일자 2015 년 08 월 17 일 (56) 선행기술조사문헌 KR1020080082955 A KR1020120003317 A (73) 특허권자 한림대학교산학협력단 강원도춘천시한림대학길 1, 한림대학교 ( 옥천동 ) (72) 발명자 임순성 강원춘천시후석로 325, 105 동 301 호 ( 후평동, 춘천더샵아파트 ) 황파 강원도춘천시한림대학길 1 생명과학관 5 층 851 0 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 특허법인정안전체청구항수 : 총 4 항심사관 : 윤동준 (54) 발명의명칭다릅나무의항비만효능과이를포함하는조성물 (57) 요약 본발명은다릅나무추출물또는분획물을유효성분으로포함하는비만의개선, 예방또는치료용조성물, 및이러한조성물을포함하는기능성식품에관한것으로, 본발명의조성물, 및식품은비만세포분화억제활성을지녀비만의개선, 예방및치료에매우유용하다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자 최면 강원춘천시동면만천로 107, 102 동 502 호 ( 한일유앤아이아파트 ) 장영수 강원도횡성군횡성읍상 647-3 5/1 왕지강 강원도춘천시한림대학길 1 생명과학관 5 층 8510 호 이수경 강원춘천시서부대성로 327, 102 동 601 호 ( 후평동, 동아아파트 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 B0008864 부처명 산업통상자원부 연구관리전문기관 한국산업기술진흥원 연구사업명 지역혁신센터조성사업 (RIC) 연구과제명 식의약품의효능평가및기능성소재개발센터 기여율 1/1 주관기관 한림대학교산학협력단 연구기간 2013.03.01 ~ 2014.02.28-2 -
명세서청구범위청구항 1 다릅나무 (Maackia amurensis) C 1 -C 4 알코올추출물또는분획물을유효성분으로포함하며, 상기분획물은 n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물또는에틸아세테이트분획물인비만의예방또는치료용약제조성물. 청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 다릅나무 C 1 -C 4 알코올추출물또는분획물을유효성분으로포함하며, 상기분획물은 n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물또는에틸아세테이트분획물인비만예방또는개선용기능성식품조성물. 청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 제4항에있어서, 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 희석제, 분산제, 결합제및윤활제로이루어진군에서선택되는하나이상의보조제를추가로포함하는것을특징으로하는, 비만예방또는개선용기능성식품조성물. 청구항 8 제4항의조성물을포함하는, 비만예방또는개선용기능성식품. 발명의설명 [0001] 기술분야본발명은다릅나무추출물또는분획물을유효성분으로포함하는비만의개선, 예방또는치료용조성물, 및이러한조성물을포함하는기능성식품에관한것으로, 보다구체적으로본발명은비만세포분화억제활성을지녀비만의개선, 예방및치료에매우유용한다릅나무추출물또는분획물을유효성분으로포함하는조성물, 및이를포함하는기능성식품에관한것이다. [0002] 배경기술 비만은음식물로섭취한에너지와신체활동으로소비한에너지간의불균형에의하여과잉의에너지가체지방으 로축적되는현상이다. 일반적으로비만이란, 지방조직이과잉으로몸에축적된상태를말하며, 건강진단등 - 3 -
에서이용되는 BMI(Body Mass Index( 체격지수 ), 체중 (kg) 을신장 (m) 의제곱으로나눈것 ) 에서, BMI가 22가되는체중을표준체중이라고하고, 그것보다 1할이상많은체중을과체중, 2할이상많은체중을비만이라고한다. 이러한비만상태가오랜시간에걸쳐지속되면당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간등의각종대사성질환과성인병이유발된다. 최근과다한열량섭취와운동부족으로인하여서구선진국뿐만아니라우리나라에서도비만인구가급증하고있으며이는심각한사회문제로대두되고있다. [0003] [0004] 비만은과잉의에너지공급이지방세포크기와수의증가를유발하여체내지방으로축적되는것이주된발생원인으로알려져있으며, 이외에도유전적요인, 서구화된식생활에의한환경적요인, 심리적요인, 에너지대사이상등다양한원인이작용한다고알려져있다. 비만을예방또는해소하기위해서는, 식사요법이나운동요법등의생활습관의개선이바람직하지만, 용이하게행할수있는것은아니다. 또한, 비만에대한치료로서는, 지질흡수저해제, 소화흡수저해제등의약물요법도있지만, 그사용은, 중증의비만증에한정되어있다. 이러한중에, 다채로운작용을갖고, 장기간복용하더라도부작용등의우려가적은천연물유래성분을이용한다양한물건이다이어트식품등으로서비만의예방이나해소를위해판매되고있고, 또한새로운항비만활성을갖는물질에대한연구가계속되어오고있다. [0005] [0006] [0007] 예를들면, 일본특허공개제2004-091464호는황파의잎또는나무껍질의건조분말, 추출물또는정제물이래트나인간에있어서체중감소효과를가짐을개시하고있다. 또한, 일본특허공개제2002-051735호는폴리페놀의일종인탄닌이 α-아밀라아제저해효과를갖고항비만효과를갖는것을개시하고있다. 또한, 다릅나무에관해서는한국특허공개제2006-0069917호에서민간요법으로서다릅나무에관절염이나종양, 뼈의결손등에효과가있음을기초로이를이용하여소주를제조하는방법을기재하고있고, 한국특허공개제2013-0123490호에서는다릅나무추출물이미백효과를나타낸다는점에기반하여이를포함하는미백화장료조성물, 약제조성물및식품조성물을개시하고있다. 그러나, 비만세포의분화를억제하여항비만효과를나타내는다릅나무추출물또는분획물에관해서는특허가없는실정이다. 이에, 본발명자들은다릅나무추출물과다릅나무분획물이비만세포분화억제활성을지녀, 비만의개선, 예방및치료에효과가있음을새롭게확인하여본발명을완성하기에이르렀다. 발명의내용 [0008] [0009] [0010] 해결하려는과제본발명의목적은비만의예방및치료를위한약제조성물및이를이용한비만의치료방법을제공하는것이다. 본발명의다른목적은비만의예방및개선을위한기능성식품조성물을제공하는것이다. 본발명의또다른목적은비만세포분화억제활성을지녀비만의예방및개선에매우유용한기능성식품을제공하는것이다. [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] 과제의해결수단상기목적을달성하기위한본발명의일양태로서, 다릅나무추출물또는분획물을유효성분으로포함하는비만예방또는치료용약제조성물이제공된다. 본발명의다른양태에따르면, 다릅나무추출물또는분획물을유효성분으로포함하는비만예방또는개선용기능성식품조성물이제공된다. 본발명의또다른양태에따르면, 다릅나무추출물또는분획물을유효성분으로포함하는식품조성물을포함하는비만예방또는개선용기능성식품이제공된다. 이하, 본발명을상세히설명한다. 본발명은다릅나무추출물또는분획물을유효성분으로포함하는비만의예방또는치료용약제조성물을제공한다. 본발명의약제조성물은비만세포의분화억제활성을지님으로써비만의예방또는치료에효과를지닌다. - 4 -
[0017] [0018] [0019] [0020] [0021] 본발명에서다릅나무는상업적으로판매되는것을구입하여사용하거나, 자연에서채취또는재배된것을사용할수있다. 다릅나무는장미목의쌍떡잎식물로한국 중국 일본 만주등지에분포하는낙엽활엽교목으로산중턱, 산기슭, 골짜기등흙이깊은곳에서잘자란다. 큰나무는지름 1.5m, 높이 15m에달하며줄기는가지를많이치고성장이빠르다. 잎은어긋나고 1회기수우상복엽이며작은잎은타원형또는장난형으로양면에털이없다. 꽃은총상꽃차례또는원추꽃차례로 7월에가지끝에서위로향해피며흰꽃이총총히달린다. 꼬투리는넓은선형이고털이없으며 9월에익는다. 나뭇결이아름답고무겁고질겨서기구재, 기계재, 차량재, 땔감등으로쓰인다. 본발명에서다릅나무는잎, 줄기, 열매, 뿌리, 전초를포함한전체부위가사용될수있다. 본발명에서용어, " 예방 " 이란조성물의투여에의해비만을억제하거나발병을지연시키는모든행위를의미한다. 본발명에서용어, " 치료 " 란조성물의투여에의해비만에의한증세가호전되거나이롭게변경하는모든행위를의미한다. 본발명에서비만의예방또는치료활성은비만세포분화억제능을통해시험하였다. 본발명에서추출물 (extract) 은천연물로부터분리된활성성분을의미하며, 여기서는다릅나무로부터분리된물질을의미한다. 상기에서추출물을제조하는방법은초음파추출법, 여과법및환류추출법등당업계의통상적인추출방법일수있다. 바람직하게는세척및건조로이물질이제거된다릅나무를물, C 1 -C 4 의알코올 ( 예 컨대, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올등 ), 또는이들의혼합용매로추출한추출물일수있다. 더바람직하게는, 본발명에서사용되는추출물은에탄올추출물이며, 가장바람직하게는 70% 의에탄올추출물이다. 추출용매는다릅나무의건조중량의 2 내지 20 배로하는것이바람직하다. 용매로추출한이후에는농축또는동결건조등의방법을추가로수행할수있다. [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] 한편, 본발명에서다릅나무분획물은상기다릅나무추출물로부터분획하여얻을수있다. 상기다릅나무분획물을수득하기위한분획용매는유기용매이다. 보다구체적으로, 상기다릅나무분획물은다릅나무추출물을물 ( 증류수 ) 에현탁시킨후 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트및 n-부탄올로각각분획함으로써, n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물, 에틸아세테이트분획물, n-부탄올분획물및물분획물로얻을수있다. 본발명에서사용될수있는바람직한다릅나무분획물은 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트분획물이다. 가장바람직한다릅나무분획물은 n-헥산분획물이다. 상기에서, 분획은분별깔때기를이용하여수행할수있다. 상기본발명의약제조성물은약학적으로허용가능한담체를포함할수있다. 약학적으로허용가능한담체를포함하는상기조성물은경구또는비경구의여러가지제형일수있다. 제제화할경우에는보통사용하는충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제등의희석제또는부형제를사용하여조제된다. 경구투여를위한고형제제에는정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제등이포함되며, 이러한고형제제는하나이상의화합물에적어도하나이상의부형제예를들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는락토오스 (lactose), 젤라틴등을섞어조제된다. 또한단순한부형제이외에스테아린산마그네슘, 탈크등과같은윤활제들도사용된다. 경구투여를위한액상제제로는현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제등이해당되는데흔히사용되는단순희석제인물, 리퀴드파라핀이외에여러가지부형제, 예를들면습윤제, 감미제, 방향제, 보존제등이포함될수있다. 비경구투여를위한제제에는멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과같은식물성기름, 에틸올레이트와같은주사가능한에스테로등이사용될수있다. 좌제의기제로는위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴등이사용될수있다. 상기약제조성물은정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제및좌제으로이루어진군으로부터선택되는어느하나의제형을가질수있다. 상기본발명의약제조성물은약제학적으로유효한양으로투여된다. 본발명에서용어 " 약제학적으로유효한양 " 은의학적치료에적용가능한합리적인수혜 / 위험비율로질환을치료하기에충분한양을의미하며, 유효용량수준은개체종류및중증도, 연령, 성별, 감염된바이러스종류, 약물의활성, 약물에대한민감도, 투여시간, 투여경로및배출비율, 치료기간, 동시사용되는약물을포함한요소및기타의학분야에잘알려진요소에따라결정될수있다. 본발명의조성물은개별치료제로투여하거나다른치료제와병용하여투여될수있고종래의치료제와는순차적또는동시에투여될수있다. 그리 - 5 -
고단일또는다중투여될수있다. 상기요소를모두고려하여부작용없이최소한의양으로최대효과를얻을 수있는양을투여하는것이중요하며, 당업자에의해용이하게결정될수있다. [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] 본발명의약제조성물은비만의예방또는치료를위하여단독으로, 또는수술, 호르몬치료, 약물치료및생물학적반응조절제를사용하는방법들과병용하여사용할수있다. 한편, 본발명은비만의예방또는치료용조성물을약제학적으로유효한양으로비만의발병또는발병가능성이있는개체에게투여하는단계를포함하는비만의치료방법을제공한다. 본발명에서용어, " 개체 " 란이미비만상태이거나비만이될위험이있는인간을포함한모든포유동물을의미하고, 본발명의추출물또는분획물을포함하는조성물을개체에게투여함으로써, 상기질환을효과적으로예방및치료할수있다. 예를들어, 본발명의약제조성물로비만상태인인간을치료할수있다. 또한, 본발명의약제조성물은기존의비만예방제또는치료제와병행하여투여할수있다. 상기약제조성물의투여경로는목적조직에도달할수있는한어떠한일반적인경로를통하여투여될수있다. 본발명의약제조성물은목적하는바에따라복강내투여, 정맥내투여, 근육내투여, 피하투여, 피내투여, 경구투여, 비내투여, 폐내투여, 직장내투여될수있으나, 이에제한되지는않는다. 또한상기약제조성물은활성물질이표적세포로이동할수있는임의의장치에의해투여될수있다. 또한, 본발명은다릅나무추출물또는분획물을유효성분으로포함하는비만의예방또는개선을위한기능성식품조성물을제공한다. 본발명의기능성식품조성물은비만세포분화억제활성을지님으로써비만의예방및개선에효과를지닌다. 본발명에서다릅나무는상업적으로판매되는것을구입하여사용하거나, 자연에서채취또는재배된것을사용할수있다. 본발명에서비만의예방또는치료활성은비만세포분화억제능을통해시험하였다. 본발명에서추출물은천연물로부터분리된활성성분을의미하며, 여기서는다릅나무로부터분리된물질을의미한다. 상기에서추출물을제조하는방법은초음파추출법, 여과법및환류추출법등당업계의통상적인추출방법일수있다. 바람직하게는세척및건조로이물질이제거된다릅나무를물, C 1 -C 4 의알코올 ( 예컨대, 메탄 올, 에탄올, 프로판올, 부탄올등 ), 또는이들의혼합용매로추출한추출물일수있다. 더바람직하게는, 본발명에서사용되는추출물은에탄올추출물이며, 가장바람직하게는 70% 의에탄올추출물이다. 추출용매는다릅나무의건조중량의 2 내지 20 배로하는것이바람직하다. 용매로추출한이후에는농축또는동결건조등의방법을추가로수행할수있다. [0036] 한편, 본발명에서다릅나무분획물은상기다릅나무추출물로부터분획하여얻을수있다. 상기다릅나무분획물을수득하기위한분획용매는유기용매이다. 보다구체적으로, 상기다릅나무분획물은다릅나무추출물을물 ( 증류수 ) 에현탁시킨후 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트및 n-부탄올로각각분획함으로써, n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물, 에틸아세테이트분획물, n-부탄올분획물및물분획물로얻을수있다. 본발명에서사용될수있는바람직한다릅나무분획물은 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트분획물이다. 가장바람직한다릅나무분획물은 n-헥산분획물이다. 상기에서, 분획은분별깔때기를이용하여수행할수있다. [0037] [0038] 본발명의기능성식품조성물은식품조성물의제조에통상적으로사용되는적절한담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 희석제, 분산제, 결합제및윤활제로이루어진군에서선택되는하나이상의보조제를추가로포함할수있다. 또한, 유기산, 인산염, 항산화제, 유당카제인, 덱스트린, 포도당, 설탕, 솔비톨, 영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 천연또는합성풍미제, 착색제, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제등을추가로포함할수있다. 유기산은이에제한되는것은아니지만구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산또는사과산일수있으며, 인산염은이에제한되는것은아니지만인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염또는폴리인산염 ( 중합인산염 ) 일수있으며, 항산화제는이에제한되는것은아니지만폴리페놀, 카테킨, α-토코페롤, 로즈마리추출물, 감초추출물, 키토산, 탄닌산또는피틴산등의천연항산화제일수있다. 본발명의기능성식품조성물은정제, 환제, 과립제, 분말제, 액제, 경질캅셀제, 연질캅셀제등과같은일반적 - 6 -
인제형으로제조될수도있으며, 죽, 빵, 음료, 바, 초콜릿, 쿠키, 차, 드링크제, 비타민복합제, 육류, 소시지, 캔디, 면, 젤리등과같은임의의형태로제조될수있다. 본발명의기능성식품조성물을음료형태로제조하는경우, 통상의음료와같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 천연탄수화물은포도당, 과당과같은모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와같은디사카라이드, 및덱스트린, 사이클로덱스트린과같은폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이해당된다. 감미제로서는타우마틴, 스테비아추출물과같은천연감미제나, 사카린, 아스파르탐과같은합성감미제등을사용할수있다. [0039] [0040] [0041] 상기와같은여러제형또는형태를제조하기위해, 전술한부형제들과같은식품학적으로허용가능한담체또는첨가제를사용할수있으며, 제조하고자하는제형또는형태의제조에당해기술분야에서사용가능한것으로공지되어있는임의의담체또는첨가제가이용될수있다. 또한, 본발명은전술한본발명의기능성식품조성물을포함하는비만의예방또는개선용기능성식품을제공한다. 상기식품의종류에는특별한제한은없다. 상기물질을첨가할수있는식품의예로는육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 아이스크림류를포함한낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜음료및비타민복합제등이있으며, 통상적인의미에서의식품을모두포함한다. [0042] 발명의효과본발명에따른다릅나무추출물또는분획물을유효성분으로포함하는조성물은비만의개선, 예방및치료효과가우수하면서도독성과부작용이없는천연물유래의조성물이므로, 비만의치료등에보다안전하게적용할수있다. [0043] 도면의간단한설명도 1은본발명의다릅나무추출물및분획물을사용한경우의지방세포분화억제정도를도시한사진및그래프이다. 해당그래프에서 "C" 는 " 컨트롤 (Control)"; "DM" 은 "Differentiation Medium (cat # DM-2-L1)" (DM 군과모든시료군에처리하여세포분화를유도한후에유도된세포분화를억제하는것을확인할수있음 ); "Crude" 는 " 다릅나무에탄올추출물 "; "Hex" 는 " 다릅나무 n-헥산분획물 "; "MC" 는 " 다릅나무디메틸클로라이드분획물 "; "EA" 는 " 다릅나무에틸아세테이트분획물 "; "BuOH" 는 " 다릅나무 n-부탄올분획물 ", "Water" 는 " 다릅나무물분획물 " 을나타낸다. 도 2 는본발명의다릅나무추출물및분획물의지방세포증식억제율을도시한그래프이다. 도 3 은 C57BL/6 마우스를이용한항비만실험결과를도시한것이다. [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명의구체적인구성및작용을실시예및실험예에의하여내용을더욱상세하게설명하기로한다. 다만, 하기실시예및실험예는본발명을위한예시일뿐이에한정되는것은아니다. 제조예 1: 다릅나무추출물의제조다릅나무를세척및건조시킨후, 건조된다릅나무잎과줄기 1kg을 70 에서 3시간동안 70% 의에탄올 10l로추출및여과하여, 다릅나무추출액을수득하였다. 상기추출과정을 2회반복하여얻어진다릅나무추출액을감압농축한후동결건조하여분말상의추출물을수득하였다. 제조예 2: 다릅나무분획물의제조상기제조예 1에서수득한다릅나무추출액을증류수에현탁시킨후 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트및 n-부탄올로각각순차적으로분획하여, n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물, 에틸아세테이트분획물, n-부탄올분획물및물분획물을수득하였다. 실험예 1: 지방세포분화억제실험지방전구세포 (pre-adipocyte cell) 3T3-L1을상기제조예 1에서수득한다릅나무에탄올추출물, 및상기제조예 2로부터수득한다릅나무 n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물, 에틸아세테이트분획물, n-부탄올분획물및물분획물각각 50μg / ml로처리한후 8일째지방염색법 (Oil red O) 을이용하여다릅나무추출물및분획물의 - 7 -
지방세포형성억제정도를시험하였다. 구체적인시험내용은다음과같다 : [0051] [0052] 실험예 1-1: 지방세포의분화유도 ATCC (American Type Culture Collection) 로부터지방전구세포 3T3-L1을구입하여사용하였다. 세포배양은 10% 소태아혈청 (FBS), 페니실린 (100U/ ml ), 스트렙토마이신 (100U/ ml ) 을포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 (Gibco) 를사용하였으며, CO 2 배양기에 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 3T3-L1 세포 를 6-웰플레이트에씨딩 (seeding) 하고, 세포가포스트-융합 (post-confluent) 할때호르몬칵테일 (hormone cocktail) 인 0.5mM 덱사메타손, 10μg / ml인슐린및 0.5mM IBMX로처리하였다. 이틀에한번배지를갈아주었으며, 4일후에배지를인슐린 5μg / ml로바꿔주고, 이틀뒤에다시정상배지로갈아주어지방세포로의분화를유도하였다. 상기제조예 1 및 2의에탄올추출물, n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물, 에틸아세테이트분획물, n-부탄올분획물및물분획물각각 50μg / ml를지방세포분화시에처리하였으며피오글리타존을양성대조군 (positive control) 으로사용하였다. [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] 실험예 1-2: MTS 어세이세포밀도가 5 10 4 가되도록 3T3-L1 세포를 96-웰에깔고부동한농도의시약들을처리하여세포의생존력 (viability) 을관찰하였다. 분화유도전에상기제조예 1 및 2의에탄올추출물, n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물, 에틸아세테이트분획물, n-부탄올분획물및물분획물로처리하고, 24시간, 48시간후에각각 MTS 시약을 20μl넣고 30분동안 37 에서인큐베이션시킨다음, 450nm에서 OD 값을측정하였다. 실험예 1-3: 지방염색법 (Oil Red O staining) 상기제조예 1 및 2의에탄올추출물, n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물, 에틸아세테이트분획물, n-부탄올분획물및물분획물시약들각각의지방생성억제효과를확인하기위해지방분화배지와각시약들을동시에처리하여 ( 다릅나무추출물및분획물을각각 50μg / ml처리 ) 8일후분화된세포의배지를버리고 1 PBS에 3 회세척한후 10% 포르말린시약에고정시켰다. 1시간후 0.6% Oil Red O 시약에염색시키고다시상대적인 TG 의 OD값을측정하였다. 실험결과상기실험결과, 도 1에도시된바와같이, 다릅나무에탄올추출물, n-헥산분획물, 디클로로메탄분획물, 에틸아세테이트분획물로처리한경우특히지방세포분화억제효과가매우뛰어났다 ( 각각도 1의 "Crude", "Hex", "MC", "EA"). 또한, n-헥산분획물을사용하여세포증식률을분석한결과, 도 2에도시된바와같이 n-헥산분획물 50μg / ml이상으로처리했을때 24시간이후부터는대조군에비해세포증식률이현저히감소함을확인할수있었다. 실험예 2: C57BL/6 마우스를이용한항비만실험 (in vivo) 실험동물은브릿지에서구입하였으며, C57BL/6N 5주령을사용하였다. 먼저, 마우스를 7일간동물실험실에적응시켰다. 1 그룹당마우스 8마리씩, 총 5개그룹으로나눈후 1 그룹은대조군으로정상식이를주고, 2 그룹은고지방식 (High Fat Diet) 만주고, 나머지그룹은고지방식을줌과동시에저농도다릅나무분획물 (100mg/kg) (3 그룹 ), 고농도다릅나무분획물 (200mg/kg) (4 그룹 ), Orlistat 30mg/kg (5 그룹 ) 을각각하루에한번씩경구로 8주동안투여하였다 ( 도 3). 매주동일한요일과시간을정하여실험동물들의식이, 체중을측정하였다. 8주후실험동물들을충분히마취시킨후개복하여심장채혈하여얻은혈청으로혈액지표를측정하였다. 5,000rpm에서 5분간원심분리한후혈청을분석에사용하여, 혈중포도당 (plasma glucose), 중성지방 (Triglyceride), 총콜레스테롤 (TC), LDL 콜레스테롤의농도는시판키트 (Stanbio, USA) 를구입하여생화학분석기기 (SMARTLAB, USA) 를사용하여측정하였으며, 혈중인슐린농도는마우스인슐린 ELISA 키트 (Shibayagi, Japan) 를구입하여 ELISA 리더 (Labsystems, Finland) 로측정하였다. 측정결과는도 3 및하기표 1에나타내었다. - 8 -
[0062] [ 표 1] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] 상기값들은평균값 ±S.E.(n=8) 으로나타낸것이다. RD: regular diet HFD: high fat diet HFD+ 다릅나무 n-헥산분획물 : HFD 투여및해당농도다릅나무 n-헥산분획물처리 p < 0.01, p < 0.001 vs. RD. [0069] [0070] [0071] * ** *** p < 0.05, p < 0.01, p < 0.001 vs. HFD 도 3으로부터, 체중변화를확인한결과다릅나무헥산분획물을투여한경우 4주후부터현저한체중증가억제활성을나타냄을확인할수있었다. 또한, 혈액채취를통해분석한결과, 다릅나무헥산분획물을투여한경우고지방식으로유도된비만쥐그룹에비해혈당감소, 혈중인슐린농도감소, 인슐린저항성감소, TG 감소, TC 감소, LDL-콜레스테롤농도감소등의상당한항비만효과가있음을알수있었다 ( 표 1). - 9 -
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